Οδηγίες χρήσης CINtec Histology Kit Το CINtec Histology Kit είναι μια ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία για την ποιοτική ανίχνευση του αντιγόνου p16 INK4a σε τομές ιστού παρασκευασμένες από τραχηλικές βιοψίες μονιμοποιημένες με φορμαλίνη και εγκλεισμένες σε παραφίνη. Ενδείκνυται για χρήση σε συνδυασμό με κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες παρασκευασμένες από το ίδιο δείγμα τραχηλικού ιστού, ως βοήθημα για την ενίσχυση της διαγνωστικής ακρίβειας και της συμφωνίας μεταξύ παρατηρητών κατά τη διάγνωση τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας υψηλού βαθμού καθώς και τραχηλικού καρκινώματος. Roche mtm laboratories AG Sandhofer Straße 116 D-68305 Mannheim Germany www.cintec.info 9511 50 2 8 C
Πίνακας περιεχομένων I. Όνομα προϊόντος... 2 II. Προοριζόμενη χρήση... 2 III. Περίληψη και επεξήγηση της συσκευής... 2 Περίληψη και επεξήγηση... 2 Κλινική σημασία... 3 Αρχές της διαδικασίας... 4 IV. Αντιδραστήρια... 4 Υλικά που παρέχονται... 4 Αποθήκευση... 6 Υλικά και αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται... 6 Εξοπλισμός που απαιτείται... 7 V. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις... 7 Προειδοποίηση... 7 Προσοχή... 8 VI. Διαδικασία... 9 Προετοιμασία δειγμάτων... 9 Δείγματα ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη... 9 Θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου... 9 Διαδικασία χρώσης... 9 1. Παρασκευή αντιδραστηρίου... 9 1.1 Epitope Retrieval Solution... 10 1.2 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης... 10 1.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB)... 10 1.4 Αντίχρωση... 11 1.5 Επικαλυπτικό μέσο... 11 2. Διαδικασία χρώσης για αυτοματοποιημένα όργανα χρώσης... 11 2.1 Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση... 11 2.2. Πρωτόκολλο χρώσης για αυτοματοποιημένα όργανα χρώσης... 12 3. Διαδικασία χρώσης για μη αυτόματη χρήση... 15 3.1 Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση... 15 3.2. Πρωτόκολλο χρώσης για μη αυτόματη χρήση... 16 VII. Ποιοτικός έλεγχος... 18 VIII. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων... 19 IX. Περιορισμοί... 20 X. Χαρακτηριστικά απόδοσης... 21 XI. Αντιμετώπιση προβλημάτων... 26 XII. Σύμβολα... 29 XIII. Κατασκευαστής... 29 XIV. Κατάσταση αναθεώρησης... 29 XV. Νομική κοινοποίηση... 29 Παράρτημα 1: Βιβλιογραφία... 30 Παράρτημα 2... 32 REF: 9511 1 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
I. Όνομα προϊόντος CINtec Histology Kit II. Προοριζόμενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το CINtec Histology Kit είναι μια ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία για την ποιοτική ανίχνευση του αντιγόνου p16 INK4a σε τομές ιστού παρασκευασμένες από τραχηλικές βιοψίες μονιμοποιημένες με φορμαλίνη και εγκλεισμένες σε παραφίνη. Ενδείκνυται για χρήση σε συνδυασμό με κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες παρασκευασμένες από το ίδιο δείγμα τραχηλικού ιστού, ως βοήθημα για την ενίσχυση της διαγνωστικής ακρίβειας και της συμφωνίας μεταξύ παρατηρητών κατά τη διάγνωση τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας υψηλού βαθμού καθώς και τραχηλικού καρκινώματος. III. Περίληψη και επεξήγηση της συσκευής Περίληψη και επεξήγηση Το CINtec Histology Kit βασίζεται σε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (κλώνος E6H4 ) στρέφεται έναντι της ανθρώπινης πρωτεΐνης p16 INK4a. Η πρωτεΐνη p16 INK4a είναι ένας κυκλινο-εξαρτώμενος αναστολέας κινάσης, ο οποίος διαδραματίζει μείζονα ρόλο στη ρύθμιση του ευκαρυωτικού κυτταρικού κύκλου. Αποτελεί μέρος του ελέγχου της μετάβασης μεταξύ των φάσεων G1-S που διαμεσολαβείται από την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (prb), και δίνει έναυσμα στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά τη διάρκεια των διαδικασιών κυτταρικής διαφοροποίησης. Σε τερματικά διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα, η p16 INK4a εκφράζεται σε επίπεδα που δεν ανιχνεύονται συνήθως μέσω ανοσοϊστοχημείας. Σε διάφορες μορφές όγκων, το γονίδιο της p16 INK4a διαπιστώθηκε ότι είναι λειτουργικά αδρανοποιημένο από μετάλλαξη ή υπερμεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Η παραπάνω αδρανοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p16 INK4a αποδείχθηκε ότι συμβάλλει στην απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την απώλεια ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ωστόσο, σε επιθηλιακά κύτταρα του τραχήλου που έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται και στα οποία η διαδικασία κυτταρικού μετασχηματισμού ξεκίνησε από ογκοπρωτεΐνες του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων τύπου υψηλού κινδύνου (HR-HPV), διαπιστώθηκε υψηλή αυξητική ρύθμιση στην έκφραση του p16 INK4a [1, 2]. Αυτή η ισχυρή υπερέκφραση του p16 INK4a είναι στενά συνδεδεμένη σε μοριακό επίπεδο με τη δραστηριότητα των ογκοπρωτεϊνών E7 από HR-HPV. Η υπερέκφραση του p16 INK4a διαπιστώθηκε ότι αντανακλά την αδρανοποίηση του λειτουργικού συμπλόκου ανάμεσα στην prb και τον παράγοντα μεταγραφής E2F που διαμεσολαβείται από την ογκοπρωτεΐνη E7, και η οποία είναι ένα από τα βασικά γεγονότα του επαγόμενου από τον HR-HPV κυτταρικού μετασχηματισμού [3]. REF: 9511 2 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Υπάρχουν πολυάριθμες μελέτες στη δημοσιευμένη βιβλιογραφία που αναφέρουν ότι παρατηρήθηκε ανοσοϊστοχημικά υπερέκφραση της πρωτεΐνης p16 INK4a σε μία πολύ υψηλή αναλογία περιπτώσεων προκαρκινικών τραχηλικών δυσπλασιών υψηλού βαθμού (δηλ. στο 80 100% των βλαβών CIN2, και σε όλες σχεδόν τις βλάβες CIN3) και διηθητικών καρκίνων. Σε χαμηλού βαθμού τραχηλικές ενδοεπιθηλιακές βλάβες (CIN1) διαπιστώθηκε ότι παρουσιάζεται υπερέκφραση της p16 INK4a σε μεταβλητά ποσοστά, συνήθως εντός ενός εύρους 30 60% [1, 2, 4-16]. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να λάβει υπόψη της το γεγονός ότι, η p16 INK4a είναι μια κυτταρική πρωτεΐνη η οποία μπορεί να εκφράζεται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα σε τραχηλικές δυσπλαστικές βλάβες και τραχηλικούς καρκίνους υψηλού βαθμού καθώς και σε ορισμένες παθήσεις που δεν σχετίζονται με τραχηλική δυσπλασία, μολονότι σε διαφορετικά επίπεδα και με διαφορετικά σχέδια έκφρασης. Τα ιστολογικά παρασκευάσματα διατηρούν άθικτη τη μορφολογία του ιστού βοηθώντας στην ερμηνεία της θετικότητας της τραχηλικής βλάβης στην p16 INK4a. Ένα πρότυπο διάχυτης χρώσης, δηλ. μια συνεχής χρώση των κυττάρων των βασικών και παραβασικών κυτταρικών στιβάδων, με ή χωρίς χρώση των υπερκείμενων κυτταρικών στιβάδων, έχει προταθεί να αξιολογείται ως θετικό αποτέλεσμα εξέτασης για την υπερέκφραση της p16 INK4a. Αυτό το πρότυπο χρώσης διαπιστώθηκε ότι προσφέρει το υψηλότερο επίπεδο τόσο ως προς την ευαισθησία όσο και ως προς την ειδικότητα για CIN υψηλού βαθμού [1, 4, 5]. Αντιθέτως, ένα πρότυπο εστιακής χρώσης (χρώση μεμονωμένων κυττάρων ή μικρών κυτταρικών ομάδων, δηλ. μη συνεχής χρώση, και ιδίως όχι των βασικών και παραβασικών κυττάρων) καθώς και η απουσία κάθε ανοσοδραστικότητας, εκλαμβάνεται ως αρνητικό αποτέλεσμα εξέτασης για την υπερέκφραση της p16 INK4a [1, 4, 5]. Η ερμηνεία των κεχρωσμένων για την p16 INK4a αντικειμενοφόρων χρησιμοποιώντας το CINtec Histology Kit πρέπει να πραγματοποιείται σε συνδυασμό με κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες παρασκευασμένες από το ίδιο δείγμα τραχηλικού ιστού. Για τη διαμόρφωση της τελικής διάγνωσης, οι επιπρόσθετες πληροφορίες που παρέχονται από τις κεχρωσμένες με CINtec αντικειμενοφόρες, πρέπει να συνδυάζονται με την προκαταρκτική μορφολογική διάγνωση που τεκμηριώνεται με τις κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες. Κλινική σημασία Η συνδυαστική ανάγνωση κεχρωσμένων με Η&Ε αντικειμενοφόρων που περιλαμβάνουν τομές από βιοψία τραχηλικού ιστού, μαζί με διαδοχικές αντικειμενοφόρες από το ίδιο δείγμα ιστού που υποβλήθηκαν σε ανοσοχρώση για την p16 INK4a, διαπιστώθηκε ότι βελτιώνει τη διαγνωστική ακρίβεια και τη συμφωνία μεταξύ των παρατηρητών στη διάγνωση της τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας υψηλού βαθμού (CIN2+). Η παθολογική διάγνωση, που βασίζεται σε κεχρωσμένες με H&E τομές τραχηλικού ιστού, εδραιώνει τη βάση για την απόφαση επιδίωξης επιπλέον αγωγής. Συνεπώς, ο αντίκτυπος μιας ανακριβούς διάγνωσης είναι σημαντικός. Η ανακριβής διάγνωση μπορεί να οδηγήσει σε ακατάλληλη διαχείριση του ασθενή, δηλ. την υπερβολική αγωγή μιας, ουσιαστικά, υγιούς γυναίκας ή την ανεπαρκή αγωγή γυναικών με εδραιωμένες δυσπλαστικές βλάβες υψηλού βαθμού. Η διαγνωστική ερμηνεία κεχρωσμένων με H&E ιστολογικών τομών υπόκειται σε υψηλά ποσοστά ασυμφωνίας μεταξύ των παθολογοανατόμων. Χαμηλά ποσοστά συμφωνίας μεταξύ παρατηρητών ή εντός παρατηρητή σε ιστολογία του τραχήλου έχουν αναφερθεί σε διάφορες δημοσιευμένες εργασίες [17-20]. REF: 9511 3 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Μια μεγάλη πολυκεντρική δοκιμή στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής αξιολόγησε την ερμηνεία ερευνών σε ιστολογικά δείγματα τραχήλου (2.237 βιοψίες κολποσκόπησης και 535 δείγματα βιοψιών κωνοειδούς ιστικής εκτομής τύπου LEEP) από πολλούς και καλά εκπαιδευμένους παθολογοανατόμους. Η επαναληψιμότητα των ιστοπαθολογικών ερμηνειών ήταν απλώς μέτρια (κ=0,46 για βιοψίες διάτρησης και κ=0,49 για δείγματα βιοψιών τύπου LEEP) [17]. Ακολουθώντας το σύστημα βαθμολόγησης του Π.Ο.Υ. και ένα τροποποιημένο σύστημα κατά Bethesda, η συμφωνία μεταξύ παρατηρητών από έξι ιστοπαθολόγους, που αξιολόγησαν 125 βιοψίες κολποσκόπησης, διαπιστώθηκε ότι ήταν ανεπαρκής για αμφότερα τα συστήματα βαθμολόγησης [18]. Παρομοίως, μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε στο Ηνωμένο Βασίλειο έδειξε ανεπαρκή συμφωνία μεταξύ παρατηρητών ανάμεσα σε οκτώ ειδικούς ιστοπαθολόγους που εξέτασαν 100 δείγματα βιοψιών κολποσκόπησης (μη σταθμισμένη τιμή κ στα 0,358) [19]. Με την προσθήκη κεχρωσμένων με CINtec Histology Kit αντικειμενοφόρων στις συμβατικώς κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες που χρησιμοποιήθηκαν για την εδραίωση των διαγνώσεων, η συνολική ακρίβεια της συγκεκριμένης ιστομορφολογικής διαγνωστικής διαδικασίας βελτιώνεται. Αρχές της διαδικασίας Το CINtec Histology Kit περιέχει ένα σύνολο αντιδραστηρίων για την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του αντιγόνου p16 INK4a. Το κιτ έχει σχεδιαστεί για την εκτέλεση μιας διαδικασίας ανοσοϊστοχημικής χρώσης δύο βημάτων για δείγματα ιστών, μονιμοποιημένων με φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη, που προέρχονται από τραχηλικές βιοψίες. Για την ανίχνευση του αντιγόνου, χρησιμοποιείται πρωτοταγές μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, κλώνος E6H4 που στρέφεται έναντι της ανθρώπινης πρωτεΐνης p16 INK4a. Χρησιμοποιείται ένα έτοιμο για χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που περιλαμβάνει ένα πολυμερές αντιδραστήριο συζευγμένο με υπεροξειδάση του χρένου και θραύσματα αντισώματος Fab αίγας έναντι ποντικού. Το Visualization Reagent έχει υποβληθεί σε απορρόφηση στερεής φάσης για εξάλειψη της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας με ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες. Η αντίδραση του χρωμογόνου βασίζεται στη μετατροπή ενός χρωμογόνου DAB που διαμεσολαβείται από υπεροξειδάση του χρένου, σε ένα ορατό προϊόν αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Μετά την αντίχρωση, το δείγμα μπορεί να καλυφθεί με καλυπτρίδα και τα αποτελέσματα να αξιολογούνται με εξέταση σε κοινό μικροσκόπιο. IV. Αντιδραστήρια Υλικά που παρέχονται Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω συμπεριλαμβάνονται σε κάθε κιτ και επαρκούν για τη διεξαγωγή 50 εξετάσεων και 50 αντιδράσεων αρνητικού μάρτυρα. Ο αριθμός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 200 µl αντιδραστηρίων ανά αντικειμενοφόρο. REF: 9511 4 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
1 Peroxidase Blocking Reagent Peroxidase Blocking Reagent 2 x 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%, που περιέχει 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN3). Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 2 Mouse anti-human p16 INK4a Antibody Mouse anti-human p16 INK4a Antibody 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι ανθρώπινης p16 INK4a, Clone E6H4, που παρέχεται σε 50 mmol/l ρυθμιστικό διάλυμα Tris ph 7,2, που περιέχει 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN3) και σταθεροποιητική πρωτεΐνη. 3 Visualization Reagent Visualization Reagent 2 x 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Πολυμερές αντιδραστήριο συζευγμένο με υπεροξειδάση του χρένου και θραύσματα αντισώματος Fab αίγας έναντι ποντικού κεκαθαρμένα με χρωματογραφία συγγένειας, που παρέχονται σε σταθεροποιητικό διάλυμα που περιέχει συντηρητικά και σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Περιέχει 5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο που μπορεί να προκαλέσει αλλεργική αντίδραση. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 4 Negative Reagent Control Negative Reagent Control 11,5 ml, έτοιμο για χρήση Μονοκλωνικό αντίσωμα νευροφυσίνης ποντικού έναντι αρουραίου σχετιζόμενη με ωκυτοκίνη, που παρέχεται σε 50 mmol/l ρυθμιστικό διάλυμα Tris ph 7,2, που περιέχει 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN3) και σταθεροποιητική πρωτεΐνη. Για επαλήθευση της ειδικότητας της χρώσης. Η νευροφυσίνη αρουραίου που σχετίζεται με την ωκυτοκίνη δεν υπάρχει σε ανθρώπινους ιστούς. 5 DAB Buffered Substrate DAB Buffered Substrate 31 ml Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος, ph 7,5, που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου <0,1%, σταθεροποιητές, ενισχυτικά και έναν αντιμικροβιακό παράγοντα. REF: 9511 5 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
6 DAB Chromogen DAB Chromogen 0,85 ml, χρωμογόνο διάλυμα 3,3 -διαμινοβενζιδίνης. Το DAB είναι επιβλαβές. Ανατρέξτε στις παρακάτω Φράσεις κινδύνου και ασφάλειας: R40 Περιορισμένα στοιχεία καρκινογόνου επίδρασης. R43 Μπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση μέσω της επαφής με το δέρμα. R68 Πιθανός κίνδυνος μη αναστρέψιμων επιδράσεων. S35 Το υλικό αυτό και ο περιέκτης του πρέπει να απορρίπτονται με ασφαλή τρόπο. S36/37 Φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ρουχισμό και γάντια. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν και η διαμινοβενζιδίνη σχετίζεται δομικά με τη βενζιδίνη, δεν υπάρχουν στοιχεία για την καρκινογόνο επίδραση της διαμινοβενζιδίνης. Συμβουλευτείτε τους τοπικούς ή κρατικούς κανονισμούς σχετικά με την απόρριψη. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 7 Epitope Retrieval Solution 10 x Epitope Retrieval Solution 10 x 500 ml, 100 mmol/l ρυθμιστικό διάλυμα Tris ph 9 που περιέχει 10 mmol/l EDTA και 15 mmol/l νατραζίδιο (NaN3). Αποθήκευση Αποθηκεύεται στους 2 8 C. Μη χρησιμοποιείτε το προϊόν μετά την ημερομηνία λήξης. Δεν έχουν συγκεντρωθεί δεδομένα αναφορικά με την αποθήκευση των αντιδραστηρίων υπό οποιεσδήποτε συνθήκες διαφορετικές των όσων αναφέρονται παραπάνω. Μετά το άνοιγμα, τα συστατικά του κιτ είναι σταθερά επί 6 μήνες εάν φυλάσσονται στους 2 8 C. Τα διαλύματα πρέπει να απορρίπτονται εάν εμφανίζουν θολερότητα. Το Diluted Wash Buffer και το αραιωμένο Epitope Retrieval Solution είναι σταθερά επί 1 μήνα εάν φυλάσσονται στους 2 8 C. Τα διαλύματα δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται εάν εμφανίζουν θολερότητα. Υλικά και αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Το Wash Buffer (10 x) που προορίζεται για χρήση με το CINtec Histology Kit διατίθεται με αριθμό καταλόγου 8550 από την Roche mtm laboratories AG αλλά δεν περιλαμβάνεται στο κιτ. Για στοιχεία παραγγελίας, ανατρέξτε στον ιστότοπο www.cintec.info. Απορροφητικό χαρτί Αντίχρωση αιματοξυλίνης REF: 9511 6 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό (Νερό πλύσης) Αιθανόλη, 95% και 70% Επικαλυπτικό μέσο Θετικοί και αρνητικοί ιστοί για χρήση ως μαρτύρων της διαδικασίας Αντικειμενοφόρες (SuperFrost Plus ή ισοδύναμες) Ξυλόλη Καλυπτρίδες Εξοπλισμός που απαιτείται Κλίβανος ξήρανσης, με ικανότητα διατήρησης της θερμοκρασίας στους 60 C ή λιγότερο Θάλαμος ύγρανσης (προαιρετικός) Κοινό μικροσκόπιο (αντικειμενική μεγέθυνση 4-40x) Δοχεία ή λουτρά χρώσης Φιάλες πλύσης Χρονόμετρο (ικανό να μετρήσει διαστήματα των 2-60 λεπτών) Υδατόλουτρο με καπάκι (ικανό διατήρησης θερμοκρασίας Epitope Retrieval Solution στους 95 99 C) V. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Προειδοποίηση 1. Προσοχή! Ορισμένα από τα αντιδραστήρια που περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ περιέχουν επικίνδυνα χημικά. Κατά το χειρισμό των συστατικών του κιτ αυτού, τηρείτε τις προφυλάξεις ασφαλείας που σχετίζονται με το χειρισμό επικίνδυνων εργαστηριακών αντιδραστηρίων. 2. Τα συστατικά 1, 2, 4, και 7 του προϊόντος αυτού περιέχουν νατραζίδιο (NaN3), που είναι εξαιρετικά τοξικό στην καθαρή μορφή του. Στις συγκεντρώσεις του προϊόντος, αν και δεν ταξινομείται ως επικίνδυνο, το νατραζίδιο ενδέχεται να αντιδράσει με μολύβδινες και χάλκινες σωληνώσεις σχηματίζοντας εξόχως εκρηκτικά μεταλλικά αζίδια. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε με μεγάλες ποσότητες νερού για να αποφευχθεί η συσσώρευση μεταλλικών αζιδίων στις σωληνώσεις. 3. Τα συστατικά 2, 3 και 4 περιέχουν υλικά ζωικής προέλευσης. Τηρείτε τις ορθές διαδικασίες χειρισμού όπως ισχύει για οποιοδήποτε προϊόν προέρχεται από βιολογικές πηγές. 4. Το Φύλλο Δεδομένων Ασφαλείας Υλικού για το κιτ είναι διαθέσιμο εάν ζητηθεί. 5. Κατά το χειρισμό και απόρριψη ιστολογικών δειγμάτων, μεταξύ των οποίων όλα τα δείγματα πριν και μετά τη μονιμοποίηση, καθώς και όλων των υλικών που εκτίθενται σε αυτά, τηρείτε τις προφυλάξεις ασφαλείας που σχετίζονται με το χειρισμό δυνητικά μολυσματικών υλικών καθώς και τις ισχύουσες απαιτήσεις απόρριψης αποβλήτων. REF: 9511 7 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
6. Κατά την αναρρόφηση αντιδραστηρίων με πιπέτα, μη χρησιμοποιείτε ποτέ το στόμα. Αποφύγετε την επαφή του δέρματος και των βλεννογόνων με αντιδραστήρια και δείγματα. Σε περίπτωση που αντιδραστήρια ή δείγματα έρθουν σε επαφή με δέρμα ή βλεννογόνους, πλύνετε με άφθονη ποσότητα νερού. 7. Τα Visualization Reagent και DAB Chromogen ενδέχεται να επηρεαστούν αρνητικά εάν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην αποθηκεύετε τα συστατικά του κιτ και μην εκτελείτε χρώση υπό ισχυρό φως, όπως σε απευθείας ηλιακό φως. 8. Φοράτε κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό για να αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα κατά το χειρισμό οποιουδήποτε από τα συστατικά που περιλαμβάνονται ή προορίζονται για χρήση σε συνδυασμό με το CINtec Histology Kit. Ανατρέξτε στο Δελτίο Δεδομένων Ασφάλειας Υλικού για περισσότερες πληροφορίες. Προσοχή 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Ελαχιστοποιήστε την μικροβιακή επιμόλυνση των αντιδραστηρίων έτσι ώστε να αποφύγετε μη ειδική χρώση. 4. Η εφαρμογή χρόνων, θερμοκρασιών ή μεθόδων επώασης διαφορετικών από τα προβλεπόμενα ενδέχεται να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα. 5. Μην χρησιμοποιείτε το κιτ εάν η συσκευασία ή οποιοδήποτε εκ των συστατικών του έχει υποστεί ζημιά. Εάν τυχόν η συσκευασία έχει αλλοιωθεί ή τα συστατικά έχουν υποστεί ζημιά, ενημερώστε τον κατασκευαστή χωρίς καθυστέρηση. 6. Η απόρριψη όλων των αποβλήτων υλικών πρέπει να είναι σύμφωνη με τις τοπικές κατευθυντήριες γραμμές και κανονισμούς. 7. Όλα τα αντιδραστήρια έχουν παρασκευαστεί ειδικά για χρήση με την εξέταση αυτή. Για να εκτελεστεί η εξέταση κατά τα καθοριζόμενα, δεν πρέπει να γίνονται υποκαταστάσεις. 8. Αν παρατηρηθεί μη αναμενόμενη χρώση, η οποία δεν μπορεί να εξηγηθεί από τις διακυμάνσεις των εργαστηριακών διαδικασιών, και υπάρχει υποψία προβλήματος με το CINtec Histology Kit, ανατρέξτε αμέσως στον ιστότοπο www.cintec.info για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την τεχνική υποστήριξη. 9. Δυσλειτουργία του προϊόντος που οφείλεται σε προβλήματα χειρισμού ή σε αστάθεια δεν έχει ως αποτέλεσμα προφανή σημάδια. Συνεπώς, ως μέτρο ποιοτικού ελέγχου, πρέπει να εκτελείται ανάλυση των θετικών και αρνητικών μαρτύρων ταυτόχρονα με τα δείγματα των ασθενών. REF: 9511 8 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
VI. Διαδικασία Προετοιμασία δειγμάτων Το CINtec Histology Kit είναι σχεδιασμένο για χρήση με δείγματα ιστών διατηρημένων για ανοσοϊστοχημικές διαδικασίες. Τα δείγματα πρέπει να παρασκευάζονται σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους επεξεργασίας ιστών. Θετικά φορτισμένες αντικειμενοφόρες, όπως οι αντικειμενοφόρες SuperFrost Plus, συνιστώνται για βέλτιστη απόδοση. Δείγματα ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη Δείγματα ιστών σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα, μονιμοποιημένα με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη, είναι κατάλληλα για χρήση με αυτό το κιτ. Αν τα δείγματα έχουν παρασκευαστεί με χρήση άλλης μεθόδου διατήρησης, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει την καταλληλότητα της μεθόδου. Δείγματα από τη βιοψία πρέπει να μονιμοποιούνται επί 18 24 ώρες σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης και να τεμαχίζονται σε τομές πάχους 3 ή 4 mm. Στη συνέχεια τα ιστοτεμάχια αφυδατώνονται με σειρά αλκοόλης αυξανόμενης διαβάθμισης και ξυλόλης, και ακολουθεί διήθηση με τηγμένη παραφίνη σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη των 60 C. Κάθε ιστοτεμάχιο τεμαχίζεται στα 4 5 µm και τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρες μικροσκοπίου SuperFrost Plus σε εργαστήριο ιστοπαθολογίας. Θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου Για τη θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου, οι τομές ιστών που επικαλύπτονται σε αντικειμενοφόρες πρέπει να θερμανθούν με εμβάπτιση στο Epitope Retrieval Solution σε βαθμονομημένο υδατόλουτρο ικανό να διατηρεί το Epitope Retrieval Solution σε θερμοκρασία 95 99 C. Εργαστήρια που βρίσκονται σε μεγαλύτερο υψόμετρο θα πρέπει να προσδιορίζουν την καλύτερη μέθοδο διατήρησης της απαιτούμενης θερμοκρασίας του υδατόλουτρου. Ο κατασκευαστής δεν συνιστά καμία απόκλιση από τη διαδικασία που περιγράφεται εδώ. Μετά από τη θερμικά επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου, οι τομές ιστού πρέπει να κρυώσουν σε θερμοκρασία δωματίου επί 20 λεπτά πριν από περαιτέρω επεξεργασία. Στη συνέχεια, πρέπει να εκτελεστεί η χρώση των τομών ιστού χωρίς καθυστέρηση. Διαδικασία χρώσης 1. Παρασκευή αντιδραστηρίου Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) πριν χρησιμοποιηθούν για ανοσοχρώση. Παρομοίως, όλα τα επόμενα βήματα πρέπει να εκτελούνται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Πρέπει να δοθεί προσοχή έτσι ώστε να αποφευχθεί στέγνωμα των δειγμάτων κατά τη διαδικασία ανοσοχρώσης, διότι το στέγνωμα ενδέχεται να οδηγήσει σε τεχνουργήματα χρώσης. Πρέπει να παρασκευαστούν τα παρακάτω αντιδραστήρια πριν την έναρξη της διαδικασίας χρώσης: REF: 9511 9 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
1.1 Epitope Retrieval Solution Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα Epitope Retrieval Solution για τη διαδικασία χρώσης που προγραμματίζεται με αραίωση μιας ποσότητας του Φιαλιδίου 7 (Epitope Retrieval Solution 10 x)σε αναλογία 1:10 με χρήση αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Μετά την αραίωση, το Epitope Retrieval Solution μπορεί να αποθηκευτεί στους 2 8 C για έως ένα μήνα. Το αραιωμένο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται εάν παρουσιάσει θολερότητα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρήση νερού με αυξημένα επίπεδα ιόντων για αραίωση του διαλύματος ανάκτησης επιτόπου μπορεί να μειώσει σημαντικά την απόδοση χρώσης της εξέτασης. Βεβαιωθείτε ότι το νερό που χρησιμοποιείται είναι σωστά απιονισμένο (δηλ. βεβαιωθείτε ότι έχει σημειωθεί η στήλη ανταλλαγής ιόντων για την παραγωγή του απιονισμένου νερού από το τμήμα συντήρησης ρουτίνας). Μην χρησιμοποιείτε νερό βρύσης! 1.2 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Χρησιμοποιήστε Wash Buffer (10 x), αριθμός καταλόγου 8550, που παρέχεται από την Roche mtm laboratories AG σε συνδυασμό με το CINtec Histology Kit. Για στοιχεία παραγγελίας, ανατρέξτε στον ιστότοπο www.cintec.info. Παρασκευάστε μια ποσότητα Wash Buffer επαρκή για τα βήματα πλύσης της διαδικασίας χρώσης που προγραμματίζεται με αραίωση μιας ποσότητας του Wash Buffer (10 x), αριθμός καταλόγου 8550, σε αναλογία 1:10 με χρήση αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Μετά την αραίωση, το Wash Buffer μπορεί να αποθηκευτεί στους 2 8 C για έως ένα μήνα. Το αραιωμένο διάλυμα πρέπει να απορρίπτεται εάν παρουσιάσει θολερότητα. 1.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) Για την παρασκευή του Substrate-Chromogen Solution, πρέπει να προστεθεί μία σταγόνα του DAB Chromogen σε 2 ml του DAB Buffered Substrate. Συνεχίστε ως εξής: i) μεταφέρετε 2 ml DAB Buffered Substrate από το Φιαλίδιο 5 σε δοκιμαστικό σωληνάριο ii) προσθέστε μία σταγόνα (25 30 µl) DAB Chromogen από το Φιαλίδιο 6. Αναμίξτε και εφαρμόστε στις τομές ιστού με πιπέτα. Συνήθως 2 ml Substrate-Chromogen Solution (DAB) που παρασκευάζονται σύμφωνα με τις παραπάνω οδηγίες επαρκούν για τη χρώση πέντε τομών ιστού, συμπεριλαμβανομένων των αντίστοιχων πέντε δειγμάτων μάρτυρα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Χρησιμοποιήστε το παρασκευασμένο Substrate-Chromogen Solution (DAB) εντός της ίδιας ημέρας. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η προσθήκη περίσσειας DAB Chromogen στο DAB Buffered Substrate έχει ως αποτέλεσμα την επιδείνωση του θετικού σήματος. REF: 9511 10 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
1.4 Αντίχρωση Οι αντιδράσεις χρώσης DAB έχουν ως αποτέλεσμα χρωματισμένο τελικό προϊόν, μη υδατοδιαλυτό. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί αιματοξυλίνη με βάση αλκοόλη ή νερό για την αντίχρωση. Αν χρησιμοποιηθεί, τηρήστε τις οδηγίες που παρέχονται από τον προμηθευτή της αιματοξυλίνης για την εκτέλεση της αντίχρωσης. 1.5 Επικαλυπτικό μέσο Για την επικάλυψη δειγμάτων αντικειμενοφόρων μετά τη χρώση, συνιστάται μη υδατικό, μόνιμο επικαλυπτικό μέσο. Ωστόσο, είναι επίσης αποδεκτή υδατική επικάλυψη. Για μη υδατική επικάλυψη συνιστάται το Eukitt Mounting Medium. Για υδατική επικάλυψη συνιστάται το Aquatex Merck. 2. Διαδικασία χρώσης για αυτοματοποιημένα όργανα χρώσης Το CINtec Histology Kit έχει προσαρμοστεί για χρήση σε αυτοματοποιημένα όργανα χρώσης (π.χ., Lab Vision Autostainer 480 ή Dako Autostainer Plus) σύμφωνα με το πρότυπο που περιγράφεται παρακάτω. Πριν τη χρώση στο αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης, τα δείγματα και τα αντιδραστήρια πρέπει να παρασκευάζονται όπως περιγράφεται στις ενότητες 1.1-1.5 και 2.1. 2.1 Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση Πριν την αποπαραφίνωση, τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε κλίβανο ξήρανσης σε θερμοκρασία όχι υψηλότερη των 60 C επί τουλάχιστον 20 λεπτά, αλλά όχι περισσότερο από μία ώρα, με σκοπό την ποσοτική αφαίρεση νερού, βελτιώνοντας έτσι την προσκόλληση του ιστού στις γυάλινες αντικειμενοφόρες ("θέρμανση") και την τήξη της παραφίνης. Οι αντικειμενοφόρες των ιστών πρέπει να αποπαραφινωθούν για να αφαιρεθεί το μέσο έγκλεισης και, στη συνέχεια, πρέπει να επανυδατωθούν για να είναι εφικτή η διαδικασία χρώσης. Είναι κρίσιμης σημασίας να αποφευχθεί η ατελής αφαίρεση της παραφίνης διότι κατάλοιπα του μέσου έγκλεισης έχουν ως αποτέλεσμα αυξημένη μη ειδική χρώση. Επωάστε τις αντικειμενοφόρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 25 C) σύμφωνα με τα παρακάτω βήματα. 5 (±1) λεπτά σε λουτρό ξυλόλης επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά με φρέσκο λουτρό αφαιρέστε την περίσσεια υγρού 3 (±1) λεπτά σε αιθανόλη 95% επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά με φρέσκο λουτρό αφαιρέστε την περίσσεια υγρού 3 (±1) λεπτά σε αιθανόλη 70% επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά με φρέσκο λουτρό αφαιρέστε την περίσσεια υγρού 30 δευτερόλεπτα τουλάχιστον σε αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης όπως περιγράφεται στην ενότητα 2.2, βήμα 1: Ανάκτηση επιτόπου. REF: 9511 11 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Τα διαλύματα ξυλόλης και αλκοόλης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για περισσότερες από 40 αντικειμενοφόρες. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι χρήστες πρέπει να σημειώσουν ότι διακυμάνσεις στη θερμοκρασία του εξοπλισμού ή στους χρόνους έκθεσης κατά την παρασκευή δειγμάτων πριν την ανάλυση ενδέχεται να οδηγήσουν σε ατελή αφαίρεση της παραφίνης από τις αντικειμενοφόρες ιστών. Κατάλοιπα παραφίνης μπορεί να οδηγήσουν σε ατελή χρώση με οποιαδήποτε ιστολογική χρωστική, συμπεριλαμβανομένης της ιστολογικής χρωστικής CINtec. Τα ιστοπαθολογικά εργαστήρια πρέπει να περιλαμβάνουν τακτική παρακολούθηση του εξοπλισμού ώστε να μειώνονται οι διακυμάνσεις της παρασκευής δειγμάτων πριν τη χρώση. Η παρατήρηση ευκρινώς προσδιορισμένων ορίων εντός των ανοσοδραστικών περιοχών του ιστού ή άλλες χρωστικές ασυνέπειες εντός μίας αντικειμενοφόρου ενδέχεται να αποτελούν ένδειξη μη βέλτιστης ή ατελούς επεξεργασίας του δείγματος πριν την ανάλυση, με οποιαδήποτε ανοσοϊστοχημική χρωστική. Οι χρήστες πρέπει να εξετάσουν το ενδεχόμενο ελέγχου του εξοπλισμού και των μεθόδων παρασκευής των δειγμάτων πριν την ανάλυση, εάν παρατηρηθεί ασυνέπεια χρώσης. 2.2. Πρωτόκολλο χρώσης για αυτοματοποιημένα όργανα χρώσης Βήμα 1: Ανάκτηση επιτόπου γεμίστε τα δοχεία χρώσης, π.χ., πλαστικά δοχεία Coplin, με το αραιωμένο Epitope Retrieval Solution (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.1) τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν Epitope Retrieval Solution σε υδατόλουτρο και θερμάνετε το υδατόλουτρο και το Epitope Retrieval Solution σε θερμοκρασία 95 99 C. Είναι σημαντικό να ρυθμίσετε τη στάθμη του νερού στο υδατόλουτρο έτσι ώστε να βεβαιωθείτε ότι τα δοχεία είναι βυθισμένα στο νερό σε επίπεδο 80%. Για να σταθεροποιήσετε τη θερμοκρασία και να αποφύγετε την εξάτμιση, καλύψτε τα δοχεία με καπάκια. βυθίστε τις αποπαραφινωμένες τομές στο προθερμασμένο Epitope Retrieval Solution στα δοχεία χρώσης. Το βήμα αυτό συνήθως ελαττώνει τη θερμοκρασία στα δοχεία σε λιγότερο από τους 90 C. αυξήστε και πάλι τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου και του Epitope Retrieval Solution μέσα στα δοχεία στους 95 99 C. Ελέγξτε τη θερμοκρασία του Epitope Retrieval Solution στα δοχεία. επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους 95 99 C. Ξεκινήστε την αντίστροφη μέτρηση μόνο αφού έχει επαληθευτεί ότι η θερμοκρασία του Epitope Retrieval Solution στα δοχεία έχει φθάσει θερμοκρασία 95 99 C. βγάλτε όλο το δοχείο με τις αντικειμενοφόρες από το υδατόλουτρο αφήστε τις αντικειμενοφόρες να κρυώσουν στο Epitope Retrieval Solution επί 20 (±1) λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου αδειάστε το Epitope Retrieval Solution και ξεπλύνετε τις τομές στο Wash Buffer (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.2) για βέλτιστη απόδοση, εμβαπτίστε τις τομές σε Wash Buffer επί 5 λεπτά μετά την ανάκτηση επιτόπου και πριν τη χρώση ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Epitope Retrieval Solution είναι σχεδιασμένο για χρήση μόνο μίας εφαρμογής. Μην το επαναχρησιμοποιείτε. REF: 9511 12 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Βήμα 2: Προγραμματισμός του οργάνου Πριν την πρώτη εφαρμογή του CINtec Histology Kit σε αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης, πρέπει να διαμορφωθεί ένα νέο πρότυπο. Ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήσης του συγκεκριμένου αυτοματοποιημένου οργάνου χρώσης. Βήμα 3: Διαδικασία αυτοματοποιημένου οργάνου χρώσης μεταφέρετε τα αντιδραστήρια από τις φιάλες του κιτ στα διαβαθμισμένα φιαλίδια αντιδραστηρίων του αυτοματοποιημένου οργάνου χρώσης. Χρησιμοποιήστε το διάγραμμα που δημιουργεί το αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης για τους χρόνους προγράμματος και τους όγκους αντιδραστηρίων (βλ. σημείο 4 για συγκεκριμένους χρόνους και όγκους). τοποθετήστε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων του αυτοματοποιημένου οργάνου χρώσης στο στατό αντιδραστηρίων του αυτοματοποιημένου οργάνου χρώσης σύμφωνα με το "Reagent Layout Map" (Διάγραμμα διάταξης αντιδραστηρίων) φορτώστε τις αντικειμενοφόρες στο αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης σύμφωνα με το "Slide Layout Map" (Διάγραμμα διάταξης αντικειμενοφόρων) πρέπει να ραντίσετε τα δείγματα με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης μετά την τοποθέτησή τους στο αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης για να αποτρέψετε το στέγνωμα. ακολουθεί μια σκιαγράφηση του κύκλου προγράμματος: o ξέπλυμα* o 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent - 5 λεπτά o ξέπλυμα* o 200 µl Primary p16 INK4a antibody ή Negative Reagent Control 30 λεπτά o ξέπλυμα* o 200 µl Visualization Reagent - 30 λεπτά o ξέπλυμα* o ξέπλυμα* o ξέπλυμα* o αλλαγή o 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) - 10 λεπτά o ξέπλυμα* o ξεπλύνετε τις αντικειμενοφόρες σε απιονισμένο νερό μετά το βήμα υποστρώματος-χρωμογόνου *χρησιμοποιήστε Wash Buffer για τα αντίστοιχα βήματα ξεπλύματος. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν το αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης που χρησιμοποιείται ξεπλένει τις αντικειμενοφόρες με ρυθμιστικό διάλυμα, οι αντικειμενοφόρες πρέπει να ξεπλυθούν με απιονισμένο νερό αφού βγουν από το αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης. REF: 9511 13 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Βήμα 4: Αντίχρωση (οι οδηγίες αφορούν την αιματοξυλίνη) βυθίστε τις αντικειμενοφόρες σε λουτρό αιματοξυλίνης. Επωάστε επί 2 5 λεπτά, ανάλογα με την ισχύ της αιματοξυλίνης που χρησιμοποιείται. τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε λουτρό νερού βρύσης και ξεπλύνετε απαλά με τρεχούμενο νερό βρύσης. Βεβαιωθείτε ότι έχει γίνει εκκαθάριση όλης της εναπομένουσας αιματοξυλίνης. ξεπλύνετε για σύντομο διάστημα τις αντικειμενοφόρες απαλά σε λουτρό αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Η αντίχρωση μπορεί να εκτελεστεί απευθείας στο αυτοματοποιημένο όργανο χρώσης. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανάλογα με τη διάρκεια της επώασης και την ισχύ της χρησιμοποιούμενης αιματοξυλίνης, η αντίχρωση θα έχει ως αποτέλεσμα μια ανοιχτή έως σκούρα μπλε χρώση των κυτταρικών πυρήνων. Η υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να παρεμποδίσει την ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Βήμα 5: Επικάλυψη Συνιστάται μη υδατικό, μόνιμο επικαλυπτικό μέσο. Ειδάλλως, είναι επίσης αποδεκτό υδατικό επικαλυπτικό μέσο. Τηρήστε τις οδηγίες χρήσης του προμηθευτή του επικαλυπτικού μέσου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση χρώματος, προστατεύστε τις αντικειμενοφόρες από το φως και φυλάξτε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 25 C). REF: 9511 14 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
3. Διαδικασία χρώσης για μη αυτόματη χρήση ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αποτρέψτε το στέγνωμα των τομών ιστού κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. Στεγνές τομές ιστού ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσμα αυξημένη μη ειδική χρώση. Για παρατεταμένους χρόνους επώασης, φυλάξτε τους ιστούς σε υγρό περιβάλλον. Τηρείτε τις πρότυπες διαδικασίες που χρησιμοποιούνται στη μη αυτόματη ανοσοϊστοχημική χρώση κατά τη μη αυτόματη χρώση με το CINtec Histology Kit. 3.1 Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση Πριν την αποπαραφίνωση, τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε κλίβανο ξήρανσης σε θερμοκρασία όχι υψηλότερη των 60 C επί τουλάχιστον 20 λεπτά, αλλά όχι περισσότερο από μία ώρα, με σκοπό την ποσοτική αφαίρεση νερού, βελτιώνοντας έτσι την προσκόλληση του ιστού στις γυάλινες αντικειμενοφόρες ("θέρμανση") και την τήξη της παραφίνης. Οι αντικειμενοφόρες των ιστών πρέπει να αποπαραφινωθούν για να αφαιρεθεί το μέσο έγκλεισης και, στη συνέχεια, πρέπει να επανυδατωθούν για να είναι εφικτή η διαδικασία χρώσης. Είναι κρίσιμης σημασίας να αποφευχθεί η ατελής αφαίρεση της παραφίνης διότι κατάλοιπα του μέσου έγκλεισης έχουν ως αποτέλεσμα αυξημένη μη ειδική χρώση. Επωάστε τις αντικειμενοφόρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 25 C) σύμφωνα με τα παρακάτω βήματα. 5 (±1) λεπτά σε λουτρό ξυλόλης Επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά με φρέσκο λουτρό Αφαιρέστε την περίσσεια υγρού 3 (±1) λεπτά σε αιθανόλη 95% Επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά με φρέσκο λουτρό Αφαιρέστε την περίσσεια υγρού 3 (±1) λεπτά σε αιθανόλη 70% Επαναλάβετε το βήμα αυτό μία φορά με φρέσκο λουτρό Αφαιρέστε την περίσσεια υγρού 30 δευτερόλεπτα τουλάχιστον σε αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης όπως περιγράφεται στην ενότητα 3,2, βήμα 1: Ανάκτηση επιτόπου. Τα διαλύματα ξυλόλης και αλκοόλης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για περισσότερες από 40 αντικειμενοφόρες. REF: 9511 15 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
3.2. Πρωτόκολλο χρώσης για μη αυτόματη χρήση Βήμα 1: Ανάκτηση επιτόπου γεμίστε τα δοχεία χρώσης, π.χ., πλαστικά δοχεία Coplin, με το αραιωμένο Epitope Retrieval Solution (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.1) τοποθετήστε τα δοχεία χρώσης που περιέχουν Epitope Retrieval Solution σε υδατόλουτρο και θερμάνετε το υδατόλουτρο και το Epitope Retrieval Solution σε θερμοκρασία 95 99 C. Στο βήμα αυτό, είναι σημαντικό να ρυθμίσετε τη στάθμη του νερού στο υδατόλουτρο έτσι ώστε να βεβαιωθείτε ότι τα δοχεία είναι βυθισμένα στο νερό σε επίπεδο 80%. Για να σταθεροποιήσετε τη θερμοκρασία και να αποφύγετε την εξάτμιση, καλύψτε τα δοχεία με καπάκια. βυθίστε τις αποπαραφινωμένες τομές στο προθερμασμένο Epitope Retrieval Solution στα δοχεία χρώσης. Το βήμα αυτό συνήθως ελαττώνει τη θερμοκρασία στα δοχεία σε λιγότερο από τους 90 C. αυξήστε και πάλι τη θερμοκρασία του υδατόλουτρου και του Epitope Retrieval Solution μέσα στα δοχεία στους 95 99 C. Ελέγξτε τη θερμοκρασία του Epitope Retrieval Solution στα δοχεία. επωάστε επί 10 (±1) λεπτά στους 95 99 C. Ξεκινήστε την αντίστροφη μέτρηση μόνο αφού έχει επαληθευτεί ότι η θερμοκρασία του Epitope Retrieval Solution στα δοχεία έχει φθάσει θερμοκρασία 95 99 C. βγάλτε όλο το δοχείο με τις αντικειμενοφόρες από το υδατόλουτρο αφήστε τις αντικειμενοφόρες να κρυώσουν στο Epitope Retrieval Solution επί 20 (±1) λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου αδειάστε το Epitope Retrieval Solution και ξεπλύνετε τις τομές στο αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (βλ. Διαδικασία, ενότητα 1.2) για βέλτιστη απόδοση, εμβαπτίστε τις τομές σε Wash Buffer επί 5 (±1) λεπτά μετά την ανάκτηση επιτόπου και πριν τη χρώση ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Epitope Retrieval Solution είναι σχεδιασμένο για χρήση μόνο μίας εφαρμογής. Μην το επαναχρησιμοποιείτε. Βήμα 2: Peroxidase-Blocking Reagent εφαρμόστε 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent για κάλυψη του δείγματος επωάστε επί 5 (±1) λεπτά απομακρύνετε με απαλό χτύπημα την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε φρέσκο λουτρό Wash Buffer επί 5 (±1) λεπτά REF: 9511 16 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Βήμα 3: Primary Antibody ή Negative Reagent Control αφαιρέστε την περίσσεια ρυθμιστικού διαλύματος καλύψτε το δείγμα με 200 µl πρωτοταγούς αντισώματος (Mouse Anti-Human p16 INK4a ή Negative Reagent Control) επωάστε επί 30 (±1) λεπτά απομακρύνετε με απαλό χτύπημα την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε φρέσκο λουτρό Wash Buffer επί 5 (±1) λεπτά Βήμα 4: Visualization Reagent αφαιρέστε την περίσσεια ρυθμιστικού διαλύματος καλύψτε το δείγμα με 200 µl Visualization Reagent επωάστε επί 30 (±1) λεπτά απομακρύνετε με απαλό χτύπημα την περίσσεια υγρού και τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε φρέσκο λουτρό ρυθμιστικού διαλύματος επί 5 (±1) λεπτά επαναλάβετε το βήμα αυτό δύο φορές με φρέσκο λουτρό Wash Buffer Βήμα 5: Substrate-Chromogen Solution (DAB) καλύψτε το δείγμα με 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) που παρασκευάστηκε σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο 1.3 παραπάνω επωάστε επί 10 (±1) λεπτά απομακρύνετε με απαλό χτύπημα την περίσσεια υγρού και ξεπλύνετε με αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Συλλέγετε τα απόβλητα του Substrate-Chromogen Solution (DAB) σε δοχείο επικίνδυνων υλικών για σωστή απόρριψη. Βήμα 6: Αντίχρωση (οι οδηγίες αφορούν την αιματοξυλίνη) βυθίστε τις αντικειμενοφόρες σε λουτρό αιματοξυλίνης. Επωάστε επί 2 5 λεπτά, ανάλογα με την ισχύ της αιματοξυλίνης που χρησιμοποιείται. τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρες σε λουτρό νερού βρύσης και ξεπλύνετε απαλά με τρεχούμενο νερό βρύσης. Βεβαιωθείτε ότι έχει γίνει εκκαθάριση όλης της εναπομένουσας αιματοξυλίνης. ξεπλύνετε για σύντομο διάστημα τις αντικειμενοφόρες απαλά σε λουτρό αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Ανάλογα με τη διάρκεια της επώασης και την ισχύ της χρησιμοποιούμενης αιματοξυλίνης, η αντίχρωση θα έχει ως αποτέλεσμα μια ανοιχτή έως σκούρα μπλε χρώση των κυτταρικών πυρήνων. Η υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να παρεμποδίσει την ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. REF: 9511 17 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Βήμα 7: Επικάλυψη Συνιστάται μη υδατικό, μόνιμο επικαλυπτικό μέσο. Για μόνιμα επικαλυπτικά μέσα με βάση την ξυλόλη, είναι απαραίτητη η διαδικασία αφυδάτωσης, π.χ. αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό 3 λεπτά αιθανόλη 70% 3 λεπτά αιθανόλη 70% 3 λεπτά αιθανόλη 96% 3 λεπτά αιθανόλη 99% 5 λεπτά ξυλόλη 5 λεπτά ξυλόλη Ειδάλλως, είναι επίσης αποδεκτό υδατικό επικαλυπτικό μέσο. Τηρήστε τις οδηγίες χρήσης του προμηθευτή του επικαλυπτικού μέσου. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση χρώματος, προστατεύστε τις αντικειμενοφόρες από το φως και φυλάξτε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (20 25 C). VII. Ποιοτικός έλεγχος Αποκλίσεις από τις συνιστώμενες διαδικασίες για τη μονιμοποίηση και επεξεργασία των δειγμάτων ενδέχεται να προκαλέσουν σημαντική μεταβλητότητα των αποτελεσμάτων, απαιτώντας τακτική εκτέλεση των μαρτύρων του εργαστηρίου. Θετικός μάρτυρας ιστού Τα υλικά των εξωτερικών θετικών μαρτύρων πρέπει να είναι νωπά δείγματα από νεκροψία, βιοψία, ή χειρουργική επέμβαση, επεξεργασμένα και εγκλεισμένα όσο το δυνατόν νωρίτερα κατά τρόπο όμοιο με το ένα ή περισσότερα δείγματα ασθενή. Οι θετικοί μάρτυρες ιστών είναι ενδεικτικοί σωστά παρασκευασμένων ιστών και ορθών τεχνικών χρώσης. Πρέπει να περιλαμβάνεται ένας θετικός εξωτερικός μάρτυρας ιστού με κάθε σύνολο συνθηκών εξέτασης σε κάθε κύκλο χρώσης. Οι ιστοί που χρησιμοποιούνται ως υλικά εξωτερικών θετικών μαρτύρων πρέπει να επιλέγονται από δείγματα ασθενών με γνωστή θετική χρώση για p16 INK4a. Αν οι θετικοί μάρτυρες ιστού δεν εμφανίσουν κατάλληλη θετική χρώση, τα αποτελέσματα της εξέτασης των δειγμάτων πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Αρνητικός μάρτυρας ιστού Κυτταρικοί τύποι γνωστοί ως αρνητικοί για p16 INK4a που υπάρχει στις περισσότερες τομές ιστού μπορούν να χρησιμοποιηθούν από τον ειδικό του εργαστηρίου ως θέσεις εσωτερικού αρνητικού μάρτυρα για επαλήθευση των προδιαγραφών απόδοσης IHC. Αν παρουσιαστεί ειδική χρώση (ψευδώς θετική χρώση) στον ιστό αρνητικού μάρτυρα, τα αποτελέσματα των δειγμάτων ασθενή πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. REF: 9511 18 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Μη ειδικό αντιδραστήριο αρνητικού μάρτυρα Χρησιμοποιήστε το μη ειδικό Negative Reagent Control αντί για το πρωτοταγές αντίσωμα με μιας τομή κάθε δείγματος ασθενή για αξιολόγηση της μη ειδικής χρώσης και διευκόλυνση καλύτερης ερμηνείας της ειδικής χρώσης στη θέση αντιγόνου. Αν παρουσιαστεί ειδική χρώση (ψευδώς θετική χρώση) με το μη ειδικό Negative Reagent Control, τα αποτελέσματα των δειγμάτων ασθενή πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. VIII. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Τα δείγματα μάρτυρα που χρωματίζονται με το Negative Reagent Control ως πρωτοταγές αντιδραστήριο δεν πρέπει να παρουσιάζουν ειδική χρώση. Η θετική χρώση με χρήση του monoclonal mouse anti-human p16 INK4a antibody, Clone E6H4 πρέπει να αξιολογείται στο πλαίσιο οποιασδήποτε μη ειδικής χρώσης υποβάθρου του Negative Reagent Control. Όπως ισχύει για κάθε ανοσοϊστοχημική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι το υπό εξέταση αντιγόνο δεν ανιχνεύτηκε και όχι ότι το αντιγόνο απουσιάζει στα κύτταρα ή στους ιστούς που αναλύθηκαν. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να λάβει υπόψη της το γεγονός ότι, η p16 INK4a είναι μια κυτταρική πρωτεΐνη η οποία μπορεί να εκφράζεται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα σε τραχηλικές δυσπλαστικές βλάβες και τραχηλικούς καρκίνους υψηλού βαθμού καθώς και σε ορισμένες παθήσεις που δεν σχετίζονται με τραχηλική δυσπλασία, μολονότι σε διαφορετικά επίπεδα και με διαφορετικά σχέδια έκφρασης. Τα δείγματα των κεχρωσμένων αντικειμενοφόρων αξιολογούνται βάσει ενός δυαδικού συστήματος αξιολόγησης που αποτελείται από τις αξιολογήσεις "θετικό" και "αρνητικό". Η αξιολόγηση "θετικό" αποδίδεται εάν το δείγμα της κεχρωσμένης για p16 INK4a αντικειμενοφόρου παρουσιάζει συνεχή χρώση κυττάρων της βασικής και παραβασικής κυτταρικής στιβάδας του πλακώδους τραχηλικού επιθηλίου, με ή χωρίς χρώση των κυττάρων των υπερκείμενων κυτταρικών στιβάδων ("πρότυπο διάχυτης χρώσης"). Ένα παράδειγμα αντικειμενοφόρου που έχει αξιολογηθεί ως "θετική" ("πρότυπο διάχυτης χρώσης") παρουσιάζεται στο Παράρτημα 2, Εικόνα 1. Η αξιολόγηση "αρνητικό" αποδίδεται εάν το δείγμα της κεχρωσμένης για p16 INK4a αντικειμενοφόρου παρουσιάζει είτε αρνητική αντίδραση χρώσης στο πλακώδες επιθήλιο ("αρνητικό πρότυπο χρώσης") ή χρώση μεμονωμένων κυττάρων ή μικρών κυτταρικών ομάδων, δηλ., μη συνεχή χρώση, και ιδίως όχι των βασικών και παραβασικών κυττάρων ("εστιακό πρότυπο χρώσης"). Ένα παράδειγμα αντικειμενοφόρου που έχει αξιολογηθεί ως "αρνητική" ("εστιακό πρότυπο χρώσης") παρουσιάζεται στο Παράρτημα 2, Εικόνα 2. Η ερμηνεία των κεχρωσμένων για την p16 INK4a αντικειμενοφόρων χρησιμοποιώντας το CINtec Histology Kit πρέπει να πραγματοποιείται σε συνδυασμό με κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες παρασκευασμένες από το ίδιο δείγμα τραχηλικού ιστού. Για τη διαμόρφωση της τελικής διάγνωσης, οι επιπρόσθετες πληροφορίες που παρέχονται από τις κεχρωσμένες με CINtec αντικειμενοφόρες, πρέπει να συνδυάζονται με την προκαταρκτική μορφολογική διάγνωση που τεκμηριώνεται με τις κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες. REF: 9511 19 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
IX. Περιορισμοί Μόνο για επαγγελματική χρήση. Απαιτείται ειδική εκπαίδευση για την εκτέλεση ανοσοϊστοχημικών διαδικασιών. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε θετικής ή αρνητικής χρώσης πρέπει να αξιολογείται στο πλαίσιο της κλινικής παρουσίασης, μορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε θετικής ή αρνητικής χρώσης πρέπει να συμπληρώνεται από μορφολογικές μελέτες με χρήση κατάλληλων θετικών και αρνητικών, εσωτερικών και εξωτερικών μαρτύρων, καθώς και από άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Είναι ευθύνη του ειδικευμένου παθολογοανατόμου, που είναι εξοικειωμένος με τη σωστή χρήση αντισωμάτων, αντιδραστηρίων και μεθόδων IHC, να ερμηνεύει όλα τα βήματα που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή και ερμηνεία του τελικού παρασκευάσματος IHC. Τα αποτελέσματα χρώσης στην ανοσοϊστοχημεία επηρεάζονται έντονα από την ποιότητα των ιστών που χρωματίζονται. Αντιστοίχως, τα βήματα μονιμοποίησης, πλύσης, στεγνώματος, θέρμανσης, τεμαχισμού ή επιμόλυνσης με άλλους ιστούς συμβάλλουν σημαντικά στο συνολικό αποτέλεσμα της χρώσης και ενδέχεται να οδηγήσουν σε τεχνουργήματα, παγίδευση αντισώματος ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Αντιφατικά αποτελέσματα ενδέχεται να οφείλονται λόγω διακυμάνσεων στις μεθόδους μονιμοποίησης και έγκλεισης ή από εγγενείς ανωμαλίες στον ιστό. Η υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να παρεμποδίσει την ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Ο κατασκευαστής παρέχει αυτά τα αντισώματα/αντιδραστήρια σε βέλτιστη αραίωση για χρήση σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται εδώ, για εξετάσεις IHC παρασκευασμένων τομών ιστού. Οποιαδήποτε απόκλιση από τις συνιστώμενες διαδικασίες εξέτασης ενδέχεται να ακυρώσει τα δηλωθέντα αναμενόμενα αποτελέσματα. Πρέπει να χρησιμοποιούνται και να τεκμηριώνονται κατάλληλοι μάρτυρες. Οι χρήστες που δεν ακολουθούν τις συνιστώμενες διαδικασίες εξέτασης πρέπει να αποδεχθούν την ευθύνη ερμηνείας των αποτελεσμάτων του ασθενή υπό αυτές τις συνθήκες. Ενδέχεται να παρουσιαστούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω μη ανοσολογικής πρόσδεσης των πρωτεϊνών, ή λόγω εμφάνισης προϊόντων αντίδρασης του υποστρώματος. Ψευδώς θετικά αποτελέσματα ενδέχεται επίσης να προκληθούν από τη δραστηριότητα της ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και τη δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωμα C). Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να παρουσιάσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε ιστούς που εξετάζονται για πρώτη φορά. Η πιθανότητα μη αναμενόμενων αντιδράσεων ακόμη και σε δοκιμασμένες ομάδες ιστών δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς λόγω της βιολογικής μεταβλητότητας της έκφρασης του αντιγόνου σε νεοπλασίες ή άλλους παθολογικούς ιστούς. Επικοινωνήστε με την Roche mtm laboratories AG με τεκμηριωμένες μη αναμενόμενες αντιδράσεις. Για πληροφορίες σχετικά με την τεχνική υποστήριξη, ανατρέξτε στον ιστότοπο www.cintec.info. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια του κιτ με αντιδραστήρια που φέρουν διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας ή με αντιδραστήρια από άλλους κατασκευαστές. REF: 9511 20 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
X. Χαρακτηριστικά απόδοσης Κλινική απόδοση Η κλινική απόδοση του CINtec Histology Kit αξιολογήθηκε σε ελεγχόμενη κλινική μελέτη με χρήση μονιμοποιημένων με φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη δειγμάτων τραχηλικού ιστού [21]. Η μελέτη σχεδιάστηκε για να αποδείξει την καταλληλότητα του CINtec Histology Kit ως βοήθημα για την αύξηση της διαγνωστικής ακρίβειας και της συμφωνίας μεταξύ των παρατηρητών για την ανίχνευση τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας υψηλού βαθμού (CIN2+). Η κλινική μελέτη διεξήχθη σε δείγματα βιοψίας με λήψη τραχηλικού ιστού και βιοψίας με κωνοειδή εκτομή ιστού, που συλλέχθηκαν αναδρομικά. Ένα σύνολο 500 τραχηλικών δειγμάτων, που ανακτήθηκαν από δύο διαφορετικά ευρωπαϊκά εργαστήρια παθολογοανατομίας και εμπλουτίστηκαν για δυσπλασία υψηλού βαθμού με βάση τις αρχικές διαγνώσεις τους, χρησιμοποιήθηκαν για παρασκευή αντικειμενοφόρων κεχρωσμένων με H&E και έγινε χρώση διαδοχικών αντικειμενοφόρων με το CINtec Histology Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τρεις Ευρωπαίοι παθολογοανατόμοι, ειδικοί στη γυναικεία παθολογοανατομία, παγίωσαν την ανεξάρτητη διάγνωσή τους για κάθε περίπτωση με βάση την κεχρωσμένη με H&E αντικειμενοφόρο. Περιπτώσεις με αντιφατικά αποτελέσματα υποβλήθηκαν σε δεύτερη κοινή διαδικασία επισκόπησης στη διάρκεια μιας συνάντησης για ετυμηγορία, και οι διαγνώσεις της πλειοψηφίας (διαγνώσεις ομοφωνίας, δύο από τις τρεις) χρησιμοποιήθηκαν ως διαγνώσεις σταθερού προτύπου (πρότυπο αναφοράς) για τη μελέτη. Δώδεκα ερευνητές (πιστοποιημένοι παθολογοανατόμοι που αναγινώσκουν τραχηλική παθολογοανατομία σε τακτική βάση) από 4 ευρωπαϊκές χώρες (Γαλλία, Ιταλία, Ισπανία και Γερμανία) συμμετείχαν ως παθολογοανατόμοι της ομάδας στη μελέτη. Σε έναν πρώτο γύρο ερμηνείας των αντικειμενοφόρων, όλοι οι παθολογοανατόμοι της ομάδας παγίωσαν τις προσωπικές διαγνώσεις τους για κάθε περίπτωση με βάση μόνο τις κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες. Οι παθολογοανατόμοι ήταν διαρκώς τυφλοποιημένοι ως προς τις αρχικές διαγνώσεις και ως προς τις διαγνώσεις σταθερού προτύπου. Μετά από μια περίοδο αδράνειας περισσότερων των 4 εβδομάδων, το ίδιο σύνολο κεχρωσμένων με H&E αντικειμενοφόρων (με αλλαγή ετικετών) εξετάστηκαν και πάλι και από τους δώδεκα παθολογοανατόμους της ομάδας, σε συνδυασμό με τις αντιστοιχισμένες αντικειμενοφόρες κάθε περίπτωσης κεχρωσμένων με το CINtec Histology Kit. Για την αξιολόγηση των βελτιώσεων στη διαγνωστική ακρίβεια των κεχρωσμένων με CINtec - τραχηλικών αντικειμενοφόρων που αναγνώσθηκαν σε συνδυασμό με τις αντίστοιχες κεχρωσμένες με H&E αντικειμενοφόρες σε σύγκριση με τις τραχηλικές που χρωματίστηκαν μόνο με H&E, τα αποτελέσματα από την ανάγνωση κάθε παθολογοανατόμου της ομάδας και για τις δύο μεθόδους συγκρίθηκαν με τις διαγνώσεις ομοφωνίας που έγιναν από τους τρεις παθολογοανατόμους, τους ειδικούς στη γυναικεία παθολογοανατομία. Αποτελέσματα: Στην ανάλυση δεδομένων συμπεριλήφθηκαν συνολικά 482 περιπτώσεις με πλήρη διάγνωση από όλους τους παθολογοανατόμους της μελέτης. Οι συχνότητες των διαφόρων διαγνώσεων ομοφωνίας από τους τρεις ειδικούς της γυναικείας παθολογοανατομίας ήταν Αρνητική για δυσπλασία (n=194), CIN1 (n=96), CIN2 (69), και CIN3 (n=123). REF: 9511 21 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5
Διαγνωστική ακρίβεια για την ανίχνευση του CIN2+ Η συνολική ευαισθησία για την ταυτοποίηση CIN2+ αυξήθηκε από 1787 (H&E) σε 2018 (H&E συν CINtec ) αληθώς θετικά αποτελέσματα CIN2+, με ελαφρά μόνο μείωση της συνολικής ειδικότητας από 3088 (H&E) σε 3051 (H&E συν CINtec ) αληθώς αρνητικά αποτελέσματα CIN1. Πίνακας 1 Η βελτίωση της διαγνωστικής ακρίβειας για CIN υψηλού βαθμού μέσω της συνδυαστικής ανάγνωσης των κεχρωσμένων με H&E συν CINtec - αντικειμενοφόρων έναντι των κεχρωσμένων με H&E αντικειμενοφόρων μόνο. Παρατίθενται οι αριθμοί των αληθώς θετικών και αληθώς αρνητικών αποτελεσμάτων καθώς και οι αριθμοί των ψευδώς αρνητικών και ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων σε σύγκριση με τις διαγνώσεις ομοφωνίας από τους ειδικούς παθολογοανατόμους (Σημείωση: συνολική συμφωνία με τις διαγνώσεις ομοφωνίας των ειδικών παθολογοανατόμων θα είχε ως αποτέλεσμα 2304 (192 περιπτώσεις CIN2+, x 12 παθολογοανατόμους ομάδας) αληθώς θετικά αποτελέσματα). Αληθώς θετικά Ψευδώς αρνητικά Ψευδώς θετικά Αληθώς αρνητικά Άθροισμα H&E 1787 517 392 3088 Άθροισμα H&E+CINtec 2018 286 429 3051 Η ανάλυση μικτών επιδράσεων του μοντέλου ANOVA για ψευδοτιμές Jackknife, ευρέως γνωστή ως μέθοδος Dorfman-Berbaum-Metz (DBM), χρησιμοποιήθηκε για δοκιμή των επιδράσεων της εξέτασης CINtec Histology επί της ακρίβειας. Η μηδενική υπόθεση ότι η διαγνωστική ακρίβεια βάσει των κεχρωσμένων με H&E αντικειμενοφόρων έναντι των κεχρωσμένων με H&E συν CINtec - αντικειμενοφόρων για CIN2+ είναι ίση απορρίφθηκε με p=0,0004 (AUC για H&E: 0,877, AUC για H&E συν CINtec : 0,925). Πίνακας 2 Η βελτίωση της διαγνωστικής ευαισθησίας για CIN υψηλού βαθμού μέσω της συνδυαστικής ανάγνωσης των κεχρωσμένων με H&E συν CINtec αντικειμενοφόρων έναντι των κεχρωσμένων με H&E αντικειμενοφόρων μόνο. Χρήση των διαγνώσεων ομοφωνίας που έγιναν από τρεις παθολογοανατόμους, ειδικούς στη γυναικεία παθολογοανατομία, σε αντικειμενοφόρες κεχρωσμένες με H&E ως σταθερό πρότυπο. Διαγνωστική κατηγορία Ευαισθησία H&E Κάπα H&E συν CINtec Βελτίωση CIN2+ 77% 87% 13% CIN2 μόνο 62% 75% 21% CIN3 μόνο 86% 95% 11% REF: 9511 22 / 31 2007-9511-001EL Rev 2.5