QUANTA Lite TM SLA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM SLA 708775 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Η ανοσοενζυμική μέθοδος QUANTA Lite TM SLA χρησιμοποιείται για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό αντισωμάτων κατά διαλυτών ηπατικών αντιγόνων IgG στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των αντισωμάτων σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα και ορολογικές εξετάσεις μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση αυτοάνοσης ηπατίτιδας (ΑΗ). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου H Αυτοάνοση ηπατίτιδα (ΑΗ) είναι μια χρόνια, προοδευτική, ετερογενής, φλεγμονώδης ηπατική ασθένεια άγνωστης αιτιολογίας. 1-6 Η διάγνωση είναι συχνά δύσκολη αφού δεν υπάρχει μια μόνο διαγνωστική εξέταση για την AH και τα παρουσιαζόμενα συμπτωμάτων μπορούν να ποικίλλουν. 1-6 Η διάγνωση συμπεριλαμβάνει αξιολόγηση κλινικών, εργαστηριακών και ιστολογικών ευρημάτων καθώς επίσης και ο αποκλεισμός άλλων αιτιών της χρόνιας ηπατίτιδας. 1-6 Η διάγνωση είναι ιδιαίτερα δύσκολη στους ασθενείς που πάσχουν από κρυπτογενή ηπατίτιδα, περιγραφόμενη σαν έχουσα μη-προσδιορισμένη χρόνια ηπατίτιδα χωρίς αντισώματα στον ιό, ή το τυπικό προφίλ των αυτοανοσών δεικτών. 1-2 Η πρώιμη διάγνωση του AH και η ανοσοκατασταλτική θεραπεία είναι απαραίτητες για να εμποδίσουν σοβαρή ηπατική ζημιά. Δυστυχώς, η έλλειψη βεβαιότητας στη διάγνωση μπορεί να οδηγήσει στην καθυστέρηση της θεραπείας και στην συνεχιζόμενη εξέλιξη της ασθένειας. 7-8 Οι ασθενείς με AH γενικά είναι χωρισμένοι σε 2 ομάδες, βασισμένες στην παρουσία συγκεκριμένων αυτοαντισωμάτων. 1-6,9,10 ΑΗ τύπου 1 (επίσης αναφερόμενη ως κλασσική, ενεργό χρόνιο, λυκοειδές, πλασμοκύτταρο, ή αυτοάνοση χρόνια ενεργό ηπατίτιδα) είναι ο πιο κοινός τύπος της AH. Η AH -1 χαρακτηρίζεται από αντιπυρηνικά,αντι λείων μυικών ινών (κατευθυνόμενο εναντίον και των αντι-ακτινικων και των μη-ακτινικων συστατικών) και περιπυρηνικά αντι-ουδετερόφιλλα κυτταροπλασματικά αντισώματα. 1,4,6 Η AH τύπου 2 χαρακτηρίζεται από αντισώματα ήπατος\ νεφρού μικροσωμιακών (LKM-1) κατευθυνόμενα αρχικά εναντίον του κυττοχρώματος P4502D6 και του αντι-ηπατικού κυτοσολικού αντιγόνου (LC-1). 4,6,11 Οι ασθενείς με AH-1 είναι αρνητικοί στα αντισώματα LKM-1 και LC1. Το 1987 τα αντισώματα σε κυτοσολικό διαλυτό αντιγόνο ήπατος (SLA) ανιχνεύτηκαν σε 23 ασθενείς με HbsAg-αρνητικό, ΑΝΑ αρνητικό, LKM-1 αρνητικό, ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα. 12 Επίσης, αντισώματα σε μια άλλη κυτοσολική διαλυτή πρωτεΐνη ήπατος, καθορισμένου αντιγόνου ήπατος-πάνγκρεας (LP), βρέθηκαν σε μερικούς ασθενείς με AH. 12 Σήμερα είναι γνωστό ότι τα SLA και τα LP αντισώματα αναγνωρίζουν τον ίδιο στόχο-αντιγόνο. 13 Το SLA είναι μια πρωτεΐνη 50 kda περίπου με 99% ομολογία σε UGA καταστολέα trna σχετικής πρωτεΐνης που είναι πιθανό να εμπλέκεται στον σπληνοκύστινο μεταβολισμό. 14-15 Παρόλο που η κυτοκερατίνη 8, η κυτοκερατίνη 18 και το γλουταθείον S-τρανφεράση έχουν θεωρηθεί ως οι κυριότεροι στόχοι της αντίδρασης SLA, αυτό δεν έχει αποδειχθεί από μεταγενέστερες μελέτες. 14,16-19 Παρόλο που μόνο ένα 12-30% των ασθενών με AH έχει αντισώματα SLA, η παρουσία των αντισωμάτων SLA έχει σχεδόν 100% ακρίβεια για την AH. 8,10,14,19-20 Υπολογίζεται ότι το 70-80% ασθενών με AH έχουν ΑΝΑ και \ή SMA και ένα μικρό ποσοστό έχει αντι-lkm-1 αντισώματα. Περίπου το 10-30% των ασθενών με κλινικά χαρακτηριστικά AH δεν δείχνουν συγκεκριμένους τίτλους από αντισώματα σε κανένα από αυτούς τους δείκτες. 1,2,7,12 Πρόσφατη θεραπευτική αντίδραση σε αντιφλεγμονώδη θεραπεία ίσως είναι η μοναδική ένδειξη για AH σε αυτούς τους ασθενείς. 1,2 Τα αντισώματα SLA έχουν βρεθεί στο 14-20% των ασθενών με κρυπτογενή ηπατίτιδα. 13,19,20 Για αυτό το λόγο η εξέταση SLA μπορεί να βοηθήσει στην διάγνωση AH και στην μείωση της εξέλιξης της ασθένειας, που απορρέει από την καθυστέρηση της θεραπείας. Είναι απαραίτητη η ακριβής αναγνώριση της AH, εφόσον η θεραπεία διαφέρει δραματικά για την AH και την ιώδη ηπατίτιδα. Η ανοσοκαταστολή που χρησιμοποιείται για την AH μπορεί να είναι επιβλαβής στις περιπτώσεις της ιώδους μολύνσεως και θεραπείας με ιντερφερόνη και μπορεί να επιδεινώσει την AH. 21 Η περιγραφή ενός τρίτου τύπου της AH, βασισμένη αρχικά στην παρουσία των αντισωμάτων στο SLA έχει ληφθεί υπόψη, αλλά πιθανώς δεν είναι απαραίτητο. 4,6,9,19 Οι ασθενείς που είναι θετικοί στα αντισώματα SLA μοιάζουν να είναι παρόμοιοι με τους ασθενείς που είναι θετικοί στη μη-sla θετική AH-1, όσον αφορά τις περισσότερες κλινικές, ιστολογικές και εργοστασιακές φιγούρες. 9,10,19 Ωστόσο, οι ασθενείς με SLA θετικό έχουν μια σχέση με την HLA DR3 και μπορεί να έχουν την τάση να υποτροπιάσουν μετά από κορτικοστεροειδή απόσυρση. 22 Παραλλαγές του AIH στις οποίες οι ασθενείς παρουσιάζουν χαρακτηριστικά τυπικά του AIH και της πρωτοπαθούς χολικής κίρρωσης (PBC) ή της πρωτοπαθούς σκληρωτικής χολαγγειίτιδας (PSC) ονομάζονται συχνά αλληλοεπικαλυπτόμενα σύνδρομα. Αυτά τα σύνδρομα, μαζί με την αυτοάνοσο χολαγγειίτιδα (AIC), ένας όρος που έχει προταθεί για να περιγράψει μια κατάσταση με ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά όμοια της PBC, αλλά χωρίς το αντι-μιτοχονδριακό αντίσωμα (AMA) 1-3,5 μπορεί να αποτελούν διαγνωστικό και διαχειριστικό πρόβλημα. Αρχη Μεθοδου Το κεκαθαρμένο ανθρώπινο ανασυνδιασμένου αντιγόνο SLA είναι συνδεδεμένο στα πηγαδάκια της μικροπλάκας από πολυστυρένιο υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της 1

ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο Gliadin (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα SLA) 3. SLA ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο SLA, προαραιωμένο, 1.2ml 4. SLA ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο SLA, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 23 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 2

8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 SLA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος SLA ELISA Low Χαμηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος SLA ELISA High Υψηλός πρότυπος ορος (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 3

2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Το SLA ELISA (Low Positive), το SLA ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) θα πρέπει να εξετάζονται με κάθε φορά για να επιβεβαιωθεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες γίνονται κανονικά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον το SLA ELISA χαμηλό Θετικό (Low Positive), το SLA ELISA Υψηλο Θετικό (High Positive) και το ELISA Αρνητικό (Negative Control) είναι προ-αραιωμένα, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της εξέτασης, πρέπει να ισχύουν όλα τα παρακάτω κριτήρια. Εάν δεν ισχύει κάποιο από αυτά, το τεστ πρέπει να θεωρηθεί άκυρα και να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου SLA ELISA High Positive πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου SLA ELISA Low Positive, του οποίου η απορροφητικότητα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από αυτή του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control. β. Το προ-αραιωμένο SLA ELISA High Positive πρέπει να έχει O.A. μεγαλύτερο από 1.0, ενώ η απορροφητικότητα του προ-αραιωμένου ELISA Negative Control δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από το 0.2. γ. Η απορροφητικότητα του SLA ELISA Low Positive πρέπει να είναι δύο φορές μεγαλύτερη από αυτή του ELISA Negative Control ή πάνω από 0.25. δ. Το ELISA Negative Control και το SLA ELISA High Positive έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. To SLA ELISA High Positive δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να αναφέρεται στο NCCLS Document C24-A για επιπλέον οδηγίες. 24 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του SLA ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του SLA ELISA Low. Η τιμή του SLA ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X SLA oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. SLA ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. 4

Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθησμού κ..λ.π. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να ταξινομηθεί ως αρνητικό (για αντίσωμα IgG σε SLA), αμφίβολο ή θετικό (ανιχνεύθηκε αντίσωμα IgG σε SLA) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Αρνητικό Αμφίβολο Ισχυρώς θετικό 0.0-20.0 μονάδες 20.1-24.9 μονάδες >25 μονάδες Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 1. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία SLA IgG αντισωμάτων καί την πιθανότητα αυτοάνοσης ηπατίτιδας (AH). 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων SLA IgG ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Ενα αμφίβολο αποτέλεσμα στάθμης SLA IgG αντισωμάτων δέν καθορίζει την κατάσταση αντισωμάτων. Εάν στην επανάληψη της διαδικασίας παραμένει το αμφίβολο αποτέλεσμα το δείγμα πρέπει να αναφερθεί σά αμφίβολο ή να δοκιμασθει νέο δείγμα. 4. Δείγματα με οπτική πυκνότητα (ΟΠ) πάνω απο τις μετρήσιμες του φωτομέτρου μπορούν να χαρακτηρισθούν σάν πάνω απο το όριο μέτρησης διαιρούμενες με την ΟΠ του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού Χ 25 ή να αραιωθούν και να δοκιμασθούν εκ νέου. Το γραμμικό εύρος της μεθόδου είναι από 9 125 μονάδες. 5. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM SLA ELISA. Οι τιμές SLA που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Το αρνητικό αποτέλεσμα αντισωμάτων SLA δέν αποκλείει την ύπαρξη AH. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα αντισωμάτων SLA δέν αποκλείει την ύπαρξη αντισωμάτων SLA καθώς η συγκέντρωση αντισωμάτων μπορεί να είναι κάτω απο το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. 3. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει μόνο τη παρουσία SLA IgG αντισωμάτων και δέν δείχνει απαραίτητα την παρουσία αυτοάνοσης ηπατίτιδας (ΑΗ). 4. Η διάγνωση ΑΗ απαιτεί συσωρευτικά αποδείξεις του ασθενούς δημογραφικές κλινική εικόνα,και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. 5. Η βιβλιογραφία προτείνει ότι τά αντι- SLA αντισωμάτα δέν χαρακτηρίζουν την ΑΗ-2. Τα τρία ΑΗ-2 δείγματα που αναφέρονται κατωτέρω ήταν αρνητικά. Ο αριθμός όμως δέν είναι αρκετός για νά γίνει αποδεκτο όσον αφορά τα αντισώματα ΑΗ-2 με τη δοκιμασία αυτή. 6. Τα αποτελέσματα της μεθόδου αυτής πρέπει να δίδονται σε συνδιασμό με τά κλινικά ευρήματα και τα ευρήματα από άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Ο μέσος όρος των ετησίων περιστατικών του ΑΗ υπολογίστηκε ότι είναι 1.9 περιπτώσεις\100,000 στην Δυτική Ευρώπη και στους Βορειοαμερικανικούς πληθυσμούς, και 0.08 0.015 περιπτώσεις\100,000 στην Ιαπωνία. Το σημείο συχνότητας της νόσου εκτιμήθηκε ότι είναι 16.9\100,000 σε Νορβηγικό πληθυσμό. Η ασθένεια είναι επικρατέστερη στις γυναίκες με μια αναλογία 4:1 από γυναίκα σε άνδρα. Η έξαρση των περιστατικών βρίσκεται στις ηλικίες 15 με 30, παρόλο που συναντάται σε όλες τις ομάδες ηλικιών. Φυσιολογικές τιμές Ένας κατάλογος από 131 υγιείς ανθρώπους χωρίς συμπτώματα εξετάστηκε για τα αντισώματα SLA με ένα QUANTA Lite TM SLA ELISA. Ο κατάλογος αποτελούνταν από 91 άνδρες και 40 γυναίκες. Οι ηλικίες ποίκιλλαν από 5 έως 69 ετών (μέση ηλικία 33 ετών). Η ακρίβεια της ανάλυσης ήταν 100% (131\131) για τον κατάλογο των ατόμων που εξετάστηκε. Ο μέσος όρος τιμών για αυτό τον πληθυσμό ήταν 2.0 μονάδες με υψηλότερη τιμή τις 5.8 μονάδες. Ακριβή Χαρακτηριστικά της Δοκιμασίας ΑΗ και ασθενείς με νοσο Ήπατος Δείγματα από ασθενείς με ΑΗ και άλλες ασθένειες ήπατος εξετάστηκαν τυχαία εσωτερικά και σε εξωτερικούς χώρους χρησιμοποιώντας το QUANTA Lite TM SLA ELISA. Οι ηλικίες των ασθενών ποίκιλαν από 13 έως 82 με μια αναλογία γυναίκα άνδρα περίπου 3.5. Τα αποτελέσματα που αποκτήθηκαν από τους διάφορους καταλόγους συνδυάστηκαν και συνοψίζονται παρακάτω: 5

Κλινική Ομάδα n= SLA+ %SLA+ ΑΗ-1 289 34 11.8 ΑΗ-1\PBC (primary biliary cirrhosis) overlap 20 11 55 ΑΗ-2 3 0 0 Cryptogenic Hepatitis 9 4 44.4 Autoimmune cholangitis 8 1 12.5 ΑΗ-1\PSC 4 1 25 Drug-induced ΑΗ 2 0 0 Primary biliary cirrhosis 15 0 0 Primary Sclerosing Cholangitis (PSC) 7 0 0 PBC\PSC 19 0 0 Other non-viral liver diseases 10 0 0 Hepatitis B virus (B, C, or D) 8 0 0 Hepatitis C virus 37 0 0 Hepatitis C\ D 1 0 0 Ευαισθησία για το ΑΗ-1 αποκλειστικά: 34/289=11.8% Ευαισθησία για το ΑΗ-1 και το ΑΗ-1 ποικίλα (υπερεπιβάσεις): 51/330=15.4% Ακρίβεια (όχι ΑΙΗ ηπατική ασθένεια): 73/73=100% Ακρίβεια (κανονική υγιής επιπρόσθετη μη-αιη ηπατική ασθένεια): 204/204=100% Μελέτη Aλληλεπίδρασης Ο ορός από 70 ασθενείς με διάφορα αντισώματα από αυτοανοσες ή μολυσματικές ασθένειες εξετάστηκαν για αντίδραση αλληλεπίδρασης με το QUANTA Lite TM SLA ELISA. Οι ομάδες του ορού που εξετάστηκαν και οι αριθμοί του καθενός ήταν τα εξής: Human Herpes virus 6 (10), Rickettsia (6), Cytomegalovirus (10), Glomerular basement membrane (3), Anti-nuclear antibody (3), systemic lupus erythematosus (3), mitochondria (3), gastric parietal cell (3), LKM-1 (3), cytokeratin 8 or 18 (26). Κανένα δείγμα δεν ερμηνεύτηκε ως θετικό για τα αντισώματα του SLA. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η εκτέλεση της ενδο-ανάλυσης για το QUANTA Lite TM SLA ELISA εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία 6 δειγμάτων 7 φορές το καθένα συνολικά. Τα αποτελέσματα που συνοψίζονται παρακάτω. Εντός της δοκιμασίας του QUANTA Lite TM SLA ELISA Δείγμα Α Δείγμα Β Δείγμα C Δείγμα D Δείγμα Ε Δείγμα F Μέσες Μονάδες 72.6 46.2 27.6 13.5 9.7 2.0 SD 1.4 1.9 1.4 0.4 0.2 0.1 CV% 1.9 4.1 5.2 2.8 2.2 7.2 Η ποικιλία της μεσο-ανάλυσης αξιολογήθηκε με την εξέταση, σε αντίγραφα, ενός καταλόγου από 5 δείγματα και των kit controls δύο φορές καθημερινά για 3 ημέρες. Μια περίληψη των αποτελεσμάτων φαίνεται παρακάτω: Μεταξύ των δοκιμασιών για το QUANTA Lite TM SLA ELISA Δείγμα Α Δείγμα Β Δείγμα C Δείγμα D Δείγμα Ε Μέσες Μονάδες 78.5 48.5 29.0 13.6 9.5 SD 1.8 1.1 0.9 0.5 0.4 CV% 1.9 4.1 5.2 2.8 2.2 Βιβλιογραφία 1. Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1996;334(14):897-903. 2. Krawitt EL. Can you recognize autoimmune hepatitis? Postgrad Med. 1998;104(2):145-149, 152. 3. Alvarez F, Berg PA, Bianchi FB, et al. International Autoimmune Hepatitis Group Report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(5):929-938. 4. Obermayer-Straub P, Strassburg CP, Manns MP. Autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;32(1 Suppl):181-197. 5. Manns MP, Strassburg CP. Autoimmune hepatitis: clinical challenges. Gastroenterology. 2001;120(6):1502-1517. 6. Czaja AJ, Homburger HA. Autoantibodies in liver disease. Gastroenterology. 2001;120(1):239-249. 7. Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med. 1995 Oct 12;333(15):1004-1005. 8. Kanzler S, Weidemann C, Gerken G, Lohr HF, Galle PR, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Clinical significance of autoantibodies to soluble liver antigen in autoimmune hepatitis. J Hepatol. 1999;31(4):635-640. 9. McFarlane IG. The relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune hepatitis. Gut. 1998;42:599-602. 10. Ballot E, Homberg JC, Johanet C. Antibodies to soluble liver antigen: an additional marker in type 1 auto-immune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):208-215. 11. Lapierre P, Hajoui O, Homberg JC, Alvarez F. Formiminotransferase cyclodeaminase is an organspecific autoantigen recognized by sera of patients with autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 6

1999 Mar;116(3):643-649. 12. Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Staritz M, Meyer zum Buschenfelde KH. Characterization of a new subgroup of autoimmune chronic active hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet. 1987;1:292-294. 13. Stechemesser E, Klein R, Berg PA. Characterization and clinical relevance of liver-pancreas antibodies in autoimmune hepatitis. Hepatology. 1993;18(1):1-9. 14. Wies I, Brunner S, Henninger J, Herkel J, Kanzler S, Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW. Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis. Lancet. 2000 29;355(9214):1510-1515. 15. Costa M, Rodriguez-Sanchez JL, Czaja AJ, Gelpi C. Isolation and characterization of cdna encoding the antigenic protein of the human trnp(ser)sec complex recognized by autoantibodies from patients with type-1 autoimmune hepatitis. Clin Exp Immunol. 2000;121(2):364-374. 16. Wachter B, Kyriatsoulis A, Lohse AW, Gerken G, Meyer zum Buschenfelde KH, Manns MP. Characterization of liver cytokeratin as a major target antigen of anti-sla antibodies. J Hepatol. 1990;11(2):232-239. 17. Wesierska-Gadek J, Grimm R, Hitchman E, Penner E. Members of the glutathione S-transferase gene family are antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998 Feb;114(2):329-335. 18. Klein R, Berg PA. Glutathione S-transferase as a major autoantigen in anti-sla-positive autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 1998;116(4):1015-1016. 19. Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen: specific marker of autoimmune hepatitis. J Hepatol. 2000;33(2):326-328. 20. Czaja AJ, Carpenter HA, Manns MP. Antibodies to soluble liver antigen, P450IID6, and mitochondrial complexes in chronic hepatitis. Gastroenterology. 1993;105(5):1522-1528. 21. Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H, Manns MP. Epitope mapping of cytochrome P4502D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alphainterferon treatment. J. Hepatol. 1999;30(3):366-375. 22. Czaja AJ, Donaldson PT, Lohse AW. Antibodies to soluble liver antigen/liver pancreas and HLA risk factors for type 1 autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol. 2002;97:413-419. 23. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). 24. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1991. Internal quality control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol.11(6). 25. Nishioka M, Morshed SA, Parveen S, Kono K, Matsuoka H, Manns MP. Antibodies to P450IID6, SLA, PDH-E2 and BCKD-E2 in Japanese patients with chronic hepatitis. J Gastroenterol Hepatol. 1997;12(12):862-868. 26. Boberg KM, Aadland E, Jahnsen J, Raknerud N, Stiris M, Bell H. Incidence and prevalence of primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, and autoimmune hepatitis in a Norwegian population. Scand J Gastroenterol. 1998;33(1):99-103. 27. Jacobson DL, Gange SJ, Rose NR, Graham NM. Epidemiology and estimated population burden of selected autoimmune diseases in the United States. Clin Immunol Immunopathol. 1997; 84(3):223-243. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628775 June 2005 Revision GRC3 7