ΕΝΖΥΜΑ Ενζυµικοί µηχανισµοί 1
Ενζυµικοί µηχανισµοί Μελετώντας τους ενζυµικούς µηχανισµούς ίσως να αντιληφθούµε την αξία των ενζύµων στη φύση αλλά και τις εφαρµογές τους στην καθηµερινότητα. 2
Επαγόµενη προσαρµογή πρόσδεσης ενζύµου-υποστρώµατος n Το αρχικό µοντέλο του Emil Fischer: κλειδί (S)-κλειδαριά (E) βελτιώνεται. n Τόσο το ένζυµο όσο και το υπόστρωµα (ή το µεταβατικό σύµπλοκο) έχουν ευελιξία n Η πρόσδεση επάγει αλλαγές στη διαµόρφωση του ενζύµου. 3
Παράδειγµα της εξοκινάσης της γλυκόζης n Γλυκόζη + ATP Γλυκόζη-6-P + ADP n Πρόβληµα: παρουσία νερού δεν γίνεται η αντίδραση n Το ένζυµο υπάρχει σε ανοικτή και κλειστή µορφή n Η γλυκόζη επάγει την κλειστή µορφή, το νερό όχι n Η µετατροπή στη κλειστή µορφή απαιτεί ενέργεια 4
Δοµή της εξοκινάσης της γλυκόζης 5
Τρόπος πρόσδεσης: αποτελεσµατική σύνδεση της ενδιάµεσης κατάστασης n Η µεταβατική κατάσταση ενός υποστρώµατος πρός το προϊόν ταιριάζει πολύ καλύτερα (γεωµετρικά και ηλεκτροστατικά) στην ενεργό θέση του ενζύµου από ό,τι το υπόστρωµα. n Αυτή η βελτιωµένη προσαρµογή µειώνει την ενέργεια της µεταβατικής κατάστασης του συστήµατος σε σχέση µε το υπόστρωµα. n Οι καλύτεροι ανταγωνιστικοί αναστολείς ενός ενζύµου είναι εκείνοι που µοιάζουν µε το ενδιάµεσο προϊόν της µεταβατική κατάσταση παρά το υπόστρωµα ή το προϊόν. 6
Επαγώµενη προσαρµογή: Μεταφέροντας την «τάση» στο υπόστρωµα Οµάδες από κατάλοιπα αµινοξέων στο ενεργό κέντρο που αλληλεπιδρούν µε το υπόστρωµα σχηµατίζουν περιοχές µε ειδικές δοµικές και χηµικές ιδιότητες αναγκαίες για τη σταθεροποίηση της µεταβατικής κατάστασης του υποστρώµατος προς το προϊόν. 7
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µερικά από τα 20 αµινοξέα για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις Ποιά αµινοξέα µπορούν να συµµετέχουν στο καταλυτικό κέντρο σαν ενεργά αµινοξέα και γιατί; Τα χηµικώς ενεργά αµινοξέα S, D, E, R, K, H, C, Y Ποιά αµινοξέα µπορούν να συµµετέχουν στο καταλυτικό κέντρο σαν αµινοξέα αναγνώρισης του υποστρώµατος και γιατί; ΟΛΑ 8
ΕS σύµπλεγµα-μεταβατική κατάσταση-ανάλογα µεταβατικής κατάστασης Ανάλογα µεταβατικής κατάστασης δεσµεύονται πολύ ισχυρά µε το ενεργό κέντρο του ενζύµου. Μια τυπική σταθερά διάστασης της τάξεως 10-15 M δείχνει εξαιρετικά σταθερή σύνδεση. Η φύση της µεταβατικής κατάστασης του S µπορεί να διερευνηθεί χρησιµοποιώντας ανάλογα µεταβατικής κατάστασης, τα οποία είναι σταθερά µόρια και είναι χηµικά και δοµικά παρόµοια µε τη µεταβατική κατάσταση του υποστρώµατος. 9
Ρακεµάση της προλίνης Ένα παράδειγµα είναι το πυρρολο-2-καρβοξυλικό άλας το οποίο προσδένεται σε ρακεµάση της προλίνης 160 φορές πιο σταθερά από ό,τι το κανονικό υπόστρωµα L-προλίνη. 10
Δραστικές οµάδες ενζύµων Η ιστιδίνη: µπορεί να παίρνει/δίνει Η + σε ουδέτερο ph (ενδοκυτταρικά) Η θειοαλκοολική οµάδα (-SH) είναι πυρηνόφιλη Τα καρβοξυλικά ιόντα (γλουταµινικού, ασπαρτικού) χρησιµεύουν σαν αποδέκτες Η + (όξινη βασική κατάλυση) Η σερίνη (-OH) συµβάλλει στη οµοιοπολική δέσµευση του υποστρώµατος Η αργινίνη µπορεί: να δεσµεύσει όξινες οµάδες (ΗPO 3-2, -COO - ) και να αντιδρά µε καρβονυλικές ενώσεις προς σχηµατισµό βάσης Schiff. 11
Δραστικές οµάδες ενζύµων 12
Oι δραστικές οµάδες των αµινοξικών καταλοίπων έχουν τις ίδιες χηµικές ιδιότητες στο ένζυµο σε σχέση µε το διάλυµα? n Οι τιµές pk a των οµάδων της πλευρικής αλυσίδας κάποιου αµινοξέος εντός της ενεργούς περιοχής των ενζύµων µπορεί να είναι αρκετά διαφορετικές από εκείνες σε διάλυµα n Εάν ένα καρβοξυλικό οξύ είναι σε µη πολική περιοχή, το pk a του θα αυξηθεί. n Γλουταµικό-35 στο σύµπλοκο λυσοζύµη glycolchitin έχει pκ α από 8,2 pκ a, ενώ το διάλυµα είναι το 4,5. n Αν το καρβοξυλικό ιόν σχηµατίσει γέφυρα άλατος σταθεροποείται και έχει χαµηλότερο pk a 13
ΕS σύµπλεγµα Μη οµοιoπολικές αλληλεπιδράσεις Ηλεκτροστατικέςιονικές + RNH 3 O O C Ιονικά δίπολα R δ C δ O + NH 3 R' Δίπολο-δίπολo δ O R C δ R' δ O H δ H-δεσµοί O RC O H O H Μεταφορά φορτίου D A A D Υδροφοβικότητα O RC O 14
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις Τα ένζυµα χρησιµοποιούν πέντε βασικές στρατηγικές για να σχηµατίσουν και να σταθεροποιήσουν τη µεταβατική κατάσταση του S προς P: 1. τη χρήση της ενέργειας πρόσδεσης, 2. την οµοιοπολική κατάλυση, 3. τη γενική οξεοβασική κατάλυση, 4. την κατάλυση από ιόντα µετάλλων, 5. την κατάλυση µε προσέγγιση. 15
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης Η ενέργεια σύνδεσης της ES είναι ζωτικής σηµασίας για την κατάλυση Γιατί η X (ενδιάµεση κατάσταση) σταθεροποιείται περισσότερο από το S στο ενεργό κέντρο του ενζύµου; Οι ευνοϊκές αλληλεπιδράσεις µεταξύ υποστρώµατος και ενεργών πλάγιων αλυσίδων των αµινοξέων του είναι σηµαντικά για την εγγενή ενέργειας δέσµευσης ΔG b. 16
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης Η ενέργεια σύνδεσης της ES είναι ζωτικής σηµασίας για την κατάλυση Η εγγενής ενέργεια σύνδεσης εξασφαλίζει το σχηµατισµό του συµπλόκου ES. Eάν δεν εξισορροπηθεί καθιστά την ενέργεια ενεργοποίησης για την ενζυµική αντίδραση που καταλύει αδικαιολόγητα µεγάλη και αρκετή σπάταλη από την καταλυτική δύναµη του ενζύµου. H ενζυµική ταχύτητα καθορίζεται από τη διαφορά στην ενέργεια µεταξύ ES και EX. Όσο µικρότερη είναι αυτή η διαφορά, τόσο πιο γρήγορα γίνεται η αντίδραση καταλυόµενη από ένζυµο. Ως εκ τούτου, πολύ σφιχτή πρόσδεση του υποστρώµατος και του ενζύµου βαθαίνει την ενέργεια του συµπλόκου ES και οδηγεί σε χαµηλότερα ποσοστά αντίδρασης, άρα χαµηλότερη ταχύτητα. 17
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης Απώλεια Εντροπίας και αποσταθεροποίηση του συµπλέγµατος ES Aυξάνοντας την ενέργεια του ES αυξάνεται η ταχύτητα της ενζυµικής αντίδρασης. Aυτό µπορεί να επιτευχθεί µε δύο τρόπους: απώλεια της εντροπίας που οφείλεται στην πρόσδεση του S στο Ε, και αποσταθεροποίηση των ES από δοµικές τάσεις, παραµόρφωση, αποδιαλύτωση, ή κάποια άλλη δράση. 18
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης Απώλεια εντροπίας, προέρχεται από το γεγονός ότι το σύµπλεγµα ES είναι µια πολύ οργανωµένη δοµή χαµηλής εντροπίας σε σύγκριση µε το E + S σε διάλυµα (στο διάλυµα είναι µια διαταραγµένη, υψηλής εντροπίας κατάσταση). Το υπόστρωµα και το ένζυµο διαθέτουν εντροπία λόγω κίνησης και εντροπία λόγω περιστροφής. Οι δύο τύποι της εντροπίας αυτής µειώνονται σηµαντικά όταν το σύµπλοκο ES σχηµατίζεται. Εφόσον το ΔS είναι αρνητικό, όταν σχηµατίζεται το ES, ο όρος - TΔS γίνεται θετικός Ως εκ τούτου, η εγγενής ενέργεια σύνδεσης του ES αντισταθµίζεται, ως ένα βαθµό, από την απώλεια εντροπίας που συνοδεύει το σχηµατισµό του συµπλόκου ES. 19
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης Αποσταθεροποίηση του συµπλόκου ES (ΔG d ) µπορεί να περιλαµβάνει δοµικές τάσεις αποδιαλύτωσης, ή ηλεκτροστατικά φαινόµενα. Αποσταθεροποίηση µέσω τάσεων ή δοµικές τροποποιήσεις οφείλεται στην επαγώµενη προσαρµογή του ενζύµου, υποστρώµατος ή και των δύο κατά το σχηµατισµό του συµπλόκου ES. Μετά την πρόσδεση του S στο Ε, τα S και Ε αλλάζουν τη διαµόρφωση µέχρις ότου τα δραστική οµάδα του αµινοξικού καταλοίπoυ προσανατολίζεται για µια ακριβή προσαρµογή στη δοµή του µεταβατικού συµπλόκου αλλά λιγότερο τέλεια τακτοποίηση για το S και το P. H αποσταθεροποίηση µπορεί επίσης να περιλαµβάνει αποδιαλύτωση των φορτισµένων οµάδων επί του S κατά τη σύνδεση του στη ενεργή θέση του Ε. Όταν οι φορτισµένες οµάδες του υποστρώµατος µετακινούνται στην ενεργό περιοχή ενός ενζύµου αποµακρύνονται τα µόρια νερού. Αυτό καθιστά το σύµπλεγµα ES λιγότερο σταθερό και ως εκ τούτου πιο χηµικά δραστικό. 20
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης Όταν ένα υπόστρωµα εισέρχεται εντός του ενεργού κέντρου του ενζύµου, φορτισµένες οµάδες επί του υποστρώµατος µπορεί να αναγκαστούν να αλληλεπιδράσουν µη ευνοϊκά µε φορτία, σαν ένα είδος υπογραφής στο ένζυµο, µε αποτέλεσµα ηλεκτροστατική αποσταθεροποίηση. Εάν το φορτίο του υποστρώµατος µειώνεται ή χάνεται κατά τη διάρκεια της αντίδραση, τότε ηλεκτροστατική αποσταθεροποίηση µπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της ταχύτητας. 21
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 1. Χρήση ενέργειας πρόσδεσης H αποσταθεροποίηση αυξάνει την ελεύθερη ενέργεια του συµπλέγµατος ES, και η αύξηση αυτή δρά αθροίστικά στην ελεύθερη ενέργεια αποσταθεροποίησης (ΔG d ). Η καθαρή ενεργειακή διαφορά µεταξύ E + S και της ES είναι το άθροισµα των η εγγενής ενέργεια δέσµευσης, (ΔG b ), η απώλεια της εντροπίας για την πρόσδεση (-TΔS), και η ενέργεια στρέβλωση (ΔG d ). Το ES αποσταθεροποιείται (αύξηση της ενέργειας) από το ποσό των ΔG d -TΔS. Η µεταβατική κατάσταση δεν υπόκεινται σε αποσταθεροποίηση, και η διαφορά µεταξύ των ενεργειών του Χ και EX είναι η πλήρης εγγενή ενέργεια σύνδεσης. 22
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 2. Οµοιοπολική κατάλυση Στην οµοιοπολική κατάλυση, το ενεργό κέντρο περιέχει µια ενεργό οµάδα, συνήθως ένα ισχυρό πυρηνόφιλο το οποίο στην πορεία της κατάλυσης προσωρινά τροποποιείται οµοιοπολικά. 23
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 2. Οµοιοπολική κατάλυση Σκεφτείτε την αντίδραση BX +Y -> X + BY Και µια ενζυµατική εκδοχή που περιλαµβάνει σχηµατισµό ενός οµοιοπολικού ενδιαµέσου: BX + E -> E:B + X + Y -> E + BY Για την καταλυόµενη αντίδραση σε σχέση µε την µη καταλυόµενη πρέπει η οµάδα δέκτης στο ένζυµο να είναι µια δυνατώτερη οµάδα χηµικής δραστικότητα από το Υ και το Χ να εγκαταλείπει την αντίδραση ταχύτερα. 24
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 2. Οµοιοπολική κατάλυση Τα περισσότερα ένζυµα που πραγµατοποιούν οµοιοπολική κατάλυση διαθέτουν µηχανισµούς πινγκπονγκ. Οι πλευρικές αλυσίδες των αµινοξικών καταλοίπων στα ένζυµα προσφέρουν µια ευρεία ποικιλία πυρηνόφιλων κέντρων κατάλυσης συµπεριλαµβανοµένων αµινών, καρβοξυλικά, αρύλια και αλκυλ υδροξύλια, ιµιδαζόλες και οµάδες θειόλης. 25
Οµοιοπολική κατάλυση: Νουκλεοφιλική κατάλυση Activated carbonyl X R O Y R X O - Y -Y - Z - R X 1.1 O X + R O Z X - Πλέον συχνά αµινοξικά κατάλοιπα Cys (SH) Ser (OH) His (imidazole) Lys (NH 2 ) Asp/Glu (COO - ) 26
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 2. Οµοιοπολική κατάλυση Αυτές οι οµάδες επιτίθενται σε ηλεκτρόφιλα κέντρα των υποστρωµάτων, σχηµατίζοντας οµοιοπολικά συνδεδεµένο ES ενδιάµεσο. Τυπικά υποστρώµατα µε ηλεκτροφιλικά κέντρα περιλαµβάνουν φωσφορυλοµάδες, ακυλο οµάδες και γλυκοσυλικές οµάδες. Οµοιοπολική ηλεκτροφιλική κατάλυση επίσης περιλαµβάνει συνένζυµα που δηµιουργούν ηλεκτρονιόφιλα κέντρα. 27
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Οι πρωτεάσες σερίνης είναι µια τάξη πρωτεολυτικών ενζύµων των οποίων η καταλυτική µηχανισµός βασίζεται σε µια σερίνη στην καταλυτική θέση του ενζύµου. Η οικογένεια πρωτεάσες σερίνης περιλαµβάνει θρυψίνη, χυµοθρυψίνη, ελαστάση, θροµβίνη, σουµπτιλισίνη, πλασµίνη, ενεργοποιητής πλασµινογόνου ιστού, και άλλα συναφή ένζυµα 28
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Τα πρώτα τρία είναι πεπτικά ένζυµα, τα οποία συντίθενται στο πάγκρεας και εκκρίνεται εντός του πεπτικού σωλήνα, όπως ανενεργά ζυµογόνα. Στην πεπτική οδό επιλεκτική πρωτεολυτική διάσπαση του ζυµογόνου αποδίδει την δραστική µορφή του ενζύµου. 29
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης n Η θρυψίνη, χυµοθρυψίνη, ελαστάση είναι όλα πρωτεολυτικά ένζυµα, αλλά έχουν ιδιαιτερότητές. n Θρυψίνη διασπά την πλευρά καρβονυλίου του Lys ή Arg. n Xυµοθρυψίνη διασπά στην καρβονυλική πλευρά των αρωµατικών αµινοξέων. n Ελαστάση διασπά την πλευρά των µικρών καρβονυλίου στα ουδέτερα αµινοξικά κατάλοιπα. n Tα τρία ένζυµα έχουν όλα Mr από ~ 25000 και όλα έχουν σχετιζόµενες αλληλουχίες και 3Dδοµές. 30
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης n Η θρυψίνη διασπά την πλευρά καρβονυλίου της Lys ή Arg. n Η χυµοθρυψίνη διασπά στην πλευρά καρβονυλ αρωµατικών αµινοξέων. n Η ελαστάση διασπά την πλευρά των µικρών καρβονυλίου ουδέτερα υπολείµµατα. n Tα τρία ένζυµα έχουν όλα Mr από ~ 25000 και όλα έχουν σχετιζόµενες αλληλουχίες και 3 διαστάσεων δοµές. 31
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Χυµοθρυψίνη έχει ένα θύλακα δραστικής θέσης περιβάλλεται από υδρόφοβα υπολείµµατα και αρκετά µεγάλη για να φιλοξενήσει αρωµατικές πλευρικές αλυσίδες. Η θήκη στη θρυψίνη έχει αρνητικό φορτίο (Asp 189) στον πυθµένα, διευκολύνοντας την πρόσδεση του θετικά φορτισµένο Arg και Lys. Ελαστάση έχει ένα ρηχό τσέπη µε ογκώδη θρεονίνη και βαλίνη υπολειµµάτων κατά το άνοιγµα. Μόνο µικρές, µη ογκώδη υπολείµµατα µπορούν να φιλοξενηθούν. 32
Καταλυτική τριάδα Η καταλυτική τριάδα της Asp-102, His-57, και Ser-195 βρίσκεται σε µια κατά προσέγγιση γραµµική διάταξη σε όλες τις πρωτεάσες σερίνης. 33
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Μία τυπική δοµή δίνεται για χυµοθρυψίνη Το σχήµα είναι ελλειψοειδές και περιέχει µία α-έλικα στο C-τερµατικό άκρο και αρκετές β-πτυχωτές επιφάνειες. Τα περισσότερα από τα αρωµατικά και υδρόφοβα αµινοξέα είναι θαµµένα στο εσωτερικό της πρωτεΐνης, και τα περισσότερα από τα φορτισµένα ή υδρόφιλα αµινοξικά κατάλοιπα είναι στην επιφάνεια. 34
Καταλυτική τριάδα της α-chymotrypsin. Οι αποστάσεις είναι: d 1 = 2.82 Å; d 2 = 2.61 Å; d 3 = 2.76 Å. Καταλυτική τριάδα
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Το ενεργό κέντρο της χυµοθρυψίνης, που είναι σηµειωµένο από τη Ser-195, βρίσκεται σε µια σχισµή στην επιφάνεια του ενζύµου Η πλευρική αλυσίδα της Ser-195 είναι συνδεδεµένη µε δεσµό υδρογόνου µε τον ιµιδαζολικό δακτύλιο της His-57. Η οµάδα -ΝΗ του ιµιδαζολικού δακτυλίου µε τη σειρά της ενώνεται µε δεσµό υδρογόνου µε την καρβοξυλική οµάδα του Asp-102. Η οµάδα αυτή των καταλοίπων αναφέρεται ως η καταλυτική τριάδα. 36
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Πώς αυτή η διάταξη των καταλοίπων οδηγεί στην υψηλή δραστικότητα της Ser-195; Η His-57 χρησιµεύει στην τοποθέτηση της πλευρικής αλυσίδας της Ser-195 και στην πόλωση της υδροξυλικής οµάδας. Έτσι, το κατάλοιπο δρα ως ένας γενικός βασικός καταλύτης, ένας δέκτης ιόντων υδρογόνου, διότι η πολωµένη υδροξυλική οµάδα του καταλοίπου της Ser-195 βρίσκεται σε ετοιµότητα για αποπρωτονίωση. Η αφαίρεση ενός Η + από την υδροξυλική οµάδα παράγει ένα ιόν αλκοξειδίου, το οποίο είναι πολύ πιο ισχυρό πυρηνόφιλο από ό,τι είναι η αλκοόλη. Το κατάλοιπο του Asp-102 βοηθά στον προσανατολισµό της His-57 και στο να το κάνει έναν καλύτερο δέκτη H + µέσω ηλεκτροστατικών επιδράσεων. 37
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Μετά από την πρόσδεση του υποστρώµατος (βήµα 1), η αντίδραση αρχίζει µε την πυρηνοφιλική προσβολή της υδροξυλικής οµάδας της Ser-195 στο καρβονυλικό άτοµο άνθρακα του υποστρώµατος (βήµα 2). 38
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Η πυρηνοφιλική προσβολή αλλάζει τη γεωµετρία από επίπεδη τριγωνική σε τετραεδρική γύρω από αυτό το άτοµο άνθρακα. Το εκ φύσεως ασταθές τετραεδρικό ενδιάµεσο που σχηµατίζεται έχει ένα τυπικό αρνητικό φορτίο στο άτοµο οξυγόνου που προέρχεται από την καρβοξυλική οµάδα. Αυτό το φορτίο σταθεροποιείται µε αλληλεπιδράσεις µε οµάδες ΝΗ από την πρωτεϊνη σε µια θέση που καλείται οπή οξυανιόντος. Oι αλληλεπιδράσεις αυτές βοηθούν στη σταθεροποίηση της µεταβατικής κατάστασης που προηγείται του σχηµατισµού του τετραεδρικού ενδιαµέσου. 39
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Στη συνέχεια, αυτό το τετραεδρικό ενδιάµεσο καταρρέει για να παραχθεί το ακυλοένζυµο (βήµα 3). 40
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Αυτό το βήµα διευκολύνεται από τη µεταφορά ενός πρωτονίου από το θετικά φορτισµένο κατάλοιπο της ιστιδίνης στην αµινική οµάδα που σχηµατίζεται από τη διάσπαση του πεπτιδικού δεσµού. Το αµινικό συστατικό είναι τώρα ελεύθερο να αποχωριστεί από το ένζυµο (βήµα 4) 41
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Το αµινικό συστατικό είναι τώρα ελεύθερο να αποχωριστεί από το ένζυµο (βήµα 4) και αντικαθίσταται από ένα µόριο ύδατος (βήµα 5). 42
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Στη συνέχεια υδρολύεται η εστερική οµάδα του ακυλοενζύµου από µια πορεία που είναι ουσιαστικά επανάληψη των βηµάτων 2 έως 4. Το µόριο ύδατος προσβάλλει την καρβονυλική οµάδα ενώ ταυτόχρονα αφαιρείται ένα πρωτόνιο από το κατάλοιπο της ιστιδίνης, το οποίο τώρα δρα ως ένας γενικός όξινος καταλύτης, σχηµατίζοντας ένα τετραεδρικό ενδιάµεσο (βήµα 6). 43
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Αυτή η δοµή διασπάται για να σχηµατίσει το προϊόν καρβοξυλικό οξύ (βήµα 7). 44
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Τελικά, η απελευθέρωση του προϊόντος ετοιµάζει το ένζυµο για έναν άλλο κύκλο κατάλυσης. 45
Ο µηχανισµός πρωτεασών Σερίνης Η εξειδίκευση της χυµοθρυψίνης εξαρτάται ολοκληρωτικά από το ποιο αµινοξύ βρίσκεται αµέσως µετά από το αµινο-τελικό άκρο του πεπτιδικού δεσµού που πρόκειται να διασπαστεί. Άλλες πρωτεάσες έχουν πιο περίπλοκο τύπο εξειδίκευσης, όπως εµφανώς δείχνεται στην Εικόνα 9.11. Τέτοια ένζυµα έχουν στις επιφάνειές τους επιπρόσθετες θήκες για την αναγνώριση και άλλων καταλοίπων του υποστρώµατος. Κατάλοιπα στο αµινοτελικό άκρο του πεπτιδικού δεσµού που πρόκειται να διασπαστεί σηµαίνονται ως P1, Ρ2, Ρ3, και ούτω καθεξής, δείχνοντας τη θέση τους σε σχέση µε τον δεσµό που πρόκειται να διασπαστεί. Παροµοίως, κατάλοιπα στο καρβοξυτελικό άκρο του δεσµού που πρόκειται να διασπαστεί σηµαίνονται ως P1', Ρ2', Ρ3' και ούτω καθεξής. Οι περιοχές που αντιστοιχούν επάνω στο ένζυµο αναφέρονται ως S1, S2, ή S1', S2' και ούτω καθεξής. 46
Τρόποι κατάλυση στις προτεάσες της serine n Κατάλυση µε προσέγγιση: συγκέντρωση των αντιδρώντων στα βήµατα 1 και 4 n Υδρόλυση πεπτιδiου από τη χυµοθρυψίνη. n Ο µηχανισµός υδρόλυσnς πεπτιδiων δειχνεl εµφανώς τις αρχές τnς οµοιοπολικής (βήµατα 2-5) και οξεοβασικής κατάλυσnς (βήµατα 2 και 4). 47
Cysteinyl πρωτεάσες n Σχετίζεται προγονικά µε τις πρωτεάσες της Ser n Καθεψίνες, κασπάσες, παπαϊνη n Διαφορές Cys SH περισσότερο βασική από την Ser OH Τα αµινοξέα είναι λιγότερο υδροφιλικά S - είναι ασθενέστερο νουκλεόφιλο από το O - 48
Το ενεργό κέντρο της παπαίνης 49
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 3. Oξεο-βασική κατάλυση. Υπάρχουν δύο τύποι οξέο-βασικής κατάλυσης: 1. ειδική κατάλυση οξέος-βάσης, στην οποία Η + και ΟΗ - επιταχύνουν την αντίδρασης, και 2. γενική κατάλυση οξέος-βάσης στην οποία ένα οξύ ή βάση, εκτός από Η + ή ΟΗ - επιταχύνει την αντίδραση. 50
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 3. Oξεο-βασική κατάλυση. Στην ειδική οξεοβασική κατάλυση η συγκέντρωση του ρυθµιστικού διαλύµατος δεν έχει καµία επίδραση στην ταχύτητα της αντίδρασης. Στη γενική οξεοβασική κατάλυση, το ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να παρέχει ή να δέχεται ένα Η + στην µεταβατική κατάσταση και ως εκ τούτου να επηρεάζουν την ταχύτητα της αντίδρασης. 51
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 3. Oξεο-βασική κατάλυση. Εξ ορισµού, η γενική οξεο-βασική κατάλυση είναι η κατάλυση στην οποία ένα πρωτόνιο µεταφέρεται στη µεταβατική κατάσταση. Γενική οξεο-βασική κατάλυση µπορεί να αυξήσει την αντίδραση κατά 10-100 φορές. Ιονίσιµες οµάδες σε ένζυµα είναι πιο αποτελεσµατικές διότι δρούν σαν παράγοντες µεταφοράς ένα Η + στο ή κοντά pκα του. Το pka της ιστιδίνης είναι κοντά στο 7, για αυτό είναι συχνά αποτελεσµατικό αµινοξύ σε γενική οξεοβασική κατάλυση, ενδοκυτταρικά. 52
Η λυσοζύµη του λευκού του αυγού n n n Αντιβακτηριδιακό προστατευτικό του αναπτυσσόµενου εµβρύου όρνιθας Υδρολύει βακτηριακές πεπτιδογλυκάνες του κυτταρικού τοιχώµατος Εµπορικώς διαθέσιµο σε καθαρή µορφή Εύκολο να κρυσταλλώσει και να κάνει τη δουλειά δοµή Διατίθεται σε πολλαπλές µορφές κρυστάλλου Ο µηχανισµός είναι εκπληκτικά περίπλοκος 53
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 4. Κατάλυση ιόντος µετάλλου. Τα ιόντα µετάλλων µπορούν να λειτουργήσουν καταλυτικά µε αρκετούς τρόπους. Π.χ. ένα ιόν µετάλλου µπορεί να χρησιµεύσει ως ηλεκτρόφιλος καταλύτης, σταθεροποιώντας ένα αρνητικό φορτίο σε ένα ενδιάµεσο της αντίδρασης. Εναλλακτικά, το ιόν µετάλλου uπορεί να παραγάγει ένα πυρηνόφιλο αυξάνοντας την οξύτητα ενός γειτονικού µορίου, όπως το νερό στην ενυδάτωση του CO 2 από την ανθρακική ανυδράση. Τελικά, το ιόν µετάλλου µπορεί να προσδεθεί σε ένα υπόστρωµα, αυξάνοντας τον αριθµό των αλληλεπιδράσεων µε το ένζυµο και έτσι την ενέργεια πρόσδεσης. 54
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 4. Κατάλυση ιόντος µετάλλου. Κάνοντας µια γρήγορη αντίδραση γρηγορότερη: ανθρακικές ανυδράσες Οι ανθρακικές ανυδράσες καταλύουν την αντίδραση του νερού µε το διοξείδιο του άνθρακα για την παραγωγή ανθρακικού οξέος. Η κατάλυση µπορεί να είναι πάρα πολύ γρήγορη: µόρια µερικών ανθρακικών ανυδρασών ενυδατώνουν διοξείδιο του άνθρακα µε ταχύτητες τόσο υψηλές όσο 1 εκατοµµύριο φορές το δευτερόλεπτο. 55
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 4. Κατάλυση ιόντος µετάλλου. Λόγω των φυσιολογικών ρόλων του διοξειδίου του άνθρακα και των ιόντων όξινου ανθρακικού, η ταχύτητα είναι η ουσία για το ένζυµο αυτό. Για να ξεπεραστούν οι περιορισµοί που επιβάλλονται από την ταχύτητα της µεταφοράς των πρωτονίων από το µόριο ύδατος που είναι προσδεµένο στον ψευδάργυρο, στις πιο ενεργές ανθρακικές ανυδράσες έχει προκύψει µέσω εξέλιξης ένας φορέας πρωτονίων για να µεταφέρει πρωτόνια σε ένα ρυθµιστικό διάλυµα. Το δέσιµο του Η 2 Ο στον Zn 2+ µειώνει το pka του από 15.7 στο 7. Αυτό επιτρέπει τον σχηµατισµό ισχυρού HO - νουκλεόφιλου σε ουδέτερο ph 56
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 4. Κατάλυση ιόντος µετάλλου. Ένα σφιχτά προσδεµένο ιόν ψευδαργύρου είναι κρίσιµο συστατικό του ενεργού κέντρου αυτών των ενζύµων. Κάθε Zn 2+ προσδένει ένα µόριο ύδατος και προάγει την αποπρωτονίωση για να παραγάγει σε ουδέτερο ρη ένα ιόν υδροξυλίου. Το υδροξύλιο αυτό επιτίθεται στο διοξείδιο του άνθρακα για να σχηµατίσει ιόν όξινου ανθρακικού, HC0 3-. 57
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 5. Κατάλυση µε προσέγγιση-εγγύτητα. Οι χηµικές αντιδράσεις προχωράνε πιο γρήγορα όταν τα αντιδρώντα είναι σε εγγύτητα. Ένζυµα, τα οποία έχουν θέσεις πρόσδεσης για µόρια αντίδρασης, αποµακρύνει τα αντιδρώντα από το διάλυµα και τα κρατάει κοντά µεταξύ τους για να ανταλλάξουν χηµικές οµάδες (φωσφορυλιώσεις, µεθυλιώσεις κλπ) 58
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 5. Κατάλυση µε προσέγγιση. Κινάσες µονοφωσφορικώννουκλεοζητών: καταλύουν την ανταλλαγή φωσφορικών οµάδων µεταξύ νουκλεοτιδίων χωρίς να προάγουν την υδρόλυση. Τελικά, οι κινάσες ΝΜΡ δείχνουν εµφανώς ότι η επαγόµενη προσαρµογή η µεταβολή της δοµής του ενζύµου κατά την πρόσδεση του υποστρώµατος διευκολύνει τη µεταφορά φωσφορικής οµάδας µάλλον µεταξύ νουκλεοτιδίων παρά σε ένα µόριο ύδατος. 59
Τα ένζυµα χρησιµοποιούν µία από τις ακόλουθες στρατηγικές για να καταλύσουν ειδικές αντιδράσεις 5. Κατάλυση µε προσέγγιση. Αυτά τα ένζυµα εξαρτώνται από ιόντα µετάλλων, αλλά τα ιόντα προσδένονται στο υπόστρωµα αντί απευθείας στο ένζυµο. Η πρόσδεση του ιόντος µετάλλου στον τριφωσφορικό νουκλεοζίτη αυξάνει την εξειδίκευση στις αλληλεπιδράσεις ενζύµουυποστρώµατος,κρατώντας το νουκλεοτίδιο σε µια καλά καθορισµένη στερεοδιάταξη και παρέχοντας επιπρόσθετα σηµεία αλληλεπίδρασης που αυξάνουν έτσι την ενέργεια πρόσδεσης. 60
Υψηλή ενζυµική εξειδίκευση n Περιοριστικά ένζυµα: εκτελώντας πολύ εξειδικευµένες αντιδράσεις διάσπασης του DNA n Ένα υψηλό επίπεδο εξειδίκευσης υποστρώµατος είναι συχνά το κλειδί στη βιολογική λειτουργία. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες που διασπούν DNA σε ειδικές αλληλουχίες αναγνώρισης διακρίνουν µεταξύ µορίων που περιέχουν αυτές τις αλληλουχίες αναγνώρισης και εκείνων που δεν τις περιέχουν. n Μέσα στο σύµπλοκο ενζύµου-υποστρώµατος,το υπόστρωµα DNA παραµορφώνεταιµε έναν τρόπο ο οποίος παράγει µια θέση πρόσδεσης ιόντος µαγνησίου µεταξύ του ενζύµου και του DNA. 61
Υψηλή ενζυµική εξειδίκευση n n n Το ιόν µαγνησίου προσδένει και ενεργοποιεί ένα µόριο ύδατος, το οποίο επιτίθεται στον φωσφοδιεστερικό κορµό. Μερικά ένζυµα κάνουν διάκριση µεταξύ δυνητικών υποστρωµάτων µε το να τα προσδένουν µε διαφορετικές συγγένειες. Άλλα ίσως προσδένουν πολλά δυνητικά υποστρώµατα, αλλά προάγουν αποτελεσµατικά χηµικές αντιδράσεις µόνο µε ειδικά µόρια. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες, όπως η ενδονουκλεάση EcoRV, χρησιµοποιούν τον τελευταίο µηχανισµό για να επιτύχουν επίπεδα διάκρισης τόσο υψηλά όσο ένα εκατοµµύριο φορές. 62
Υψηλή ενζυµική εξειδίκευση n n n Δοµικές µελέτες αποκαλύπτουν ότι τα ένζυµα αυτά ίσως προσδένουν µη ειδικά µόρια DNA, αλλά τέτοια µόρια δεν παραµορφώνονται µε έναν τρόπο που να επιτρέπει την πρόσδεση ιόντος µαγνησίου και ως εκ τούτου την κατάλυση. Τα περιοριστικά ένζυµα εµποδίζονται από το να δρουν στο DNA ενός κυττάρου-ξενιστή µε µεθυλίωση των σηµαντικών θέσεων µέσα στις αλληλουχίες αναγνώρισης. Οι προστιθέµενες µεθυλικές οµάδες εµποδίζουν ειδικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ του ενζύµου και του DNA έτσι ώστε δεν λαµβάνει χώρα αυτή η παραµόρφωση που είναι αναγκαία για τη διάσπαση. 63
Συγκλίνουσα εξέλιξη Επανεµφάνιση της τριάδας ser-his-asp σε άσχετα µεταξύ τους ένζυµα 64
Αποκλίνουσα εξέλιξη n Προγονικές ευκαρυωτικές πρωτεάσες της σερίνης πιθανόν διαφοροποιήθηκαν σε διαφορετικές ευκαρυωτικές σερινοπρωτεάσες προφανώς έχουν διαφοροποιηθεί σε µορφές µε διαφορετικές ειδικότητες πλευρικής αλυσίδας. n Χυµοθρυψίνη είναι ουσιαστικά συντηρηµένη εντός των ευκαρυωτικών, αλλά είναι σαφώς διαφορετική από ελαστάση. 65