Κατασκευή φορέων έκφρασης και έκφραση της πλειοτροπίνης και τροποποιημένων μορφών της. Μελέτη της βιολογικής δράσης τμημάτων της πρωτεΐνης.

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Κατασκευή φορέων έκφρασης και έκφραση της πλειοτροπίνης και τροποποιημένων μορφών της. Μελέτη της βιολογικής δράσης τμημάτων της πρωτεΐνης. ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΛΑΜΠΡΟΥ ΜΑΡΓΑΡΙΤΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΠΑΤΡΑ 2009

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το ταξίδι άρχισε πριν δυο χρόνια..κατά τη διάρκεια αυτού έμαθα να λειτουργώ ως μέλος μιας ομάδας, να δουλεύω πάνω σε ιδέες, να αντιμετωπίζω προβλήματα και να μπορώ να σχεδιάζω το επόμενό μου βήμα. Για τις γνώσεις, τις ιδέες και το διαφορετικό τρόπο σκέψης που απέκτησα θα ήθελα να ευχαριστήσω: την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου κα. Ευαγγελία Παπαδημητρίου, που πάντοτε ήταν δίπλα μου σε όλην την προσπάθεια, τα μέλη της τριμελούς μου επιτροπής κυρίους Σωκράτη Τζάρτο και Γεώργιο Σπυρούλια που δέχτηκαν να είναι μέλη αυτής αλλά και για τις συμβουλές τους κατά τη διάρκεια του μεταπτυχιακού μου, τον κ. Κωνσταντίνο-Μάριο Μικέλη που είναι ο δάσκαλος μου, τις κυρίες Ευγενία Λαμπροπούλου και Ευανθία Σφαέλου με τις οποίες συνεργάστηκα το πρώτο διάστημα στο εργαστήριο. Επίσης, ευχαριστώ όλους τους φίλους μου στο εργαστήριο για το πολύ ζεστό κλίμα που έχουν δημιουργήσει. Τέλος, ευχαριστώ τους δικούς μου ανθρώπους για την ηθικη και υλική συμπαράσταση. Το ταξίδι συνεχίζεται.

Στη μνήμη του πατέρα μου Ρήγα..

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 1.Πλειοτροπίνη (PTN)... 1 1.1 Δομή της πλειοτροπίνης και του γονιδίου της... 1 1.2 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της πλειοτροπίνης... 6 1.3 Έκφραση και βιολογικές δράσεις της πλειοτροπίνης... 7 1.3.1 Νευρικό σύστημα... 7 1.3.2 Αναπαραγωγικό σύστημα... 8 1.3.3 Σκελετικό σύστημα... 9 1.3.4 Εσωτερικά όργανα... 10 1.4 Υποδοχείς της πλειοτροπίνης... 11 1.4.1 Ν-Συνδεκάνη (Συνδεκάνη 3)... 11 1.4.2 Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTP β/ζ)... 13 1.4.3 Κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (ALK)... 17 1.4.4 Άλλοι υποδοχείς ή συν-υποδοχείς της πλειοτροπίνης... 19 1.5 Σχέση δομής-δράσης... 21 1.6 Πλειοτροπίνη και καρκίνος... 22 1.6.1 Ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων... 22 1.6.2 Καρκινική αγγειογένεση... 23 ΣΚΟΠΟΣ... 25 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 27 1. Παραγωγή και απομόνωση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης 27 1.1 Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Miniprep)... 28 1.2 Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Boiling Protocol)... 29 1.3 Μεσαίας κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Midiprep)... 31 1.4 Εκχύλιση DNA από πήκτωμα αγαρόζης... 32 1.5 Αντίδραση πέψης με ένζυμα περιορισμού... 33 1.6 Αντίδραση σύνδεσης μορίων DNA με συνεκτικά άκρα... 36 1.7 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης DNA... 38 1.8 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης... 38 1.9 Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή καλλιέργεια... 40 1.10 Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια... 41

1.11 Υγρή καλλιέργεια βακτηρίων σε minimal media... 42 1.12 Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων... 44 1.13 Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό... 45 1.14 Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation)... 47 1.15 Μικρής κλίμακας ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια... 50 2. Διερεύνηση βέλτιστων συνθηκών για έκφραση της υπό μελέτη πρωτεΐνης.. 51 2.1 Μικρής κλίμακας απομόνωση ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των βακτηριακών κυττάρων και διαχωρισμός κλασμάτων... 52 2.2 Παραγωγή ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης... 53 2.3 Απομόνωση πρωτεΐνης με τη χρήση στήλης His Trap HF 5ml (Amersham)... 55 2.4 Απομόνωση της πρωτείνης με τη χρήση Protino Ni-TED resin (Macherey- Nagel)... 58 2.5 Διαπίδυση... 59 2.6 Συμπύκνωση της πρωτεΐνης... 60 2.7 Απομάκρυνση του tag με τη χρήση παράγοντα Xα... 61 3. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων... 63 3.1 Aπομόνωση της πλειοτροπίνης από το θρεπτικό μέσο κύτταρων Μ059Κ... 64 3.2 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford)... 66 4. Λύση κυττάρων μετά από ενεργοποίηση για πειράματα μελέτης φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών... 67 5. Ανοσοκατακρήμνιση... 69 6. Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE)... 72 7. Ηλεκτροφόρηση δυο διαστάσεων... 76 8. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western... 77 9. Χρώση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου με Coomasie... 82 10. Χρώση πηκτώματος με χρήση διαλύματος νιτρικού αργύρου (Silverstain, Sigma, ProteoSilver TM Silverstain Kit)... 83 11. Χρώση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου με καρβοκυανίνη (stains all, SA). 85 12. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping). 86 13. Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων... 87

14. Παρασκευή ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) από εγκέφαλο βοός... 88 15. Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer... 90 16. Ανακαλλιέργεια κυττάρων... 91 17. Κατάψυξη κυττάρων... 94 18. Απόψυξη κυττάρων... 96 19. Επώαση κυττάρων με παράγοντες για μελέτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών... 97 20. Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi)... 99 21. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας.. 101 22. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων... 102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 103 1.Υποκλωνοποίηση της κωδικής περιοχής της ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης και τμημάτων της... 103 2. Εύρεση βέλτιστων συνθηκών έκφρασης... 115 3. Απομόνωση των Η9-59 και Η60-110 με τη χρήση ολοκληρωμένου συστήματος της Amersham.... 117 4. Απομόνωση του τμήματος Η9-59 με τη χρήση συστήματος της Μacherey- Νagel... 119 5. Καθαρισμός της πρωτεΐνης από το ιμιδαζόλιο και προβλήματα... 121 6. Αποκοπή του His-tag με την επίδραση του παράγοντα Χa... 125 7. Προσπάθεια απομόνωσης του τμήματος PTNΔ111-136... 127 8.Επίδραση του Ca 2+ στην κινητικότητα της πλειοτροπίνης σε ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων... 128 9. Ανίχνευση Ca 2+ στην πλειοτροπίνη που εκκρίνεται από ανθρώπινα κύτταρα... 129 10. Μελέτη της αλληλεπίδρασης των τμημάτων Η9-59 και Η60-110 που φέρουν το His-tag με τους υποδοχείς της πλειοτροπίνης RPTPβ/ζ και α ν β 3... 131 11. Το πεπτίδιο PTN111-136 επάγει τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης στη θέση Υ773 και την ενεργοποίηση των Erk1/2, πιθανά μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ και της κινάσης c-src... 132 ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 135 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 141 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 161 ABSTRACT... 163

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... 165

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1.Πλειοτροπίνη (PTN) Η πλειοτροπίνη (ΡΤΝ) είναι μια εκκρινόμενη κυτταροκίνη που παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια με την ηπαρίνη. Αρχικά απομονώθηκε από μήτρα βοός ως ασθενής μιτογόνος παράγοντας και παράγοντας που προάγει την ανάπτυξη των νευριτών από εγκέφαλο νεογνού επίμυος. Σήμερα έχει εντοπιστεί και σε άλλα είδη, όπως στον άνθρωπο, στο μυ, στην όρνιθα, στους ιχθείς, στους βατράχους και στα έντομα (Englund et al., 2005). Η αλληλουχία της πλειοτροπίνης φαίνεται να παρουσιάζει ομολογία μεγαλύτερη του 90% ανάμεσα στις αλληλουχίες που απομονώνονται από όρνιθα, επίμυ, βου και τον άνθρωπο (Kilpeläinen et al., 2000). Λαμβάνει μέρος σε διαδικασίες όπως είναι η ανάπτυξη των κυττάρων και η επιβίωση τους, η κυτταρική μετανάστευση, η αγγειογένεση και η ανάπτυξη των νευριτών. Στη βιβλιογραφία μπορεί κανείς να τη συναντήσει με διαφορετικές ονομασίες, λόγω των διαφορετικών πηγών από όπου προέρχεται και των διαφορετικών της δράσεων (Lai et al., 1992). Τέτοιες ονομασίες είναι οι εξής: heparin-binding growth-associated molecule (HB-GAM) (Hampton et al., 1992, Merenmies and Rauvala, 1990), heparin-affin regulatory peptide (HARP) (Laaroubi et al., 1995), heparin binding growth factor-8 (HBGF-8) (Milner et al., 1989), protein 18kDa (Rauvala et al., 1989), heparin binding neurotrophic factor (HBNF) (Kovesdi et al., 1990, Böhlen et al., 1991), osteoblast specific factor (OSF-1) (Tezuka et al., 1990, Lai et al., 1992). Η πλειοτροπίνη παρουσιάζει μεγάλη ομολογία, της τάξης του 55%, με μια άλλη πρωτεΐνη, τη midkine (ΜΚ), με την οποία δημιουργούν μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων που παρουσιάζουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Στην οικογένεια αυτή ανήκουν επιπλέον και οι πρωτεΐνες Miple1 και Miple2 που απομονώνονται από τη Drosophila (Englund et al.,2005). 1.1 Δομή της πλειοτροπίνης και του γονιδίου της Η πλειοτροπίνη αποτελείται από 168 αμινοξέα. Το ώριμο πεπτίδιο αποτελείται από 136 και προκύπτει μετά την αποκοπή ενός τμήματος 32 αμινοξέων. Μια άλλη άποψη είναι ότι το ώριμο πεπτίδιο αποτελείται από 139 1

αμινοξέα, καθώς έχει βρεθεί και δεύτερη περιοχή από την οποία αποκόπτεται το πεπτίδιο. Το πεπτίδιο αυτό που αποκόπτεται αποτελεί το «πεπτίδιο σινιάλο», πράγμα το οποίο εμφανίζεται στις πρωτεΐνες που έχουν την ικανότητα να εκκρίνονται. Το πεπτίδιο σινιάλο εμφανίζει τη κλασσική δομή που συναντάται, η οποία είναι το θετικά φορτισμένο αμινοτελικό άκρο, το υδρόφοβο κεντρικό τμήμα και το υδρόφιλο καρβοξυτελικό άκρο (Bernard-Pierrot et al., 2001; Merenmies and Rauvala, 1990). Εικόνα Ε1. Η αλληλουχία της πλειοτροπίνης. Η υπογραμμισμένη αλληλουχία αντιστοιχεί στο πεπτίδιο σινιάλο ενώ με έντονη γραφή επισημαίνονται τα τρία επιπλέον αμινοξέα της επιμηκυμένης μορφής. H μοριακή μάζα της πλειοτροπίνης έχει εκτιμηθεί με SDS-PAGE ανάλυση περίπου 18 kda, ενώ έχει υπολογιστεί με τη μέθοδο plasma desorption time-offlight mass spectroscopy να είναι περίπου 15,3 kda. Αυτή η ανακολουθία έχει αποδοθεί στο γεγονός ότι μόριο περιλαμβάνει σε μεγάλο ποσοστό (~24%) κατιονικά αμινοξέα (~20,6% λυσίνες, ~3,7% αργινίνες). Το πεπτίδιο περιλαμβάνει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες, υπάρχουν αναφορές στις οποίες πιστεύεται ότι αυτές οι κυστεΐνες σχηματίζουν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς ως εξής: Cys 67 και Cys 99, Cys 77 και Cys 109, Cys 15 και Cys 44, Cys 23 και Cys 53, Cys 30 και Cys 57 (Hampton et al., 1992; Kilpeläinen et al., 2000, Inui et al., 2000; Seddon et al., 1994). Υπάρχει όμως και η θεωρία ότι σχηματίζουν τρεις δισουλφιδικούς δεσμους (Hampton et al., 1992). Οι απόψεις αυτές είναι υπό διερεύνηση. Η πρωτοταγής δομή του μορίου επίσης περιλαμβάνει και τρεις περιοχές με το μοτίβο Κ-R/K-X- R/K που αποτελούν πιθανές θέσεις πυρηνικών στόχων (Chelsky et al.,1989). Στο καρβόξυτελικό της άκρο εμφανίζει ομολογία με τις ενεργές περιοχές τύπου Kazal 2

που υπάρχουν σε αναστολείς πρωτεϊνασών, παρόλα αυτά δεν έχει βρεθεί ανασταλτική δράση έναντι της τρυψίνης, χωρίς να αποκλείεται ανασταλτική δράση για άλλου τύπου πρωτεϊνάσες (Kuo et al.,1990). Δεν έχουν αναφερθεί μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στο μόριο εκτός από την αποκοπή του «πεπτιδίου σινιάλου» και δεν υπάρχουν θέσεις Ν-γλυκοσυλίωσης (Merenmies et al.,1990; Hampton et al., 1992). Η δομή της ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης μελετήθηκε με ετεροπυρηνικό NMR το 2000 και από αυτό προέκυψε μια πιθανή διαμόρφωση, σύμφωνα με την οποία αποτελείται από δυο β-δομές που ενώνονται με έναν εύκαμπτο συνδέτη, και κάθε μια από τις οποίες περιλαμβάνει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές. Τα N- και C- τελικά άκρα λόγω της ύπαρξης μεγάλου αριθμού λυσινών είναι ιδιαίτερα εύκαμπτα και εμφανίζονται με τυχαίες διαμορφώσεις (Εικόνα Ε2). Εικόνα Ε2. Υποθετική σχηματική αναπαράσταση της δομής της πλειοτροπίνης με βάση τις μέχρι τώρα παρατηρήσεις. Στο σχήμα φαίνονται οι δυο β-δομές, οι δισουλφιδικοί δεσμοί που σχηματίζονται μεταξύ των κυστεϊνών και οι β- αντιπαράλληλες πτυχές. Οι τυχαίες διαμορφώσεις που εμφανίζονται στα άκρα τις πρωτεΐνης απεικονίζονται με κυλινδρικά σχήματα (Papadimitriou et al., 2004). 3

Έχει βρεθεί ότι και οι δυο κεντρικές περιοχές της πλειοτροπίνης εμφανίζουν μεγάλη αμινοξική ομολογία με τα μοτίβα TSR-1 (Thrombospondin type I repeat), τα οποία τα συναντά κανείς σε αρκετές πρωτεΐνες που διαμεσολαβούν αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων ή κυττάρων με εξωκυττάρια ύλη. Βασικά χαρακτηριστικά των μοτίβων αυτών είναι η ύπαρξη κυστεϊνών, καταλοίπων τρυπτοφάνης, καθώς και άλλων βασικών καταλοίπων. Οι καλά συντηρημένες τρυπτοφάνες σχηματίζουν αλληλουχίες που είναι σημαντικές για την πρόσδεση στην ηπαρίνη (Kilpeläinen et al., 2000). Παρόλα αυτά, μια άλλη μελέτη υποστηρίζει ότι τόσο η αμονιξική αλληλουχία όσο και η τριτοταγής δομή των δυο κεντρικών περιοχών της πλειοτροπίνης διαφέρει σημαντικά από εκείνη της δεύτερης περιοχής TSR-1 της θρομβοσπονδίνης (Roszmusz et al., 2002). Φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού έδειξε ότι κατά την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην ηπαρίνη ή έπειτα από αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών, η πρώτη υφίσταται διαφοροποιήσεις στη διαμόρφωσή της. Οι περιοχές που έχουν ιδιαίτερη σημασία για την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην ηπαρίνη είναι οι δυο κεντρικές περιοχές του μορίου, ενώ τα άκρα του μορίου δε φαίνεται να παίζουν ρόλο σε αυτήν την πρόσδεση (Kilpeläinen et al., 2000). Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι πιο σημαντική για την πρόσδεση στη ηπαρίνη είναι η C-TSR περιοχή, καθώς και κάποια αμινοξέα στο σύνορο ανάμεσα στην N- και την C-TSR-1 περιοχή (Ori et al., 2009). Το ανθρώπινο γονίδιο της πλειοτροπίνης εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 7 στο βραχίονα q33a. Έχει βρεθεί ότι το ελάχιστο μέγεθος του είναι 42kb και περιλαμβάνει 7 εξώνια. Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης εκτείνεται σε 4 εξώνια, ενώ είναι χαρακτηριστικό το γεγονός ότι τα σύνορα εσωνίων/εξωνίων είναι συντηρημένα ανάμεσα στα είδη στην οικογένεια πλειοτροπίνης/midkine (Kretschmer et al., 1993; Lai et al., 1992). Το πεπτίδιο σινιάλο και τα πέντε πρώτα αμινοξέα της ώριμης πρωτεΐνης εντοπίζονται στο εξώνιο 2. Η κεντρική περιοχή διαχωρίζεται στα εξώνια 2 και 3, στα οποία περιέχονται τα 6 και 4 κυστεϊνικά κατάλοιπα αντίστοιχα. Το εξώνιο 4 αντιστοιχεί στη C-τελική περιοχή, στην οποία υπάρχει πιθανή αλληλουχία σινιάλο για μετατόπιση της πλειοτροπίνης στον πυρήνα, υπόθεση που προκύπτει από την ομολογία της περιοχής αυτής με την ιστόνη Η1 (Kretschmer et al., 1993). Τα 5 - και 3 - άκρα στις αμετάφραστες περιοχές του ανθρώπινου γονιδίου της πλειοτροπίνης είναι διαφορετικά από αυτά 4

σε άλλα είδη, και εμφανίζουν μεγάλη ομολογία με τις αντινοηματικές cdna αλληλουχίες της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (hsp70) και της ριβοσωμικής πρωτεΐνης L7 αντίστοιχα. Υπάρχουν πολλαπλές 5 αμετάφραστες περιοχές που προέρχονται από εναλλακτικό μάτισμα, κάτι που πιθανά να παίζει ρόλο στην ειδική σε κάθε ιστό ή κύτταρο ρύθμιση της έκφρασης της πλειοτροπίνης (Kretschmer et al., 1993; Lai et al., 1992; Lai et al., 1995). Ο υποκινητής της πλειοτροπίνης περιέχει αλληλουχία CAAT box, δεν περιλαμβάνει TATA box, ενώ έχει αναφερθεί η ύπαρξη αλληλουχίας ΤΑΑΤΑΑ. Είναι γνωστό ότι υπάρχουν τέσσερις περιοχές πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα myogenic differentiation 1(MyoD), δυο του activator protein 1 (ΑΡ1), μια των πυρηνικών παραγόντων GT (GT1), ένα στοιχείο απόκρισης στον ορό (SRE) και μια περιοχή πρόσδεσης για τον homebox A5 (HOXA5). Επίσης υπάρχουν και πιθανές θέσεις για την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων, όπως του πυρηνικού υποδοχέα κb (ΝFκB), του CREB binding protein (CBP), του παράγοντα απόκρισης στον ορό (CArG box) και του ρετινοϊκού οξέος (RARE/TRE/VDE), κάτι το οποίο χρήζει περεταίρω διερεύνησης (Li et al., 1992; Kretschmer et al., 1993; Polytarchou et al., 2005; Chen et al., 2005; Poimenidi et al., 2009). Τέλος, έχει αναφερθεί ότι υπάρχει πιθανότητα πρόσδεσης του Sox10, αλλά η ακριβής περιοχή δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί (Lee et al., 2008) (Εικόνα Ε3). Εικόνα Ε3. Σχηματική απεικόνιση του υποκινητή του γονιδίου της πλειοτροπίνης. Με τετράγωνα φαίνονται γνωστές θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων, ενώ με κύκλους απεικονίζονται οι πιθανές θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων που είναι υπό διερεύνηση. 5

1.2 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της πλειοτροπίνης Είναι γνωστό ότι η έκφραση του γονιδίου της πλειοτροπίνης εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου και το χρόνο, και τροποποιείται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις (Rauvala et al.,1989; Li et al., 1990; Rauvala et al., 1994). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η έκφραση της αυξάνεται από παράγοντες όπως ο TNFα (tumor necrosis factor α), ο EGF (epidermal growth factor), ο CNTF (ciliary neurotrophic factor), τα μέλη της οικογένειας των FGFs (fibroblast growth factors) FGF2 και FGF10, ο PDGF(platelet-derived growth factor), το camp, η υποξία, ο ορός, το υπεροξείδιο του υδρογόνου και η enos (endothelial nitric oxide synthase) (Pufe et al., 2003; Roger et al, 2006; Hatziapostolou et al., 2006; Mitsiadis et al., 2008; Li et al, 1992; Antoine et al, 2005; Mourlevat et al., 2005; Poimenidi et al., 2009 Polytarchou et al., 2005; Polytarchou et al., 2008). Αντικρουόμενα αποτελέσματα έχουν αναφερθεί για το ρετινοϊκό οξύ, το οποίο φαίνεται να επάγει την έκφραση της σε συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές, ενώ σε άλλες όχι (Kretschmer et al., 1991; Mitsiadis et al., 2008; Li et al, 1992). Μεταγραφικοί παράγοντες όπως είναι ο HOXΑ5 (Chen et al, 2005) και ο AP-1 (Polytarchou et al., 2005) επηρεάζουν άμεσα την έκφραση του γονιδίου, αφού υπάρχουν θέσεις πρόσδεσης τους στον υποκινητή του. Επιπλέον, ο παράγοντας ΑΡ-1 έχει καθοριστικό ρόλο στην επαγόμενη από το ορό (Poimenidi et al., 2009) από φάρμακα, όπως η απροτινίνη (Koutsioumpa et al., 2009) ή από μηχανική τάση (Liedert et al., 2009) αύξηση της έκφρασης και της έκκρισης της πλειοτροπίνης. Πρόσφατα έχει βρεθεί ότι έλλειψη της περιοστίνης οδηγεί σε έκτοπη αύξηση της έκφρασης της πλειοτροπίνης (Tkatchencko et al., 2009). Τέλος, έλλειψη του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης της πλειοτροπίνης (Li et al., 2006). 6

1.3 Έκφραση και βιολογικές δράσεις της πλειοτροπίνης 1.3.1 Νευρικό σύστημα Η έκφραση της πλειοτροπίνης ελέγχεται εξελικτικά στο νευρικό σύστημα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του και διαφοροποιείται ανάλογα με το στάδιο. Η πλειοτροπίνη συγκεντρώνεται στις εξωκυττάριες δομές που περιβάλλουν τους προς σχηματισμό νευράξονες, αλλά απουσιάζει παντελώς ή τα ποσοστά της είναι πολύ μειωμένα όταν αυτοί έχουν σχηματιστεί (Kuo et al., 1990; Bohlen et al.,1991; Vanderwinden et al., 1992; Rauvala et al.,1994; Fan et al., 2000). Επιπλέον, εκφράζεται και από μη νευρικά κύτταρα, όπως τα κύτταρα Schwann (Vanderwinden et al., 1992). Σε εγκέφαλο ενηλίκου επίμυος, η έκφραση της πλειοτροπίνης είναι περιορισμένη σε συγκεκριμένες περιοχές και μάλλον παίζει ρόλο στους μηχανισμούς που εμπλέκονται στη συναπτική πλαστικότητα (Pavlov et al., 2006). Φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και ωρίμανση του εγκεφάλου, έχει την ικανότητα να επάγει την ανάπτυξη των νευριτών, και επηρεάζει τη μορφογένεση των κυττάρων Purkinje και τη διαφοροποίηση της γλοίας Bergmann μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού φωσφακάνη/rptpζ (Chang et al., 2004; Rauvala 1989; Raulo et al.,1992; Shimazaki et al., 2005; Li et al., 2007). Παίζει ρόλο στο σχηματισμό μνήμης μέσω του υποδοχέα της RPTPβ/ζ (Tamura et al., 2006; del Olmo et al., 2009), ενώ αυξημένα επίπεδα του mrna τόσο της πλειοτροπίνης όσο και των υποδοχέων της έχουν ανιχνευτεί στη νευρόσφαιρα, κάτι το οποίο υποδεικνύει πιθανή εμπλοκή της σε λειτουργίες των νευρικών βλαστικών κυττάρων (Furuta et al., 2004; Jung et al., 2004; Hienola et al., 2004). Πιο πρόσφατα βρέθηκε ότι συνδυασμός πλειοτροπίνης και άλλων παραγόντων (SDF-1, IGF2 και EENB1) οδηγούν σε διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυονικών κυττάρων σε λειτουργικούς νευρώνες του μεσεγκεφάλου (Vazin et al., 2009). Έχει αναφερθεί επίσης στη βιβλιογραφία ότι η πλειοτροπίνη παίζει σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση του νευρονικού δικτύου και στη διαδικασία επαναφοράς μετά από τραυματισμό στο νευρικό σύστημα, καθώς και στην επαναδόμηση της νευρομυϊκής σύναψης (Peng et al., 1995; Takeda et al.,1995; Blondet et al., 2005; Jin et al.,2009). Επιπλέον, προλαμβάνει την επαγόμενη από κοκαΐνη τοξικότητα στις κυτταρικές σειρές NG108-15 και PC12, υποδηλώνοντας ότι αυξημένη έκφραση της πλειοτροπίνης που παρατηρείται σε διαφορετικές 7

περιοχές του εγκεφάλου μετά από λήψη ναρκωτικών ουσιών, μπορεί να σχετίζεται με τη πρόληψη της επαγόμενης από αυτά τοξικότητας (Gramage et al., 2008). Η πλειοτροπίνη ανιχνεύεται στις πλάκες αμυλοειδούς που χαρακτηρίζουν νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως είναι η νόσος του Alzheimer και το σύνδρομο Down, και μάλλον αποτελεί συμπαράγοντα για το σχηματισμό τους (Marchionini et al., 2007, Wisniewski et al.,1996; Taravini et al., 2005). Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη νόσο του Parkinson, καθώς εντείνει την επιβίωση των νευρικών κυττάρων και την επέκταση των νευριτών στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Marchionini et al., 2007; Hida et al. 2003; Ferrario et al., 2004; Hida et al., 2007; Ferrario et al., 2008). 1.3.2 Αναπαραγωγικό σύστημα Σε μήτρα επίμυος τα επίπεδα mrna της πλειοτροπίνης που ανιχνεύονται διαφέρουν ανάλογα με τη φάση του κύκλου. Φτάνουν στο μέγιστο κατά το δίοιστρο και αυξάνονται με την επίδραση της προγεστερόνης, κάτι που δείχνει ότι η έκφραση της πλειοτροπίνης είναι ορμονοεξαρτώμενη. Το mrna της είναι παρόν σε λεία μυϊκά κύτταρα του μυομητρίου και των αιμοφόρων αγγείων, καθώς και σε ενδοθηλιακά κύτταρα του ενδομητρίου. Πιθανά δρα ως διαμεσολαβητής στις επιδράσεις της προγεστερόνης στην αγγείωση και αιμόσταση του ιστού της μήτρας (Milhiet et al., 1998). Θηλυκοί επίμυες που δεν παράγουν ούτε την πλειοτροπίνη ούτε τη midkine, εμφανίζουν προβλήματα κατά το κύκλο του οίστρου και κολπικές ανωμαλίες που έχουν ως αποτέλεσμα την απώλεια της γονιμότητας τους (Muramatsu et al., 2006). Στον άνθρωπο, αυξημένη έκφραση του mrna της πλειοτροπίνης μπορεί να σχετίζεται με την απαρχή μιας έκτοπης ενδομητρίωσης και με περιτοναϊκή διήθηση (Chung et al., 2002). Επίσης, το μοτίβο έκφρασης της πλειοτροπίνης, καθώς και των υποδοχέων της, κατά την ανάπτυξη του πλακούντα, δείχνουν ότι είναι πολύ πιθανό η πλεοτροπίνη να εμπλέκεται στη διαδικασία της ανάπτυξης, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις (Ball et al., 2009). Στο μαστικό αδένα εκφράζεται στις μυοεπιθηλιακές κυψελίδες, στα επιθηλιακά, στα ενδοθηλιακά και στα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα (Ledoux et al., 1997). Σε ενήλικες αρσενικούς επίμυες παράγεται στα κύτταρα Leydig των όρχεων. Απουσία πλειοτροπίνης, οι άρρενες επίμυες παρουσιάζουν στειρότητα, 8

με ατροφικούς όρχεις και αποπτωτικά σπερματοκύτταρα (Zhang et al., 1999), υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο της πλειοτροπίνης στη σπερματογένεση. Αυξημένη έκφραση σχετίζεται και με τις ασθένειες του Peyronie και του Dupuytren (Qian et al., 2004). 1.3.3 Σκελετικό σύστημα Η πλειοτροπίνη επάγει την προσκόλληση, τη μετανάστευση, την επέκταση και τη διαφοροποίηση των ανθρώπινων προγονικών κυττάρων των οστεοβλαστών (Yang et al., 2003), έχοντας πιθανά σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό των οστών. Σε οστεοκύτταρα in vitro η έκφραση της πλειοτροπίνης αυξάνεται με τη μηχανική φόρτιση, λειτουργία που μπορεί να είναι σημαντική για το σχηματισμό των οστών in vivo (Imai et al., 2009). Υπερέκφραση της πλειοτροπίνης σε διαγονιδιακούς μύες, έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του πάχους των οστών (Imai et al., 1998). Ανάλογα, σε επίμυες που εκφράζουν αυξημένα επίπεδα πλειοτροπίνης, το μήκος των σχηματιζόμενων οστών είναι ιδιαίτερα αυξημένο κατά τα πρωταρχικά στάδια της ανάπτυξης των οστών, αλλά η διαφορά αυτή μειώνεται στη συνέχεια (Petersen et al., 2004; Tare at al., 2002). Από την άλλη πλευρά, σκελετική ανάλυση επίμυων που δεν εκφράζουν πλεοτροπίνη έδειξε ότι δεν επηρεάζεται ο σχηματισμός των οστών in vivo (Lehmann et al., 2004), αν και παρουσιάζεται καθυστέρηση στην ανάπτυξη συγκεκριμένου τύπου οστών που επηρεάζονται από το βάρος (weight- bearing bones) σε ηλικία 2 μηνών (Imai et al., 2009). Επίμυες που παρουσιάζουν έλλειψη και σε πλειοτροπίνη αλλά και στη midkine έχουν μικρότερο σωματικό μέγεθος και βάρος (Muramatsu et al., 2006). Tέλος, η πλειοτροπίνη φαίνεται να παίζει ρόλο και κατά την αποκατάσταση καταγμάτων σε ενήλικες (Weiss et al., 2009). Αυξημένη έκφραση της πλειοτροπίνης κατά τη χονδρογένεση in vivo δείχνει ότι πιθανά παίζει ρόλο στο σχηματισμό του χόνδρου (Dreyfus et al., 1998; Neame et al., 1993). Στα πτηνά η πλειοτροπίνη εκφράζεται στις καταβολές των τενόντων και στις ενώσεις των φαλλάγγων και φαίνεται να παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των τενόντων (Mittapalli et al., 2009). Μηχανική φόρτιση επηρεάζει την έκφραση της πλειοτροπίνης σε ανθρώπινα κύτταρα μεσοσπονδύλιου δίσκου και επηρεάζει την ικανότητα τους να διεγείρουν τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων 9

(Neidlinger-Wilke et al., 2009). Σε ασθένειες όπως η οστεοαρθρίτιδα, η πλειοτροπίνη εκφράζεται στα αρχικά στάδια, ενώ η συγκέντρωση της στο αρθρικό υγρό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την πορεία της νόσου (Pufe et al., 2003). 1.3.4 Εσωτερικά όργανα Η πλειοτροπίνη φαίνεται να εμπλέκεται στην ανάπτυξη του ήπατος, αλλά και στην αναγέννηση αυτού. Πέραν όμως αυτών των ιδιοτήτων, έχει αναφερθεί και πιθανή ανάμειξη της πλειοτροπίνης στην ίνωση και στο σχηματισμό προνεοπλασματικών οζιδίων (Asahina et al., 2002; Kohashi et al., 2002; Ochiai et al., 2004). Πλειοτροπίνη έχει εντοπιστεί και στο μεσέγχυμα των νεφρών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Υπερεκφράζεται σε μεταναστευτικά κύτταρα του μεσαγγειακού χώρου (Vanderwinden et al., 1992; Sakurai et al., 2001; Martin et al., 2006). Το mrna της πλειοτροπίνης έχει εντοπιστεί και σε αναπτυσσόμενο πνεύμονα επίμυος, με μεγαλύτερη έκφραση σε εμβρυϊκό ιστό πνεύμονα απ ότι σε εμβρυϊκά τύπου ΙΙ κύτταρα (Vanderwinden et al., 1992; Weng et al., 2006). Έχει βρεθεί αυξημένη έκφραση και της πλειοτροπίνης και του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στο μεσέγχυμα, αλλά και σε επιθηλιακά κύτταρα εμβρυικού πνεύμονα. Επίσης η πλειοτροπίνη προάγει τον πολλαπλασιασμό των εμβρυικών κυττάρων τύπου ΙΙ και σταματά τη διαφοροποίηση τους προς επιθηλιακά τύπου Ι, δράσεις που διαμεσολαβούνται από δυο διαφορετικά μονοπάτια, αυτά των πλειοτροπίνη/βκατενίνη και Notch. Η απουσία πλειοτροπίνης επηρεάζει τη μορφογένεση της διακλάδωσης του πνεύμονα (Weng et al., 2009). Η έκφραση του γονιδίου της πλειοτροπίνης αυξάνεται σε αμφιβληστροειδείς χιτώνες σε οφθαλμό μυός μετά από προσθήκη CTNF (ciliary neurotrophic factor), σε αγγειωμένους κερατοειδείς χιτώνες (Roger et al., 2006; Usui et al., 2004) και κατά την επούλωση δερματικών πληγών in vivo (Florin et al., 2005). Η πλειοτροπίνη είναι δυο φορές πιο αυξημένη στους ανθώπινους παροτιδικούς 10

αδένες σε σχέση με τους υπογνάθιους (Sun et al.,2008). Τέλος έχει βρεθεί ότι παίζει αρνητικό ρόλο στην αδιπογένεση (Gu et al., 2007). 1.4 Υποδοχείς της πλειοτροπίνης 1.4.1 Ν-Συνδεκάνη (Συνδεκάνη 3) Η Ν-συνδεκάνη (συνδεκάνη 3) είναι μια πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης 200kDa, η οποία απομονώνεται από καλλιέργειες νευρώνων του εγκεφάλου και από εγκέφαλο επίμυος και αποτελεί υποδοχέα της πλεοτροπίνης. Αποτελείται από έναν πρωτεϊνικό κορμό 120kDa, πάνω στον οποίο είναι συνδεδεμένες αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης (Raulo et al., 1994). Η Ν-συνδεκάνη εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό κατά την ανάπτυξη του νευρικού ιστού στο περιγενετικό εγκέφαλο επίμυος, και κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου υπάρχει σύγχρονη και παροδική έκκρισή της με την πλειοτροπίνη σε συγκεκριμένα μέρη αυτού (Nolo et al., 1995). Η πλειοτροπίνη οδηγεί σε ανάπτυξη των νευριτών, μέσω της αλληλεπίδρασής της με τις αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης της Ν-συνδεκάνης (Kinnunen et al., 1996). Η πρόσδεση στις αλυσίδες της θειϊκής ηπαράνης φαίνεται να γίνεται μέσω των TSR περιοχών της πλειοτροπίνης και συμμετέχει στη ρύθμιση της πλαστικότητα της νευρομυϊκής σύναψης και στην ανάπτυξη των νευρώνων στον ιππόκαμπο (Raulo et al., 2006; Raulo et al, 2005). Μετάγραφα mrna τόσο της πλειοτροπίνης όσο και της Ν-συνδεκάνης έχουν εντοπιστεί στη νευρόσφαιρα, κάτι που σημαίνει ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι της πλειοτροπίνης παίζει σημαντικό ρόλο και στη διαφοροποίηση των βλαστικών νευρικών κυττάρων (Furuta et al., 2004). Συνδεκάνες εκφράζονται και σε ενεργά αστροκύτταρα και πιθανά δημιουργούν υποστηρικτικό περιβάλλον για την αναγέννηση των νευραξόνων σε τραυματισμένο εγκέφαλο. Η Ν-συνδεκάνη εκφράζεται στους νευρώνες του εγκεφάλου αλλά όχι στη γλοία (Iseki et al., 2002), και σε καλλιέργειες μεσεγκεφαλικών νευρώνων (Hida et al, 2003). Το μονοπάτι πλειοτροπίνη/νσυνδεκάνη παίζει ρόλο σε διαδικασίες, όπως είναι η μάθηση και η μνήμη (Pavlov et al., 2002). Η Ν-συνδεκάνη απαιτείται για την επιβίωση αισθητικών νευρώνων σε καλλιέργεια από γάγγλια ραχιαίας ρίζας κατά τα πρώτα στάδια εμβρυϊκής 11

ανάπτυξης, αντίθετα η επιβίωση αυτών των νευρώνων από ενήλικους μύες δείχνει να μην επηρεάζεται από την N-συνδεκάνη (Paveliev et al., 2008). Συνεντοπισμός της πλειοτροπίνης και της Ν-συνδεκάνης έχει επιβεβαιωθεί και στους οστεοβλάστες in vivo, όπου αποτελεί υποδοχέα της πλειοτροπίνης, κάτι το οποίο ισχύει και στα προγονικά κύτταρα των οστεοβλαστών (Imai et al., 1998; Tare et al., 2002). Επίσης, η Ν-συνδεκάνη ενδέχεται να αποτελεί υποδοχέα που επηρεάζει τη μιτωτική συμπεριφορά των χονδροκυττάρων και να παίζει ρόλο στο σχηματισμό διμερών/ολιγομερών δομών στην επιφάνεια τους (Kirsch et al., 2002). Η έκφραση της Ν-συνδεκάνης παρατηρείται και στα μυϊκά κύτταρα, και φαίνεται να είναι απαραίτητη για την επαναφορά του μυός έπειτα από τραυματισμό (Casar et al., 2004). Αποτελεί υποδοχέα της πλειοτροπίνης και στα ηπατοκύτταρα (Asahina et al., 2002). Η αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την Ν-συνδεκάνη έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της c-src και της Fyn, αλληλεπιδράσεις της κορτακτίνης (cortactin) και της τουμπουλίνης και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, οδηγώντας έτσι στην ανάπτυξη των νευριτών και στη μετανάστευση των οστεοβλαστών (Kinnunen et al., 1998; Imai et al., 1998) (Εικόνα Ε4). Εικόνα Ε4. Σχηματική αναπαράσταση των σηματοδοτικών μονοπατιών που προκύπτουν από την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην Ν-συνδεκάνη (Mikelis et al., 2007). 12

1.4.2 Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTP β/ζ) Ο RPTPβ/ζ αρχικά αναφέρθηκε ότι εκφράζεται κατά κύριο λόγο στο νευρικό σύστημα και ανήκει στους υποδοχείς με ενδογενή δράση φωσφατάσης τυροσίνης. Το εξωκυττάριο τμήμα της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του υποδοχέα περιλαμβάνει το Ν-τελικό άκρο με δομή καρβονικής ανυδράσης, μια περιοχή ινονεκτίνης τύπου ΙΙΙ και μια περιοχή πλούσια σε σερίνη και γλυκίνη. Το κυτταροπλασματικό τμήμα περιλαμβάνει δυο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες με δράση φωσφατάσης τυροσίνης, με καταλυτικά ενεργή αυτή που βρίσκεται πιο κοντά στη μεμβράνη, και ένα C-τελικό PDZ μοτίβο πρόσδεσης (Krueger and Saito,1992; Levy et al., 1993). Εκτός από τη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή υπάρχουν και άλλες τρεις ισομορφές (Εικόνα Ε5). Μια είναι η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή που διαφέρει από τη μεγάλη κατά 850 αμινοξέα και της λείπει η εξωκυττάρια αλληλουχία που υφίσταται τη γλυκοζυλίωση. Οι δυο άλλες ισομορφές είναι εκκρινόμενες. Η φωσφακάνη είναι πρωτεογλυκάνη που προέρχεται από εναλλακτικό μάτισμα από τη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή και περιέχει το εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα (Barnea et al., 1994; Maurel et al., 1994). Η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης (phosphacan short isoform, PSI) έχει ανακαλυφθεί πιο πρόσφατα, δεν είναι πρωτεογλυκάνη, αλλά υφίσταται μικρού βαθμού γλυκοζυλίωση (Garwood et al., 2003), αν και η ύπαρξή της έχει αμφισβητηθεί (Chow et al., 2008a).O RPTPβ/ζ σε φυσιολογικές συνθήκες υφίσταται και πρωτεόλυση από την MMP-9, το μετατρεπτικό ένζυμο του TNF-α, την πρενεσιλίνη/γ-συκρετάση και την πλασμίνη, οδηγώντας έτσι στην παραγωγή πολλών διαφορετικών μορφών, εκκρινόμενων, διαμεμβρανικών ακόμα και κυτταροπλασματικών (Chow et al., 2008a, b). 13

Εικόνα Ε5. Σχηματική απεικόνιση των ισομορφών του RPTPβ/ζ. Στο σχήμα φαίνονται οι δύο διαμεμβρανικές και οι δυο εκκρινόμενες ισομορφές (Garwood et al., 2003). O RPTPβ/ζ εκφράζεται στο νευρικό σύστημα, όπου φαίνεται να παίζει ρόλο στη μορφογένεση και πλαστικότητα του (Furuta et al., 2004; Levy et al., 1993; Krueger and Saito, 1992; Canoll et al., 1993). Επιπλέον, αυξάνεται μετά από χρόνια θεραπεία με L-DOPA σε παρκινσονικούς ασθενείς (Ferrario et al., 2008), γεγονός που υποδεικνύει ότι ίσως να αποτελεί αποτελεσματικό στόχο για την ανάπτυξη θεραπειών για τη νόσο του Parkinson s. Εκτός από το νευρικό σύστημα, φαίνεται να εκφράζεται και σε ενδοθηλιακά κύτταρα (Polykratis et al., 2005; Polytarchou et al., 2009), καθώς και σε καρκινικά κύτταρα από διάφορους τύπους καρκίνου (Gaits et al., 1994; Goldmann et al., 2000; Lorente et al., 2005; Lu et al., 2005; Foehr et al., 2006; Perez-Pinera et al., 2007b; Bermek et al., 2007), όπου φαίνεται να διαμεσολαβεί τις δράσεις της πλειοτροπίνης και ίσως να αποτελεί θεραπευτικό στόχο (Lorente et al., 2005; Foehr et al., 2006). 14

Η πλειοτροπίνη προσδένεται στον RPTPβ/ζ με μεγάλη χημική συγγένεια, η οποία επηρεάζεται από το ποσοστό της θειϊκής χονδροϊτίνης στον υποδοχέα. Γενικά, θεωρείται ότι μείωση του ποσοστού της θειϊκής χονδροϊτίνης οδηγεί σε μείωση της ικανότητας πρόσδεσης της πλειοτροπίνης στον υποδοχέα. Στην περίπτωση της φωσφακάνης, όπου έχουν γίνει και οι περισσότερες μελέτες, η δομή της θειϊκής χονδροϊτίνης αλλάζει σημαντικά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εγκεφάλου, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα να αλλάζει και η ικανότητα πρόσδεσης της πλειοτροπίνης σε αυτήν, και κατ επέκταση η μεταγωγή σήματος στον εγκέφαλο (Maeda et al.,1998; Qi et al., 2001; Maeda et al., 1996; Maeda et al., 2003). Διάφορα μονοπάτια μεταγωγής σήματος έχουν περιγραφεί να ενεργοποιούνται μετά την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ (Εικόνα Ε6). Ενεργοποίηση του RPTPβ/ζ που σχετίζεται με τη διαδικασία της μνήμης, οδηγεί σε ρύθμιση της ενεργότητας της GTPασης Rho (Tamura et al., 2006). Πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον RPTΡβ/ζ οδηγεί σε αύξηση της φωσφορυλίωσης σε τυροσίνη της β-κατενίνης, με επακόλουθη μείωση της αλληλεπίδρασης με την Ε-καντχερίνη και αποσταθεροποίηση των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων (Meng et al., 2000; Deuel et al., 2002). Μέσω του μονοπατιού RPTPβ/ζ/ΡΤΝ αυξάνεται η φωσφορυλίωση της β-αντουσίνης μέσω της ενεργοποίησης της PKC και η β-αντουσίνη οδηγείται στον πυρήνα. Επιπλέον, επηρεάζονται και οι κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες (Pariser et al., 2005b). H Fyn φαίνεται να αλληλεπιδρά με τον RPTPβ/ζ και η φωσφορυλίωση της αυξάνεται μετά από αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με τον RPTPβ/ζ (Pariser et al., 2005a). Η c-src επίσης αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ, ενεργοποίηση του οποίου από την πλειοτροπίνη οδηγεί σε ενεργοποίηση της c-src, της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (FAK, focal adhesion kinase), της κινάσης της τριφωσφορικής ινοσιτόλης (PI3K) και των κινασών που ρυθμίζονται από εξωκυττάρια σημάτα (ERK1/2) (Polykratis et al., 2005). Τέλος έχει δειχθεί ότι αυξάνεται η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Gif1 (Fukada et al.,2006) και η αλληλεπίδραση με τις Magi1 και Magi3, οι οποίες πιθανά να λειτουργούν ως ικριώματα για άλλα υποστρώματα του υποδοχέα (Fukada et al., 2006; Adamsky et al., 2003). 15

Εικόνα Ε6. Σχηματική απεικόνιση των σηματοδοτικών μονοπατιών που ενεργοποιούνται μετά από πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ (Mikelis et al., 2007). Έχει προταθεί ότι δέσμευση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ επάγει τον ολιγομερισμό του υποδοχέα και την απενεργοποίηση της δράσης του ως φωσφατάση (Meng et al., 2000; Fukada et al.,2006). Απενεργοποίηση του υποδοχέα έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της φωσφορυλίωσης σε τυροσίνη υποστρωμάτων του RPTPβ/ζ, όπως η β-κατενίνη, η Fyn και η β-αντουσίνη (Pariser et al., 2005; Herradon et al., 2009). Από την άλλη πλευρά, δέσμευση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ σε ενδοθηλιακά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα αύξηση της αποφωσφορυλίωσης της τυροσίνης 527 της κινάσης c-src, που έχει ως αποτέλεσμα ενεργοποίηση της τελευταίας και επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης (Polykratis et al., 2005). 16

1.4.3 Κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) O ΑLK είναι μια κινάση τυροσίνης, η οποία εκφράζεται περιστασιακά σε συγκεκριμένες περιοχές τόσο του κεντρικού, όσο και του περιφερικού νευρικού συστήματος. Έχει επίσης εντοπιστεί σε καλλιέργειες ινοβλαστών, επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, όπως σε διάφορες σειρές γλοιοβλαστώματος ή καρκίνου του μαστού (Stoica et al., 2001; Powers et al., 2002; Stoica et al., 2002; Dirks et a., 2002; Lamant et al.,2000; Delsol et al.,1997; Lu et al., 2005; Perez-Pinera et al., 2007a). Δυο μορφές του ALK έχουν εντοπιστεί, μία με μοριακή μάζα 220kDa και μία με μοριακή μάζα 140kDa, με τη δεύτερη να προκύπτει από την πρώτη μετά από πρωτεόλυση (Moog-Lutz et al., 2005; Iwahara et al., 1997; Morris et al., 1997). Ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων της ινσουλίνης, όπως προκύπτει από την υψηλή αμινοξική ομολογία που εμφανίζεται μεταξύ τους (Morris et al., 1994). Η πρώτη περιγραφή ήταν ότι αποτελεί τμήμα μιας ογκογόνου πρωτεΐνης σύντηξης, που αποτελείται από το Ν-τελικό άκρο της νουκλεοπλασμίνης και την καταλυτική περιοχή της κινάσης του αναπλαστικού λεμφώματος (NPM-ALK), πρωτεΐνη που σχετίζεται με το αναπλαστικό λέμφωμα non Hodgikn s (Morris et al., 1994). Ο ΑLK ανθρώπου και μυός αποτελείται από μια εκτεταμένη εξωκυττάρια περιοχή, μια υδρόφοβη διαμεμβρανική, και μια ενδοκυττάρια με δράση κινάσης τυροσίνης. Η εξωκυττάρια περιοχή υφίσταται γλυκοζυλίωση και επίσης παρουσιάζει 50% ομολογία με τον υποδοχέα με δράση τυροσίνης LTK (leukocyte tyrosine kinase). Η ενδοκυττάρια περιοχή με δράση κινάσης τυροσίνης τόσο στον άνθρωπο όσο και στο μυ εμφανίζει αμινοξική ομολογία της τάξης του 98% (Iwahara et al.,1997). Αρχικά χαρακτηρίστηκε ως ορφανός υποδοχέας με σημαντικό ρόλο στην ομαλή ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, αλλά και στις λειτουργίες του (Morris et al., 1997). Υπάρχουν εργασίες που αναφέρουν τον ALK ως λειτουργικό υποδοχέα της πλειοτροπίνης (Εικόνα Ε7), χωρίς όμως να έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως τα σηματοδοτικά μονοπάτια που προκύπτουν από αυτή τη πρόσδεση. Έχει αναφερθεί δέσμευση της πλειοτροπίνης στον ALK έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των MAPK κινασών και την αντιαποπτωτική δράση της 17

πλειοτροπίνης στους ινοβλάστες. Επιπλέον, η επακόλουθη από ενεργοποίηση του ALK ενεργοποίηση των MAPK κινασών και της PI3K οδηγεί σε επαγωγή της ανάπτυξης των κυττάρων (Wang et al., 1997; Stoica et al., 2001; Bowden et al., 2002; Powers et al., 2002). Η χρήση αντισώματος που αναγνωρίζει την περιοχή πρόσδεσης προσδέτη στον ALK έδειξε να ανταγωνίζεται την πρόσδεση της πλειοτροπίνης και να αναστέλλει το μονοπάτι που αυτή επάγει (Stylianou et al.; 2009). Διπλή στόχευση και αποσιώπηση της έκφρασης της πλειοτροπίνης και του ALK είναι πιο αποτελεσματική κατά της ογκογένεσης, σε σχέση με τη στόχευση κάθε μορίου χωριστά (Grzelinski et al., 2009). Παρόλα αυτά, υπάρχουν και αναφορές που αμφισβητούν το αν η πλειοτροπίνη αποτελεί ή όχι προσδέτη του ALK (Moog-Lutz et al., 2005; Dirks et a., 2002). Αυτό μπορεί εν μέρει να οφείλεται στο γεγονός ότι η μια μόνο από τις δυο μορφές της πλειοτροπίνης που έχουν προσδιοριστεί προσδένεται στον ALK και επάγεται κατά αυτό τον τρόπο ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων στο γλοιοβλάστωμα (Lu et al., 2005). Μια άλλη θεωρία είναι ότι η πλειοτροπίνη ενεργοποιεί τον ALK έμμεσα, επάγοντας την απενεργοποίηση του RPTPβ/ζ (Perez-Pinera et al., 2007a, 2007b). Ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας του ενδοκυττάριου τμήματος του ALK έδειξε ότι υπάρχουν πιθανές θέσεις πρόσδεσεις για την Shc (SH2 phosphotyrosine-binding adapter protein), την PI3K, την rasgap (Ras GTPaseactivating protein), τον IRS1(insulin receptor substrate 1), τον Grb2(Growth factor receptor-bound substrate 2) και την PLCγ (phospholipase γ) (Morris et al., 1997). Ανοσοκακρήμνιση της πρωτεΐνης σύντηξης NMP-ALK έδειξε ότι υπάρχει φυσική σύνδεση με τα μόρια IRS1, Grb2 και Shc (Fujimoto et al.,1996). Πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον ΑLK οδηγεί σε συγκέντρωση των IRS1 και Shc και ενεργοποίηση τους από τον ALK (Stoica et al., 2001; Fujimoto et al.,1996; Bischof et al., 1997), ενώ η επιστράτευση του Grb2 γίνεται έμμεσα (Piccinini et al.,2002). Το σηματοδοτικό μονοπάτι της PI3K είναι σημαντικό για τη μιτογόνο δράση που προκύπτει από την ενεργοποίηση του ALK, ενώ το μονοπάτι των MAPK κινασών που ενεργοποιείται από την αλληλεπίδραση πλειοτροπίνης/alk είναι σημαντικό για τη διαφοροποίηση των νευρώνων (Souttou et al., 2001). 18

Εικόνα Ε7. Σχηματική απεικόνιση των μορίων μεταγωγής σήματος που έχουν αναφερθεί να ενεργοποιούνται μετά από πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον ALK (Mikelis et al., 2007). 1.4.4 Άλλοι υποδοχείς ή συν-υποδοχείς της πλειοτροπίνης Η πλειοτροπίνη είναι γνωστό ότι προσδένεται σε πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης, καθώς και σε αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης και θειϊκής δερματάνης, οι οποίες εντοπίζονται τόσο στο εξωκυττάριο υλικό, όσο και στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (Martin et al., 2006; Kinnunen et al., 1999; Vacherot et al., 1999; Deepa et al., 2002; Bao et al., 2004b; Nandini et al., 2004; Nandini et al., 2005; Bao et al., 2005a). Η αλληλεπίδραση παίζει ρόλο σε ιδιότητες της πλειοτροπίνης όπως είναι ο διμερισμός της (Bernard-Pierrot et al., 1999), ή χρησιμεύει ως «αποθηκευτικός» χώρος για την πλειοτροπίνη (Papadimitriou et al., 2000). Αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με τη θειϊκή χονδροϊτίνη φαίνεται να παίζει ρόλο στο σχηματισμό του νευρικού συστήματος (Maeda et al., 1996, 2003; Deepa et al., 2002; Xingfeng et al., 2004; Kadomatsu and Muramatsu, 2004; Bao et al., 2005b; Maeda et al., 2006; Li et al., 2007) και στην ανάπτυξη όγκων (Malavaki et al., 2008). Επίσης έχει αναφερθεί ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες 19

προστατεύουν την πλειοτροπίνη από πρωτεόλυση από την πλασμίνη (Polykratis et al., 2004). Σημαντικός παράγοντας για την ισχυρή πρόσδεση της πλειοτροπίνης στις αλυσίδες της θειϊκής χονδροϊτίνης είναι η περιεκτικότητα αυτών στους δισακχαρίτες Ε (Zou et al., 2000; Umehara et al., 2004). Πέραν όμως της σύστασης, σημαντικό ρόλο στην πρόσδεση της πλειοτροπίνης παίζει και το μήκος των αλυσίδων, αφού το ελάχιστο στο οποίο έχει βρεθεί να προσδένεται είναι οκτασακχαρίτης (Bao et al., 2005b). Οι μονάδες IdoUA(2S) 1-3GalNAc(4S), IdoUA 1-3GalNAc(4S,6S) και IdoUA 1-3GalNAc(4S), εμφανίζουν μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης με την πλειοτροπίνη σε σχέση με άλλες αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης/δερματάνης (Li et al., 2007). Μελέτες στο Xenopus laevis έχουν δείξει ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες υφίστανται δομικές αλλαγές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, κάτι το οποίο πιθανά να επηρεάζει και τη συγγένεια με την οποία η πλειοτροπίνη προσδένεται σε αυτές (Yamada et al., 2009). Μικρού μοριακού βάρους πρωτεογλυκάνες με τις οποίες αλληλεπιδρά η πλειοτροπίνη είναι η αγκρίνη (agrin), μια πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης που εκφράζεται στα κινητικά νεύρα (Daggett et al., 1996) και η νευροκάνη (neurocan), η οποία ανήκει στην οικογένεια των πρωτεογλυκανών θειϊκής χονδροϊτίνης που προσδένονται στο υαλουρονικό και παίζει ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος (Milev et al.,1998). Η νουκλεολίνη θεωρείται επίσης υποδοχέας της πλειοτροπίνης, ο οποίος όμως εμφανίζει μικρή συγγένεια με αυτήν, και ίσως εμπλέκεται με τη μεταφορά της πλειοτροπίνης στον πυρήνα (Take et al., 1994; Said et al., 2005). Τέλος, προσφάτως έχει δειχθεί ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αποτελεί υποδοχέα της πλειοτροπίνης, η παρουσία του οποίου είναι απαραίτητη για την επαγωγή της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ. Σε κύτταρα που εκφράζουν τον RPTPβ/ζ αλλά όχι την ιντεγκρίνη α ν β 3, η πλειοτροπίνη προκαλεί αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης (Mikelis et al., 2009). 20

1.5 Σχέση δομής-δράσης Διαφορετικά τμήματα της πλειοτροπίνης φαίνεται να σχετίζονται με διαφορετικές δράσεις. Έχουν γίνει προσπάθειες για την αποσαφήνιση αυτών των δράσεων και των περιοχών που τις προκαλούν, χωρίς πάντως μέχρι σήμερα να έχουν προκύψει κάποια τελικά συμπεράσματα. Όπως έχει προαναφερθεί, το μόριο της πλειοτροπίνης περιλαμβάνει δυο περιοχές TSR-1 που σχετίζονται με την πρόσδεση της στην ηπαρίνη (Kilpelainen et al., 2000) και την επαγωγή της ανάπτυξης των νευριτών (Raulo et al., 2005). Με βάση τις παρατηρήσεις αυτές, πεπτίδια που αντιστοιχούν στις περιοχές TSR έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διευκρίνηση του ρόλου τους στις διάφορες βιολογικές δράσεις της πλειοτροπίνης. Συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στην περιοχή C-TSR-1 αναστέλλει την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην ηπαρίνη και κατ επέκταση τη μιτογόνο δράση της και τις αγγειογενετικές της ιδιότητες τόσο in vivo όσο και in vitro (Hamma- Kourbali et al.,2008). Μια άλλη παρατήρηση για το πεπτίδιο C-TSR-1 είναι ότι έχει την ιδιότητα να αναστέλλει τη μόλυνση που προκαλείται από τον ιό HIV, καθώς προσδένεται στις πρωτεογλυκάνες και στη νουκλεολίνη που είναι σημαντικές για την είσοδο του ιού στα κύτταρα. Η δράση αυτή είναι πιο έντονη όταν συνυπάρχουν και οι δυο περιοχές TSR-1 (Said et al., 2005). Έχει βρεθεί επίσης ότι παίζει ρόλο στην καρκινική αγγειογένεση, ενώ η περιοχή N-TSR-1 εμπλέκεται κυρίως στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Zhang et al., 2006). Αρκετές είναι και οι αναφορές για το καρβοξυτελικό άκρο της πλειοτροπίνης, το οποίο αν και δε φαίνεται να εμπλέκεται στην ανάπτυξη των νευριτών, εν τούτοις φαίνεται να παίζει ρόλο στις μιτωτικές της δράσεις και στην ανάπτυξη των όγκων. Συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα 111-136 της πλειοτροπίνης οδηγεί σε αναστολή της δράσης ολόκληρης της πλειοτροπίνης στα κύτταρα NIH-3T3 και MDA-MB 231 και μείωση της ικανότητα της πλειοτροπίνης να προσδένεται στους υποδοχείς της ALK (Bernard- Pierrot et al., 2002) και RPTPβ/ζ (Bermek et al., 2007). Μεταλλαγμένη πλειοτροπίνη της οποίας λείπουν τα 25 τελευταία αμινοξέα δεν είναι ικανή να επάγει το σηματοδοτικό μονοπάτι της πλειοτροπίνης (Bernard-Pierrot et al., 2001) και αναστέλλει τις δράσεις του ενδογενούς μορίου σε κύτταρα MDA-MB231, 21

πιθανά σχηματίζοντας με αυτό μη λειτουργικά διμερή (Bernard-Pierrot et al, 2002; Duces et al, 2008). Τέλος, έχει αναφερθεί η ύπαρξη δυο μορφών της πλειοτροπίνης που εκκρίνονται από τα κύτταρα, μία με μοριακή μάζα σε SDS-PAGE 15 kda (PTN15) και μία με μοριακή μάζα σε SDS-PAGE 18 kda (PTN18). Η PTN15 αλληλεπιδρά με τον ALK και επάγει το πολλαπλασιασμό των κυττάρων γλοιώματος, ενώ η PTN18 αλληλεπιδρά με τον RPTPβ/ζ και επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων γλοιώματος (Lu et al., 2005). 1.6 Πλειοτροπίνη και καρκίνος 1.6.1 Ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων Η πλειοτροπίνη εντοπίστηκε αρχικά στο θρεπτικό μέσο καρκινικών κυττάρων MDA-MB231 (Lupu et al., 1992) και θεωρήθηκε ότι παίζει ρόλο στον καρκίνο. Από τότε έχει εντοπιστεί να εκφράζεται σε διάφορες καρκινικές σειρές, όπως σε καρκίνο του μαστού, προστάτη, ωοθηκών, πνεύμονα, παγκρέατος, ήπατος και θυρεοειδούς, σε χοριοκαρκίνωμα, σε μηνιγγίωμα, στο μελάνωμα, σε πολλαπλό μυέλωμα και στο γλοιοβλάστωμα (Papadimitriou et al., 2004; Grzelinski et al., 2005; Grzelinski et al., 2006; Tong et al., 2006; Chen et al., 2007; Park et al., 2008; Ameur et al., 2009). Αύξηση της έκφρασης της πλειοτροπίνης σε φυσιολογικά κύτταρα οδηγεί στην εκδήλωση καρκινικού φαινοτύπου, με αύξηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού και του σχηματισμού όγκων σε ανοσοκατεσταλμένους μύες in vivo (Chauhan et al., 1993), χαλάρωση των κυτταρικών συνδέσεων με αποικοδόμηση της Ν-καντχερίνης και αναδιοργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού (Perez-Pinera et al., 2006). Σε αναλογία με αυτά τα αποτελέσματα, μείωση της έκφρασης της πλειοτροπίνης σε καρκινικά κύτταρα μαστού (Choudhuri et al., 1997; Chang et al., 2007) προστάτη (Vacherot et al., 1999; Hatziapostolou et al., 2005), μελανώματος (Czubayko et al., 1994; Czubayko et al., 1996; Wu et al., 2005) και πολλαπλού μυελώματος (Chen et al., 2007), οδηγεί σε μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων αυτών in vitro και in vivo και επαγωγή της απόπτωσης τους. Μείωση της έκφρασης της πλειοτροπίνης σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG οδηγεί σε τετραπλοειδία και ανευπλοειδία, 22

καθώς και σε καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 (Chang et al., 2006). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, έλλειψη του ογκοκατασταλτικού γονιδίου pten οδηγεί σε υπερκέκφραση της πλειοτροπίνης (Li et al., 2006). Εκτός από αποτελέσματα που καταδεικνύουν μια θετική δράση της πλειοτροπίνης στην καρκινική ανάπτυξη, υπάρχουν και περιπτώσεις όπου εμφανίζονται τα αντίθετα αποτελέσματα. Σε καρκίνο του κόλον τα επίπεδα του mrna της είναι μειωμένα σε σύγκριση με τις γειτονικές, υγιείς περιοχές (Yamakawa et al., 1999). Επίσης είναι μικρή η έκφραση της στο νευροβλάστωμα (Nakagawara et al., 1995; Calvet et al., 2006), όπου η αυξημένη έκφραση σχετίζεται με καλύτερη κλινική πορεία των ασθενών (Calvet et al., 2006). Τέλος, φαίνεται να επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη και τη μετανάστευση κυττάρων γλοιοβλαστώματος επίμυ in vitro (Parthymou et al., 2008). 1.6.2 Καρκινική αγγειογένεση Μια άλλη σημαντική βιολογική δράση της πλειοτροπίνης είναι και η επίδραση της στην αγγειογένεση. Υπάρχουν αρκετές αναφορές για την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στην αγγειογένεση, τόσο in vivo όσο και in vitro. Σε in vitro πειράματα, επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό τους, καθώς και την ικανότητα τους να σχηματίζουν αυλούς σε διάφορα υποστρώματα (Hampton et al., 1992; Papadimitriou et al., 2000; Papadimitriou et al., 2001; Polykratis et al., 2005; Souttou et al.,2001; Courty et al., 1991; Fang et al., 1992; Laaroubi et al., 1995; Delbe et al., 1995; Brockmann et al., 2003). Η παραπάνω παρατήρηση έχει επιβεβαιωθεί in vivo σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας και σε εμφύτευμα matrigel σε μυς (Papadimitriou et al., 2001; Bernard-Pierrot et al., 2002). Σε μονοκύτταρα/μακροφάγα, η πλειοτροπίνη επάγει τη διαφοροποίηση τους προς λειτουργικά ενδοθηλιακά κύτταρα (Sharifi et al., 2006). Πρόσδεση της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ την καθιστά ενδιάμεσο μόριο για τη διεγερτική δράση του μονοπατιου enos/no στη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro (Polytarchou et al., 2009). Υπάρχουν πάντως και αντίθετα αποτελέσματα που αναφέρουν ότι η πλειοτροπίνη συνδέεται με τον αγγειογενετικό παράγοντα VEGF και αναστέλλει την επαγωγική του δράση στη μετανάστευση και στον 23

πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Heroult et al., 2004; Kokolakis et al., 2006). Επιπλέον, η έκφραση της πλειοτροπίνης φαίνεται να επάγεται άμεσα από το μεταγραφικό παράγοντα HOXΑ5 (Chen et al., 2005), ο οποίος έχει αναφερθεί να αναστέλλει την αγγειογένεση (Rhoads et al., 2005). Εκτός από το ρόλο της στη φυσιολογική αγγειογένεση, η πλειοτροπίνη φαίνεται να συμμετέχει και στην αγγειογένεση των όγκων. Ελάττωση της έκφρασης της πλειοτροπίνης στο χοριοκαρκίνωμα έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ανάπτυξης και της μετάστασης του όγκου, που οφείλεται σε μείωση της αγγειογένεσης (Schulte et al., 1996). Στόχευση από ριβοένζυμο του mrna της πλειοτροπίνης που εκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των αγγείων στον πρωταρχικό όγκο και της μεταστατικής ικανότητας σε αθυμικούς μύες (Czubayko et al., 1996). Πλειοτροπίνη που έχει απομονωθεί από καρκίνο του πνεύμονα επάγει τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro (Jager et al., 1997). Πλειοτροπίνη που παράγεται από κύτταρα MCF-7 επάγει την αγγειογένεση in vivo (Choudhuri et al., 1997), ενώ η πλειοτροπίνη έχει επίσης συσχετιστεί με τη μετάσταση καρκινικών κυττάρων μαστού μυός (Sugino et al., 2002). Πλειοτροπίνη που εκκρίνεται από ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη επάγει την αγγειογένεση in vivo και in vitro (Hatziapolstolou et al., 2005). Παραγωγή της πλειοτροπίνης από κύτταρα του πολλαπλού μυελώματος επάγει τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων προς ενδοθηλιακά αγγειακά κύτταρα (Chen et al., 2009). Πλειοτροπίνη που απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές από καρκίνο του πνεύμονα έχει επαγωγική δράση στις λειτουργίες των ινοβλαστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων καρκίνου των επινεφριδίων (Jager et al., 1997). Παρόλα αυτά έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία και αντίθετη δράση, δηλαδή αγγειοστατική σε in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος ανθεκτικό στην ιρινοτεκάνη. Στο μοντέλο αυτό, αυξημένη έκφραση της πλειοτροπίνης σχετίζεται με μικρή αγγείωση και με καλή πρόγνωση (Calvet et al., 2006). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, αναστολή της έκφρασής της σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος επίμυ οδηγεί σε αυξημένη ικανότητα των κυττάρων αυτών να προκαλέσουν αγγειογένεση in vitro και in vivo (Parthymou et al., 2008). 24