ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΔΟΜΗΣ ΝΕΩΝ ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΩΝ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΥΓΡΩΝΣΥΝΘΕΣΗ, ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΝΕΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΥΔΡΟΞΥ- ΤΥΡΟΣΟΛΗΣ ΜΕ ΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΟΞΕΑ Χ. Κονταρέλη, Β. Σταματέλου, Α. Δέτση Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ, Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 157 80 Αθήνα Ι. Παπαδάκη, Β. Ωραιοπούλου Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, ΕΜΠ Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 157 80 Αθήνα Μ. Παπανδρέου, Π. Ζουμπουλάκης, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Βασ. Κωνσταντίνου 48, 116 35 Αθήνα Μ. Λιούνη Εργαστήριο Βιομηχανικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ, Πανεπιστημιούπολη, 157 71 Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σκοπό της παρούσας εργασίας αποτελεί η σύνθεση νέων εστέρων ορισμένων φαινολικών οξέων με τυροσόλη και υδροξυ-τυροσόλη, έτσι ώστε να επιτευχθεί ο συνδυασμός δύο από τις κυριότερες κατηγορίες φαινολικών παραγώγων με αξιοσημείωτη αντιοξειδωτική δράση σε μία ένωση. Η σύνθεση των νέων ενώσεων πραγματοποιήθηκε μέσω αντιδράσεων εστεροποίησης μεταξύ επιλεγμένων φαινολικών οξέων (κινναμωμικό, σαλικυλικό και συριγγικό) και των αντίστοιχων προστατευμένων αλκοολών (4-μεθοξυφαινυλαιθανόλη και 3,4-διμεθοξυφαινυλαιθανόλη). Απομάκρυνση των προστατευτικών μεθοξυ-ομάδων οδήγησε στην παραλαβή των επιθυμητών τελικών προϊόντων. Η δομή των νέων παραγώγων χαρακτηρίστηκε πλήρως με φαματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού ( 1 Η και 13 C NMR). Η αντιοξειδωτική δράση των ενώσεων προσδιορίστηκε in vitro χρησιμοποιώντας την τεχνική της μέτρησης της ικανότητας δέσμευσης της σταθερής ελεύθερης ρίζας DPPH. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα φαινολικά οξέα είναι ενώσεις φυτικής προέλευσης, που δεν ανήκουν στην κατηγορία των φλαβονοειδών και τα οποία χαρακτηρίζονται από αυξημένη αντιοξειδωτική δράση. Τα φυσικά φαινολικά οξέα διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με τη δομή τους: τα υδροξυκινναμικά οξέα, με κύριους αντιπροσώπους το κινναμικό, το καφφεϊκό, το φερουλικό, το σιναπικό, και το p-κουμαρικό οξύ και τα υδροξυβενζοϊκά οξέα όπως το γαλλικό, το βαννιλικό, το σαλικυλικό και το συριγγικό οξύ (Εικόνα 1) [1].
Εικόνα 1: Χημικές δομές των φαινολικών παραγώγων που εξετάζονται σε αυτή την εργασία. Τα φαινολικά οξέα παρέχονται στον ανθρώπινο οργανισμό με τη διατροφή, καθώς περιέχονται σε μεγάλη ποικιλία τροφίμων και ποτών. Αποτελούν ισχυρούς αντιοξειδωτικούς παράγοντες, οι οποίοι είναι εύκολα απορροφήσιμοι από τον οργανισμό. Η ημερήσια πρόσληψη φαινολικών οξέων είναι περίπου 200mg/d, ποσότητα η οποία ποικίλει ανάλογα με τις διατροφικές συνήθειες και προτιμήσεις [2]. Τα φαινολικά οξέα συνδέονται επίσης με το χρώμα, τις οργανοληπτικές ιδιότητες και τις διατροφικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες των τροφών. Η μελέτη της σύστασης και του φυσικοχημικού προφίλ των φαινολικών οξέων, της επίδρασής τους στην ωρίμανση των φρούτων, της δράσης τους ως αναστολέων της ενζυματικής αμαύρωσης και του ρόλου τους ως συντηρητικών στα τρόφιμα αποτελούν πεδία έρευνας με ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη βιομηχανία τροφίμων [1]. Η τυροσόλη και η υδροξυ-τυροσόλη (Εικόνα 1) είναι φυσικές φαινολικές ενώσεις που βρίσκονται κυρίως στο ελαιόλαδο αλλά παρουσιάζονται και σε άλλα τρόφιμα και ποτά όπως το κρασί. Η υδροξυ-τυροσόλη περιέχεται στο άγλυκο μέρος της ολευροπεϊνης και πιστεύεται ότι απελευθερώνεται μέσω ενζυματικής ή όξινης υδρόλυσης κατά την επεξεργασία και αποθήκευση του ελαιόλαδου. Έρευνες in vitro έχουν δείξει ότι η τυροσόλη και η υδροξυτυροσόλη εμφανίζουν αντιοξειδωτική, αντικαρκινική, καρδιοπροστατευτική και αντιμικροβιακή δράση [3], [4]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η σύνθεση των νέων εστέρων της υδροξυ-τυροσόλης με φαινολικά οξέα πραγματοποιήθηκε μέσω των αντιδράσεων που φαίνονται στο Σχήμα 1.
Αρχικά, παρασκευάστηκαν οι εστέρες 3a-3e, μέσω αντίδρασης των αντίστοιχων χλωριδίων των οξέων 2a-2d και της 2-(3,4-διμεθοξυφαινυλο)αιθανόλης (1a) ή της 2-(4- μεθοξυφαινυλο)αιθανόλης (1b). Οι εστέρες 3a-3e ελήφθησαν σε καθαρή μορφή είτε μετά από χρωματογραφία στήλης είτε μετά από ανακρυστάλλωση. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε αποπροστασία των μεθοξυ-ομάδων χρησιμοποιώντας τριβρωμιούχο βόριο σε διαλύτη άνυδρο διχλωρομεθάνιο. Η αντίδραση αυτή είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό των επιθυμητών εστέρων της υδροξυ-τυροσόλης 4a-4c και της τυροσόλης 4d με διάφορα φαινολικά οξέα και το 3-φαινυλο-προπανοϊκό οξύ. Η δομή των νέων μορίων ταυτοποιήθηκε πλήρως με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού ( 1 Η και 13 C NMR). Η αντιοξειδωτική δράση των νέων ενώσεων αξιολογήθηκε με βάση την ικανότητά τους να δεσμεύουν τη σταθερή ελεύθερη ρίζα 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Για τις δοκιμές DPPH [5], κατά την μέρα της ανάλυσης παρασκευάζεται διάλυμα της ρίζας διαλύοντας 0,0025 g σε μεθανόλη καθαρότητας HPLC σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και ακολουθεί έντονη ανακίνηση ώστε να διαλυθεί πλήρως. Ακολούθως ζυγίζεται η απαιτούμενη ποσότητα της προ μελέτης ουσίας και μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml, όπου αραιώνεται ως την χαραγή. Από το διάλυμα αυτό παρασκευάζονται διάφορες αραιώσεις για την μελέτη της πλήρους αντίδρασης. Σύμφωνα με τη μέθοδο, σε κυψελίδα με πώμα μεταφέρονται με αριθμημένο σιφώνιο 3,9 ml του διαλύματος DPPH και αναμιγνύονται με 0,1 ml του διαλύματος της ουσίας, τα οποία μεταφέρονται με αυτόματη πιπέτα. Στην συνέχεια καταγράφεται η μείωση της απορρόφησης στα 515 nm, που είναι το μέγιστο μήκος κύματος απορρόφησης του DPPH, σε καθεμία κυψελίδα ανά 30 s. Οι αντιδράσεις ολοκληρώνονται, όταν οι προκύπτουσες καμπύλες μείωσης της απορρόφησης φτάνουν σε πλατώ. Εκτός από τα παραπάνω παρασκευάζεται και το τυφλό διάλυμα, που περιέχει 3,9 ml του διαλύματος DPPH και 0,1 ml διαλύτη. Αυτό το δείγμα είναι πολύ σημαντικό γιατί παρέχει πληροφορίες για τον ρυθμό αυθόρμητου αποχρωματισμού της ρίζας και χρησιμοποιείται στην επεξεργασία των αποτελεσμάτων ως διορθωτικός παράγοντας [6].
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε η σύνθεση νέων εστέρων της τυροσόλης και της υδροξυτυροσόλης με φαινολικά οξέα. Η αντιοξειδωτική δράση των νέων μορίων αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της ικανότητάς τους να δεσμεύουν τη σταθερή ελεύθερη ρίζα DPPH. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της αντιοξειδωτικής δράσης για τις ενώσεις 4a-4c. Πίνακας 1. Αντιοξειδωτική δράση των ενώσεων 4a-4c. Ένωση EC 50 EC 50 (mol ουσίας /mol DPPH ) (g ουσίας /L) n* 4a 4b 0,170388 0,003442 3,94 0,276261 0,005287 1,81 0,405746 0,00675 1,08 4c *n= στοιχειομετρικός συντελεστής του DPPH, δηλαδή το πλήθος δεσμευόμενων ριζών ανά μόριο της ουσίας Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του Πίνακα 1, τη βέλτιστη αντιοξειδωτική δράση μεταξύ των ενώσεων που εξετάστηκαν εμφανίζει ο εστέρας της υδροξυ-τυροσόλης με το κινναμικό οξύ 4a με τιμή EC 50 0.17 και το μέγιστο πλήθος δεσμευόμενων ριζών DPPH ανά μόριο. Το ανάλογο 4b, στο οποίο το κινναμικό οξύ έχει αντικατασταθεί από το κορεσμένο 3- φαινυλο-προπανοϊκό οξύ, εμφανίζει σαφώς μικρότερη αντιοξειδωτική δράση σε σχέση με το 4a, γεγονός που υποδεικνύει ότι η παρουσία του διπλού δεσμού ευνοεί την αντιοξειδωτική δράση, πιθανότατα λόγω της εκτεταμένης συζυγίας η οποία σταθεροποιεί την παραγόμενη ελεύθερη ρίζα. Ο εστέρας της υδροξυ-τυροσόλης με το σαλικυλικό οξύ 4c παρουσιάζει τη μικρότερη αντιοξειδωτική δράση από τα τρία μόρια που εξετάστηκαν σε αυτή την εργασία. Η διερεύνηση της αντιοξειδωτικής δράσης του παραγώγου της τυροσόλης 4d όπως επίσης και η σύνθεση των αντίστοιχων αναλόγων του συριγγικού οξέος είναι υπό εξέλιξη. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η σύνθεση νέων εστέρων των φυσικών αντιοξειδωτικών τυροσόλη και υδροξυτυροσόλη με φαινολικά οξέα πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια, παρέχοντας τα τελικά προϊόντα σε καθαρή μορφή και ικανοποιητικές αποδόσεις. Η αντιοξειδωτική δράση των νέων μορίων αξιολογήθηκε αρχικά με τη μέτρηση της ικανότητάς τους να δεσμεύουν τη σταθερή ελεύθερη ρίζα DPPH. Τη βέλτιστη δράση μεταξύ των μορίων που εξετάστηκαν, παρουσίασε ο εστέρας της υδροξυ-τυροσόλης με το κινναμικό οξύ 4a ενώ η σύγκριση με το ανάλογο 4b που δεν διαθέτει το διπλό δεσμό του κινναμικού οξέος υποδεικνύει ότι αυτός ο δεσμός αποτελεί δομικό χαρακτηριστικό που ευνοεί σημαντικά την αντιοξειδωτική δράση σε αυτή την κατηγορία μορίων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Robbins J.R. J. Agric. Food Chem. 51: 2866-2887 (2003) [2] Saxena M., Saxena J, Pradhan A. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 28: 130-134 (2012) [3] Tuck, K.L., Hayball, P, J. J. Nutrit.l Biochem. 13: 636 (2002)
[4] Pereira-Caro, G., Madrona, A., Bravo, L., Espartero, J.L., Alcudia, F., Cert, A., Mateos, R. Food Chemistry 115:86-91 (2009) [5] Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C. LWT-Food Sci. Techn. 28:25 (1995). [6] Ancerewicz J., Migliavacca E., Carrupt P.-A., Testa B., Brée F., Zini R., Tillement J.-P., Labidalle S., Guyot D., Chauvet-Monges A.-M., Crevat A., Le Ridant A. Free Rad. Biol. Med. 25: 113 (1998).