ΠΕΡΙΛΗΨΗ Χρήση Φυσικοχημικών μεθόδων στη μελέτη Διαμορφωτικής Ανάλυσης Πεπτιδικών Παραγώγων κατά της Σκλήρύνσης κατά Πλάκας και των Αλληλεπιδράσεών τους με Λιποειδείς Διπλοστιβάδες ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΠΟΤΑΜΙΤΗΣ Στόχοι της διδακτορικής διατριβής είναι να μελετηθούν: (α) το φαινόμενο της μερικής ενδοεπιχώρησης σε λιπιδικές διπλοστιβάδες που προκαλούν δύο συνθετικά πεπτίδια τα οποία παρουσιάζουν αγωνιστική και ανταγωνιστική δράση αντίστοιχα κατά της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομνελίτιδας (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE), ένα μοντέλο της Σκλήρύνσης Κατά Πλάκας σε ζώα και (β) η αλληλεπίδραση δύο συνθετικών πεπτιδικών αναλόγων της Βασικής Πρωτεϊνης της Μυελίνης (ΜΒΡ), στο ενεργό κέντρο δράσης τους ώστε να κατανοηθούν οι στερεοηλεκτρονιακές αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στη βιολογική τους δράση. H Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μία χρόνια ασθένεια του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) που επηρεάζει τους νευρώνες, τα κύτταρα τον εγκεφάλου και το νωτιαίο μυελό, τα οποία διαβιβάζούν πληροφορίες, δημιουργούν τη σκέψη, την αντίληψη και επιτρέπουν στον εγκέφαλο να ελέγξει το σώμα. Τα νευρικά κύτταρα περιβάλλονται από ένα λεπτό περίβλημα, το οποίο αποτελείται από μνελίνη, μια ουσία που βοηθά στην προστασία των νεύρων καθώς και στη μετάδοση των νευρικών ώσεων. H ΣΚΠ προκαλεί σταδιακή καταστροφή της μυελίνης (απομνελίνωση), με αποτέλεσμα οι νευρώνες να μην μπορούν να μεταδώσούν αποτελεσματικά τα ηλεκτρικά τους σήματα. Μία ελπιδοφόρα προσέγγιση στην αντιμετώπιση της ΣΚΠ περιλαμβάνει τη σύνθεση σταθερών πεπτιδικών αναλόγων τα οποία εμφανίζουν αυξημένη ανταγωνιστική βιολογική δράση. Τα τροποποιημένα πεπτίδια (Altered Peptide Ligands APLs) σχεδιάζονται και συντίθενται με βάση ανοσοκυρίαρχες περιοχές πρωτεϊνών της μυελίνης όπως της MBP, PLP και MOG. Στη παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις τον πεπτιδικού επιτόπου της Βασικής Πρωτεϊνης της Μυελίνης (Myelin Basic Protein, MBP) ΜΒΡ87_
99, ο οποίος παρουσιάζει αγωνιστική δράση, και τον ανταγωνιστή ΜΒΡ87_99 (Arg91, Α1α96) με τις λιπιδικές διπλοστιβάδες. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης, Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) στερεής κατάστασης και Φασματοσκοπίας Raman. Το λιπίδιο που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία των διπλοστιβάδων είναι η διπαλμιτική φωσφατιδυλοχολίνη (DPPC). Στα πειράματα Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης χρησιμοποιήθηκαν μοριακές αναλογίες πεπτιδίον ως προς DPPC από 1-10%. Σε όλο το εύρος των συγκεντρώσεων που μελετήθηκαν, και ειδικά σε συγκέντρωση 5%, προκύπτει ότι ο αγωνιστής προκαλεί μεγαλύτερες μεταβολές στις διπλοστιβάδες της DPPC, σε σχέση με τον ανταγωνιστή. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι τα δύο πεπτίδια προκαλούν μερική ενδοεπιχώρηση στις λιπιδικές διπλοστιβάδες σε συγκεντρώσεις? 5%, με τον αγωνιστή να προκαλεί μερική ενδοεπιχώρηση σε μεγαλύτερο βαθμό. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα 13C-NMR στερεής κατάστασης με τη χρήση περιστροφής τον δείγματος υπό μαγική γωνία (MAS) σε υψηλότερες μοριακές συγκεντρώσεις 10% και 20%, δεδομένης της μικρότερης ευαισθησίας της μεθοδολογίας συγκριτικά με αυτή της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης. Από τη μελέτη τον ημίσειου εύρους των κορυφών συντονισμού των διπλοστιβάδων της DPPC προκύπτουν ενδείξεις μερικής ενδοεπιχώρηση που προκαλεί ο αγωνιστής στις λιπιδικές διπλοστιβάδες, κυρίως όταν αυτές βρίσκονται στην υγρή κρυσταλλική κατάσταση. H μερική ενδοεπιχώρηση δεν Θα μπορούσε να ανιχνευθεί με τη Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης γιατί σε συγκεντρώσεις του αγωνιστή >7.5% εμφανίζονται δύο διακριτές περιοχές στις διπλοστιβάδες. Το αποτέλεσμα αυτό αναδεικνύει τη συμπληρωματικότητα της φασματοσκοπίας 13C-NMR/MAS σε σχέση με τα αποτελέσματα της DSC. Ο ανταγωνιστής φαίνεται να προκαλεί και αυτός μερική ενδοεπιχώρηση η οποία εντείνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης. Επίσης, με τα πειράματα 13C-NMR/MAS αποδεικνύεται άμεσα η ενσωμάτωση και των δύο πεπτιδίων στις λιπιδικές διπλοστιβάδες, γεγονός που αποδεικνύεται από την παρουσία φασματικών κορυφών που αποδίδονται στα αμινοξέα που απαρτίζουν τα πεπτίδια. Οι μεταβολές στις χημικές μετατοπίσεις έδωσαν πληροφορίες σε ατομικό επίπεδο των κινητικών μεταβολών που προκαλούν στις λιπιδικές διπλοστιβάδες η παρουσία των πεπτιδίων. Από τη φασματοσκοπία Raman αναδείχθηκε ο καίριος ρόλος του ύδατος στη δημιουργία αλλά και τις αλληλεπιδράσεις των πεπτιδίων με αυτές. Μελετήθηκε η άνυδρη DPPC και δείγματα DPPC με τον αγωνιστή και τον ανταγωνιστή σε μοριακές
αναλογίες 1%, 5% και 10%. Οι αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν από τις προηγούμενες μεθοδολογίες παρατηρούνται μόνο σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες από τη θερμοκρασία τήξης τους. Σε μικρότερες θερμοκρασίες δεν είναι δυνατή η ανάπτυξη αυτών των αλληλεπιδράσεων εξαιτίας της απουσίας του ύδατος. Γενικότερα, δεν είναι δυνατή η άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων των πειραμάτων Raman με αυτά της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης και της φασματοσκοπίας ι3 C-NMR/MAS εξαιτίας της απώλειας ύδατος από τα δείγματα. Σε δύο συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα της ΜΒΡ, το ΜΡΒ83_99 (Phe91) και ΜΡΒ83-99 (Tyr91), τα οποία παρουσίασαν ελπιδοφόρα βιολογικά αποτελέσματα, πραγματοποιήθηκε διαμορφωτική ανάλυση με τη χρήση φασματοσκοπίας NMR δύο διαστάσεων (2D NOESY) και μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις τους στο ενεργό κέντρο δράσης τους με χρήση Μοριακής Δυναμικής. Τα δύο πεπτίδια έχουν γραμμική και εκτεταμένη διαμόρφωση τόσο σε διάλυμα DMSO, όπως προκύπτει από τα ΝΟΕ δεδομένα, όσο και στο κέντρο δράσης τους, όπως προκύπτει από τις προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής. Πιο συγκεκριμένα για τις προσομοιώσεις της Μοριακής Δυναμικής χρησιμοποιήθηκαν οι συντεταγμένες (PDB: lymm) τον τριμοριακού συμπλόκον του ΜΒΡ83-96, HLA-DRB 1 * 1501 και TCR. Τα δύο μελετώμενα πεπτίδια εμφάνισαν τις απαραίτητες αλληλεπιδράσεις τόσο για την πρόσδεση τους με το HLA-DR2 όσο και για την αναγνώρισή τους από τον TCR. Παρατηρήθηκε ότι το πεπτίδιο ΜΒΡ83.99 (Phe91) εμφανίζει μεγαλύτερο αριθμό αλληλεπιδράσεων στο τριμοριακό σύμπλοκο και ειδικά στις αλληλεπιδράσεις τον με τον TCR, σε σχέση με το πεπτίδιο ΜΒΡ83-99 (Tyr91). Τα καλύτερα βιολογικά αποτελέσματα τον πεπτιδίον ΜΒΡ83-99 (ΤΥτ91) πιθανώς να οφείλονται στις μειωμένες αλληλεπιδράσεις με τον TCR, οι οποίες συνδέονται με την ανοσολογική απόκριση τον οργανισμού μέσω της ενεργοποίησης των Τ-κυττάρων, που οδηγεί στην εμφάνιση της νόσού.
SUMMARY The Use of Physicochemical Methodologies to Study the Conformational Analysis of Peptide Analogs against Multiple Sclerosis and their Interactions with Lipid Bilayers. Constantinos Potamitis The aims of this dissertation are to: (a) study the phenomenon of partial interdigitation for two synthetic peptides possessing different biological activity against Autoimmune Encephalomyelitis (ΕΑΕ), namely agonistic and antagonistic respectively and (b) analyze the conformational characteristics of two synthetic peptides analogues of Myelin Basic Protein and their sterenelectronic interactions with their active site in order to understand their biological response. Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease affecting the central nervous system (CNS) characterized by discrete areas of inflammation and demyelination that can occur in multiple anatomical locations in the CNS. Although the antigenic components of myelin in MS have not been identified with certainty yet, Myelin Basic Protein (MBP) is believed to be one of the main autoantigens. ΜΒP87.99 epitope is encephalitogenic in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (ΕΑΕ), a prototypic model for induced autoimmune diseases, considered as an instructive model for MS in humans. A promising approach in the treatment of MS is the use of Altered Peptide Ligands (APLs) derived from the proteins of myelin sheath, mainly from the MBP. The myelin-specific T-cells induce paralysis and demyelination when they are triggered by the native MBP. When these T cells recognize the APL, they produce interleukin IL-4, which can reverse EAE. Clinical signs of EAE induced by ΜBΡ72_85 were completely suppressed by the linear APL [Arg91, A1a96] MBP87-99. ΜΒΡ87-99 epitope peptide and its antagonist [Αrg91, A1a96] ΜΒP87-99 interactions with lipid bilayers of dipalmimy1phosphatidy1chnlin (DPPC) bilayers were investigated using Differential Scanning Calorimetry (DSC) and high resolution solid state 13C and 31 P NMR spectroscopy in an attempt to explore the role of the lipid bilayers in their physiological action and more specifically their ability to exert partial interdigitation.
For the Differential Scanning Calorimetry results molar ratios from 1% up to 10% have been used in order to explore the role of the concentration in the activity. The greatest thermal modifications are observed for the agonist and at the molar ratio of 5%. The two peptides caused partial interdigitaion in the lipid bilayers at concentrations?: 5% molar ratio with the agonist to exert a greater degree of partial interdigitation. From the two peptides studied only agonist's effect is saturated as it is depicted from the observed two discrete areas when a molar ratio of 10% is used. In the case of antagonist, only a significant broadening in the breadth of the phase transition is observed. 13C MAS NMR experiments were performed using the high 10% and 20% molar ratios of peptides. 13 C MAS NMR experiments are less sensitive compared to DSC. Using as a diagnostic parameter, the half width of the observed peaks in the 13C NMR spectra, it was observed as in DSC, that greater partial interdigitation is caused by the agonist. In addition, more information was provided by examining at atomic level the chemical shift changes versus concentration. 13C MAS NMR experiments provided direct evidence of the incorporation of the peptides into the lipid bilayers since new peaks attributed to the aminoacids constituting the peptides are observed in the 13C MAS NMR spectra. The role of water was studied in Raman Spectroscopy. Indeed, the effects observed with the other methodologies were observed in higher temperatures. This is expected since phase transition in the absence of water is shifted to higher temperatures. Anyway the direct comparison of the Raman results with those from DSC and 13 C MAS NMR is not possible due to the loss of water from the samples. NMR results of two peptides analogues of MBP, namely ΜΡΒ83.99 (Phe91) and ΜΡΒ83-99 (Tyr91 ) showed that they adopt in DSMO solution linear conformation. Molecular Dynamics studies in their active site revealed that they are accommodated also with a linear conformation. Molecular Dynamics simulations were performed using the coordinates of the trimolecular complex ΜΒΡ83-96, HLA-DRB 1 * 1501 and TCR (PDB: lymm). Both of the studied peptides form the necessary interactions for the binding to the HLA-DR2, as well as for the recognition by the TCR. Their different biological activity is reflected to their different interactions they exert with the amino acids constituting the active site.