ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1. ΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΣΤΗ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΑ ΚΑΙ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ Ιωάννης Ρούσσης

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1 ΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΣΤΗ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΑ ΚΑΙ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ Ιωάννης Ρούσσης Ενζυμικές και Μικροβιακές Δράσεις στη Γαλακτοκομία Οκτώβριος 2016 Προσδιορισμός πηκτικής δύναμης της πυτιάς Πυτιά είναι το προϊόν που λαμβάνεται με εκχύλιση, με διάλυμα NaCl, από το τέταρτο στομάχι, το λεγόμενο ήνυστρο, μη απογαλακτισμένων νεαρών μηρυκαστικών, κυρίως μοσχαριών αλλά και αρνιών και κατσικιών. Χρησιμοποιείται στην πήξη του γάλακτος προς τυρί. Η πυτιά περιέχει πρωτεολυτικά ένζυμα, κυρίως χυμοζίνη, δευτερευόντως πεψίνη και άλλα. Επίσης, περιέχει και άλλα ένζυμα όπως λιπάση, η οποία συμβάλλει στην λιπόλυση κατά την ωρίμανση των τυριών και προσδίδει πικάντικη γεύση. Για να χρησιμοποιηθεί η πυτιά προηγείται οξίνηση για να ενεργοποιηθεί το ένζυμο χυμοζίνη, στο οποίο οφείλεται η πηκτική δύναμη. Τα άλλα προϊόντα από άλλες πηγές που χρησιμοποιούνται στην πήξη του γάλακτος χαρακτηρίζονται ως υποκατάστατα πυτιάς η απλά ένζυμα πήξης. Κατά την ενζυμική φάση της πήξης του γάλακτος η χυμοζίνη υδρολύει τη καζεΐνη στο δεσμό φαινυλαλανίνης (105)-μεθειονίνης (106). Παράγονται η παρα-κ-καζείνη που είναι υδρόφοβη, και ένα υδρόφιλο μακροπεπτίδιο, γνωστό ως γλυκομακροπεπτίδιο, που μεταφέρεται στο τυρόγαλα. Με τη υδρόλυση της κ- καζείνης αποσταθεροποιείται το μικκύλιο των καζεινών, καθόσον το σταθεροποιεί η κ-καζείνη. Κατά τη δεύτερη φάση της πήξης του γάλακτος συμβαίνει κροκίδωση των καζεινών παρουσία ιόντων ασβεστίου σε κατάλληλη θερμοκρασία. Στη συνέχεια συμβαίνει η συναίρεση του πήγματος, δηλαδή η συρρίκνωσή του με αποβολή νερού και υδατοδιαλυτών συστατικών. Η πήξη βοηθείται από την πτώση του ph, που συμβαίνει με τη δράση της καλλιέργειας εκκίνησης, δηλαδή την ζύμωση της λακτόζης από γαλακτικά βακτήρια

και την παραγωγή γαλακτικού οξέος. Επίσης, στην πορεία παρασκευής του τυριού, η χυμοζίνη υδρολύει την as1-καζεΐνη στο δεσμό φαινυλαλανίνης 23-φαινυλαλανίνης24 και προκύπτει η as1-ι-καζείνη και το πεπτίδιο as1-f l-23. Η as1-ι-καζείνη συμβάλλει στην υφή του τυριού, και το πεπτίδιο asl-f l-23 με περαιτέρω διάσπασή του συμβάλλει στο άρωμα-γεύση του τυριού. Η ποιότητα της πυτιάς εξαρτάται από την αναλογία χυμοζίνης/πεψίνης, και την πηκτική της δύναμη. Πηκτική δύναμη της πυτιάς είναι η ικανότητά της για πήξη του γάλακτος. Συγκεκριμένα, είναι τα μέρη γάλακτος που πήζει ένα μέρος πυτιάς σε χρόνο 40 min στους 35 C. Εκφράζεται συνήθως ως κλάσμα με αριθμητή τη μονάδα και παρανομαστή τα μέρη του γάλακτος που μπορεί να πήξει ένα μέρος πυτιάς στις παραπάνω συνθήκες. Οι υγρές πυτιές που κυκλοφορούν στο εμπόριο έχουν πηκτική δύναμη της τάξης 1 : 15.000-20.000, ενώ η πυτιά σε σκόνη της τάξης 1 : 100.000. Αποτίμηση πρωτεόλυσης σε γάλα Στο γάλα, και σε προϊόντα του όπως τα τυριά, συμβαίνει πρωτεόλυση και λιπόλυση. Η πρωτεόλυση συμβαίνει με δράση της φυσικής πρωτεινάσης του γάλακτος (της πλασμίνης), εξωκυτταρικών πρωτεινασών ψυχροτρόφων βακτηρίων και άλλων μικροβιακών πρωτεινασών. Κατά την πήξη και ωρίμανση των τυριών υπάρχει, κυρίως, η δράση πρωτεολυτικών ενζύμων της πυτιάς, των γαλακτικών βακτηρίων καλλιεργειών που χρησιμοποιούνται και άλλων μικροοργανισμών, κυρίως γαλακτικών βακτηρίων της φυσικής χλωρίδας. Πρωτεόλυση: προσδιορισμός πεπτιδίων διαλυτών σε τριχλωροξικό οξύ. Η αποτίμηση της πρωτεόλυσης μπορεί να γίνει με προσδιορισμό των πεπτιδίων και αμινοξέων που παράγονται με διάσπαση των πρωτεϊνών. Ο προσδιορισμός πεπτιδίων στο γάλα μπορεί να γίνει μετά από καταβύθιση των πρωτεϊνών με τριχλωροξικό οξύ. Χρησιμοποιείται 2 % είτε 12 % τριχλωροξικό οξύ. Με 2 % λαμβάνεται πολύ περισσότερο διαλυτό άζωτο από ότι με 12 %. Με 12 % θεωρείται ότι καταβυθίζονται οι πρωτεΐνες, και το διαλυτό καλείται μη πρωτεινικό άζωτο. Επίσης, χρησιμοποιείται το φωσφοβολφραμικό οξύ 5 %. Θεωρείται ότι στο διαλυτό υπάρχουν αμινοξέα και πεπτίδια με μοριακό βάρος μικρότερο

από 600. Με βάση τα παραπάνω, με προσδιορισμό των διαλυτών πεπτιδίων μπορεί να γίνει αποτίμηση του βαθμού πρωτεόλυσης. Ο προσδιορισμός тων πρωτεϊνών και πεπτιδίων μπορεί να γίνει με τη μέθοδο Bradford. Η μέθοδος στηρίζεται στο ότι το μέγιστο απορρόφησης όξινου διαλύματος της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 μετατοπίζεται από τα 465 nm στα 595 nm με σύνδεσή της με διαλυμένες πρωτεΐνες. Η χρωστική χρωστική συνδέεται κυρίως με βασικά αρωματικά αμινοξέα και ιδιαίτερα την αργινίνη. Επίδραση χλωριούχου νατρίου και θερμικής κατεργασίας στην ανάπτυξη γαλακτικών βακτηρίων γαλακτοκομίας Στη γαλακτοκομία χρησιμοποιούνται γαλακτικά βακτήρια, όπως κυρίως στην παρασκευή τυριών και γιαουρτιού. Σε άλλα τρόφιμα χρησιμοποιούνται ζυμομύκητες, όπως στην παρασκευή ψωμιού. Στα τρόφιμα υπάρχουν αλλά και προστίθενται διάφορα αντιμικροβιακά για την αναστολή και τον έλεγχο διάφορων μικροοργανισμών. Επίσης, χρησιμοποιούνται διάφορες κατεργασίες για αναστολή και καταστροφή μικροοργανισμών, όπως οι θερμικές κατεργασίες. Τα αντιμικροβιακά είτε υπάρχουν φυσικά στα τρόφιμα είτε προστίθενται. Τα προστιθέμενα (πρόσθετα) είτε έχουν φυσική προέλευση είτε είναι συνθετικά. Μεταξύ των αντιμικροβιακών είναι το χλωριούχο νάτριο (αλάτι) που χρησιμοποιείται στην παρασκευή ψωμιού, τυριών και άλλων τροφίμων. Επίσης, χρησιμοποιούνται ο θειώδης ανυδρίτης, βενζοικά, σορβικά και προπιονικά, νιτρώδη/νιτρικά, σάκχαρα, γαλακτικό και οξικό οξύ και άλλα. Επίσης, φαινολικά συστατικά, πεπτίδια και άλλα συστατικά τροφίμων έχουν αντιμικροβιακή δράση. Διάφορες θερμικές κατεργασίες εφαρμόζονται σε τρόφιμα. Τέτοιες είναι το θέρμισμα, η παστερίωση, το ζεμάτισμα, η υψηλή παστερίωση, η υπερυψηλή θέρμανση, η αποστείρωση (κονσερβοποίηση). Η αποτίμηση της αποτελεσματικότητας αντιμικροβιακών παραγόντων μπορεί να γίνει με μέτρηση της ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού των μικροοργανισμών είτε με μέτρηση μεταβολικής απόκρισης, όπως παραγωγή αερίου (όπως διοξείδιο του άνθρακα) και οξέος (όπως γαλακτικό οξύ).

Μικροβιακές και Ενζυμικές Δράσεις στην Οινολογία Ζυμομύκητες οινοποίησης Χρήση ενεργών αφυδατωμένοι ζυμομυκήτων Οι ζυμομύκητες παρουσία οξυγόνου αναπνέουν και πολλαπλασιάζονται, ενώ απουσία οξυγόνου ζυμώνουν ζάχαρα με παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα και αλκοόλης και ο πολλαπλασιασμός τους είναι περιορισμένος. Παραδοσιακά η ζύμωση του γλεύκους γινόταν από την μικροχλωρίδα του περιβάλλοντος. Σήμερα χρησιμοποιούνται σε μεγάλο βαθμό ενεργοί αφυδατωμένοι ζυμομύκητες που επιλέγονται για ομαλή οινοποίηση και παραγωγή καλής ποιότητας οίνου. Η χρήση καλλιέργειας εκκίνησης (starters) μειώνει τον κίνδυνο επιμόλυνσης από άλλους μικροοργανισμούς που παράγουν πτητική οξύτητα, και τον κίνδυνο να σταματήσει η ζύμωση από έλλειμμα ζυμομυκήτων στο γλεύκος. Χαρακτηριστικά που εξετάζονται για την επιλογή των στελεχών ζυμομυκήτων είναι η γρήγορη εκκίνηση, ταχύτητα και ολοκλήρωση της ζύμωσης, η παραγωγή αλκοόλης και η απόδοση σακχάρων/αλκοόλη, η αντίσταση στην αλκοόλη, η μη ταραχώδης ζύμωση, οι θρεπτικές απαιτήσεις, η προσαρμογή στη θερμοκρασία οινοποίησης, ο παράγοντας killer, η ελάχιστη παραγωγή πτητικής οξύτητας, SO 2, ακεταλδεύδης, H 2 S και αφρού. Επίσης, η παραγωγή ζυμωτικών αρωμάτων, η εκχύλιση χρώματος, η μερική μείωση της οξύτητα, η συμβολή στην ισορροπία του οίνου και ο σεβασμός και αξιοποίηση της πρώτης ύλης. Η αφυδάτωση των ζυμομυκήτων και η συσκευασία σε κενό διασφαλίζουν ζωτικότητα μέχρι τρία χρόνια. Οι αφυδατωμένοι ζυμομύκητες περιέχουν 2 έως 3 χ 10 10 κύτταρά ανά gr, τα οποία επανενεργοποιούνται άμεσα και διατηρούν πλήρως τα αρχικά τους χαρακτηριστικά. Μετά την ενυδάτωσή τους οι ζυμομύκητες μπορούν να ξεκινήσουν αμέσως την ζύμωση. Έτσι, αποφεύγεται ο κίνδυνος επιμόλυνσης και η πιθανότητα να σταματήσει η ζύμωση. Προσθήκη 20 g ανά 100 L προσφέρουν 4 έως 6 χ 10 10 κύτταρα ανά ml. Σημειώνεται ότι τα κύτταρα στη φάση της ζύμωσης είναι 60 έως 100 χ 10 10 ανά ml. Επίσης, ότι οι ζυμομύκητες της καλλιέργειας εκκίνησης πρέπει να είναι 10 φορές παραπάνω από τους ενδογενείς ζυμομύκητες. Η ενεργοποίηση των αφυδατωμένων ζυμομυκήτων, πριν την προσθήκη στο γλεύκος, γίνεται είτε σε αραιωμένο γλεύκος είτε σε ζαχαρούχο διάλυμα.

Μετά την ενεργοποίησή του ο ζυμομύκητας προστίθεται στο γλεύκος για επιτέλεση της ζύμωσης. Αφομοιώσιμο άζωτο Σημαντικός παράγοντας για επιτυχή ζύμωση είναι το σωστό επίπεδο στο γλεύκος αζώτου που είναι αφομοιώσιμο από το ζυμομύκητα. Ο ζυμομύκητας οινοποίησης χρειάζεται επαρκή πηγή αζώτου για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό του, και κατά συνέπεια για την επιτέλεση της ζύμωσης. Η έλλειψη αζώτου μπορεί να οδηγήσει σε σταμάτημα της ζύμωσης. Επίσης, λόγω χρησιμοποίησης θειούχων αμινοξέων μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό υδροθείου, που έχει αρνητική επίδραση στην ποιότητα του οίνου. Από την άλλη πλευρά, υπερβολικά επίπεδα αζώτου μπορεί να οδηγήσουν σε αλλαγές στον χαρακτήρα του αρώματος του οίνου. Επίσης, μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό καρβαμιδικού αιθυλεστέρα, που είναι επικίνδυνος για την υγεία. Τα επιθυμητά επίπεδα αζώτου που χρειάζονται για επιτέλεση της ζύμωσης κυμαίνονται στην περιοχή 100-200 mg/l. Το αφομοιώσιμο άζωτο από τους ζυμομύκητες είναι το αμμωνιακό άζωτο (ΝΗ 3 / ΝΗ 4 + ) και το άζωτο α-αμινοξέων (FAN). Οι μέθοδοι που εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό του αφομοιώσιμου αζώτου είναι διάφορες. Με τη μέθοδο της φορμόλης προσδιορίζεται και το αμμωνιακό άζωτο και το άζωτο α-αμινοξέων ( ΝΗ 4 + + FAN). Με την προσθήκη διαλύματος φορμαλδεύδης απελευθερώνονται ιόντα υδρογόνου και μειώνεται το ph. Τα ml διαλύματος NaOH που απαιτούνται για επαναφορά του ph στο 8,0 είναι ανάλογα του αφομοιώσιμου αζώτου. Καλλιέργεια ζυμομυκήτων Οι ζυμομύκητες έχουν λιγότερες θρεπτικές απαιτήσεις από τα βακτήρια. Το πιο διαδεδομένο θρεπτικό υλικό είναι το YPD (Yeast Peptone Dextrose) που περιέχει πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη 20, 10 και 20 g/l αντίστοιχα.

Γίνεται καλλιέργεια ζυμομύκητα Saccharomyces cerevesiae, αφυδατωμένος που ενεργοποιήθηκε. Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται θρεπτικός ζωμός YPD. Εμβολιάζεται ο ζωμός με το αιώρημα του ζυμομύκητα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Επιπλέον, προστίθεται ο θειώδης ανυδρίτης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Σημειώνεται ότι το μεταμπισουλφίτ αποδίδει περίπου 50 % θειώδη ανυδρίτη. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη ζυμομύκητα είτε θειώδη ανυδρίτη. Στους δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετείται σωληνάκι Durcham, και γίνεται επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham). Πηκτινολυτικά ένζυμα Τα κύρια ένζυμα που χρησιμοποιούνται στη οινοποίηση είναι τα πηκτινολυτικά ένζυμα. Τα πηκτινολυτικά ένζυμα των σταφυλιών δεν είναι δραστικά στις συνθήκες οινοποίησης (ph και θειώδης ανυδρίτης). Μυκητιακά πηκτινολυτικά ένζυμα, όμως, είναι ανθεκτικά στις συνθήκες οινοποίησης. Έτσι, χρησιμοποιούνται ένζυμα από Aspergillus niger και Trichoderma. Η χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων είναι χρήσιμη α) για τη διαύγαση. Αυτό καθόσον οι πηκτίνες δρουν ως προστατευτικά κολλοειδή, και β) για εκχύλιση περισσότερου χυμού, και εκχύλιση συστατικών αρώματος και χρώματος.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Ενζυμικές και Μικροβιακές Δράσεις στη Γαλακτοκομία Προσδιορισμός πηκτικής δύναμης Για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύναμης η ποσότητα της πυτιάς πρέπει να είναι τόση ώστε να επιφέρει την πήξη σε 3 μέχρι 6 min. Συνήθως για τη μέτρηση της πηκτικής δύναμης χρησιμοποιούνται 100 ml γάλακτος και 1 ml πυτιάς. Η πήξη γίνεται στους 35 C. Μετράται ο χρόνος πήξης σε sec, και η πηκτική δύναμη υπολογίζεται από τη σχέση, Πηκτική Δύναμη = (100 χ 2.400): χρόνος πήξης σε sec. Χρησιμοποιείται άπαχο γάλα που περιέχει 0,01 Μ χλωριούχο ασβέστιο. 100 ml τοποθετούνται σε ποτήρι ζέσεως και γίνεται θερμοστάτηση σε υδατόλουτρο στους 35 C. Προστίθενται με ακρίβεια 1-2 ml διαλύματος πυτιάς. Η υγρή πυτιά προστίθεται ως έχει, και η σκόνη διαλύεται σε νερό σε αναλογία 1: 10000 είτε μεγαλύτερη, ανάλογα με την πηκτική δύναμη που αναμένεται να έχει. Με την προσθήκη της πυτιάς αρχίζει η χρονομέτρηση. Γίνεται ήρεμη ανάδευση για να μη σχηματιστεί αφρός και αφήνεται σε ηρεμία για να πήξει. Ο έλεγχος της πήξης γίνεται με σπάτουλα. Εμβαπτίζεται η σπάτουλα κάθετα και ανασύρεται συνεχώς, και παρατηρείται τυχόν εμφάνιση άσπρων κόκκων πάνω σε αυτήν, που είναι ένδειξη πήξης. Μετράται ο χρόνος πήξης. Η όλη διαδικασία επαναλαμβάνεται για να υπολογιστεί ο μέσος όρος του χρόνου πήξης. Η πηκτική δύναμη υπολογίζεται από τη σχέση: Πηκτική Δύναμη = (ποσότητα γάλακτος σε ml) χ 2400 / (Ποσότητα πυτιάς σε ml) χ (χρόνος πήξης σε sec). Αποτίμηση πρωτεόλυσης Χρησιμοποιούνται τα διηθήματα που λαμβάνονται μετά τη δράση της πυτιάς, στους διαφορετικούς χρόνους. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθούν τα παραπάνω διηθήματα, μετά από καταβύθιση πολυπεπτιδίων είτε και μικρότερων πεπτιδίων. Αυτό γίνεται με προσθήκη 2 ml τριχλωροξικού οξέος 24 % είτε 4 % (είτε φωσφοβολφραμικό οξύ 10 %) σε 2 ml διηθήματος. Μετά από παραμονή για 30 min, γίνεται

διήθηση με πτυχωτό ηθμό. Στα δείγματα γίνεται προσδιορισμός πεπτιδίων με τη μέθοδο Bradford. Σε 2,5 ml αντιδραστηρίου В (1:4) προστίθενται 0,5 ml διηθήματος. Μετά από ανάδευση και παραμονή για 5 min, γίνεται μέτρηση στα 595 nm. Επίδραση χλωριούχου νατρίου και θερμικής κατεργασίας στην ανάπτυξη γαλακτικών βακτηρίων γαλακτοκομίας Ως καλλιέργεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν στελέχη γαλακτικών βακτηρίων. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί φρέσκο γιαούρτι, που συνήθως παρασκευάζεται και κατά συνέπεια συνιστά μικτή καλλιέργεια γαλακτικών βακτηρίων (στο εργαστήριο πραγματοποιείται αυτή η εφαρμογή). Ως θρεπτικό υλικό χρησιμοποιείται ζωμός MRS, που περιέχει πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, εκχύλισμα κρέατος, γλυκόζη, άλατα. Παρασκευάζεται αιώρημα της καλλιέργειας, στους δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούνται σωληνάκια Durcham (ανάστροφα). Προστίθεται αντιμικροβιακό, το χλωριούχο νάτριο σε συγκεντρώσεις 1, 2 και 4 % w/v. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη καλλιέργειας είτε αλατιού. Για τη θερμική κατεργασία, το υγρό θρεπτικό υλικό, αφού ενοφθαλμιστεί, κατεργάζεται στους 60 C και στους 80 C για 5, 15 και 30 min. Γίνεται διόρθωση (αφαίρεση) του χρόνου που απαιτείται για την άνοδο της θερμοκρασίας. Χρησιμοποιούνται δύο τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη καλλιέργειας είτε χωρίς θερμική κατεργασία. Ακολουθεί η επώαση, που γίνεται στους περίπου 30-35 o C. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham), ενώ παρατηρείται και η αλλαγή χρώματος από την παραγωγή γαλακτικού οξέος.

Μικροβιακές και Ενζυμικές Δράσεις στην Οινολογία Χρήση ενεργών αφυδατωμένων ζυμομυκήτων Σε 5 % διάλυμα ζάχαρης σε πόσιμο νερό 30-35 C προστίθενται 100 g/l αφυδατωμένων ζυμομυκήτων. Ακολουθεί ήπια ανάδευση για λήψη αιωρήματος του ζυμομύκητα. Το αιώρημα αφήνεται 20 minutes για ενυδάτωση των ζυμομυκήτων. Προκύπτει πλούσιος αφρός με γλυκιά οσμή, που δεικνύει την ενυδάτωση του ζυμομύκητα. Χρησιμοποιείται 5 % διάλυμα ζάχαρης, διότι σε αυτή τη συγκέντρωση οι ζυμομύκητες ενυδατώνονται και πολλαπλασιάζονται. Εναλλακτικά χρησιμοποιείται αραιωμένο γλεύκος (3 όγκοι γλεύκος και 7 όγκοι πόσιμο νερό). Στο μη αραιωμένο γλεύκος η συγκέντρωση των ζαχάρων είναι πολύ υψηλή και εμποδίζει τη σωστή ενυδάτωση. Αντίθετα, στο καθαρό νερό τα κύτταρα προσροφούν πολύ νερό και διαρρηγνύονται. Οι ενυδατωμένοι ζυμομύκητες προστίθενται στο γλεύκος με διασφάλιση καλής διασπορά τους. Δόση 20 g/ 100 L θεωρείται άριστη. Κατά την προσθήκη των ζυμομυκήτων πρέπει να αποφεύγονται, αλλαγές θερμοκρασίας πάνω από 5/7 C. Έτσι, μετά την ενυδάτωση των ζυμομυκήτων γίνεται ανάμιξη με ποσότητα γλεύκος για μείωση της θερμοκρασίας πριν την προσθήκη στο προς ζύμωση γλεύκος. Από την αρχή της ζύμωσης γίνεται προσθήκη αζωτούχων (αμμωνιακών είτε οργανικού αζώτου) και επίσης αδρανών ζυμομυκήτων (εμπλουτισμός σε βιταμίνες, αμινοξέα, λιπαρά οξέα, στερόλες). Ακόμη, εφαρμόζεται ήπιος αερισμός 36 έως 48 ώρες από την εκκίνηση της ζύμωσης που ευνοεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ώστε να υπάρχει μεγάλος πληθυσμός κυττάρων στο τέλος της ζύμωσης χωρίς κίνδυνο οξείδωσης. Η πορεία της ζύμωσης ελέγχεται με μέτρηση της θερμοκρασίας και της μείωσης της πυκνότητας του γλεύκους. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Ο ζυμομύκητας που ενεργοποιήθηκε φέρεται σε πλάκα μικροσκοπίου και γίνεται άμεση παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Γίνεται παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων, η εκβλάστηση και τα ασκοσπόρια.

Με τη μικροσκοπική παρατήρηση γίνεται και διάκριση μεταξύ γενών ζυμομυκήτων. Οι ζυμομύκητες Sacharomyces cereviseae διακρίνονται εύκολα από αυτούς του γένους Kloeckera. Στο Σχήμα παρατίθενται φωτογραφίες 12 στελεχών ζυμομυκήτων που απομονώθηκαν από αυθόρμητες ζυμώσεις γλεύκους (συλλογή στελεχών Ι. Ρούσση). Τα 1, 2, 3, 4, 5, 6 και 12 είναι Sacharomyces cereviseae, ενώ τα 7, 8, 9, 10, 11 είναι Kloeckera apiculata. Τούτο είναι εύκολα διακριτό από τη μορφολογία των κυττάρων. Στα κύτταρα του στελέχους 12 διακρίνονται, επίσης, τα ασκοσπόρια.

Προσθήκη ζυμομύκητα στο γλεύκος Κατ αρχή, γίνεται προσδιορισμός του αφομοιώσιμου αζώτου στο γλεύκος. Έάν δεν είναι ικανοποιητική γίνεται προσθήκη αμμωνιακών αλάτων, όπως διαμμωνιακού φωσφορικού άλατος. Στη συνέχεια, γίνεται η προσθήκη του ζυμομύκητα στο γλεύκος για την επιτέλεση της ζύμωσης. Η πορεία προσδιορισμού του αφομοιώσιμου αζώτου είναι η παρακάτω: Πορεία 1 Ποσότητα γλεύκους διηθείται με διηθητικό χαρτί είτε με σύριγγα 5-μm, είτε γίνεται φυγοκέντρηση του δείγματος. Ακολουθεί αραίωση του δείγματος, συνήθως 10 ml διηθημένου γλεύκους στα 25 ml. Τοποθετούνται 10 ml αραιωμένου γλεύκους και γίνεται ρύθμιση τουph του στο 8,0 με 0,05 Ν NaOH. Ακολουθεί προσθήκη 2 ml διαλύματος φορμαλδεύδης που έχει πρόσφατα έχει ρυθμιστεί στο ph 8,0. Στη συνέχεια, γίνεται ρύθμιση του ph του διαλύματος στο 8,0 με προσθήκη 0,05 Ν NaOH. Ο υπολογισμός του αφομοιώσιμου αζώτου θα γίνει από τη σχέση: YAN, mg N/L = (ml 0,05 N NaOH) x 175 Πορεία 2 Σε ποτήρι ζέσεως τοποθετούνται 100 ml γλεύκους και γίνεται ρύθμιση του ph στο 8,0 με 1 Ν NaOH, με τη χρήση πεχαμέτρου. Γίνεται συμπλήρωση με απιονισμένο νερό στα 200 ml με καλή ανάμιξη. Ακολουθεί διήθηση. Λαμβάνονται 100 ml διηθήματος σε ποτήρι ζέσεως και γίνεται ξανά ρύθμιση του ph στο 8,0 με 1 Ν NaOH, εάν χρειάζεται. Ακολούθως, προστίθενται 25 ml διαλύματος φορμαλδεύδης, που πρόσφατα είχε ρυθμιστεί στο ph 8,0. Το μίγμα αναδεύεται και γίνεται ρύθμιση του ph στο 8,0 με 0,1 Ν NaOH. Η συγκέντρωση αζώτου mg/l υπολογίζεται όπως παρακάτω: ml NaOH x 0,1 N NaOH x 14 x συντελεστή αραίωσης x 1000 / όγκο δείγματος

Στο εργαστήριο θα γίνει προσδιορισμός αφομοιώσιμου αζώτου, με ογκομέτρηση με δείκτη ερυθρό της κρεσόλης, που αλλάζει χρώμα από κίτρινο σε κόκκινο ιώδες σε ph 7,2-8,8. Σε ποτήρι ζέσεως τοποθετούνται 50 ml γλεύκους και γίνεται ρύθμιση στο ph 8,0 με 1 Ν NaOH και δείκτη ερυθρό της κρεσόλης. Γίνεται συμπλήρωση στα 100 ml με απιονισμένο νερό. Ακολουθεί διήθηση. Λαμβάνονται 50 ml διηθήματος σε ποτήρι ζέσεως και γίνεται πάλι ρύθμιση στο ph 8,0, εάν χρειάζεται, με 1 Ν NaOH και δείκτη ερυθρό της κρεσόλης. Ακολούθως, προστίθενται 12,5 ml διαλύματος φορμαλδεύδης, που πρόσφατα είχε ρυθμιστεί στο ph 8,0. Το μίγμα αναδεύεται και γίνεται ρύθμιση του ph στο 8,0 με 0,1 Ν NaOH και ερυθρό της κρεσόλης. Επίδραση θειώδη ανυδρίτη στην ανάπτυξη ζυμομύκητα Ως καλλιέργεια χρησιμοποιείται ζυμομύκητας Saccharomyces cerevisae (μαγιά κρασιού). Ως υπόστρωμα χρησιμοποιείται θρεπτικός ζωμός (πεπτόνη, εκχύλισμα ζύμης, γλυκόζη, 20, 10 και 20 g/l, αντίστοιχα), ενώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί και μηλοχυμός είτε πορτοκαλοχυμός. Παρασκευάζεται αιώρημα της μαγιάς, και εμβολιάζεται ο ζωμός χυμός (ή ο χυμός) με το αιώρημα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις σε δοκιμαστικούς σωλήνες. Προστίθενται θειώδης ανυδρίτης σε συγκεντρώσεις 20, 100, 200 mg/l. Χρησιμοποιούνται και τυφλά, δηλαδή χωρίς προσθήκη μαγιάς είτε συντηρητικού. Τοποθετείται στους δοκιμαστικούς σωλήνες σωληνάκι Durcham ανάστροφα, και γίνεται επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Παρακολουθείται η ανάπτυξη του μικροοργανισμού (θόλωμα) και η παραγωγή αερίου (συλλογή στο σωληνάκι Durcham). Χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων Σε ποσότητα θολού γλεύκους γίνεται προσθήκη πηκτινολυτικών ενζύμων, σε διάφορες συγκεντρώσεις. Ακολουθεί οπτική παρατήρηση του γλεύκους σε διάρκεια ωρών.