igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση
Κεφάλαιο 23 (+κεφ. 14 Hartwell) Μη μεντελικη κληρονομικότητα Μιτοχόνδρια κυττάρων οστεοσαρκώματος χρωματισμένα με Mito Tracker Red. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 2
Μη μεντελική κληρονομικότητα: Τα γονίδια των μιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών ακολουθούν διαφορετικούς κανόνες κληρονομικότητας από εκείνους των πυρηνικών γονιδίων. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 3
Προέλευση των μιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών Η θεωρία της ενδοσυμβίωσης: μια αμοιβαία ωφέλιμη σχέση. τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες προήλθαν από ελεύθερα διαβιώντες προκαρυώτες που εισέβαλαν σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Πριν από 1 δισ. xρόνια: -ένα ευκαρυωτικό κύτταρο αναπτύσσει μια συμβιωτική σχέση με ένα μη θειώδες φωτοσυνθετικό βακτήριο. Παρουσία O2, το ευκαρυωτικό κύτταρο χάνει τη φωτοσυνθετική του ικανότητα. Πλέον, εξαρτάται για την ενέργεια του από το βακτήριο (μιτοχόνδριο). -Το μιτοχόνδριο (ή ο χλωροπλάστης) μετέφερε ορισμένα από τα γονίδια του στο πυρηνικό DNA χάνοντας την ανεξαρτησία του. -Όλα τα κύτταρα έχουν μιτοχόνδρια αλλά όχι χλωροπλάστες. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 4
ΕΙΚΟΝΑ 23.1. Δομή μιτοχονδρίου -Έχουν επίμηκες, σφαιρικό ή ωοειδές σχήμα. -Περιβάλλονται από δύο μεμβράνες: -Eξωτερική τους μεμβράνη: περιέχει πορίνες που επιτρέπουν την διέλευση μορίων. -Eσωτερική μεμβράνη: φέρει υπεροξειδοσώματα (πολυενζυμικά συστήματα) για τη φωσφορυλίωση και την αναπνευστική αλυσίδα. -Ο διαμεμβρανικός χώρος χρησιμεύει στη λειτουργική επικοινωνία των δύο μεμβρανών. -Η μήτρα ή το στρώμα περιέχει το DNA, ριβοσώματα και ένζυμα που καταλύουν τις μεταβολικές αντιδράσεις. Ο ρυθμός εξέλιξης του mtdna στην περίπτωση των θηλαστικών υπολογίζεται ότι είναι μεγαλύτερος από το ρυθμό εξέλιξης του πυρηνικού DNA κυρίως λόγω της έλλειψης επιδιορθωτικού μηχανισμού DNA βλαβών οι οποίες λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια της αντιγραφής.
Η γλυκόλυση λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Ο οξείδωση του πυροσταφυλικού οξέος σε CΟ 2 και H 2 0 με ταυτόχρονη παραγωγή του ATP γίνεται στα μιτοχόνδρια. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 6
Κύρια σημεία: Μιτοχονδριακό γονιδίωμα -Πολλά μιτοχονδριακά γονιδιώματα είναι δίκλωνα, κυκλικά μόρια DNA. -Το GC περιεχόμενο διαφέρει αισθητά από το πυρηνικό DNA (χρήσιμο για το διαχωρισμό). -Το mtdna δεν συνδέεται με ιστόνες ή άλλες πρωτεΐνες, -Το mtdna διαφέρει σημαντικά σε μέγεθος: (ζώα <20kb, μύκητες: ~80kb). -Πυκνή διάταξη των mtdna γονιδίων στα ζώα. Στους μύκητες και τα φυτά: επιπλέον αλληλουχίες που δεν κωδικοποιούν προϊόντα. -Το μιτοχόνδριο του ανθρώπου περιέχει 5-15 μόρια mtdna και κάθε κύτταρο περιέχει ~100 μιτοχόνδρια (~500 αντίγραφα). Στο μυ: 5.000 μιτοχόνδρια (25-75.000 αντίγραφα). igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 7
Η αντιγραφή του mtdna -Οι δύο αλυσίδες του mtdna έχουν διαφορετική πυκνότητα επειδή οι βάσεις είναι άνισα κατανεμημένες (βαριά: περισσότερες G, ελαφριά: περισσότερες C). -Πρώτα αντιγράφεται η L (σύνθεση της H). Μόλις φτάσει στη μέση της διαδρομής, ξεκινά η η αντιγραφή της Η. ΕΙΚΟΝΑ 23.3. Μοντέλο αντιγραφής του μιτοχονδριακού DNA όπου φαίνεται ο σχηματισμός του βρόχου D. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 8
ΕΙΚΟΝΑ 23.4 Χάρτης των γονιδίων του ανθρώπινου μιτοχονδριακού DNA. Γενικά, το μιτοχόνδριο κωδικοποιεί trna, rrna και μερικές υπομονάδες των πρωτεϊνών NADH αφυδρογονάση και ΑΤPases. Όλα τα υπόλοιπα γονίδια κωδικοποιούνται από το πυρηνικό DNA! igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 9
Τα γονίδια του mtdna και η μεταγραφή τους -Τα πυρηνικά γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα που εισέρχονται στο μιτοχόνδριο: -Η DNA πολυμεράση για την αντιγραφή -H RNA πολυμεράση για τη μεταγραφή -Ριβοσωμικές πρωτεΐνες για τη συναρμολόγηση μιτοχονδριακών ριβοσωμάτων -Πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη μετάφραση των μιτοχονδριακών mrna -Ορισμένες πολυπεπτιδικές υπομονάδες της NADH αφυδρογονάσης και της ATPase. Τα mrna μεταγράφονται μέσα στο μιτοχόνδριο. Παραμένουν εκεί. Και μεταφράζονται από μιτοχονδριακά ριβοσώματα που έχουν συναρμολογηθεί μέσα στο μιτοχόνδριο. Η μεταγραφή του mtdna των θηλαστικών είναι ιδιότυπη: κάθε αλυσίδα (L ή Η) μεταγράφεται σε ένα μοναδικό μόριο mrna. Κόβεται μετά με ειδικά ένζυμα. Δεν υπάρχουν ιντρόνια στα μιτοχόνδρια των θηλαστικών. Αλλά υπάρχουν στα μιτοχόνδρια των φυτών και του μύκητα! Τα mrna δεν έχουν καλύπτρα.
Τα γονίδια του mtdna και η μετάφραση τους -Το κωδικόνιο έναρξης βρίσκεται πολύ κοντά στο 5 άκρο των mrna. Η 5 μη μεταφραζόμενη περιοχή είναι σχεδόν ανύπαρκτη. -Οι μιτοχονδριακοί παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού της μετάφρασης είναι διαφορετικοί στα μιτοχόνδρια από ότι στο κυτταρόπλασμα. Παρατήρηση: -τα μιτοχονδριακά ριβοσώματα είναι ευαίσθητα σε αναστολείς της λειτουργίας των βακτηριακών χρωμοσωμάτων (χλωραμφαινικόλη). -δεν είναι όμως ευαίσθητα σε αντιβιοτικά που αναστέλλουν τη δράση των κυτταροπλασματικών ριβοσωμάτων (κυκλοεξαμίδιο). Αρα: με επιλεκτική χρήση αντιβιοτικών, μπορούμε να γνωρίζουμε αν μια πολυπεπτιδική αλυσίδα στα μιτοχόνδρια συντίθεται εκεί ή στο κυτταρόπλασμα.
ΕΙΚΟΝΑ 23.5 Ορισμένες από τις πολυπεπτιδικές υπομονάδες της οξειδάσης του κυτοχρώματος συντίθενται από κυτταροπλασματικά ριβοσώματα, ενώ άλλες συντίθενται από μιτοχονδριακά ριβοσώματα.
Τα μιτοχόνδρια των θηλαστικών και του ζυμομύκητα χρησιμοποιούν διαφορετικό γενετικό κώδικα για τη πρωτεΐνοσύνθεση από εκείνο των κυτταροπλασματικών mrna. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 13
Επομένως: Από το κεφάλαιο 17: τα μιτοχόνδρια κληρονομούνται από το θηλυκό γονέα Oι συγγενικές σχέσεις μεταξύ ατόμων σε ότι αφορά τους θηλυκούς τους προγόνους μπορούν να διερευνηθούν με ανάλυση πολυμορφικών περιοχών στο mtdna. Υπάρχει μια πολυμορφική περιοχή 400bp 1917: Tsar Nicholas Romanov II Η κόρη του Αναστασία Ann Anderson: αν και το ισχυριζόταν δεν ήταν η κόρη του
ΕΙΚΟΝΑ 23.6. Σχηματική απεικόνιση χλωροπλάστη σε εγκάρσια τομή. Σύστημα παραγωγής ενέργειας: κατανέμεται στο διαμεμβρανικό χώρο, στο στρώμα και στα θυλακοειδή, τα οποία είναι στοιβαγμένα σε grana. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 15
Κύρια σημεία: Γονιδίωμα χλωροπλάστη -Το χλωροπλαστικό γονιδίωμα (cpdna) είναι δίκλωνο, κυκλικό μόριο DNA. -Το GC περιεχόμενο διαφέρει αισθητά από το πυρηνικό DNA (χρήσιμο για το διαχωρισμό). -Το cpdna δεν συνδέεται με ιστόνες ή άλλες πρωτεΐνες, -Το cpdna είναι μεγαλύτερο από το mtdna: (80kb-600kb). -.επειδή το cpdna έχει επιπλέον αλληλουχίες που δεν κωδικοποιούν προϊόντα. -Ενας χλωροπλάστης περιέχει 500-1500 μόρια cpdna. Κάθε κύτταρο έχει ένα χλωροπλάστη.
Το cpdna περιέχει: -τα rrna γονίδια του χλωροπλάστη (2 φορές οργανωμένα σε πανομοιότυπες περιοχές) -ορισμένων πρωτεϊνών για τη μεταγραφή και τη μετάφραση -ορισμένων πρωτεϊνών για τη φωτοσύνθεση Οι υπόλοιπες πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από το πυρηνικό DNA
Τα γονίδια του cpdna και η μετάφραση τους -Χρησιμοποιούνται ειδικά ριβοσώματα: 70S (2 υπομονάδες: 50S και 30S). Προέρχονται από το cpdna ή το ndna. -Οι χλωροπλαστικοί παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού της μετάφρασης είναι διαφορετικοί από ότι στο κυτταρόπλασμα. -Οι χλωροπλάστες χρησιμοποιούν τον κλασσικό γενετικό κώδικα για τη πρωτεΐνοσύνθεση. Όπως και στα μιτοχόνδρια: -τα χλωροπλαστικά ριβοσώματα είναι ευαίσθητα σε αναστολείς της λειτουργίας των βακτηριακών χρωμοσωμάτων (χλωραμφαινικόλη). -δεν είναι όμως ευαίσθητα σε αντιβιοτικά που αναστέλλουν τη δράση των κυτταροπλασματικών ριβοσωμάτων (κυκλοεξαμίδιο). Αρα: με επιλεκτική χρήση αντιβιοτικών, μπορούμε να γνωρίζουμε αν μια πολυπεπτιδική αλυσίδα στους χλωροπλάστες συντίθεται εκεί ή στο κυτταρόπλασμα. 50% του πρωτεϊνικού περιεχομένου των πράσινων φυτικών ιστών: καρβοξυλάση/οξυγονάση της διφωσφορικής ριβουλόζης (rubisco) 8 υπομονάδες που συντίθενται από το cpdna ή το ndna
Μη μεντελική κληρονομικότητα 4 κύρια σημεία: 1. Δεν επιτελείται μεντελικός διαχωρισμός βασιζόμενος στη μείωση. 2. Τα mt και τα cp γονίδια εμφανίζουν συνήθως μονογονιδιακή κληρονομικότητα. Αρσενικοί και θηλυκοί απόγονοι κληρονομούν ένα γονέα. Στους πολυκύτταρους οργανισμούς συνήθως εκφράζεται ο μητρικός φαινότυπος. 3. Τα εξωπυρηνικά γονίδια δεν χαρτογραφούνται στα χρωμοσώματα του πυρήνα. 4. Ο φαινότυπος δεν επηρεάζεται με αντικατάσταση του πυρήνα.
ΕΙΚΟΝΑ 23.8 Ποικιλότητα χρωμάτων στους βλαστούς του δειλινού (Mirabilis jalapa). (α) Φωτογραφία του φυτού δειλινό. (β) Σχηματική απεικόνιση ποικιλόχρωμου δειλινού. Στο ίδιο φυτό μπορεί να υπάρχουν περιοχές του βλαστού που είναι εντελώς πράσινες, εντελώς λευκές ή ποικιλόχρωμες (άνθη μπορούν να σχηματιστούν σε όλους τις περιοχές). α) Μη μεντελική κληρονομικότητα igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 20
Μη μεντελική κληρονομικότητα Οι φαινότυποι των απογόνων είναι πάντα όμοιοι με εκείνων του θηλυκού γονέα. Οι αναλογίες των διαφόρων φαινοτυπικών κατηγοριών ποικίλλουν. Οι λευκοί απόγονοι πεθαίνουν λόγω απουσίας χλωροφύλλης (λευκοπλάστες) και φωτοσύνθεσης (μεταλλαγή στο cpdna). igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 21
Μη μεντελική κληρονομικότητα Γιατί συμβαίνει αυτό; Υποθέσεις: 1. Η γύρη δεν συνεισφέρει στη κυτταροπλασματική πληροφορία. 2. Το cpdna των λευκοπλαστών και χλωροπλαστών αντιγράφεται αυτόνομα και τα μόρια διαχωρίζονται τυχαία. 3. Η μεταβίβαση των πλαστιδίων στα θυγατρικά κύτταρα γίνεται τυχαία και σε τυχαία αναλογία (λευκοπλαστών: χλωροπλαστών).
ΕΙΚΟΝΑ 23.9 Η κληρονομικότητα του χρώματος του βλαστού στο δειλινό (Mirabilis jalapa). igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 23
Ο μύκητας Neurospora Crassa -Η μύκητας είναι απλοειδής. -Η διασταύρωση επιτελείται με σύζευξη δύο κυττάρων. ενός συζευτικού τύπου Α και τύπου α. και δημιουργείται το ζυγωτό. -Όταν γίνει η μείωση (1 και 2) τότε έχουμε 4 απλοειδή κύτταρα. και μπορούμε να διακρίνουμε τα πρότυπα διαχωρισμού. Ποιά είναι η σημασία των απλοειδών κυττάρων στην έρευνα και γιατί;
ΕΙΚΟΝΑ 23.10 Αποτελέσματα αμοιβαίων διασταυρώσεων στη Neurospora μεταξύ ενός στελέχους [poky] και του άγριου τύπου. (α) [poky] άγριου τύπου. (β) άγριου τύπου [poky]. Neurospora crassa είναι υποχρεωτικά αερόβιος (το O2 είναι απαραίτητο). Poky (μεταλλαγή στην αερόβια αναπνοή): μεγαλώνει πιο αργά. Για να διασταυρώσουμε 2 στελέχη: Poky x wt: 1. Πρώτα τοποθετούμε το ένα στέλεχος στο θρεπτικό μέσο. 2. Μετά από επώαση 3-4 ημερών προσθέτουμε το άλλο στέλεχος. 3. Το στέλεχος που τοποθετείται πρώτο παράγει όλα τα πρωτοπεριθήκια: τα σωμάτια που δίνουν τα αληθινά σποριογόνα όργανα. 4. Τα πρωτοπεριθήκια περιέχουν μεγάλο κυτταρόπλασμα (όπως και τα ωάρια). 5. Οι απόγονοι εμφανίζουν πάντα το φαινότυπο του στελέχους που προστέθηκε πρώτο στο μέσο igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 25
ΕΙΚΟΝΑ 23.11 Κληρονομικότητα της μεταλλαγής petite στη ζύμη. Μονοκύτταρος οργανισμός Αερόβια ή αναερόβια αναπνοή Κάποιες υπομονάδες μιτοχονδριακών πρωτεϊνών κωδικοποιούνται από πυρηνικά γονίδια (pet) και κάποιες από μιτοχονδριακά γονίδια (rho). Ίσο μέγεθος και ίση ποσότητα κυτταροπλάσματος. Σε στερεό θρεπτικό μέσο κάποιες αποικίες είναι πολύ μικρότερες. Αφορoύν στο φαινότυπο Petite (ελλαττωματικά κυτοχρώματα).
ΕΙΚΟΝΑ 23.11 Κληρονομικότητα της μεταλλαγής petite στη ζύμη. Όταν διασταυρωθούν μεταλλάγματα petite με τον άγριο τύπο τότε έχουμε αναλογία 2:2 στις τετράδες (γιατί έχουμε μεταλλαγές σε πυρηνικά γονίδια). Για τα ουδέτερα και Κατασταλτικά ισχύει η μη μεντελική κληρονομικότητα Επιβιώνουν μόνο μέσω ζύμωσης Ενδιάμεση Κατάσταση μεταξύ Pet και wt Απουσιάζει το 99% του μιτοχονδριακού DNA λόγω έκθεσης σε παρεμβαλλόμενο παράγοντα Υπερισχύει το κατασταλτικό igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 petite 27
ΕΙΚΟΝΑ 23.12 Το μονοκύτταρο πράσινο φύκος Chlamydomonas. Αυτός ο οργανισμός διαθέτει ένα μοναδικό χλωροπλάστη και ένα ζευγάρι μαστιγίων. Κινείται με δύο μαστίγια και περιέχει 1 χλωροπλάστη αλλά πολλά αντίγραφα cpdna Δύο συζευκτικοί τύποι: mt+ και mt- Tο ζυγωτό παράγεται με σύζευξη δύο κυττάρων ίσου μεγέθους και ποσότητας κυτταροπλάσματος. Μετά τη μείωση το ζυγωτό δίνει 4 απλοειδή κύτταρα. Τα wt κύτταρα είναι ευαίσθητα στην ερυθρομυκίνη (ery s ) Η ανθεκτικότητα στην ερυθρομυκίνη (ery r ) κληρονομείται με μη μεντελικό τρόπο
ΕΙΚΟΝΑ 23.13 Μονογονική κληρονομικότητα στο Chlamydomonas. To mt+ cpdna μεθυλιώνεται σε σημαντικό βαθμό. Και για αυτό αντιγράφεται πιο αποτελεσματικά από το mt- cpdna Επιπλέον το mt- cpdna καταστρέφεται λίγο μετά τη σύντηξη. Το 95% των ζυγωτών εμφανίζει Μονογονική κληρονομικότητα Το υπόλοιπο 5% εμφανίζει μεικτό φαινότυπο διγονική κληρονομικότητα και κυτταροπλασματική ετεροζυγωτία igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 29
Ανωμαλίες του μιτοχονδριακού DNA και ασθένεις στον άνθρωπο 1. Κληρονομική οπτική νευροπάθεια του Leber: ολική ή μερική τύφλωση λόγω εκφυλισμού του οπτικού νεύρου (διαταραχή στη οξ. φωσφορυλίωση) 2. Σύνδρομο Kearns-Sayre: καρδιακές παθήσεις, παράλυση ορισμένων μυών του ματιού, μη φυσιολογική συσσώρευση χρωστικής στον αμφιβληστροειδή (ελλείματα σε μεγάλα τμήματα του mdna). 3. Μυοκλονική επιληψία με ερυθρές ρακώδεις ίνες: Ερυθρές ρακώδεις ίνες στο μυικό ιστό (μεταλλαγή στο trna λυσίνης). igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 30
ΕΙΚΟΝΑ 23.14 Παραγωγή υβριδικών σπόρων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της κυτταροπλασματικής αρσενικής στειρότητας (CMS) και ένα γονίδιο αποκατάστασης γονιμότητας. -Τα υβρίδια αναπτύσσονται ταχύτερα και παράγουν περισσότερους σπόρους (ετεροζυγωτική υπεροχή). -Το καλαμπόκι μπορεί να αυτογονιμοποιηθεί. -Για να επιτύχουμε υβρίδια αφαιρούμε τα αρσενικά αναπαραγωγικά όργανα. -Δεν είναι όμως εύκολο σε κάθε φυτό. -Για αυτό αξιοποιούμε μεταλλαγές σε εξωπυρηνικά γονίδια που προκαλούν κυτταροπλασματική αρσενική στειρότητα: (cytoplasmic male sterility). -Όμως αυτά τα υβριδικά φυτά δεν είναι γόνιμα πλέον. -Οπότε χρησιμοποιούνται και γόνιμα αρσενικά φυτά τα οποία φέρουν ένα πυρηνικό γονίδιο αποκατάστασης της γονιμότητας (Fertility restorer). Το επικρατές Rf καταστέλλει τη μεταλλαγή CMS.
ΕΙΚΟΝΑ 23.15 Μολυσματική κληρονομικότητα στο ζυμομύκητα. (α) Κάποια στελέχη ζυμομύκητα φέρουν δύο τύπους ιών, τους L και M. Οι L και Μ έχουν ένα δίκλωνο γονιδίωμα RNA. Ο ιός L κωδικοποιεί την πρωτεΐνη του καψιδίου και την ιική πολυμεράση για την αντιγραφή του RNA τους. O ιός Μ δεν κωδικοποιεί αυτές τις πρωτεΐνες (και άρα υπάρχει όπου υπάρχει ο ιός L). Κωδικοποιεί όμως τη θανατηφόρο τοξίνη η οποία δίνει και ανοσία στα κύτταρα που την παράγουν. (β) Οι ευαίσθητοι ζυμομύκητες, oι οποίοι πεθαίνουν από τη θανατηφόρο τοξίνη, είτε δεν περιέχουν κανέναν από τους δύο τύπους ιού είτε περιέχουν μόνο τον ιό L. Και οι 2 ιοί δεν εντοπίζονται εκτός κυττάρου. Μεταδίδονται όταν τα κύτταρα του ζυμομύκητα ζευγαρώνουν.
Μητρική επίδραση -Η μητρική επίδραση διαφέρει από τη μητρική κληρονομικότητα εξωπυρηνικών γονιδίων. -Μητρική επίδραση: ο φαινότυπος στην F1 εξαρτάται από το μητρικό πυρηνικό γονιδίωμα λόγω των mrna ή των πρωτεϊνών που εναποτίθενται στο ωοκύτταρο πριν τη γονιμοποίηση και ρυθμίζουν την ανάπτυξη του εμβρύου. -Έτσι οι απόγονοι εκδηλώνουν το μητρικό φαινότυπο που ελέγχεται από εξωπυρηνικά γονίδια (σε σχέση με το έμβρυο). -Ένα παράδειγμα είναι η κατεύθυνση της σπείρωσης στο σαλιγκάρι Limnea peregra. D: επικρατές αλληλόμορφο δεξιόστροφης σπείρωσης, d: αριστερόστροφης σπείρωσης Το σαλιγκάρι Limnaea peregra.
ΕΙΚΟΝΑ 23.17 Η κληρονομικότητα της κατεύθυνσης της σπείρωσης του κελύφους στο σαλιγκάρι Limnaea peregra αποτελεί ένα παράδειγμα μητρικής επίδρασης. igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 34
Μη μεντελική κληρονομικότητα: Συνοπτικά: Μιτοχόνδρια Χλωροπλάστες Ιοί Μητρική επίδραση igenetics Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009 35