1 Κεφ.3. Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA 1. Τι ονομάζεται ανασυνδυασμένο DNA και τι τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA. Ποιά η σημασία της. Ανασυνδυασμένο DNA: είναι αυτό που προκύπτει από την συνένωση 2 τμημάτων DNA διαφορετικής προέλευσης, πιθανόν από 2 διαφορετικά είδη οργανισμών ή από την συνένωση φυσικού και συνθετικού DNA. Τεχνολογία Ανασυνδυασμένου DNA: Recombinant DNA Technology or rdna Είναι το σύνολο των τεχνικών με τις οποίες, τμήματα DNA διαφορετικής προέλευσης συνδέονται μεταξύ τους, για την παραγωγή ενός νέου μορίου DNA. Οι τεχνικές αυτές χρησιμοποιούνται ευρέως για την κλωνοποίηση γονιδίων, την γενετική τροποποίηση των οργανισμών καθώς και στην μοριακή βιολογία. 2.Ποιά ένζυμα καλούνται περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ποιά η σημασία τους 2 είναι τα είδη των ενζύμων που συμμετέχουν στην κατασκευή ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA. Τα περιοριστικά ένζυμα ή περιοριστικές ενδονουκλεάσες: Restrictive Enzymes or Restrictive Endonucleases Tεμαχίζουν μόρια DNA σε συγκεκριμένες θέσεις, σχηματίζοντας συνεκτικά άκρα ή (συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα). Αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες βάσεων στην διπλή έλικα του DNA και διασπούν και τις 2 αλυσίδες της διπλής έλικας σε συγκεκριμένες θέσεις. Δρουν δηλαδή σαν Μοριακά Ψαλίδια. Ο φυσικός τους ρόλος είναι η προστασία των βακτηρίων από την προσβολή των βακτηριοφάγων ιών. Λιγάσες ή Συνδετάσες:
Ενώνουν μεταξύ τους διπλοελικωμένες αλυσίδες DNA. Δηλαδή επανενώνουν τα τμήματα του DNA στα οποία έχει επέλθει τεμαχισμός από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες. 2 3.Τι είναι τα πλασμίδια. Αναφέρατε παράδειγμα χαρακτηριστικού πλασμιδίου και των γονιδίων που φέρει. Ποια η σημασία τους στην βιοτεχνολογία Πλασμίδια: είναι φορείς κλωνοποίησης. Είναι μικρά κυκλικά μόρια DNA τα οποία αναπαράγονται αυτόνομα μέσα σε κύτταρα- ξενιστές (όπως βακτήρια και ευκαρυωτικά κύτταρα). Το πιο γνωστό βακτηριακό πλασμίδιο είναι το pbr322. Το πλασμίδιο αυτό έχει 2 γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Έχει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό της Amp r : Αμπικιλλίνης καθώς επίσης έχει ανθεκτικότητα και στο αντιβιοτικό της Tet r : Τετρακυκλίνης και θέσεις αναγνώρισης από περιοριστικά ένζυμα ( όπως HindI,II, BamHI). Τα πλασμίδια: μεταφέρονται εύκολα στα βακτήρια μέσω της κυτταρικής μεμβράνης και όταν βρεθούν μέσα στο κύτταρο-ξενιστή, αντιγράφονται με ταχύτατους ρυθμούς. 4. Περιγράψτε συνοπτικά την διαδικασία κλωνοποίησης γονιδίου. Στάδια κλωνοποίησης DNA Κλωνοποίηση γονιδίου/dna/dna cloning Η Απομόνωση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας βάσεων (π.χ. ενός συγκεκριμένου γονίδιου) από το υπόλοιπο DNA ενός κυττάρου και η παραγωγή πολλών ταυτόσημων αντιγράφων του μορίου αυτού. Στάδια κλωνοποίησης του DNA Recombinant: Κατασκευή 1 ανασυνδυασμένου μορίου DNA. Ένα μόριο DNA που μας ενδιαφέρει ενώνεται ομοιοπολικά με έναν φορέα κλωνοποίησης DNA(π.χ. πλασμίδιο ή ιός). Εισαγωγή ανασυνδυασμένου μορίου DNA σε κύτταρα-ξενιστές: πολλά βακτηριακά και ευκαρυωτικά κύτταρα προσλαμβάνουν μόρια DNA από το περιβάλλον τους (μετασχηματισμός) ή χρησιμοποιούνται φυσικοί μεταφορείς όπως ιοί.
3 Επιλογή: προσδιορισμός κυττάρων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο μόριο DNA (θρεπτικό μέσο με αντιβιοτικό). 5. Σημασία των γονιδίων ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά στα πλασμίδια Τα πλασμίδια συνήθως φέρουν 1 γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό, που δρα ως marker: δείκτης αναγνώρισης. Αν το αντιβιοτικό προστεθεί στο θρεπτικό μέσο που καλλιεργούνται τα βακτήρια, τότε μόνον τα βακτήρια που έχουν προσλάβει το ανασυνδυαμένο πλασμίδιο : φέρει κλωνοποιημένο κλάσμα DNA και το γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά, θα επιβιώσουν. Έτσι επιτυγχάνεται διαχωρισμός μεταξύ βακτηρίων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και μεταξύ αυτών που δεν το περιέχουν. 6. Τι είναι οι βακτηριοφάγοι ιοί και πως ανιχνεύονται. Βακτηριοφάγοι ιοί ή λ: Εισαγωγή ξένου DNA στο DNAτου φάγου. Ο ανασυνδυασμένος ιός μολύνει τα βακτήρια και ενσωματώνει το DNAτου στο γονιδίωμα του ξενιστή. 7. Με ποιούς τρόπους μπορεί να εισαχθεί ξένο DNA σε κύτταρα ξενιστή Η εισαγωγή ξένου μορίου DNA ή ξένου γονιδίου σε κύτταρα-ξενιστές (βακτήρια, ευκαρυωτικά κύτταρα) Επιτυγχάνεται με τους ακόλουθους τρόπους: Είτε απευθείας από το υλικό καλλιέργειας (μετασχηματισμός) Είτε με ειδική μικροένεση (κυρίως σε ζωικά και φυτικά κύτταρα) Είτε όταν μολύνονται από ανασυνδυασμένους ιούς (μεταγωγή ή μεταμόλυνση) Στην γενετική μηχανική, ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος οργανισμός ως ξενιστής, είναι το βάκτηριο της E.coli. 8. Τι είναι ο γενετικός φορέας και ποιές οι προϋποθέσεις που πρέπει να έχει Οι προϋποθέσεις που πρέπει να έχει ένας φορέας είναι οι ακόλουθοι:
4 1. να είναι ένα μικρό μόριο με γνωστή δομή 2. να είναι ικανός να αναπαράγεται αυτόνομα σε τουλάχιστον 1 κύτταρο-ξενιστή 3. να έχει μία «περιοχή κλωνοποίησης» 4. να περιέχει 1 γονίδιο-δείκτη: π.χ. γονίδιο ανθεκτικότητας σε κάποιο αντιβιοτικό, που χρησιμεύει ως marker: δείκτης αναγνώρισης, για να απομονωθούν τα κύτταρα-ξενιστές που περιέχουν τέτοια μόρια. 9. Τρόποι απομόνωσης και ανίχνευσης γονιδίων Τρόποι απομόνωσης γονιδίων (για ανώτερους ευκαρυωτικούς όπως ζώα, φυτά) 1. Το DNA απομονώνεται και καθαρίζεται (από εκ. κύτταρα του φυτού ή ζώου) 2. Το DNA τεμαχίζεται σε πολύ μικρά κομμάτια με την βοήθεια των περιοριστικών ενζύμων. 3. Εισάγονται κλάσματα DNA σε φορείς κλωνοποίησης (π.χ. πλασμίδιο, φάγος λ) 4. Εισάγονται οι φορείς κλωνοποίησης μέσα σε κύτταρα- ξενιστές (π.χ. βακτήρια όπως η E.coli). Τα πλασμίδια μπορούν να εισαχθούν στο E.coli μέσα από τους πόρους της κυτταρικής μεμβράνης με διάχυση. Για την ανίχνευση 1 γονιδίου χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές, που οι περισσότερες έχουν ως βάση την χρήση γονιδιακών ανιχνευτών: genetic probes. Οι γονιδιακοί ανιχνευτές:είναι μικρές μονόκλωνες αλληλουχίες DNAπου είναι συμπληρωματικές (complementary) με κάποιο γονίδιο που μας ενδιαφέρει. Λόγω της συμπληρωματικότητας του, ο ανιχνευτής θα δεσμευθεί μόνο στο γονίδιο υπό ανίχνευση και σε κανένα άλλο τμήμα DNA.
5