Ζωικά πρότυπα κακόηθους υπεζωκοτικής συλλογής

Ανασκόπηση Ζωικά πρότυπα κακόηθους υπεζωκοτικής συλλογής Μαριάνθη Ηλιοπούλου, MD, 1 Αντωνία Μαραζιώτη, PhD, 2 Γεώργιος Σταθόπουλος, MD, PhD 3 1 Ιατρός, Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες 2 Βιολόγος PhD, Μεταδιδακτορική Ερευνήτρια 3 Ιατρός PhD, Επίκουρος Καθηγητής Φυσιολογίας Λέξεις κλειδιά: - Κακοήθης υπεζωκοτική συλλογή, - Ζωικά πρότυπα, - Καρκίνος, - Αγγειογένεση, - Φλεγμονή Περiληψη. Η κακοήθης υπεζωκοτική συλλογή (ΚΥΣ) είναι μια κοινή επιπλοκή σε προχωρημένες κακοήθειες, όπως του πνεύμονα και του μαστού. Οι ασθενείς με ΚΥΣ παρουσιάζουν περιορισμένο χρόνο επιβίωσης και εξαιρετικά πτωχή ποιότητα ζωής. Φυσιολογικά, η υπεζωκοτική κοιλότητα περιέχει ένα λεπτό στρώμα υγρού, το οποίο παράγεται με αγγειακή διήθηση της συστηματικής κυκλοφορίας και απομακρύνεται μέσω των λεμφαγγείων. Κάθε επαγόμενη από νεοπλασία επιτάχυνση της παραγωγής και παρεμπόδιση της απομάκρυνσης του πλευριτικού υγρού έχει ως απότοκο τη δημιουργία ΚΥΣ. Μέχρι πρόσφατα, οι μηχανισμοί που οδηγούν σε συσσώρευση πλευριτικού υγρού δεν είχαν χαρακτηριστεί, διότι οι μελέτες για την παθογένεια της ΚΥΣ ήταν περιορισμένες ελλείψει κατάλληλων ζωικών προτύπων που θα μπορούσαν να αναπαραγάγουν την παθοβιολογία της ανθρώπινης ΚΥΣ. Ωστόσο κατά τη διάρκεια της περασμένης δεκαετίας, διάφορες ερευνητικές ομάδες ανέπτυξαν πειραματικά πρότυπα που μιμούνταν την δημιουργία της ανθρώπινης ΚΥΣ, συμπεριλαμβανομένων μοντέλων που απαιτούσαν ανοσοκατασταλμένους ή ανοσοεπαρκείς ποντικούς. Αυτά τα πειραματικά πρότυπα ΚΥΣ παρέχουν σημαντικές πληροφορίες ως προς τη βιολογική συμπεριφορά των νεοπλασματικών κυττάρων όπως επίσης και ως προς τις αλληλεπιδράσεις όγκου-ξενιστή στην υπεζωκοτική κοιλότητα, ανοίγοντας τον δρόμο για αποτελεσματικούς θεραπευτικούς χειρισμούς αυτής της ασθένειας. Πνεύμων 2013, 26(3):210-215. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αλληλογραφία: Αντωνία Μαραζιώτη, PhD; Εργαστήριο Μοριακής Καρκινογένεσης Αναπνευστικού, Τομέας Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, 2 ος όροφος, Αίθουσα B40, Πανεπιστημιούπολη Πατρών, 26504 Ρίο, Τηλ.: +30 2610-969116, Fax: +30 2610-997215, E-mail: amarazioti@upatras.gr. H κακοήθης υπεζωκοτική συλλογή (ΚΥΣ) αποτελεί σημαντικό κλινικό πρόβλημα, προσβάλλοντας ετησίως 7.000 ασθενείς μόνο στην Ελλάδα. Κατατάσσεται στη 2 η θέση κατά σειρά συχνότητας αιτία εξιδρωματικής υπεζωκοτικής συλλογής μετά από την παραπνευμονική συλλογή 1,2. Η επίπτωσή της είναι μεγάλη (500-700 περιστατικά ανά 100.000 κατοίκους/έτος), αγγίζοντας σχεδόν τη συχνότητα επίπτωσης του καρκίνου του πνεύμονα 3. H ΚΥΣ αποτελεί ως επί το πλείστον μεταστατική νόσο 4. Προκαλείται από

ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 3ο, Τόμος 26ος, Ιούλιος - Σεπτέμβριος 2013 211 πρωτοπαθείς ή μεταστατικούς όγκους που εξορμούνται από άλλες περιοχές. Συγκεκριμένα η ΚΥΣ προκύπτει λόγω μετάστασης αδενοκαρκινώματος πνεύμονα στην υπεζωκοτική κοιλότητα σε ένα ποσοστό 37,5% 2. Ακολουθεί ο καρκίνος του μαστού σε ποσοστό 17% και αιματολογικές κακοήθειες, π.χ. λεμφώματα σε ποσοστό 11,5%. Νεοπλάσματα του γαστρεντερικού και του ουροποιητικού συστήματος έπονται σε ποσοστά που ανέρχονται στο 7% και 9,5% αντίστοιχα ενώ η πρωτοπαθής εστία δεν ανευρίσκεται σε ένα ποσοστό 11% 5. Η κακοήθης υπεζωκοτική συλλογή ισοδυναμεί με προχωρημένη συστημική νόσο, χαμηλό προσδόκιμο επιβίωσης και κακή ποιότητα ζωής. Πιο συγκεκριμένα, η μέση επιβίωση κυμαίνεται περίπου στους 3-12 μήνες κατά την διάρκεια των οποίων ο ασθενής υποφέρει από δύσπνοια, βήχα και πόνο στο στήθος, ενώ παρουσιάζει απώλεια βάρους, ανορεξία και έντονη κόπωση. Οι θεραπευτικοί χειρισμοί σε ΚΥΣ που γίνονται σήμερα είναι κυρίως ανακουφιστικοί και στόχο έχουν τον περιορισμό της δύσπνοιας που προκαλεί η συλλογή. Αυτό επιτυγχάνεται είτε μέσω απομάκρυνσης του πλευριτικού υγρού είτε μέσω αποτροπής της συσσώρευσής του. Η απομάκρυνση του υγρού πραγματοποιείται είτε με επανειλημμένες παρακεντήσεις είτε με «μόνιμους» ενδοϋπεζωκοτικούς καθετήρες. Η αποτροπή της συσσώρευσης του υγρού πραγματοποιείται είτε μέσω πλευρεκτομής είτε μέσω πλευρόδεσης (με έγχυση σκληρυντικών μέσων π.χ. τάλκη, παράγωγα τετρακυκλίνης, μπλεομυκίνη) 6. ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΚΥΣ Ο υπεζωκότας είναι λεπτή, ελαστική και ορρώδης μεμβράνη, η οποία περιβάλλει την εξωτερική επιφάνεια του πνευμονικού παρεγχύματος και την εσωτερική επιφάνεια του θωρακικού τοιχώματος. Αποτελείται από δύο πέταλα, περίτονο και περισπλάχνιο, μεταξύ των οποίων δημιουργείται η υπεζωκοτική κοιλότητα. Φυσιολογικά η υπεζωκοτική κοιλότητα περιέχει μικρή ποσότητα υγρού που ονομάζεται υπεζωκοτικό υγρό 7. Το υπεζωκοτικό υγρό παράγεται με διαδιήθηση από τα τριχοειδή του τοιχωματικού υπεζωκότα ενώ απομακρύνεται από τα λεμφαγγεία που εξορμούνται από τα στόματα αυτού. Ο οργανισμός έχει τη δυνατότητα να απομακρύνει 20-30 φορές περισσότερο υπεζωκοτικό υγρό από αυτό που παράγεται σε φυσιολογικές καταστάσεις 8. Η ΚΥΣ σχηματίζεται όταν ο ρυθμός με τον οποίο απομακρύνεται το υπεζωκοτικό υγρό είναι μικρότερος από τον ρυθμό με τον οποίο παράγεται. Έχει υποστηριχθεί ότι η δημιουργία της ΚΥΣ οφείλεται κυρίως σε μείωση της παροχέτευσης του υπεζωκοτικού υγρού λόγω απόφραξης από νεοπλασματικά κύτταρα ή νεοπλασματικό ιστό της οδού παροχέτευσης, λόγου χάριν επί επινέμεσης των στομάτων του τοιχωματικού υπεζωκότα 9,10. Ωστόσο, νεότερα δεδομένα υποδεικνύουν ότι βασική προϋπόθεση δημιουργίας της ΚΥΣ είναι η αλληλεπίδραση όγκου ξενιστή, δηλαδή των καρκινικών κυττάρων με τα μεσοθηλιακά και φλεγμονώδη κύτταρα του υπεζωκότα, με αποτέλεσμα την τοπική παραγωγή φλεγμονωδών και αγγειογενετικών μεσολαβητών που προάγουν τρεις σημαντικές διαδικασίες: τη φλεγμονή, την αγγειογένεση και την αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας στην υπεζωκοτική κοιλότητα. Επακόλουθο αυτών των διαδικασιών είναι η αυξημένη παραγωγή υγρού 11. ΖΩΙΚΑ ΠΡΟΤΥΠΑ ΚΥΣ Ανάπτυξη του κατάλληλου ζωικού προτύπου Την περασμένη δεκαετία, η έρευνα στη ΚΥΣ παρουσίασε σημαντική πρόοδο χωρίς όμως αντίκτυπο στην κλινική έκβαση της νόσου. Η επιλογή ενός απλού και εφικτού πειραματικού ζωικού προτύπου αποτελεί έναν απλό τρόπο μελέτης της παθογένειας και της θεραπευτικής της ΚΥΣ. Πράγματι, αναπτύχθηκαν ζωικά πρότυπα τα οποία παρείχαν νέα δεδομένα για τους μηχανισμούς δημιουργίας της ΚΥΣ. Οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες αναπτύχθηκαν σε εργαστηριακά ποντίκια, τα οποία προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα περιλαμβανομένων το ότι διακρίνονται από 90% ομολογία στο γονιδίωμα τους με τον άνθρωπο, έχουν μικρό μέγεθος σώματος, γρήγορη ανάπτυξη νεοπλασμάτων, υπάρχουν πολλά καθαρά αλλά και γενετικώς τροποποιημένα στελέχη και έχει αλληλουχηθεί ολόκληρο το γονιδίωμά τους. Περιστασιακά, έχουν χρησιμοποιηθεί μεγαλύτερα ζώα, όπως τα κουνέλια και οι αρουραίοι, τα οποία λόγω μεγέθους προσφέρουν ευκολότερους πειραματικούς χειρισμούς και επαρκές βιολογικό υλικό για περαιτέρω εξέταση. Η αποτελεσματική εγκατάσταση νεοπλασματικών κυττάρων και ιστού στον υπεζωκοτικό χώρο δύναται να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους εμφύτευσης, όπως: Θωρακοτομή, όπου γίνεται ορθοτοπική εμφύτευση προσφάτως απομονωμένου κακοήθους ιστού. Ο όγκος δένεται στο περίτονο και περισπλάχνιο πέταλο του υπεζωκότα. Αυτή η μέθοδος προσφέρει ένα γοργό ρυθμό ανάπτυξης της νεοπλασίας ωστόσο είναι επεμβατική και οδυνηρή γεγονός που θα μπορούσε να επηρεάσει αρνητικά το αναπνευστικό σύστημα των ζώων 12,13.

212 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 3ο, Τόμος 26ος, Ιούλιος - Σεπτέμβριος 2013 Ενδοφλέβια έγχυση, με την οποία επιτυγχάνεται η μεταφορά καρκινικών κυττάρων μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας στα αγγεία του πνεύμονα και από εκεί στην υπεζωκοτική κοιλότητα. Πράγματι, η ενδοφλέβια έγχυση ανθρώπινων κυττάρων αδενοκαρκινώματος πνεύμονα προκαλεί πολλές βλάβες στο πνευμονικό παρέγχυμα, υπεζωκοτικές μεταστάσεις και πλευριτικές συλλογές 14-16. Αυτή η προσέγγιση προσομοιάζει με την μετάσταση στην υπεζωκοτική κοιλότητα στον άνθρωπο αλλά σχετίζεται με υψηλή θνησιμότητα των πειραματόζωων κατά την διαδικασία της εμφύτευσης. Επιπρόσθετα, μια επιτυχής αναπαραγωγή της ΚΥΣ με αυτή τη μέθοδο είναι εφικτή μόνο όταν χρησιμοποιούνται συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινωμάτων πνεύμονα. Ενδοϋπεζωκοτική έγχυση, όπου ένας μικρός αριθμός καρκινικών κυτταρικών σειρών που βρίσκονται σε καλλιέργεια εμφυτεύεται στην υπεζωκοτική κοιλότητα μέσω μιας μικρής τομής του δέρματος στην αριστερή προσθιοπλάγια θωρακική περιοχή. Αυτή η έγχυση έχει ως απότοκο τη δημιουργία τοπικών εμφυτεύσεων στο θωρακικό τοίχωμα, στο μεσοθωράκιο, στους πνεύμονες και στο διάφραγμα. Οι πλευριτικές συλλογές (που συνήθως είναι αιμορραγικές) αναπτύσσονται λίγες εβδομάδες μετά την εμφύτευση, μιμούμενες το προχωρημένο στάδιο της ανθρώπινης νόσου 17. Αυτή η μέθοδος δεν σχετίζεται με θνητότητα αφού απαιτείται ελάχιστη χειρουργική παρέμβαση και έχει τα πλεονεκτήματα της επιτόπιας επιβεβαίωσης της ορθοτοπικής μεταφοράς των νεοπλασματικών κυττάρων στον υπεζωκοτικό χώρο καθώς και της πλήρους και επιτυχούς αναπαραγωγής. Για τους λόγους αυτούς, τα πρότυπα ενδοϋπεζωκοτικής ορθοτοπικής εμφύτευσης υπερισχύουν στη μελέτη της ΚΥΣ. Η ανοσολογική κατάσταση του ζώου που χρησιμοποιείται μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του όγκου και την εξέλιξή του in vivo. Ανοσοανεπαρκή ζώα έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως πρότυπα ΚΥΣ. Πολλά αλλογενή νεοπλασματικά κύτταρα έχουν εισαχθεί επιτυχώς στον υπεζωκοτικό χώρο ανοσοανεπαρκών ποντικών και αρουραίων, συνοδευόμενα από σχηματισμό ΚΥΣ 14,15,18-20. Ωστόσο, τα παραπάνω ζωικά πρότυπα δεν αντιπροσωπεύουν την πραγματική νεοπλασματική ανάπτυξη στο πραγματικό περιβάλλον μιας και ο σχηματισμός της ΚΥΣ είναι αποτέλεσμα σύνθετων αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στον όγκο και το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. Επομένως καθίσταται σημαντικό τα δύο εμπλεκόμενα βιολογικά υποκείμενα να προέρχονται από το ίδιο είδος ώστε να εξασφαλίζεται η πλήρης αναπαραγωγή του βιολογικού φαινομένου που λαμβάνει χώρα στην υπεζωκοτική κοιλότητα. Τα πειραματικά πρότυπα ΚΥΣ που χρησιμοποιούν ανοσοεπαρκή ξενιστή στον οποίο εμφυτεύονται συγγενή νεοπλάσματα μπορούν καλύτερα να προσομοιάσουν την ΚΥΣ 17,21,22. Συγκεκριμένα, η ενδοϋπεζωκοτική έγχυση καρκινικών κυττάρων σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς μιμείται σε μεγάλο βαθμό την ανθρώπινη νόσο και όλοι οι ποντικοί αναπτύσσουν ΚΥΣ 17. Αυτό το μοντέλο έχει το πλεονέκτημα ότι το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή είναι άθικτο, με αποτέλεσμα το μικροπεριβάλλον του όγκου να αναπαράγεται όσο το δυνατόν καλύτερα καθιστώντας εφικτή τη μελέτη του ρόλου συγκεκριμένων μορίων και γονιδίων στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου σε όλα τα στάδια της ασθένειας. Ένα μειονέκτημα είναι ότι χρησιμοποιούνται νεοπλάσματα ποντικού τα οποία ίσως αντιδρούν διαφορετικά από τα αντίστοιχα ανθρώπινα στους πιθανούς θεραπευτικούς χειρισμούς. Επιμέρους Ζωϊκά Πρότυπα ΚΥΣ Μόνο ένα γενετικό ζωικό πρότυπο αυθόρμητης δημιουργίας ΚΥΣ υπάρχει προς το παρόν 28. Πιο συγκεκριμένα, οι ερευνητές δημιούργησαν ένα υπό όρους διαγονιδιακό ποντίκι με μεσοθηλιακά κύτταρα υπεζωκότα που είναι ανεπαρκή σε συγκεκριμένα γονίδια που βρίσκονται συχνά μεταλλαγμένα στο ανθρώπινο μεσοθηλίωμα (NF2;Ink 4a /Arf; 53). Το πειραματικό πρότυπο που προκύπτει αποτελεί ένα υπό όρους μοντέλο κακοήθους μεσοθηλιώματος συνοδευόμενο από σχηματισμό ΚΥΣ. Η πλειονότητα των ζωικών προτύπων ΚΥΣ έχει αναπτυχθεί σε ανοσοανεπαρκείς ξενιστές. Στα ανοσοανεπαρκή ζώα που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνονται τα severe combined immunodeficient (SCID) 18,19 και τα αθυμικά 14,15 ποντίκια καθώς επίσης και οι ανοσοανεπαρκείς αρουραίοι 20. Ο Yano και οι συνεργάτες του (2000) δημιούργησαν ένα πρότυπο ΚΥΣ χρησιμοποιώντας αθυμικούς ποντικούς. Κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα δίνονταν ενδοφλέβια προκαλώντας βλάβες στο πνευμονικό παρέγχυμα και εισβάλλοντας στον υπεζωκοτικό χώρο με αποτέλεσμα την ανάπτυξη ΚΥΣ 14. Το μοντέλο αυτό αναπαράχθηκε επιτυχώς από και από μια άλλη ερευνητική ομάδα 15. Αν και η ενδοφλέβια μεταφορά καρκινικών κυττάρων μιμείται την αιματογενή μετάσταση, λείπει ο πρωτοπαθής όγκος ως πηγή της μετάστασης. Επομένως, η εμφύτευση του όγκου ορθοτοπικά φαίνεται να σχετίζεται περισσότερο με την κλινική κατάσταση. Ο Boehle και οι συνεργάτες του εγκαθίδρυσαν ένα μοντέλο ορθοτοπικής μεταμόσχευσης ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα με επακόλουθο σχηματισμό ΚΥΣ. Πιο συγκεκριμένα, χορηγήθηκαν ενδοπνευμονικά και ενδοϋπεζωκοτικά κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς με 80%-

ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 3ο, Τόμος 26ος, Ιούλιος - Σεπτέμβριος 2013 213 100% ποσοστό επιτυχούς μεταμόσχευσης 18. Παρόμοια μοντέλα ορθοτοπικής εμφύτευσης σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς χρησιμοποιήθηκαν για επαγωγή ΚΥΣ και από άλλες ερευνητικές ομάδες 19,25,29. Κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μεσοθηλιώματος ή ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα εμφυτεύθηκαν ενδοϋπεζωκοτικά σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς και οδήγησαν στην τοπική ανάπτυξη του όγκου και τη δημιουργία ΚΥΣ. Επιπρόσθετα, ένα ορθοτοπικό μοντέλο αναπτύχθηκε σε ανοσοανεπαρκείς αρουραίους στο οποίο αναπτύχθηκε ΚΥΣ μετά από χορήγηση ανθρώπινων κυττάρων αδενοκαρκινώματος πνεύμονα απευθείας στη θωρακική κοιλότητα 20. Η χρησιμοποίηση ανοσοανεπαρκών ποντικών για την εμφύτευση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων στην υπεζωκοτική κοιλότητα έχουν συνεισφέρει σημαντικά στην κατανόηση των βασικών πτυχών της ΚΥΣ. Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα που υποδεικνύουν τη σημαντική επιρροή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου στη νεοπλασματική ανάπτυξη και εξέλιξη οδήγησε στην χρήση ανοσοεπαρκών προτύπων. Ο Kimura και οι συνεργάτες του εμφύτευσαν meth A ινοσάρκωμα στον υπεζωκοτικό χώρο συγγενικών Balb/c ποντικών 21. Επίσης άλλο ένα μοντέλο ΚΥΣ δημιουργήθηκε σε ανοσοεπαρκή νεοζηλανδέζικα λευκά κουνέλια με ενδοϋπεζωκοτική εγκατάσταση σαρκώματος κουνελιού VX2 22,30,31. Ένα ακόμα σχετικό και 100% αναπαραγόμενο ζωικό πρότυπο αναπτύχθηκε από τον Stathopoulos και τους συνεργάτες του και περιλαμβάνει την ενδοϋπεζωκοτική έγχυση κυττάρων αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (LLC) σε συγγενικού αγρίου τύπου ποντικούς C57BL/6 17. Η εμφύτευση και η ανάπτυξη των όγκων στην υπεζωκοτική κοιλότητα πυροδοτεί την ανοσολογική αντίδραση του ξενιστή με εμφανές στοιχείο την ύπαρξη μικτών φλεγμονωδών κυττάρων στο πλευριτικό υγρό που είναι παρόμοια με τα φλεγμονώδη κύτταρα που βρίσκονται σε ανθρώπινη ΚΥΣ. Το μοντέλο αυτό αναπαράχθηκε και εξελίχθηκε από την ίδια και από άλλες ερευνητικές ομάδες 29,32-34. Συγκεκριμένα, η ερευνητική μας ομάδα ανέπτυξε πρόσφατα νέα πειραματικά πρότυπα ΚΥΣ από διαφορετικούς ιστολογικούς τύπους καρκίνου, όπως το μεσοθηλίωμα και το αδενοκαρκίνωμα του παχέως εντέρου 29,32. Τα χαρακτηριστικά των μοντέλων ΚΥΣ που περιγράψαμε συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα. Στάδια σχηματισμού ΚΥΣ Η ενδοϋπεζωκοτική έγχυση καρκινικών κυττάρων σε ανοσοεπαρκείς ποντικούς οδηγεί βαθμιαία στο σχηματισμό ΚΥΣ σε περίπου 14 ημέρες 17,29,32,36,37. Η διαδικασία αυτή μπορεί να διαιρεθεί σε τέσσερις φάσεις: Φάση 1. Λαμβάνει χώρα από την ημέρα 0 έως την ημέρα 4. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης πραγματοποιείται η εμφύτευση του όγκου. Ως μέρα 0 ορίζεται η ημέρα της ενδοϋπεζωκοτικής έγχυσης των καρκινικών κυττάρων στους ποντικούς. Τις επόμενες ημέρες τα καρκινικά κύτταρα αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και να σχηματίζουν μικρές νεοπλασματικές εστίες στην επιφάνεια του περίτονου και περισπλάχνιου πετάλου του υπεζωκότα. Φάση 2. Λαμβάνει χώρα από την ημέρα 5 έως την ημέρα 8 και αποτελεί τη φλεγμονώδη φάση της ΚΥΣ. Οι όγκοι αναπτύσσονται και εκκρίνουν κυτταροκίνες και χημειοκίνες που προσελκύουν ένα μικτό φλεγμονώδη κυτταρικό πληθυσμό. Το εξίδρωμα αρχίζει να σχηματίζεται και στο τέλος της φάσης αυτής ο όγκος του υγρού είναι μικρός, περιέχοντας υψηλές συγκεντρώσεις φλεγμονωδών μεσολαβητών εκκρινόμενων από τον όγκο και τον ξενιστή καθώς και μεγάλο αριθμό ανοσοποιητικών κυττάρων. Φάση 3. Λαμβάνει χώρα τις ημέρες 9 με 12. Κατά τη διάρκεια της φάσης αυτής παρατηρείται αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Οι υπεζωκοτικές νεοπλασματικές εστίες εκκρίνουν αγγειογενετικές κυτταροκίνες που καθιστούν τα αγγεία υπερδιαπερατά. Πλάσμα και πρωτεϊνες διηθούνται μέσα στην υπεζωκοτική κοιλότητα. Το πλευριτικό υγρό συσσωρεύεται και αρχίζει να γίνεται αιμορραγικό όπως συμβαίνει και στα άτομα με προχωρημένη ΚΥΣ. Φάση 4. Λαμβάνει χώρα από την ημέρα 13 μέχρι και τον θάνατο του ζώου. Στη φάση αυτή το εμπλουτισμένο πλευριτικό υγρό τροφοδοτεί τις νεοπλασματικές εστίες οδηγώντας τες σε επιταχυνόμενη ανάπτυξη και μετάσταση σε γειτονικές δομές όπως τον πνεύμονα, το θωρακικό τοίχωμα και το διάφραγμα. Οι ποντικοί παρουσιάζουν σοβαρή αναπνευστική δυσχέρεια καθώς οι πνεύμονες συμπιέζονται από τον σχηματισμό πολλών όγκων και άφθονου υγρού, οδηγώντας σε σοβαρή δύσπνοια και επακόλουθο θάνατο. Εκτίμηση του σχηματισμού ΚΥΣ Η γενική κατάσταση του πειραματοζώου αποτελεί ένδειξη της νεοπλασματικής προόδου. Καθώς αναπτύσσεται η ΚΥΣ, οι ποντικοί χάνουν βάρος σταδιακά και παρουσιάζουν μειωμένη φυσική δραστηριότητα. Σε προχωρημένα στάδια ΚΥΣ, οι ποντικοί εμφανίζουν δύσπνοια και καχεξία. Ωστόσο, είναι απαραίτητη η καθημερινή παρατήρηση των πειραματοζώων καθώς και ο προσδιορισμός του σωματικού βάρους ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Το πλευριτικό υγρό, οι όγκοι και ο γειτονικός ιστός συλλέγονται κατά τη νεκροψία των ζώων για να αναλυθούν με τη χρήση διάφορων τεχνικών. Το κύριο τελικό σημείο έκβασης της πειραματικής ΚΥΣ είναι ο όγκος του πλευριτικού υγρού και το περιεχόμενό

214 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 3ο, Τόμος 26ος, Ιούλιος - Σεπτέμβριος 2013 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΟΜΑΔΑ ΕΤΟΣ ΕΙΔΟΣ ΚΑΚΟΗΘΗ ΚΥΤΤΑΡΑ/ΙΣΤΟΣ ΟΔΟΣ ΕΓΧΥΣΗΣ Yano et al 2000 ποντικοί Κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ΒΑΘΜΟΣ ΑΝΟΣΟΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΚΥΡΙΟ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑ Ενδοφλέβια αθυμικοί Μίμηση αιματογενούς μετάστασης Boehle et al 2000 ποντικοί Κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα, πλακώδους αδενοκαρκινώματος και αδενοκαρκινώματος εκ μεγάλων κυττάρων Ενδοπνευμονική και ενδοϋπεζωκοτική ανοσοανεπαρκείς Έγχυση ανθρώπινης Kimura et al 2000 Balb/C ποντικοί metha ινοσάρκωμα Ενδοϋπεζωκοτική ανοσοανεπαρκείς Ορθοτοπική εμφύτευση Ohta et al 2001 αρουραίοι Kύτταρα PC14 ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα Ενδοϋπεζωκοτική και υποπλευρική ανοσοανεπαρκείς Έγχυση ανθρώπινης Hatton et al 2002 Νεοζηλανδέζικα λευκά κουνέλια VX2 όγκος κουνελιού θωρακοτομή ανοσοεπαρκείς Συνδυασμένη μεταμόσχευση καρκινικών κυττάρων όγκου και στρώματος Yeh et al 2006 ποντικοί Κύτταρα PC14PE6/ AS2 ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος πνεύμονα Ενδοφλέβια και ενδοπεριτοναϊκή έγχυση αθυμικοί Έγχυση ανθρώπινης Edakuni et al 2006 ποντικοί Κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μεσοθηλιώματος Υποδόρια και ενδοϋπεζωκοτική έγχυση ανοσοανεπαρκείς Έγχυση ανθρώπινης Jongsma et al 2008 FVB ποντικοί υπό όρους διαγονιδιακό ποντίκι με μεσοθηλιακά κύτταρα υπεζωκότα που είναι ανεπαρκή σε συγκεκριμένα γονίδια που βρίσκονται συχνά μεταλλαγμένα στο ανθρώπινο μεσοθηλίωμα Αυθόρμητη ανάπτυξη μεσοθηλιώματος ανοσοεπαρκείς Αυθόρμητη δημιουργία ΚΥΣ Stathopoulos et al 2006 C57BL/6 ποντικοί Κύτταρα Lewis lung carcinoma ποντικού Ενδοϋπεζωκοτική ανοσοεπαρκείς Λαμβάνεται υπόψιν η επιρροή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου στην ανάπτυξη αυτού ΚΥΡΙΟ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑ Λείπει ο πρωτοπαθής όγκος ως πηγή μετάστασης Δεν λαμβάνεται υπόψιν η επιρροή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου στην ανάπτυξη αυτού Η καρκινική σειρά είναι ποντικίσια Δεν λαμβάνεται υπόψιν η επιρροή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου στην ανάπτυξη αυτού Η θωρακοτομή είναι χρονοβόρα και με υψηλή θνητότητα Η συμπεριφορς των κυττάρων και ο βαθμός κάθαρσης στην περιτοναϊκή κοιλότητα ίσως είναι διαφορετικά Δεν λαμβάνεται υπόψιν η επιρροή του μικροπεριβάλλοντος του όγκου στην ανάπτυξη αυτού Απαιτείται μεγάλο χρονικό διάστημα για να αναπτυχθεί η ΚΥΣ Η καρκινική σειρά είναι ποντικίσια

ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 3ο, Τόμος 26ος, Ιούλιος - Σεπτέμβριος 2013 215 του. Ο όγκος αυτού μετριέται με χρήση σύριγγας ή πιπέτας ακριβείας. Οι ΚΥΣ είναι εξιδρωματικές, αιμορραγικές, δεν πήζουν και έχουν όγκο μεταξύ 200 με 1500 μl. Ένα άλλο σημαντικό τελικό σημείο έκβασης είναι ο προσδιορισμός του αριθμού των υπεζωκοτικών όγκων και το μέγεθος αυτών. Οι περίτονες και περισπλάχνιες υπεζωκοτικές εμφυτεύσεις δύναται να μετρηθούν στο στερεοσκόπιο. Μια πιο ακριβής μέθοδος για την αξιολόγηση των υπεζωκοτικών όγκων είναι η στερεολογία 23,35. Βέβαια, αρκετές μη επεμβατικές τεχνικές (αξονική τομογραφία, μαγνητική τομογραφία, τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων, in vivo βιοφωταύγεια κτλ.) χρησιμοποιούνται ευρέως για την παρακολούθηση της νεοπλασματικής προόδου και του σχηματισμού υγρού σε ζωντανά πειραματόζωα 24-26. Επιπρόσθετα, τελικά σημεία έκβασης που πρέπει να προσδιοριστούν είναι η επαγόμενη από τον όγκο φλεγμονή, η αγγειογένεση και η αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας στην υπεζωκοτική κοιλότητα των πειραματικών ποντικών. Τα περισσότερα εμπύρηνα κύτταρα στο πλευριτικό υγρό, εκτός από τα καρκινικά και τα μεσοθηλιακά, είναι τα μονοκύτταρα, τα ουδετερόφιλα και τα λεμφοκύτταρα. Φλεγμονώδη κύτταρα καθώς και φλεγμονώδεις και αγγειογενετικοί μεσολαβητές μετρώνται στο πλευριτικό υγρό, στον όγκο και στο περιφερικό αίμα πειραματοζώων με ΚΥΣ. Ακόμη, η αυξημένη αγγειογένεση οδηγεί στην πιο γρήγορη αύξησή του όγκου. Επομένως, ο υπεζωκοτικός νεοπλασματικός ιστός δύναται επίσης να εξεταστεί για δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης. Η διήθηση του πλάσματος από τα υπεζωκοτικά αγγεία σε πειραματική ΚΥΣ συνήθως ποσοτικοποιείται με χρήση διαφόρων μεθόδων, όπως με τη χρώση Evan s Blue, την τροποποιημένη μέθοδο Miles ή μέσω σύγκρισης της ολικής πρωτεϊνης ανάμεσα στο υπεζωκοτικό υγρό και τον ορό του αίματος 17,27. ΜΕΤΑΦΡΑΣΤΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΤΗΣ ΚΥΣ Η ΚΥΣ είναι μια θανατηφόρα ασθένεια που χρειάζεται εστιασμένες ερευνητικές προσπάθειες για βελτιώσεις που μπορούν να εισαχθούν στην κλινική πράξη. Κατά την τελευταία δεκαετία, διάφορες προκλινικές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας τα προαναφερθέντα πειραματικά μοντέλα ΚΥΣ προσφέροντας σημαντικές γνώσεις σχετικά με την παθοβιολογία της ΚΥΣ. Αν και οι περισσότερες εργασίες πάνω στην ΚΥΣ έχουν πραγματοποιηθεί σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια, η ανάπτυξη ανοσοεπαρκών μοντέλων ΚΥΣ τα τελευταία χρόνια αποτέλεσε ένα σημαντικό βήμα προς την κατεύθυνση της μεταφραστικής υπεζωκοτικής έρευνας, αφού οι αλληλεπιδράσεις όγκου ξενιστή αποτελούν βασικούς παράγοντες στη διαμόρφωση και εξέλιξη της νόσου. Χρησιμοποιώντας αυτά τα μοντέλα έχει αποκαλυφθεί ο ρόλος σημαντικών μεσολαβητών καθώς και βιολογικών οδών στο σχηματισμό ΚΥΣ. Οι πιο σημαντικοί μεσολαβητές αλλά και μονοπάτια που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία φαίνεται να είναι ο VEGF, η IL-6/Stat3, η MCP-1, η Spp1, και η σηματοδότηση των αξόνων angiopoietin/ Tie2 και TNF /NF-κΒ 14,15,17,33,36-38. Αυτά τα ογκο-παραγόμενα γονιδιακά προϊόντα οδηγούν στην ανάπτυξη του όγκου με αυτοκρινή τρόπο και επίσης έλκουν κυτταρικούς πληθυσμούς του ξενιστή, οι οποίοι συνδέονται στενά με την εξέλιξη του όγκου του υπεζωκότα και τη συσσώρευση υγρού, αποτελώντας νέους θεραπευτικούς στόχους σε προκλινικά μοντέλα. Επιπλέον, μελέτες έχουν εξετάσει την αποτελεσματικότητα νέων θεραπειών τόσο σε ανοσοανεπαρκή όσο και σε ανοσοεπαρκή μοντέλα ΚΥΣ, και έχουν παράσχει γνώσεις σχετικά με πιθανές μελλοντικές θεραπείες κατά της συγκεκριμένης νόσου. Σε αυτό το πλαίσιο, το μπλοκάρισμα των ιντερλευκινών IL-12 και IL-15 δείχθηκε να είναι επωφελές έναντι πειραματικής ΚΥΣ 21, ενώ οι αναστολείς της τοποϊσομεράσης II 39 καθώς και το μπλοκάρισμα του VEGF-υποδοχέα κινάσης τυροσίνης 14 εφαρμόστηκαν σε προκλινικό επίπεδο. Η Μπορτεζομίμπη (έμμεσος αναστολέας του NF-κΒ) και το Ζολεδρονικό οξύ (ένα διφωσφονικό άλας που ασκεί ισχυρή αντικαρκινική δράση) βρέθηκαν επίσης ότι ασκούν ευεργετική επίδραση κατά της πειραματικής ΚΥΣ αναστέλλοντας τη σηματοδότηση του NF-κΒ και του Ras, αντίστοιχα, στον όγκο 40,41. Πρόσφατες μελέτες χρησιμοποιώντας ένα παράγωγο σουλινδάκης έδειξαν σημαντική επίδραση στη ενδοϋπεζωκοτική διάδοση του όγκου μέσω της μείωσης της αγγειακής διαπερατότητας υπεζωκότα 42. Επιπλέον, αντισώματα εξουδετέρωσης των CCL2 και CCL12 μειώνουν σημαντικά την ανάπτυξη ΚΥΣ που προκαλείται από αδενοκαρκινώματα ανθρώπου και ποντικού 29. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η ΚΥΣ είναι μια κοινή και επώδυνη κατάσταση που σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο διαφόρων μορφών καρκίνου. Η ανάπτυξη διαφόρων ζωικών προτύπων ΚΥΣ άνοιξε τον δρόμο για την κατανόηση της γενετικής και μοριακής βάσης της παθογένεσης της νόσου. Ωστόσο, απαιτείται ακόμα μεγάλη ερευνητική προσπάθεια για την ανάπτυξη αποτελεσματικών και στοχευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (Βλέπε αγγλικό Κείμενο)