Γενετική ΙΙ: Ύλη: 1. igenetics τόμος ΙΙ, κεφάλαια: 15-25 2. Ανασυνδυασμένο DNA. Watson J, κεφάλαια: 3-11 3. Γενετική: από τα γονίδια στα γονιδιώματα-hartwell (κατά περίπτωση και όταν αναφέρεται στην αρχή κάθε παρουσίασης) Επικοινωνία: Email: garinis@imbb.forth.gr Lab website: www.garinislab.gr Γραφείο: Α125 Ανασυνδυασμένο DNA Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2007 1
igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση
Κεφάλαιο 15 (+ κεφάλαιο 7 Hartwell) Μεταλλαγές του DNA, επιδιόρθωση του DNA και μεταθετά στοιχεία Η πρωτεΐνη UvrB, ένα ένζυμο επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίου. 3
Μεταλλαγές και βλάβες του DNA Μεταλλαγές: αλλαγή στη πληροφορία, κληρονομούνται Βλάβες: αλλαγή στη διπλή έλικα, η πληροφορία παραμένει ανέπαφη, δεν κληρονομούνται Σωματικές μεταλλαγές: επηρεάζει μόνο το άτομο στο οποίο εμφανίζονται Μεταλλαγές γαμετικής σειράς: κληρονομούνται επηρεάζοντας και τις επόμενες γενιές Ρυθμός μεταλλαγής: αριθμός μεταλλαγών ανά γονίδιο ανά γενιά Συχνότηητα μεταλλαγής: αριθμός εμφάνισης μίας μεταλλαγής προς τον αριθμό κυττάρων 4
ΕΙΚΟΝΑ 15.1 Συνέπειες των μεταλλαγών στην κωδική περιοχή ενός γονιδίου. Σημειώστε ότι δεν οδηγούν όλες οι μεταλλαγές σε τροποποιημένες πρωτεΐνες (όπως παρουσιάζεται στο γενικευμένο παράδειγμα της εικόνας αυτής) και ότι δε συμβαίνουν όλες οι μεταλλαγές σε κωδικές περιοχές. 5
ΕΙΚΟΝΑ 15.2 Αναπαράσταση ενός διαιρούμενου πληθυσμού E. coli άγριου τύπου που είναι ευπαθής στο φάγο Τ1. Η θεωρία της προσαρμογής και των τυχαίων μεταλλαγών 6
ΕΙΚΟΝΑ 15.3 Είδη μεταλλαγών αντικατάστασης ζεύγους βάσεων. 7
ΕΙΚΟΝΑ 15.3 Είδη μεταλλαγών αντικατάστασης ζεύγους βάσεων. 8
ΕΙΚΟΝΑ 15.4 Μια ανερμηνεύσιμη μεταλλαγή και οι επιπτώσεις της στη μετάφραση. 9
Σημειακές μεταλλαγές: Πρόσθιες μεταλλαγές που μετατρέπουν το γονότυπο αγρίου τύπου σε μεταλλαγμένο Αντίστροφες μεταλλαγές που επαναφέρουν το γονότυπο αγρίου τύπου μερικώς ή πλήρως. -γνήσια αντιστροφή: επαναφέρει το αμινοξύ αγρίου τύπου -μερική αντιστροφή: αντικαθιστά το κωδικόνιο τερματισμού σε κωδικόνιο που αντιστοιχεί σε κάποιο άλλο αμινοξύ (αποκαθιστά πλήρως ή μερικώς τη λειτουργία της πολυπτειτιδικής αλυσίδας) Κατασταλτική μεταλλαγή: γίνεται σε διαφορετική θέση από την αρχική και αποκρύπτει ή αναπληρώνει τις επιπτώσεις της αρχικής μεταλλαγής. -ενδογονιδιακός καταστολέας: η κατασταλτική μεταλλαγή συμβαίνει στο ίδιο γονίδιο -διαγονιδιακός καταστολέας: η κατασταλτική μεταλλαγή συμβαίνει σε διαφορετικό γονίδιο (κατασταλτικό γονίδιο) 10
ΕΙΚΟΝΑ 15.5 Μηχανισμός δράσης μιας κατασταλτικής μεταλλαγής η οποία μεταβάλλει την αλληλουχία ενός γονιδίου trna και λειτουργεί ως διαγονιδιακός καταστολέας, εξαλείφοντας τις συνέπειες μιας ανερμηνεύσιμης μεταλλαγής. Τα γονίδια trna βρίσκονται σε περισσόερα του ενός αντίγραφα = Άρα πάντα θα υπάρχουν φυσιολογικά trna μόρια. 11
Αυθόρμητες και επαγόμενες μεταλλαγές Μεταλλαξιγένεση: η δημιουργία μεταλλαγών Αυθόρμητες μεταλλαγές: προκύπτουν φυσιολογικά (10.000-1.000.000/γονίδιο /γενιά Επαγόμενες μεταλλαγές: συμβαίνουν μετά από έκθεση σε μεταλλαξιγόνο (συχνές) 12
Σφάλματα κατά την αντιγραφή DNA ΒΛΑΒΕΣ ΕΙΚΟΝΑ 15.6 Φυσιολογικό ζευγάρωμα των βά- σεων κατά Watson καιcrick και ζευγάρωμα βάσεων που βρίσκεται σε ασυμφωνία με τους κανόνες συμ- πληρωματικότητας των Watson και Crick. (α) Φυσιολογικό ζευγάρωμα των βάσεων κατά Watson και Crick ανάμεσα στις φυσιολογικές μορφές των Τ και Α, καθώς και των C και G. (β) Ζευγάρωμα βάσεων που παραβιά- ζει τους κανόνες συμπληρωματικό- τητας κατά Watson και Crick ανάμεσα σε φυσιολογικές μορφές πυριμιδινών και σπάνιες ταυτομερικές καταστά- σεις πουρινών. (γ) Ζευγάρωμα βά- σεων που παραβιάζει τους κανόνες συμπληρωματικότητας κατά Watson-Crick ανάμεσα σε σπάνιες ταυτομερι- κές μορφές πυριμιδινών και φυσιολο- γικές μορφές πουρινών. Ταυτομερή: ίδιος χημικός τύπος αλλά διαφορετική συνδεσιμότητα μεταξύ των μορίων της ένωσης. Οι διαφορετικές μορφές βρίσκονατι σε ισορροπία. 13
ΕΙΚΟΝΑ 15.7 Πρόκληση μεταλλαγής λόγω αναντιστοιχίας που οφείλεται σε ταυτομερική μετατροπή κάποιας βάσης στη σπάνια μορφή της. 14
ΕΙΚΟΝΑ 15.8 Αυθόρμητη δημιουργία μεταλλαγών προσθήκης και ελλείμματος λόγω δημιουργίας βρόχων στο DNA κατά την αντιγραφή. 15
ΕΙΚΟΝΑ 15.9 (α) Απαμίνωση της κυτοσίνης προς ουρακίλη. (β) Απαμίνωση της 5-μεθυλοκυτοσίνης (5 m C) προς θυμίνη. Επίσης: Αποπουρίνωση (αφαίρεσης μια αδενίνης ή θυμίνης από το DNA) Σημείωση: Η κυτοσίνη μπορεί να απαμινωθεί αυθόρμητα και να δώσει ουρακίλη. Δηλαδή, C U μεταλλαγές. Μάλλον κατά την εξέλιξη προστέθηκε ένα CH3 στην ουρακίλη μετατρέποντάς την σε θυμίνη στο DNA. Ετσι τα κύταρρα μπορούν να ξεχωρίζουν τη φυσιολογική θυμίνη από την ουρακίλη που υπέστη βλάβη (στο RNA αυτό δεν είναι δυνατό).
ΕΙΚΟΝΑ 15.10 Δημιουργία διμερών θυμίνης λόγω της επίδρασης υπεριώδους ακτινοβολίας. Τα δύο μέρη του διμερούς είναι ομοιοπολικά ενωμένα μεταξύ τους, γεγονός που προκαλεί παραμόρφωση της διπλής έλικας του DNA στη θέση αυτή. 17
ΕΙΚΟΝΑ 15.11 Μεταλλαξιγόνες επιδράσεις του αναλόγου βάσης 5-βρομοουρακίλη (5BU). (α) Στη φυσιολογική της κατάσταση η 5BU ζευγαρώνει με την αδενίνη. 18
ΕΙΚΟΝΑ 15.11 Μεταλλαξιγόνες επιδράσεις του αναλόγου βάσης 5-βρομοουρακίλη (5BU). (γ) Οι δύο πιθανοί μηχανισμοί μεταλλαγής. Η 5BU επάγει μεταλλαγές μετάπτωσης όταν εισάγεται στο DNA σε μια κατάσταση και στη συνέχεια μετατρέπεται στην άλλη κατά τον επόμενο κύκλο αντιγραφής του DNA. 19
ΕΙΚΟΝΑ 15.12 Η δράση τριών παραγόντων τροποποίησης βάσεων. 20
ΕΙΚΟΝΑ 15.12 Η δράση τριών παραγόντων τροποποίησης βάσεων. (β) Η υδροξυλαμίνη (ΝΗ 2 ΟΗ) αντιδρά μόνο με την κυτοσίνη. (γ) O μεθανοσουλφονικός μεθυλεστέρας (MMS, Methylmethane Sulfonate), ένας αλκυλιωτικός παράγοντας, αλκυλιώνει τη γουανίνη. (Σημείωση: dr = δεοξυριβόζη.) 21
ΕΙΚΟΝΑ 15.13 Μεταλλαγές λόγω εισαγωγής παρεμβαλλόμενων παραγόντων. (α) Μεταλλαγή μετατόπισης αναγνωστικού πλαισίου λόγω προσθήκης που προκαλείται από την ένθεση του παρεμβαλλόμενου παράγοντα στην αλυσίδαμήτρα. (β) Μεταλλαγή μετατόπισης αναγνωστικού πλαισίου που προκαλείται από τη δημιουργία ελλείμματος λόγω της ένθεσης του παρεμβαλλόμενου παράγοντα στην αλυσίδα που συντίθεται. Βρομιούχο αιθίδιο! 22
ΕΙΚΟΝΑ 15.14 Δοκιμασία Ames για τον προσδιορισμό της πιθανής μεταλλαξιγόνου δράσης χημικών ουσιών. Μείγμα ηπατικών ενζύμων αρουραίου, ποντικού ή χάμστερ Μεταλλαγμένα στελέχη, αυξοτροφικά ως προς την ιστιδίνη 23
ΕΙΚΟΝΑ 15.15 Τεχνική επίστρωσης αντιγράφων για τον εντοπισμό μεταλλαγμένων στελεχών ενός μικροοργανισμού που σχηματίζει αποικίες. Εντοπισμός μεταλλαγών: 1.Ορατές μεταλλαγές: επηρεάζουν τη μορφολογία ή τη φυσική εμφάνιση ενός οργανισμού 1.Διατροφικές/αυξοτροφικές μεταλλαγές 1.Υπό συνθήκη μεταλλαγές (θερμοευαίσθητες μεταλλαγές) 24
Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί 25
Επιδόρθωση διμερών πυριμιδίνης: φωτολυάση UV 5 3 T - T 3 5 Διμερή πυριμιδινών Cyclobutane Pyrimidine Dimers (CPD) 6-4 PhotoProducts (6-4PP)
Φωτολυάσες: n Ενζυματική φωτοαντίδραση n Αποδιμερισμός σε 1 μόνο βήμα n Ειδικότητα στη βλάβη n Δεν υπάρχουν στα θηλαστικά με πλακούντα
Οχι στα θυλαστικά με πλακούντα: Φωτολυάσες Ορατό φως επιδόρθωση Αποδέσμευση
Διαγονιδιακά ποντίκια για τη CPD-φωτολυάση CPD Photolyase Tasmanian rat kangaroo UV CPDs Non-CPD lesions
Λιγότερο ερύθημα! Λιγότερη υπερπλασία!
Λιγότεροι όγκοι στα διαγονιδικά ποντίκια με CPD φωτολυάση!
Μηχανισμός Εκτομής Βάσεων (ΒER) AP: apurinic/ apyrimidinic site N DNA deoxyribophosphodiesterases (drpases)
Μηχανισμός Εκτομής Νουκλεοτιδίων (NER) ΕΙΚΟΝΑ 15.16 Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (NER) στην περίπτωση διμερών πυριμιδινών και άλλων παραμορφώσεων του DNA που οφείλονται σε βλάβες. Η εικόνα αφορά στο μηχανισμό ΝER στα βακτήρια
Μηχανισμός Εκτομής Νουκλεοτιδίων (NER) Global Genome Transcription-coupled Η εικόνα αφορά στο μηχανισμό ΝER στά θηλαστικά
Global genome nucleotide excision repair (GG-NER)
Global genome nucleotide excision repair ERCC1 XPF (GG-NER) XPA RPA
Global genome nucleotide excision repair (GG-NER) DNA polymerase δ/ε, RFC PCNA and DNA ligase
Transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) CSB RNA RNA polymerase II
Transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) RPA XPG ERCC1/ XPA XPF
Transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) DNA polymerase δ/ε, RFC PCNA and DNA ligase
Μηχανισμός επιδιόρθωσης αταίριαστου ζεύγους Το σύστημα επιδιόρθωσης αταίριαστου ζεύγους αναγνωρίζει σε ποιον κλώνο βρίσκεται το λανθασμένο νουκλεοτίδιο με βάση τη μεθυλίωση σε μια γειτονική αλληλουχία GATC. Αν η αλληλουχία αυτή δεν είναι μεθυλιωμένη, τότε απομακρύνεται τμήμα του κλώνου DNA που περιέχει τη λανθασμένη βάση και συμπληρώνεται με σύνθεση νέου DNA. MutS, H, L: Γονίδια-μεταλλάκτες Οι δύο κλώνοι διακρίνονται λόγω της μεθυλίωσης στην αδενίνη σε γειτονική αλληλουχία (GATC) στην αλυσίδα μήτρα. Ο νέος κλώνος μεθυλιώνεται λίγο αργότερα
Μηχανισμός Επιδιόρθωσης Διπλών Θραυσμάτων DNA
E. Coli: η απόκριση SOS (και η σχέση της με τη διαβλαβική σύνθεση) DNA polymerase V (Pol V)!
Διαβλαβική σύνθεση DNA (translesion DNA synthesis) στα ευκαρυωτικά κύτταρα DNA polymerase η is involved in the DNA repair by translesion synthesis Polymerase δ is the main polymerase involved with nuclear DNA replication Η ίδια η διαδικασία είναι μεταλλαξιγόνος!
ΕΙΚΟΝΑ 15.18 Άτομο που πάσχει από μελαγχρωματική ξηροδερμία. 45
46
ΕΙΚΟΝΑ 47
48
Μεταθετά στοιχεία 49
Μεταθετά στοιχεία στους προκαρυώτες ΕΙΚΟΝΑ 15.19 Η αλληλουχία ένθεσης IS1. Αυτό το μεταθετό στοιχείο IS έχει μήκος 768 bp και φέρει ανάστροφες επαναλήψεις (IR) στα άκρα του. Κάτω από το στοιχείο παρουσιάζονται οι αλληλουχίες των ανάστροφων επαναλήψεων. Το μήκος καθεμιάς είναι 23 bp. 50
ΕΙΚΟΝΑ 15.20 Διαδικασία ένθεσης ενός στοιχείου IS στο χρωμοσωμικό DNA. Transposase: It catalyzes the movement of the transposon to another part of the genome by a cut and paste mechanism or a replicative transposition mechanism. Μεταθετάση 51
ΕΙΚΟΝΑ 15.21 Η δομή των βακτηριακών τρανσποζονίων. πιο πολύπλοκα από τα στοιχεία IS Σύνθετο τρανσποζόνιο Μη σύνθετο τρανσποζόνιο Καταλύει την ένθεση του Tn3 Εμπλέκεται σε γεγονότα ανασυνδυασμού που σχετίζονται με τη μετάθεση Καταστρέφει αντιβιοτικά (πενικιλίνη, αμπικιλλίνη) 52
ΕΙΚΟΝΑ 15.22 Μοντέλο συνενσωμάτωσης για τη μετάθεση ενός μεταθετού στοιχείου μέσω αντιγραφής. Το DNA-δότης, που περιέχει ένα μεταθετό στοιχείο, συνενώνεται με το DNA -δέκτη. Κατά τη διαδικασία της συνένωσης, το μεταθετό στοιχείο διπλασιάζεται, με αποτέλεσμα να προκύπτει ένα συνενσωμάτωμα που φέρει ένα μεταθετό στοιχείο σε κάθε σημείο συνένωσης μεταξύ DNA-δότη και DNA-δέκτη. Το συνενσωμάτωμα διασπάται μεσω ανασυνδυασμού σε δύο μόρια, καθένα από τα οποία φέρει ένα αντίγραφο του μεταθετού στοιχείου. 53
Tn10 2 ος τύπος μηχανισμού μετάθεσης (συντηρητική μετάθεση) «μετακίνηση του μεταθετού στοιχείου από μία θέση σε μία άλλη στο ίδιο ή διαφορετικό μόριο DNA χωρίς να γίνει αντιγραφή του στοιχείου. Στοιχεία IS υπάρχουν και στο παράγοντα F της E.coli. -δύο αντίγραφα IS3 -ένα αντίγραφο IS2 -ένα αντίγραφο γδ 54
Μεταθετά στοιχεία στους ευκαρυώτες ΕΙΚΟΝΑ 15.23 Σπόροι καλαμποκιού, ορισμένοι από τους οποίους εμφανίζουν κηλίδες χρωστικής. Οι κηλίδες αυτές αντιστοιχούν στα κύτταρα στα οποία έχει γίνει απομάκρυνση ενός μεταθετού γενετικού στοιχείου από ένα γονίδιο που ευθύνεται για την παραγωγή χρωστικής, με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της λειτουργίας του. Τα κύτταρα των λευκών περιοχών του σπόρου δε διαθέτουν χρωστική, επειδή το γονίδιο που ευθύνεται για την παραγωγή της εξακολουθεί να είναι απενεργοποιημένο λόγω της παρουσίας ενός μεταθετού στοιχείου μέσα σε αυτό. 2 είδη τρανσποζονίων: 1.Αυτόνομα μεταθετά στοιχεία 2.Μη αυτόνομα μεταθετά στοιχεία
Barbara McClintock (June 16, 1902 September 2, 1992), an American scientist and cytogeneticist who was awarded the 1983 Nobel Prize in Physiology Λάθος: theory of developmental control Σωστό: theory of transposition
ΕΙΚΟΝΑ 15.24 Το χρώμα του σπόρου στο καλαμπόκι και πώς επηρεάζεται από τα τρανσποζόνια. 57
ΕΙΚΟΝΑ 15.25 Ο μηχανισμός μετάθεσης του Ac. 58
Τρασποζόνια στο ζυμομύκητα ΕΙΚΟΝΑ 15.26 Το μεταθετό στοιχείο Ty του ζυμομύκητα. Το Ty μοιάζει με τους ρετροιούς (DNA RNA DNA ένθεση. Είναι ένα ρετροτρασποζόνιο και η διαδικασία μετάθεσης του λέγεται ρετρομετάθεση. 59
Τρασποζόνια στη μύγα ΕΙΚΟΝΑ 15.27 Δομή του αυτόνομου μεταθετού στοιχείου Ρ που συναντάται στην Drosophila melanogaster. 60
ΕΙΚΟΝΑ 15.28 Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας εισαγωγής διαγονιδίων στο γονιδίωμα της Drosophila με τη χρήση στοιχείων Ρ. 61
Τρασποζόνια στον άνθρωπο LINE: long interspersed nucleotide elements (μακρά διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων) -επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους 5kb -αυτόνομα ρετροτρανσποζόνια SINE: short interspersed nucleotide elements (βραχέα διάσπαρτα στοιχεία νουκλεοτιδίων) -επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους 500b -μη αυτόνομα ρετροτρανσποζόνια -Alu repeats (AluI περιοριστική θέση) 62