ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ «Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση μυκήτων του γένους Aspergillus» ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Κωνσταντίνος Γκρίντζαλης Βιολόγος, MSc ΠΑΤΡΑ, Φεβρουάριος 2012

ΠΕΡΙΛΗΨΗ H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και την παραγωγή αφλατοξίνης του μύκητα Aspergillus flavus. Ο μύκητας αυτός έχει σπουδαία αγροτική σημασία διότι μπορεί να επιμολύνει αποθηκευμένους καρπούς. Επίσης μπορεί να αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό για τον άνθρωπο που σχετίζεται με ασπεργιλλώσεις των πνευμόνων και άλλες λοιμώξεις. Πολλά στελέχη παράγουν μεγάλες ποσότητες αφλατοξίνης, μιας καρκινογόνου και εξαιρετικά τοξικής ένωσης. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε ο ρόλος κεντρικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες όπως η λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση, η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση αλλά και συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων, καθώς και η επίδραση συγκεκριμένων αντιοξειδωτών στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση ενός στελέχους αγρίου τύπου σε σύγκριση με ένα μεταλλαγμένο μη σκληρωτιογόνο και μη αφλατοξινογόνο στέλεχος (ΔveA). Για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής χρειάστηκε η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την ποσοτικοποίηση στους μύκητες της ολικής πρωτεΐνης, και εξειδικευμένων θειολικών και λιπιδικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν μια σαφή συσχέτιση του οξειδωτικού στρες με τη διαφοροποίηση των σκληρωτιογόνων μυκήτων, αφού το αγρίου τύπου στέλεχος εμφανίζεται περισσότερο στρεσαρισμένο οξειδωτικά σε σύγκριση με το αδιαφοροποίητο μεταλλαγμένο στέλεχος. Η χορήγηση αντιοξειδωτών ανέστειλε πλήρως (με εξαίρεση το ασκορβικό οξύ) τη σκληρωτιογένεση του αγρίου τύπου στελέχους επιδρώντας διαφορετικά στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες, ενώ μείωσε έως ανέστειλε πλήρως τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης, αποκαλύπτοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτές τις διαδικασίες. Τα αποτελέσματα της διατριβής εκτός από επιστημονικό ενδιαφέρον έχουν και πρακτική σημασία εξαιτίας της παθογένειας του συγκεκριμένου μύκητα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα φυτά. 2

ABSTRACT The present thesis aims to elucidate the relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation and aflatoxin production of the fungus Aspergillus flavus. This fungus has great agricultural importance because it can infect stored grains. It can also be a human pathogen, associated with aspergillosis of the lungs and other infections. Many strains produce significant quantities of aflatoxin, a carcinogenic and acutely toxic compound. In particular, the role of central parameters of oxidative stress such as lipid and protein peroxidation, thiol redox state and antioxidant enzymes, and the influence of certain related exogenous antioxidants were studied on the biosynthesis of aflatoxin, on the biogenesis of sclerotia in a wild type in comparative relationship with a non-sclerotiogenic and non-aflatoxigenic mutant strain (ΔveA). The experimental needs of this thesis necessitates the development of new methodologies for the precise quantification of certain thiol and lipid markers of oxidative stress and protein concentration. The results show a clear relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation since the wild type strain is more oxidatively stressed than the mutant non-differentiating strain. Administration of certain antioxidants completely inhibited sclerotiogenesis in the wild type strain (with the exception of ascorbic acid), and decreased or even halted the biosynthesis of aflatoxin, thus revealing an implication of oxidative stress on these processes. The results besides having scientific interest, have also practical importance since this fungi is both human and plant pathogen. 3

ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Συνετός Διονύσιος Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αγγελής Γεώργιος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Νταϊλιάνης Στέφανος Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Παναγόπουλος Νικόλαος Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Κλάπα Μαρία Κύρια Ερευνήτρια ΙΤΕ Τα μέλη της Συμβουλευτικής Επιτροπής (Δ.Δ.) Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Συνετός Διονύσιος Καθηγητής Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αγγελής Γεώργιος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Ο Επιβλέπων Καθηγητής 4

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή διεκπεραιώθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, κατά το χρονικό διάστημα 2007-2011. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντά μου, τον καθηγητή κ. Χρήστο Γεωργίου, ο οποίος μου δίδαξε το σωστό τρόπο προσέγγισης επιστημονικών ζητημάτων. Η βοήθεια και η καθοδήγησή του ήταν σημαντική σε όλη την πορεία μου στο εργαστήριο και θα ήθελα να τον ευχαριστήσω για το πλήθος των συμμετοχών μου σε διεθνή και ελληνικά συνέδρια, καθώς και σε δημοσιεύσεις σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά. Θα ήθελα επίσης, να ευχαριστήσω τον καθηγητή του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Συνετό Διονύσιο, τον καθηγητή του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Αγγελή Γεώργιο για τη συμμετοχή τους στη τριμελή συμβουλευτική επιτροπή καθώς και για τις εύστοχες υποδείξεις τους κατά τη συγγραφή της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κα. Στεφάνου Γεωργία και τους λέκτορες του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών Νταϊλιάνη Στέφανο και Παναγόπουλο Νίκο τόσο για τη συμμετοχή τους στην επταμελή εξεταστική επιτροπή, αλλά και γιατί μου έδωσαν την ευκαιρία να συνεργαστώ μαζί τους σε επιστημονικά πεδία εκτός της θεματολογίας της διατριβής μου. Ένα σημαντικό κομμάτι αυτής της διατριβής πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το εργαστήριο μεταβολομικής της κύριας ερευνήτριας Μαρίας Κλάπα στο Ερευνητικό Ινστιτούτο Χημικής Μηχανικής και Χημικών Διεργασιών Υψηλής Θερμοκρασίας του Ιδρύματος και Τεχνολογίας και Έρευνας. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου για την πειραματική δουλειά, τη συμμετοχή και το άριστο κλίμα συνεργασίας τόσο στην ίδια όσο και στον υποψήφιο διδάκτορα και προσωπικό φίλο Σπύρο Βερναρδή. Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω τους συνεργάτες μας από το εξωτερικό που μας διέθεσαν τα στελέχη των μυκήτων και είχαν κάνει εξαιρετική δουλειά για το μοριακό και γενετικό προσδιορισμό τους, και ειδικότερα την Ana Calvo, καθηγήτρια Μικροβιολογίας στο τμήμα Βιολογικών Επιστημών του Πανεπιστημίου του Βόρειου Ιλλινόις των ΗΠΑ. Θα ήταν μεγάλη παράλειψη να μην ευχαριστήσω τον πολύ καλό φίλο και συνεργάτη Γιάννη Παπαποστόλου για την ευχάριστη διάθεση και την πολύ καλή συνεργασία που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια στο εργαστήριο. Κατά το διάστημα 2010-2011 υπήρξα υπότροφος του Ιδρύματος Μποδοσάκη και θα ήθελα ολόψυχα να ευχαριστήσω τον Πρόεδρο και τα μέλη του Δ.Σ. του Ιδρύματος για την εμπιστοσύνη τους στο πρόσωπό μου. Κλείνοντας, θα ήθελα ολόψυχα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στη μητέρα μου για την πολύπλευρη υποστήριξή της καθ όλη την πορεία των σπουδών μου, αλλά και στον αδερφικό μου φίλο Βαγγέλη Λάμπα για τη συμπαράστασή του. 5

Όλα για την Μητέρα μου 6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. Εισαγωγή 12 1. Βιοχημεία του οξειδωτικού στρες 12 1.1. Η εξέλιξη της αερόβιας διαβίωσης 12 1.2. Ελεύθερες ρίζες και χημεία των δραστικών μορφών οξυγόνου 12 1.3. Οι συνέπειες του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα 15 1.4. Η αντιοξειδωτική άμυνα των οργανισμών 17 1.5. Βιοχημεία της ρίζας του σουπεροξειδίου (O - 2 ) 17 1.5.1. Η κύρια οδός βιομετατροπής του O 2-1.5.2. Η εναλλακτική οδός βιομετατροπής του O 2-19 20 1.6. Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ) 21 1.6.1. Μη πρωτεϊνικες θειόλες 22 1.6.1.1. Γλουταθειόνη και δισουλφίδιο της γλουταθειόνης 22 1.6.1.2 Κυστεΐνη (CSH) και κυστίνη (CSSC) 23 1.6.2 Ένζυμα που συμμετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ των κυττάρων 24 1.6.3. Τεχνητή αύξηση ή μείωση των επιπέδων των θειολών του κυττάρου 24 1.6.4 Πρωτεϊνικές θειόλες (PSH), πρωτεϊνικά δισουλφίδια (PSSP) και μεικτά πρωτεϊνικά δισουλφίδια (PSSΝΡ) 25 1.6.5 Παραγωγή θειυλικών ριζών 26 2. Βιολογία του γένους Aspergillus 26 2.1 Χαρακτηριστικά και ταξινόμηση των μυκήτων 26 2.2. Το φαινόμενο της διαφοροποίησης στους μύκητες 30 3. Οξειδωτικό στρες και διαφοροποίηση μυκήτων 31 3.1. Συσχέτιση οξειδωτικού στρες και διαφοροποίησης μικροοργανισμών 31 3.2. Συσχέτιση οξειδωτικού στρες και διαφοροποίησης μυκήτων του γένους Aspergillus 34 3.3. Αφλατοξίνη και οξειδωτικό στρες 38 ΣΚΟΠΟΣ 39 Β. Υλικά και Μέθοδοι 40 1. Υλικά 40 7

1.1. Χημικά αντιδραστήρια 40 1.2. Στελέχη μυκήτων, θρεπτικά υλικά και μέθοδοι καλλιέργειας 40 1.2.1. Πειραματικά στελέχη μυκήτων 40 1.2.2. Θρεπτικά υλικά και μέθοδοι καλλιέργειας 40 1.2.3. Συνθήκες καλλιέργειας 41 1.2.3.1. Χορήγηση χημικών αντιδραστηρίων κατά την ανάπτυξη των σκληρωτιογόνων μυκηλιακών μυκήτων 41 2. Εφαρμογή μεθόδων 42 2.1. Δειγματοληψία και ομογενοποίηση μυκητιακών ιστών 42 2.2. Ανάπτυξη μεθόδου ποσοτικοποίησης πρωτεϊνών - μια νέα υπερευαίσθητη μέθοδος Bradford 2.3. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών (PrMDA) και μη πρωτεϊνικών (FrMDA) αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων 2.3.1. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των μη πρωτεϊνικών (FrMDA) αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων 2.3.2. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών (PrMDA) αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων 2.4. Φωτομετρικός προσδιορισμός των λιπιδικών (lipid hydroperoxides, LOOH) και των πρωτεϊνικών υδροϋπεροξειδίων (protein hydroperoxides, PrOOH) με τη μέθοδο FOX 43 44 46 46 47 2.4.1. Φωτομετρικός προσδιορισμός των λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων (LOOH) 49 2.4.2. Φωτομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών υδροϋπεροξειδίων (PrOOH) 50 2.5. Προσδιορισμός της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης (ΘΟΚ) 50 2.5.1. Φθορισμομετρικός προσδιορισμός της ελεύθερης αναγμένης γλουταθειόνης (GSH) και του συμμετρικού δισουλφιδίου της (GSSG) 2.5.2. Ποσοτικοποίηση της ελεύθερης αναγμένης (CSH) και οξειδωμένης (CSHox) κυστεΐνης 51 53 2.5.3. Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνικών θειολών 55 2.6. Ποσοτικοποίηση πολυφαινολών 56 2.7. Ποσοτικοποίηση ενεργότητας ενζύμων 58 2.7.1. Ποσοτικοποίηση της ενεργότητας της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου 58 2.7.2. Προσδιορισμός της ενεργότητας της καταλάσης (CAT) 60 2.7.3. Φωτομετρικός προσδιορισμός της ενεργότητας του ενζύμου αναγωγάση του GSSG (GR) 2.7.4. Φωτομετρικός προσδιορισμός της ενεργότητας της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) 61 62 8

2.7.5. Φωτομετρικός προσδιορισμός της ενεργότητας τηςαναγωγάσης της 6- φωσφορικής γλυκόζης (G6PDH) 2.7.6. Φωτομετρικός προσδιορισμός της ενεργότητας όξινης και της αλκαλικής φωσφατάσης 64 65 2.8. Ποσοτικοποίηση βιοσύνθεσης αφλατοξίνης 66 2.9. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων 67 Γ. Αποτελέσματα 68 1. Βασικά προφίλ δεικτών του οξειδωτικού στρες στους μύκητες A. flavus 68 1.1. Στάδια διαφοροποίησης των μυκήτων που εξετάζονται 69 1.2. Δείκτες πρωτεϊνικής και λιπιδικής υπεροξείδωσης και αντιοξειδωτικά ένζυμα 69 1.3. Θειολικοί δείκτες και ένζυμα εμπλεκόμενα στη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ) 72 1.4. Επίπεδα πολυφαινολών 76 1.5. Ενεργότητα όξινης (ACP) και αλκαλικής (ALP) φωσφατάσης 77 1.6. Ποσοτικοποίηση βιοσύνθεσης αφλατοξίνης 78 2. Διερεύνηση του ρόλου του οξειδωτικού στρες και εμπλεκομένων ενζύμων στο αγρίου τύπου στέλεχος με τη χρήση εξωγενώς χορηγούμενων χημικών ενώσεων 79 2.1. Επίδραση των χορηγούμενων ουσιών στη διαφοροποίηση των μυκήτων 79 2.2. Δείκτες πρωτεϊνικής και λιπιδικής υπεροξείδωσης και αντιοξειδωτικά ένζυμα 80 2.3. Θειολικοί δείκτες και ένζυμα εμπλεκόμενα στη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ) 83 2.4. Επίπεδα πολυφαινολών 88 2.5. Ενεργότητα όξινης (ACP) και αλκαλικής (ALP) φωσφατάσης 89 2.6. Ποσοτικοποίηση βιοσύνθεσης αφλατοξίνης 90 Δ. Συζήτηση 91 1. Οξειδωτική κατάσταση κατά την ανάπτυξη του ΑΤ και ΔveA στελέχους 91 1.1. Συσχέτιση των λιπιδικών δεικτών και των αντιοξειδωτικών ενζύμων με το αδιαφοροπιοίητο και το διαφοροποιημένο στάδιο 1.2. Συσχέτιση της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης με το αδιαφοροπιοίητο και το διαφοροποιημένο στάδιο 1.3. Συσχέτιση των φωσφατασών, πολυφαινολών και αφλατοξίνης με το αδιαφοροπιοίητο και το διαφοροποιημένο στάδιο 91 92 93 1.3.1. Οι φωσφατάσες 93 1.3.2. Οι πολυφαινόλες 94 1.3.3. Βιοσύνθεση αφλατοξίνης 94 9

2. Οξειδωτική κατάσταση με την επίδραση χημικών τροποιητών του οξειδωτικού στρες 96 2.1. Χορήγηση θειολικών τροποποιητών 96 2.2. Χορήγηση TIRON και αμινοτριαζόλης 98 2.3. Χορήγηση άλλων εξειδικευμένων και μη αντιοξειδωτών 100 3. Τελικά συμπεράσματα 101 Ε. Βιβλιογραφία 103 10

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΔΜΑ: Δραστικές μορφές αζώτου ΔΜΟ: Δραστικές μορφές οξυγόνου ΘΟΚ: Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση ACP: όξινη φωσφατάση ALP: αλκαλική φωσφατάση ΒΗΑ:butyl hydroxylanisole CAT: καταλάση (Catalase) CSH: αναγμένη κυστεΐνη CSHox: οξειδωμένη κυστεΐνη CSSC: κυστίνη (cystine) DTT: διθειοθρεϊτόλη (dithyothreitol) FrMDA: μη πρωτεϊνική (ελεύθερη) MDA GSH: αναγμένη γλουταθειόνη GSSG: οξειδωμένη γλουταθειόνη GPx: υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (glutathione peroxidase) GR: αναγωγάση του δισουλφιδίου της γλουταθειόνης (GSSG Reductase) LOOH: λιπιδικά (οργανικά) υδροϋπεροξείδια MDA: μηλονική διαλδεΰδη (malonyldialdehyde) NAC: N-ακετυλ-κυστεΐνη (N-acetyl-cysteine) PrMDA: πρωτεϊνικά δεσμευμένη MDA PrOOH: πρωτεϊνικά υδροϋπεροξείδια PSH: αναγμένες πρωτεϊνικές θειόλες PSSΝΡ: μεικτά δισουλφίδια PSSP: πρωτεϊνικά δισουλφίδια RNS: Reactive nitrogen species ROS: Reactive oxygen species SOD: δισμουτάση της ρίζας σουπεροξειδίου (SuperOxide Dismutase) ΤΒΑ: θειοβαρβιτουρικό οξύ (thiobarbiruric acid) TBARS: ουσίες αντιδρούσες με θειοβαρβιτουρικό οξύ (thiobarbiruric acid reactive substances) TRS: Thiol Redox State O - 2 : ελεύθερη ρίζα (ή ανιόν) σουπεροξειδίου (superoxide radical) H 2 O 2 : υπεροξείδιο του υδρογόνου (hydrogen peroxide) OH : ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου (hydroxyl radical) ΝΟ : μονοξείδιο του αζώτου ΟΝΟΟ - :υπεροξυνιτρίτης 11

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Βιοχημεία του οξειδωτικού στρες 1.1. Η εξέλιξη της αερόβιας διαβίωσης Το μοριακό οξυγόνο εισήχθη στην αρχέγονη ανοξική ατμόσφαιρα σαν παραπροϊόν της φωτοσυνθετικής δράσης των κυανοβακτηρίων και η αναγωγή του ήταν αυτή που έδωσε στους οργανισμούς το πλεονέκτημα του εποικισμού της ξηράς, εφοδιάζοντάς τους με ένα φίλτρο προστασίας από την επικίνδυνη υπεριώδη ακτινοβολία, τη στοιβάδα του όζοντος (Ο 3, τριατομικό οξυγόνο). Γενικά, οι οργανισμοί που εισήγαγαν το οξυγόνο στο μεταβολισμό τους επωφελήθηκαν ενεργειακά σημαντικά. Παρόλα αυτά, η αναγωγή του οξυγόνου με τα διάφορα μοριακά συστήματα των κυττάρων δεν είναι τέλεια και σε αυτό το σημείο έρχεται η βιοχημεία του οξειδωτικού στρες (oxidative stress), η οποία εμπλουτίζει την κλασική βιοχημεία εστιάζοντας στη μελέτη της βλαπτικής πλευράς του αερόβιου μεταβολισμού (Halliwell & Gutteridge, 1999; Latifi et al., 2009). 1.2. Ελεύθερες ρίζες και χημεία των δραστικών μορφών οξυγόνου Σήμερα πιστεύεται ότι όλες σχεδόν οι επιβλαβείς επιδράσεις του οξυγόνου οφείλονται στο σχηματισμό ελεύθερων ριζών (free radicals) και άλλων δραστικών μορφών οξυγόνου. Με τον όρο ελεύθερη ρίζα ορίζεται κάθε άτομο ή μόριο που φέρει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια (ασύζευκτο ή μονήρες καλείται το ηλεκτρόνιο που καταλαμβάνει μόνο του ένα ατομικό ή μοριακό τροχιακό). Στον ορισμό αυτό συγκαταλέγονται πολλά χημικά μόρια, με απλούστερο το ατομικό υδρογόνο που ως γνωστόν διαθέτει ένα μόνο ηλεκτρόνιο. Η ύπαρξη ενός τουλάχιστον ασύζευκτου ηλεκτρονίου συμβολίζεται συνήθως με μια τελεία ως εκθέτη στη δεξιά πλευρά του χημικού τύπου της ελεύθερης ρίζας, συμβολισμό τον οποίο θα ακολουθήσουμε στη συνέχεια. Ο σχηματισμός μιας ελεύθερης ρίζας γίνεται από μια μη-ρίζα η οποία (α) χάνει ένα ηλεκτρόνιο, (β) δέχεται ένα ηλεκτρόνιο ή (γ) υφίσταται ομολυτική διάσπαση (homolytic fission) ενός ομοιοπολικού δεσμού (στην ομολυτική διάσπαση τα 2 ηλεκτρόνια του ομοιοπολικού δεσμού δε μένουν με το περισσότερο ηλεκτραρνητικό άτομο αλλά μοιράζονται μεταξύ των δύο αποχωρισμένων ατόμων): α) Χ e - + X + β) Y + e - Y - γ) Χ : Y X + Y Αντιστροφή της περίπτωσης της ομόλυσης έχουμε όταν δύο ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν μεταξύ τους και συνδεθούν με ομοιοπολικό δεσμό, οπότε προκύπτει μια μη-ρίζα (X + Y X Y), γεγονός που είναι πολύ σπάνιο, αφού η συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών διατηρείται σε πολύ χαμηλά επίπεδα ακόμη και σε καταστάσεις έντονου οξειδωτικού στρες (oxidative stress). Από την άλλη πλευρά, μια ελεύθερη ρίζα μπορεί να αντιδράσει με μια μη-ρίζα (κάτι που συνηθίζεται, αφού τα περισσότερα βιολογικά μόρια δεν είναι ελεύθερες ρίζες) με τους εξής τρόπους: 12

α) προσθετικά, όταν η ελεύθερη ρίζα συνδέεται με τη μη-ρίζα (π.χ. προσθήκη του ΟΗ στη γουανίνη του DNA): Χ + Υ [Χ-Υ] β) αναγωγικά, όταν η ελεύθερη ρίζα δρα ως αναγωγικός παράγοντας, παραχωρώντας το ασύζευκτό της ηλεκτρόνιο στη μη-ρίζα: Χ + Υ Χ + + Υ - γ) οξειδωτικά, όταν η ελεύθερη ρίζα δρα ως οξειδωτικός παράγοντας, δεχόμενη ένα ηλεκτρόνιο από τη μη-ρίζα: X + Y X - + Y + δ) αφαιρετικά, όταν η ελεύθερη ρίζα αποσπά ένα άτομο υδρογόνου από τον ανθρακικό σκελετό μιας οργανικής ένωσης: Χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιας αντίδρασης είναι η προσβολή των αλυσίδων λιπαρών οξέων από την ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου, με την οποία αρχίζουν οι αλυσιδωτές αντιδράσεις της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Το κοινό χαρακτηριστικό αυτών των αντιδράσεων είναι ότι σχηματίζεται πάντα μια νέα ελεύθερη ρίζα, η οποία αν είναι επίσης δραστική μπορεί να αντιδράσει εκ νέου με ένα άλλο μόριο κ.ο.κ. Η ύπαρξη ενός ή περισσοτέρων ασύζευκτων ηλεκτρονίων σε ένα χημικό μόριο δεν είναι ούτε ικανή ούτε αναγκαία συνθήκη για την εμφάνιση υψηλής χημικής δραστικότητας. Η τάση ενός μορίου να αντιδρά είναι συνάρτηση ενός μεγάλου αριθμού παραγόντων, όπως (α) η συνολική ηλεκτρονιακή του κατανομή, που καθορίζει τη σταθερότητα των ενδομοριακών δεσμών, (β) ο αριθμός και η θέση των ασύζευκτων ηλεκτρονίων σε περίπτωση που πρόκειται για ελεύθερη ρίζα, (γ) το ph και (δ) η χημική φύση του περιβάλλοντος μέσου (υδρόφιλο ή υδρόφοβο) κ.α. Σύμφωνα με την ηλεκτρονιακή του κατανομή, το μοριακό οξυγόνο (Ο 2 ) στη βασική (μη διεγερμένη) κατάσταση (ground-state O 2 ) είναι διπλή ελεύθερη ρίζα, αφού διαθέτει δύο ηλεκτρόνια που λόγω των παράλληλων στροφορμών τους (spin) δε μπορούν να ζευγαρώσουν και ως εκ τούτου καταλαμβάνουν το καθένα ένα διαφορετικό μοριακό τροχιακό. Η κατανομή αυτή προσδίδει στην όλη δομή υψηλού βαθμού χημική σταθερότητα, αφού προκειμένου το Ο 2 να αντιδράσει απευθείας με κάποια ένωση, θα πρέπει η ένωση αυτή να διαθέτει επίσης δύο μονά ηλεκτρόνια με spin παράλληλα μεταξύ τους και αντίθετα ως προς τα spin των ασύζευκτων ηλεκτρονίων του Ο 2. Τέτοια ένωση ευτυχώς δεν υπάρχει στη φύση και αυτός ο περιορισμός (spin restriction) εξηγεί την αδυναμία του οξυγόνου να προσβάλλει απευθείας τα διάφορα βιολογικά μόρια και γενικότερα ενώσεις που δεν είναι ελεύθερες ρίζες, αλλά μπορεί να αρθεί με το σχηματισμό δραστικότερων παραγώγων Ο 2 με τους δύο ακόλουθους τρόπους: α) με πρόσληψη ενέργειας του Ο 2 βασικής κατάστασης, το οποίο έτσι μεταπίπτει στη διεγερμένη κατάσταση του μονήρους οξυγόνου (singlet oxygen). H απορροφούμενη ενέργεια αρχικά αντιστρέφει το spin του ενός ασύζευκτου ηλεκτρονίου (ενδιάμεση μορφή μονήρους οξυγόνου, 1 Σg + O 2 ). στη συνέχεια, τα δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια που έχουν αντίθετα spin (triplet oxygen, οξυγόνο τριπλής 13

κατάστασης) ζευγαρώνουν σε κοινό τροχιακό και δίνουν την τελική μορφή μονήρους οξυγόνου ( 1 ΔgO 2, singlet Oxygen, μονήρες οξυγόνο) που είναι ιδιαίτερα δραστικός οξειδωτικός παράγοντας. Η μετάπτωση του μοριακού οξυγόνου από τη βασική στη μονήρη κατάσταση είναι κατά κανόνα συζευγμένη με την αποδιέγερση κάποιου κατάλληλου μορίου, το οποίο είχε προηγουμένως διεγερθεί με την απορρόφηση φωτεινής ακτινοβολίας ορισμένου μήκους κύματος (φωτοενεργοποίηση). β) με προοδευτική αναγωγή του μοριακού οξυγόνου μετά από πρόσληψη ενός ηλεκτρονίου τη φορά. Η σταδιακή αυτή μονοσθενής αναγωγή (Σχήμα 1) μπορεί να συνεχισθεί μέχρι την προσθήκη τεσσάρων συνολικά ηλεκτρονίων, που καταλήγει στη μετατροπή ενός μορίου O 2 σε δύο μόρια Η 2 Ο με τη μεσολάβηση πολύ δραστικών και μερικώς αναγμένων μορφών Ο 2. Οι μορφές αυτές είναι με τη σειρά το ανιόν (ελεύθερη ρίζα) σουπεροξειδίου O - 2 (superoxide radical), το υπεροξείδιο του υδρογόνου H 2 O 2 (hydrogen peroxide) και η ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου OH (hydroxyl radical). Σχήμα 1. Ηλεκτρονιακή κατανομή του ground state Ο 2 και των παραγώγων του (Halliwell & Gutteridge, 1999). Δραστικές μορφές οξυγόνου (ΔΜΟ, reactive oxygen species ή ROS), στις οποίες - συμπεριλαμβάνονται τα O 2 και OH, σχηματίζονται αναπόφευκτα στον αερόβιο μεταβολισμό και είναι η κύρια αιτία εκδήλωσης του φαινομένου της οξειδωτικής πίεσης στα κύτταρα. Οι ΔΜΟ περιλαμβάνουν τα πρωτογενή δραστικά παράγωγα του οξυγόνου αλλά και όλα εκείνα (ρίζες ή μη), τα οποία προκύπτουν δευτερογενώς κατά τις διάφορες χημικές αλληλεπιδράσεις με τα στοιχεία του κυτταρικού περιβάλλοντος (π.χ. ελεύθερες υπεροξυλ-ρίζες R-C-O-O και αλκοξυλ-ρίζες R-C-O, ενδιάμεσα προϊόντα της υπεροξείδωσης λιπιδίων). Εκτός από τις ΔΜΟ πολύ σημαντικές στο οξειδωτικό στρες είναι και οι δραστικές μορφές (ρίζες ή μη) άλλων χημικών στοιχείων και μορίων, που διακρίνονται ανάλογα με την προέλευσή τους α) σε εκείνες που ενυπάρχουν στο κυτταρικό περιβάλλον και β) σε εκείνες που σχηματίζονται από τη δράση των ΔΜΟ επί των διαφόρων κυτταρικών συστατικών. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα ιόντα Fe, Cu και άλλων μετάλλων μετάπτωσης (που καταλύουν αντιδράσεις του οξειδωτικού stress και προάγουν οξειδωτικές βλάβες στο κύτταρο), τα ιόντα Cl και το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ ) (που παράγεται από την L-αργινίνη με τη δράση του ενζύμου συνθετάση του ΝΟ και έχει οξειδωτική και αντιοξειδωτική δράση). Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι ελεύθερες ρίζες θείου (ή θειυλικές ρίζες, RS, που είναι προϊόντα της οξειδωτικής βλάβης ή αντιοξειδωτικής δράσης διαφόρων θειολών), ελεύθερες ρίζες 14

άνθρακα R-C (ενδιάμεσα προϊόντα της υπεροξείδωσης λιπιδίων), ο υπεροξυνιτρίτης (ΟΝΟΟ -, προϊόν της αντίδρασης O 2 - και ΝΟ ), το υποχλωριώδες οξύ (HOCl, προϊόν της αντίδρασης H 2 O 2 και Cl - ) κ.α. 1.3. Οι συνέπειες του οξειδωτικού στρες στα κύτταρα Το οξειδωτικό στρες, δηλαδή η αύξηση των ΔΜΟ και των ελευθέρων ριζών σε βάρος των αντιοξειδωτών, είναι υπεύθυνο για την πρόκληση πληθώρας βλαβών στα κύτταρα (Σχήμα 2), προκαλώντας αλλαγές στα βιο(μακρο)μόρια του κυττάρου. Η ρίζα ΟΗ είναι η πιο δραστική ελεύθερη ρίζα οξυγόνου και αποτελεί έναν εξαιρετικά ισχυρό οξειδωτικό παράγοντα που αντιδρά σχεδόν ακαριαία με οποιοδήποτε τύπο βιομορίου τυγχάνει να βρίσκεται πλησίον της θέσης σχηματισμού της. Ένα από τα σημαντικά συστατικά του κυττάρου είναι τα νουκλεϊνικά οξέα (DNA και RNA), που μπορεί να υποστούν οξειδωτικές αλλαγές στις βάσεις (π.χ. προσθήκη του ΟΗ, απαμινώσεις, απομάκρυνση του Η) και στη ριβόζη τους ή ακόμα και δημιουργία σπασιμάτων (fragmentation) και εγκοπών (nicks), ή διασυνδέσεις (cross links) DNA-πρωτεΐνης. Εκτός από τα νουκλεϊκά οξέα, συνήθεις είναι και οι οξειδωτικές βλάβες στις πρωτεΐνες, όπως η δημιουργία υπεροξειδίων στην πεπτιδική αλυσίδα ή στις πλευρικές ομάδες των αμινοξέων, η οξείδωση ομάδων του S, τα πρωτεϊνικά καρβονύλια και οι απαμινώσεις, οι οποίες επιφέρουν αλλαγές στη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Τέλος, τα λιπιδικά συστατικά των κυττάρων είναι από τους πλέον σημαντικούς στόχους των ΔΜΟ. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων και κυρίως των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) περιλαμβάνει δύο στάδια: 1. Το στάδιο έναρξης (initiation) το οποίο αρχίζει όταν κάποιο μόριο ΔΜΟ υψηλής δραστικότητας (π.χ. ΟΗ ) αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από μια ομάδα μεθυλενίου (CH 2 ) (Parsons, 2000), με περισσότερο ευάλωτες τις θέσεις της ανθρακικής αλυσίδας που γειτονεύουν με διπλό δεσμό (δεδομένου ότι αυτός εξασθενεί το δεσμό C H των μεθυλενικών ομάδων): CH=CH CH 2 CH=CH + ΟΗ CH=CH C H CH=CH + Η 2 Ο Η παραπάνω διαδφικασία οδηγεί στη δημιουργία μιας ασταθούς ελεύθερης ρίζας άνθρακα (carbon-centered radical) με ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, το οποίο συνήθως υφίσταται μια ενδομοριακή αναδιάταξη και μεταπίπτει σε συζυγές διένιο (αλληλουχία διπλού - μονού - διπλού δεσμού, καταλήγοντας σε δύο ισομερή συζυγή διένια): CH=CH C H CH=CH C H CH=CH CH=CH ή CH=CH CH=CH C H 2. Το στάδιο διάδοσης (propagation stage) στο οποίο η ρίζα άνθρακα που σχηματίζεται (R ) συνδέεται με ένα μόριο Ο 2 (που αντιδρά εύκολα με ελεύθερες ρίζες και συσσωρεύεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο εσωτερικό των μεμβρανών, λόγω της υδροφοβικότητάς του) και δημιουργείται μία υπεροξυλ-ρίζα: L + Ο 2 L O O (υπεροξυλ-ρίζα) 15

Η ελεύθερη υπεροξυλ-ρίζα είναι πολύ δραστική και μπορεί να αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από κάποιο γειτονικό μόριο PUFA, μετατρεπόμενη στο αντίστοιχο υδροϋπεροξείδιο (L O O H): L O O + CH 2 L O O H + C H Πρόκειται για μια αντίδραση που οδηγεί στο σχηματισμό μιας νέας ελεύθερης ρίζας άνθρακα, η οποία μπορεί να αντιδράσει με Ο 2 και να δώσει εκ νέου ρίζα περοξυλίου, που με τη σειρά της μπορεί να αποσπάσει ένα υδρογόνο από άλλο μόριο PUFA κ.ο.κ., συνεχίζοντας έτσι την αλυσίδα αντιδράσεων που ξεκίνησε από την προσβολή ενός αρχικού μορίου PUFA από ΟΗ. Αυτή η συνεχώς ανατροφοδοτούμενη αλυσιδωτή αντίδραση μπορεί να διακοπεί με τους εξής τρόπους: α) με επίθεση της ρίζας υπεροξυλίου σε γειτονικό διπλό δεσμό της ίδιας ανθρακικής αλυσίδας, οπότε σχηματίζεται κυκλικό ενδοϋπεροξείδιο. Αυτό το κυκλικό ενδοϋπεροξείδιο είναι ελεύθερη ρίζα και μπορεί να αποσπάσει υδρογόνο από άλλο PUFA, συνεχίζοντας την αλυσίδα αντιδράσεων, αλλά συνήθως μετατρέπεται σε διάφορα τελικά προϊόντα όπως μηλονική διαλδεΰδη (malonyldialdehyde, MDA), ισοπροστάνες κ.α., β) με οξειδωτική επίθεση των ριζών C H ή L O O σε άλλα μεμβρανικά συστατικά (στερόλες και πρωτεΐνες), γ) με αλληλεξουδετέρωση δύο ριζών C H ή δύο ριζών L O O. Στην πρώτη περίπτωση σχηματίζεται πλευρική διασύνδεση δύο αλυσίδων λιπαρών οξέων, ενώ στη δεύτερη απελευθερώνεται μονήρες οξυγόνο: και δ) με αναγωγή της ρίζας L O O από κατάλληλο αντιοξειδωτή (chain-breaking antioxidant), όπως π.χ. η βιταμίνη Ε, το βούτυλο-υδροξυλικό-τολουένιο (butyl hydroxyltoluene, ΒΗΤ), η βούτυλουδροξυλική-ανισόλη (butyl hydroxylanisole, ΒΗΑ) κ.α. Η τελική κατάληξη των μη επιδιορθωμένων υδροϋπεροξειδίων είναι να κατακερματιστούν σε αλδεϋδικά προϊόντα και συγκεκριμένα στις μη επιδιορθώσιμες μηλονική διαλδεΰδη και 4-υδροξυ-νονενάλη. Σχήμα 2. Οι κύριες μορφές οξειδωτικής επίθεσης που δέχεται ένα κύτταρο. 16

1.4. Η αντιοξειδωτική άμυνα των οργανισμών Οι αερόβιοι οργανισμοί έχουν αναπτύξει αρκετούς αμυντικούς μηχανισμούς ώστε να μπορούν να επιβιώσουν σε έντονα οξειδωτικές συνθήκες. Είναι σημαντικό ότι κατορθώνουν να διατηρούν την ενδοκυτταρική συγκέντρωση του Ο 2 σε επίπεδα χαμηλότερα από της ατμόσφαιρας (21%) καθώς και την ικανότητα αποτελεσματικής λειτουργίας της αναπνευστικής αλυσίδας σε αυτά τα χαμηλά επίπεδα Ο 2. Το οξειδωτικό φορτίο (ΔΜΟ και προϊόντα δράσης τους) που δημιουργείται σε αυτές τις συνθήκες αντιμετωπίζεται από την αντιοξειδωτική άμυνα των οργανισμών που εκδηλώνεται σε τρία βασικά επίπεδα (γραμμές) άμυνας (Halliwell & Gutteridge, 1999): α) στον περιορισμό της διαθεσιμότητας των μετάλλων μετάπτωσης και άλλων ουσιών με προοξειδωτική δράση (προάγουν την οξειδωτική καταστροφή των βιομορίων από ΔΜΟ ή άλλα προϊόντα του οξειδωτικού στρες). Εδώ συμμετέχουν πρωτεΐνες που δεσμεύουν μέταλλα μετάπτωσης (μεταλλοπρωτεΐνες) και συνεπώς μειώνουν τη διαθεσιμότητά τους (τρανσφερρίνη, φερριτίνη και σερουλοπλασμίνη κ.λπ.). β) στην εκκαθάριση των ΔΜΟ και άλλων δραστικών μορίων πριν πλήξουν τα βιομόρια, που επιτυγχάνεται με ένζυμα με αντιοξειδωτική δράση όπως οι δισμουτάσες (εξωκυττάρια, κυταροπλασματική, μιτοχονδριακή) της ρίζας σουπεροξειδίου (SuperOxide Dismutases, SOD), η καταλάση (Catalase, CAT), οι υπεροξειδάσες (με ή χωρίς σελήνιο) της γλουταθειόνης (Glutathione Peroxidases, GPx), και οι γενικές υπεροξειδάσες (Peroxidases), και με οργανικές ενώσεις μικρού συνήθως μοριακού βάρους που δρουν ως αντιοξειδωτικοί εκκαθαριστές ελεύθερων ριζών (free radical scavengers) και δραστικών μορίων, όπως οι γλουταθειόνη, χολερυθρίνη, λιποϊκό οξύ, ουρικό οξύ, ουμπικινόνη, μελανίνες, ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), τοκοφερόλες και τοκοτριενόλες, καροτενοειδή, ΒΗΤ και ΒΗΑ. γ) στην επιδιόρθωση των πληγέντων μορίων και αποκατάσταση των βλαβών που αφορά μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA (DNA γλυκοζυλάσες), αναγωγής οξειδωμένων σουλφυδρυλομάδων των πρωτεϊνών και την επιδιόρθωση των λιπιδικών υπεροξειδίων. Χωρίς αυτούς τους μηχανισμούς οι οργανισμοί θα συσσώρευαν οξειδωτικές βλάβες σε βαθμό τέτοιο που δε θα επέτρεπε την επιβίωσή τους (Liu et al., 2000; Nordberg & Arner, 2001). 1.5. Βιοχημεία της ρίζας του σουπεροξειδίου (O - 2 ) Γενικός εκκινητής του οξειδωτικού στρες είναι η ρίζα του σουπεροξειδίου, και σχηματίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια (αλλά και ενζυμικά π.χ. από την οξειδάση της ξανθίνης). Το 85-90% του Ο 2 που προσλαμβάνεται από τα κύτταρα καταναλώνεται στο μιτοχόνδριο ως δέκτης των ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας (Lehninger, 1975). Η μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, η καρδιά του αερόβιου μεταβολισμού, αποτελεί μια αποτελεσματική βιοχημική λειτουργική μονάδα, εξελικτικά τελειοποιημένη, ώστε το 97-99% του Ο 2 που υπό φυσιολογικές συνθήκες διαχειρίζεται το μιτοχόνδριο να υφίσταται πλήρη αναγωγή στην εντελώς ακίνδυνη μορφή του Η 2 Ο. Το εντυπωσιακό 17

αυτό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται χάρη στη συνολική δομή και οργάνωση των τεσσάρων ενζυμικών συμπλόκων της αλυσίδας, που διασφαλίζει τη διοχέτευση των εισερχόμενων ηλεκτρονίων προς την κυτοχρωμική οξειδάση αλλά και εξαιτίας του σχεδόν αλάνθαστου μηχανισμού δράσης της, η οποία καταλύει τη σταδιακή αναγωγή του Ο 2 σχεδόν χωρίς καμία διαφυγή μερικώς αναγμένων ΔΜΟ από το ενεργό της κέντρο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Όμως ακόμη και υπό τις πλέον ιδανικές συνθήκες (φυσιολογική συγκέντρωση οξυγόνου και άψογη λειτουργική κατάσταση αναπνευστικής αλυσίδας), το 1-3% του Ο 2 (αυξάνεται σε υψηλό επίπεδο όταν δυσλειτουργεί η αλυσίδα ή ανέλθει το επίπεδο Ο 2 πάνω από το φυσιολογικό) ανάγεται μερικώς προς O - 2. Η αναγωγή αυτή δεν είναι ενζυμική αλλά οφείλεται σε διαρροή ηλεκτρονίων προς μόρια Ο 2 από αρχικά τμήματα της αναπνευστικής αλυσίδας. Κύρια σημεία διαρροής φαίνεται να είναι το σύμπλοκο Ι, η ημιανηγμένη μορφή (ημικινόνη) του συνενζύμου Q και το κυτόχρωμα b του συμπλόκου ΙΙΙ. Σε O - 2 μετατρέπεται και ένα μέρος από το υπόλοιπο 10-15% του O 2 που καταναλώνεται σε άλλες περιοχές του κυττάρου πλην των μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα, κυτταροπλασματικές πηγές O - 2 είναι α) η δράση διαφόρων ενζύμων που χρησιμοποιούν το O 2 ως υπόστρωμα για την οξείδωση διαφόρων βιολογικών μορίων (οξειδάσες, οξυγενάσες και υδροξυλάσες, π.χ. οξειδάση της ξανθίνης, υδροξυλάση της τυροσίνης, λιποξυγενάση κ.α.), και β) η αυτοοξείδωση (δηλαδή απευθείας οξείδωση από το μοριακό O 2 ) διαφόρων βιομορίων (π.χ. γλυκεραλδεϋδη, FADH 2, FMNH 2, NADH κ.α.). Η αυτοοξείδωση είναι κανονικά αμελητέα, αλλά επιταχύνεται σημαντικά από την παρουσία μετάλλων μετάπτωσης ως καταλυτών (π.χ. Fe 3+ και Cu 2+ - ). Τέλος, σημαντική πρωτογενής πηγή O 2 είναι το ενδοπλασματικό δίκτυο λόγω της δράσης των κυτοχρωμάτων Ρ450, ενζυμικών συμπλόκων που χρησιμοποιούν το O 2 για χημικές τροποποιήσεις (συνήθως υδροξυλίωση) και αποτοξικοποίηση πληθώρας υποστρωμάτων. Το παραγόμενο O - 2 δε μπορεί (λόγω της ιοντικής του φύσης) να εισχωρήσει στο ανιονικό φραγμό των λιπιδικών μεμβρανών, γι αυτό και παραμένει εγκλωβισμένο στο κυτταρικό διαμέρισμα (μιτοχόνδριο, κυτταρόπλασμα ή ενδοπλασματικό δίκτυο) στο οποίο σχηματίζεται. Γενικά σε φυσιολογικό ph ( 7,4) το O - 2 δεν είναι ιδιαίτερα δραστικό με μόρια που δεν είναι ελεύθερες ρίζες και έτσι η ταχύτητα αντίδρασής του με το DNA, τα λιπίδια, τα αμινοξέα και άλλους μεταβολίτες είναι πρακτικά αμελητέα λόγω της ταχύτατης αυτοοξειδοαναγωγής του σε Η 2 Ο 2 και Ο 2. Συνεπώς, οι άμεσες - τοξικές επιδράσεις του O 2 είναι εξειδικευμένες και αφορούν κυρίως έναν αριθμό συγκεκριμένων ενζυμικών και μη στόχων (όπως η ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση, η ακονιτάση, το κυττόχρωμα c, η αφυδρογονάση του NADH, σιδηροθειούχα ένζυμα, η φερριτίνη, η CAT, ορισμένες υπεροξειδάσες και η αναγωγή των Fe 3+ και Cu 2+ - (Sumner & Dounce, 1955; Aronoff, 1965). Επειδή το O 2 έχει χαμηλή - δραστικότητα μετατρέπεται γρήγορα σε άλλες ΔΜΟ, έτσι η κυτταροτοξική επίδραση του O 2 εκδηλώνεται κυρίως έμμεσα, δηλαδή με την παραγωγή από αυτό άλλων περισσότερο δραστικών μορίων που πλήττουν άμεσα και ισχυρά τα πλησιέστερα σε αυτά βιομόρια. Η βιομετατροπή του O - 2 σε 18

δραστικότερες μορφές (και συγκεκριμένα σε ΟΗ και ΟΝΟΟ - ) μπορεί να γίνει με δύο εναλλακτικούς μηχανισμούς, που δεν έχουν την ίδια βαρύτητα. - 1.5.1. Η κύρια οδός βιομετατροπής του O 2 - Το περισσότερο από το παραγόμενο O 2 μετατρέπεται γρήγορα σε Η 2 Ο 2 με την παρακάτω - - αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής (δισμουτίωσης, dismutation): O 2 + O 2 + 2Η + Η 2 Ο 2 + O - 2. - Σύμφωνα με την αντίδραση αυτή, τα μισά μόρια O 2 ανάγονται σε Η 2 Ο 2, ενώ τα υπόλοιπα μισά - οξειδώνονται σε Ο 2. Έτσι, με αυτή την πορεία βιομετατροπής του O 2 ο συνολικός αριθμός μορίων ΔΜΟ μειώνεται στο μισό (Banerjee, 2008). - Απουσία κατάλληλου ενζύμου, ο ρυθμός δισμουτίωσης του O 2 σε υδατικό διάλυμα εξαρτάται από το ph, ξεκινώντας από σχεδόν μηδέν σε ουδέτερο ph και αυξανόμενος όσο πιο όξινο γίνεται το διάλυμα. Στα βιολογικά συστήματα η δισμουτίωση του O - 2 είναι εξαιρετικά γρήγορη παρά το σχεδόν ουδέτερο ph ( 7,4) λόγω της αποτελεσματικής κατάλυσής της από ειδικά ένζυμα, τις SODs (Marklund, 1976; Misra & Fridovich, 1997). Ανάλογα με τα μεταλλικά ιόντα που φέρουν στο ενεργό τους κέντρο, οι SODs διακρίνονται σε CuZnSODs (με το Cu μόνο να παίρνει μέρος στον καταλυτικό μηχανισμό) και MnSODs (ενώ μια τρίτη κατηγορία, οι FeSODs, απαντά μόνο στα βακτήρια). Η CuZnSOD είναι κυτταροπλασματική κυρίως αλλά σε μικρότερες ποσότητες απαντά και στον πυρήνα, τα λυσοσώματα και τα υπεροξειδιοσώματα, ενώ η MnSOD εντοπίζεται αποκλειστικά στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων και αναλαμβάνει το μεγαλύτερο φορτίο της εκκαθάρισης του O - 2 που διαρρέει από την αναπνευστική αλυσίδα. Επιπροσθέτως, η SOD αποτελεί και ένα ένζυμο το οποίο εκκρίνεται από τα - κύτταρα (π.χ. σε μύκητες που έχουμε εξετάσει στο παρελθόν) και βοηθά στην απομάκρυνση του O 2 από το περιβάλλον τους. - Η δράση των SODs επί του παραγόμενου O 2 οδηγεί στο σχηματισμό μιας σημαντικής ποσότητας Η 2 Ο 2, η οποία συμπληρώνεται από το Η 2 Ο 2 που παράγεται κατά την ενζυμική δράση διαφόρων οξειδασών και άλλων ενζύμων των υπεροξειδιοσωμάτων. Σε αντίθεση με το O - 2, το Η 2 Ο 2 μπορεί να διαπερνά τις βιολογικές μεμβράνες και ως εκ τούτου διαχέεται ελεύθερα μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών διαμερισμάτων. Γενικά είναι ασθενής οξειδωτικός και αναγωγικός παράγοντας αλλά δεν εμφανίζει δραστικότητα με τα περισσότερα βιομόρια. Έτσι, οι άμεσες επιδράσεις του περιορίζονται στην απενεργοποίηση ορισμένων ενζύμων (π.χ. της 3-φωσφορικής γλυκεριναλδεϋδης, βασικό ενζύμου της γλυκόλυσης) μέσω της οξείδωσης καίριων θειολικών ομάδων (-SH) του ενεργού τους κέντρου, στην οξείδωση ορισμένων κετοξέων (π.χ. του πυροσταφυλικού) και στην απελευθέρωση Fe από διάφορες αιμοπρωτεΐνες. Το Η 2 Ο 2 υστερεί σε δραστικότητα ως προς το O - 2 αλλά υπερτερεί στο σημείο ότι επειδή δεν έχει φορτίο μπορεί να διαπερνά λιπιδικές μεμβράνες με διάχυση και ως εκ τούτου είναι ένα κομβικό μόριο στη διαδικασία πρόκλησης οξειδωτικών βλαβών, αφού υπό κατάλληλες συνθήκες (και αν δεν εκκαθαριστεί εγκαίρως από την αντιοξειδωτική άμυνα) μπορεί να 19

δημιουργήσει την ελεύθερη ρίζα ΟΗ, το πλέον δραστικό και επικίνδυνο για την ακεραιότητα των βιομορίων είδος ΔΜΟ. Το απαραίτητο ηλεκτρόνιο για την μονοσθενή αναγωγή του Η 2 Ο 2 σε ΟΗ προέρχεται από κάποιο αναγμένο μέταλλο μετάπτωσης, συνήθως Fe ή Cu. H μεταλλοεξαρτώμενη αναγωγή του Η 2 Ο 2 ονομάζεται αντίδραση Fenton και περιγράφεται από την ακόλουθη εξίσωση: Η 2 Ο 2 + Μe OH + OH - + Me +1, όπου Me = Fe 2+ ή Cu + Επειδή η διαθεσιμότητα μετάλλων μετάπτωσης βρίσκεται υπό αυστηρό έλεγχο και διατηρείται φυσιολογικά σε πολύ χαμηλά επίπεδα, απαραίτητη προϋπόθεση για τη λειτουργία του μηχανισμού αυτού παραγωγής ΟΗ είναι η ανακύκλωση των ιόντων Fe ή Cu από την οξειδωμένη (Me +1 ) στην αναγμένη τους μορφή (Me). Ο ρόλος αυτός αρχικά αποδόθηκε στη ρίζα O - 2 και έτσι η συνολική αντίδραση είναι: Η 2 Ο 2 + Μe OH + OH - + Me +1 (αντίδραση Fenton) Me +1 + O 2 - Μe + Ο 2 Net : Η 2 Ο 2 + O 2 - OH + OH - + Ο 2 (αντίδραση Haber-Weiss) Τα κύτταρα όμως διαθέτουν μια πληθώρα εξίσου ισχυρών ή ισχυρότερων ακόμα αναγωγικών παραγόντων (π.χ. GSH, NAD(P)H, κυστεΐνη, ασκορβικό οξύ) που βρίσκονται σε εξαιρετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις από το O - 2, με αποτέλεσμα η αναγωγή των μετάλλων μετάπτωσης από το O - 2 να είναι στην πραγματικότητα τελείως απίθανη. Επιπλέον, όταν τα κύτταρα εκτεθούν σε υπεριώδη ακτινοβολία, σχηματίζεται ΟΗ ανεξάρτητα από τη διαθεσιμότητα των μετάλλων, με απευθείας ομόλυση του Η 2 Ο 2 : 2Η 2 Ο 2 2 OH Η ρίζα ΟΗ προκαλεί στη συνέχεια τη λιπιδική υπεροξείδωση όπως περιγράφτηκε προηγουμένως και χρησιμοποιείται συχνά ως δείκτης οξειδωτικού στρες για την αξιολόγηση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων (Kaschnitz & Hatefi, 1975; De Zwart et al., 1999; Nowak et al., 2001). - 1.5.2. Η εναλλακτική οδός βιομετατροπής του O 2 Όπως προαναφέρθηκε η αποτελεσματική κατάλυση από το σύστημα των SODs μετατρέπει το - μεγαλύτερο ποσοστό των O 2 σε Η 2 Ο 2. Ένα από τα λίγα κυτταρικά προϊόντα που, λόγω του ότι είναι και το ίδιο ελεύθερη ρίζα, μπορεί να αντιδράσει με το O - 2 με ρυθμούς παραπλήσιους με εκείνους της αντίδρασης με τις SOD, είναι το μονοξείδιο του αζώτου ΝΟ, αντίδραση που οδηγεί στον σχηματισμό του υπεροξυνιτρίτη (ΝΟ + O - 2 ΟΝΟΟ - ) ένος ισχυρού οξειδωτικού και κυτταροτοξικού παράγοντα με δραστικότητα που συγκρίνεται με την ΟΗ. In vivo, αυτή η εναλλακτική πορεία μετατροπής του O - 2 σε πιο δραστικές μορφές εξαρτάται από τα ενδοκυττάρια επίπεδα ΝΟ, το οποίο συντίθεται κατά 20

τη μετατροπή του αμινοξέος L-αργινίνη σε L-κιτρουλίνη από το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (Nitric Oxide Synthase, NOS): L-arginine + O 2 + NADPH L-citrulline + NO + NADP + Σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις, το ΝΟ λειτουργεί πρωτίστως ως ενδοκυττάριος μηνυματοδότης (μέσω της γουανιλικής κυκλάσης και πρωτεϊνικών κινασών), ενώ επειδή μπορεί να διαπερνά με διάχυση τις κυτταρικές μεμβράνες συμμετέχει και στη διακυτταρική μεταγωγή σημάτων. Η παραγωγή του ΝΟ σε μεγαλύτερες ποσότητες προκαλεί την οξειδωτική του δράση, η οποία εκδηλώνεται κυρίως με την αντίδρασή του με το O - 2 και το σχηματισμό του υπεροξυνιτρίτη. Παρόλα αυτά σε χαμηλές ποσότητες μπορεί να δρα και αντιοξειδωτικά, αντιδρώντας με ποικίλες δραστικές ελεύθερες ρίζες (π.χ. αλκόξυλ και υπερόξυλ) και μετατρέποντάς τις σε πιο αδρανείς μορφές. Για την δράση που εκδηλώνει το ΝΟ, καθοριστικός παράγοντας φαίνεται να είναι ο λόγος ΝΟ / O - 2, αφού σε υψηλές τιμές του οποίου (μέχρι ενός ορίου βέβαια) η αντιοξειδωτική δράση του NO δείχνει να υπερτερεί. 1.6. Θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ) Η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ή ΘΟΚ, Thiol Redox State, ή TRS) των κυττάρων χαρακτηρίζεται από το επίπεδο και την ισορροπία ορισμένων πρωτεϊνικών (P), μη πρωτεϊνικών (NP ή R) και μεικτών (NP-P) μορίων που περιέχουν θειολικές (thiol, SH) και δισουλφιδικές (disulfide, SS) ομάδες και αποτελεί μια σημαντική παράμετρο του γενικότερου οξειδοαναγωγικού περιβάλλοντος των κυττάρων. Στη ΘΟΚ περιλαμβάνονται: α) η γλουταθειόνη (glutathione, GSH) και οξειδωμένη της μορφή, το δισουλφίδιό της (glutathione disulphide, GSSG), β) η κυστεΐνη (cysteine, CSH) και η οξειδωμένη της μορφή, η κυστίνη (cystine, CSSC), γ) άλλες μη πρωτεϊνικές θειόλες (RSH) και τα δισουλφιδικά μη πρωτεϊνικά μόρια (RSSR), δ) οι πρωτεϊνικές θειόλες (PSH) και τα δισουλφίδιά τους (PSSP) και ε) άλλα μεικτά δισουλφιδικά μόρια (όπως GSH και CSH και άλλων RSH συνδεδεμένων σε πρωτεϊνες) που αποτελούν το σύνολο των μεικτών πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (PSSR ή PSSNP) (Patsoukis & Georgiou, 2004). Από όλα τα παραπάνω μόρια, η GSH και η GSSG θεωρούνται οι σημαντικότεροι από τους παράγοντες που καθορίζουν τη ΘΟΚ και αποτελούν συνήθεις δείκτες του οξειδωτικού στρες. Άλλες σημαντικές θειόλες των κυττάρων είναι η CSH που αποτελεί πρόδρομο μόριο στη βιοσύνθεση της GSH, το λιποϊκό οξύ (lipoic acid), το συνένζυμο Α (Coenzyme CoA, CoASH, ή HSCoA) και το διπλό ολιγοπεπτίδιο θειορεδοξίνη (Thioredoxin, Trx) (Halliwell & Gutteridge, 1999; Banerjee, 2008). 21

1.6.1. Μη πρωτεϊνικες θειόλες 1.6.1.1. Γλουταθειόνη και δισουλφίδιο της γλουταθειόνης Η αναγμένη γλουταθειόνη (GSH) είναι ένα τριπεπτίδιο, L-γ-γλουτάμυλο-L-κυστεΐνυλογλυκίνη (L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycine) και είναι η σπουδαιότερη μικρομοριακή θειόλη που έχει βρεθεί σε φυτικά και ζωικά κύτταρα καθώς και σε αερόβια βακτήρια (π.χ. στο E. coli) σε συγκεντρώσεις της τάξης του mm, καθώς επίσης σπανιότερα και σε αναερόβια βακτήρια (Banerjee, 2008). Με το μόριο αυτό δεν παρατηρούνται τα φαινόμενα οξειδωτικής τοξικότητας που έχουν αναφερθεί ότι προκαλεί από μόνο του το αμινοξύ κυστεΐνη (CSH) (Puka- Sundvall et al., 1995) και έτσι έχει επιλεγεί στη φύση ως το πλέον κατάλληλο μόριο για να διευθετήσει τη θειολική οξειδοαναγωγική ισορροπία που χαρακτηρίζεται από την αναλογία των αναγμένων θειολών (RSH) προς τα οξειδωμένα δισουλφίδια (RSSR). Η παρουσία γ-πεπτιδικού δεσμού στο μόριο το καθιστά ανθεκτικό στην αποικοδόμηση μέσω αμινοπεπτιδασών. Το δισουλφίδιο της γλουταθειόνης (GSSG), αναφέρεται συχνά και ως οξειδωμένη γλουταθειόνη, προκύπτει ύστερα από οξείδωση και σχηματισμό δισουλφιδικής γέφυρας μεταξύ δύο μορίων GSH, μέσω των SH ομάδων των κυστεϊνών. Εκτός όμως από την αυτό-οξείδωσή της, η GSH μπορεί να σχηματίσει δισουλφιδική γέφυρα και με άλλα μικρού μοριακού βάρους μόρια, όπως ελεύθερη CSH, συνένζυμο Α, καθώς και με θειολικές ομάδες πρωτεϊνών (Sies, 1999). Σχήμα 3. Η δομή της γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της γλουταθειόνης (Halliwell & Gutteridge, 1999). Η GSH συντίθεται από τρία αμινοξέα, L-γλουταμινικό οξύ (L-glutamate), L-κυστεΐνη (Lcysteine) και γλυκίνη (glycine) σε δύο διακριτά μεταξύ τους στάδια που καταλύονται από δύο κυτταροπλασματικά ένζυμα. Σε πρώτο στάδιο δρα η συνθετάση της γ-γλουτάμυλο-κυστεΐνης (γglutamyl-cysteine synthetase, γ-gcs) και σε δεύτερο στάδιο η συνθετάση της γλουταθειόνης καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού με τη γλυκίνη. Οι αντιδράσεις σύνθεσης της GSH είναι οι ακόλουθες (Halliwell & Gutteridge, 1999): L-γλουταμινικό οξύ + L-κυστεΐνη + MgATP L-γ-γλουτάμυλο-L-κυστεΐνη + MgADP + Pi L-γ-γλουτάμυλο-L-κυστεΐνη + γλυκίνη + MgATP GSH + MgADP + Pi Για τη σύνθεση της GSH απαραίτητο συστατικό είναι η κυστεΐνη (CSH) η οποία παράγεται από μεθειονίνη στα κύτταρα (με μεταφορά του S από τη μεθειονίνη στη σερίνη) (Karlson et al., 1980) ή προσλαμβάνεται απευθείας. Συχνά προσλαμβάνεται ως κυστίνη (cystine, το συμμετρικό δισουλφίδιο της κυστεΐνης, CSSC) η οποία ανάγεται στο εσωτερικό του κυττάρου σύμφωνα με την αντίδραση: L- 22

κυστίνη + 2GSH 2L-CSH + GSSG. Για τη CSH και τη CSSC η μεταφορά γίνεται με ειδικούς μεταφορείς. Το μεγαλύτερο ποσοστό της GSH του κυττάρου εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και μόνο το 10% βρίσκεται στα μιτοχόνδρια, τα οποία στερούνται ενζύμων σύνθεσης της. Επιπρόσθετα, ένα μέρος της GSH βρίσκεται και στον πυρήνα (Halliwell & Gutteridge, 1999). H GSH είναι ο σπουδαιότερος θειολικός οξειδοαναγωγικός ρυθμιστής του κυττάρου και βρίσκεται σε μεγάλη συγκέντρωση στα κύτταρα. Πολλοί ερευνητές εστιάζουν στο λόγο [GSH]/[GSSG] για να χαρακτηρίσουν τη ΘΟΚ (Schafer & Buettner, 2001). Ιδιαίτερη σημασία έχουν τα προϊόντα αντίδρασης της γλουταθειόνης με πρωτεΐνες (PSSG) κατά την αντίδραση της S-γλουταθειονυλίωσης (S-glutathionylation) των πρωτεϊνικών θειολικών ομάδων. Σε προοξειδωτικές καταστάσεις, η S- γλουταθειονυλίωση μπορεί να λειτουργεί σαν ένας μηχανισμός αποθήκευσης στο εσωτερικό του κυττάρου για τη γλουταθειόνη, επειδή η οξείδωσή της σε GSSG οδηγεί στην απομάκρυνσή της (της GSSG) από τα κύτταρα. Επιπλέον, η S- γλουταθειονυλίωση παρέχει προστασία των PSH από μη αναστρέψιμες βλάβες σε καταστάσεις υψηλού οξειδωτικού στρες (Dalle-Donne et al., 2007). 1.6.1.2 Κυστεΐνη (CSH) H CSH είναι ένα αμινοξύ με μια σουλφυδρυλομάδα στην πλάγια ομάδα του ( CH 2 SH) που παράγεται από τη μεθειονίνη. Η οξείδωση δύο μορίων CSH με σχηματισμό θειογέφυρας οδηγεί στο σχηματισμό της κυστίνης (CSSC). H CSH αποτελεί πρόδρομο μόριο της βιοσύνθεσης της GSH (Halliwell & Gutteridge, 1999), αλλά έχει ενοχοποιηθεί και για τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα, όπως για παράδειγμα νευροτοξικότητα (Puka-Sundvall et al., 1995; Winterbourn & Metodiewa, 1999) και γι αυτό προτιμάται εναλλακτικά η χορήγηση της N-ακετυλ-κυστεΐνης (N-acetyl-cysteine ή NAC) που απορροφάται από τα κύτταρα ευκολότερα και δεν έχει τοξική επίδραση σε αυτά. Η CSH ως μια μη πρωτεϊνική θειόλη αντιδρά με O - 2, H 2 O 2, NO, με μέταλλα μετάπτωσης και άλλες ελεύθερες ρίζες (Halliwell & Gutteridge, 1999; Winterbourn & Metodiewa, 1999). Η συσσώρευση όμως των ενδιάμεσων προϊόντων των αντιδράσεων, οι ελεύθερες ρίζες CS -, μπορεί να έχουν τοξική επίδραση στα κύτταρα (Halliwell & Gutteridge, 1999). Έχει βρεθεί ακόμα ότι η CSH (όπως και η GSH) αναστέλλει την καταλάση (Sun & Oberley, 1989), καθώς και την τυροσινάση των μυκηλιακών μυκήτων (Miller & Limberta, 1977) που ευθύνεται για την παραγωγή της μελανίνης. Η CSH (όπως και η GSH) αυτοοξειδώνεται πολύ εύκολα και είναι ιδιαίτερα ασταθής σε αλκαλικό ph και υψηλή θερμοκρασία (Halliwell & Gutteridge, 1999). Η CSH αποτελεί υπόστρωμα για τις υπεροξυρεδοξίνες, συμμετέχοντας έτσι στην ενζυμική απομάκρυνση H 2 O 2 και οργανικών υπεροξειδίων (Forman, 2005). Η CSSC, αποτελεί υπόστρωμα της θειολμεταφοράσης μέσω της οποίας ανάγεται σε CSH (Bick et al., 1998). 23

1.6.2 Ένζυμα που συμμετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ των κυττάρων Εκτός από την άμεση αντίδραση της GSH με ελεύθερες ρίζες, οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει και πιο ελεγχόμενα ενζυμικά αντιοξειδωτικά συστήματα που αφορούν τη GSH, με την κύρια ενζυμική γραμμή άμυνας που χρησιμοποιεί τη GSH να αποτελείται από τις υπεροξειδάσες και τις μεταφοράσες της GSH και την αναγωγάση του GSSG. Εκτός όμως από τα ένζυμα που χρησιμοποιούν αποκλειστικά τη GSH, υπάρχουν και ένζυμα που χρησιμοποιούν ως υποστρώματα άλλες μη πρωτεϊνικές θειόλες, αλλά και πρωτεϊνικές θειόλες συνεισφέροντας σημαντικά στον έλεγχο της ΘΟΚ των κυττάρων. Οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (GSH Peroxidases, GPxs) ανάγουν το H 2 O 2 σε H 2 O οξειδώνοντας τη GSH σε GSSG σύμφωνα με την αντίδραση: H 2 O 2 + 2GSH GSSG + 2H 2 O. Οι GPxs αποτελούνται από τέσσερις υπομονάδες, η καθεμία από τις οποίες περιέχει ένα άτομο σεληνίου (Se) στο ενεργό της κέντρο, που είναι ενσωματωμένο υπό τη μορφή του αμινοξέος σεληνιοκυστεΐνη (selynocysteine, η κυστεΐνη με Se στη θέση του S) και αναγνωρίζουν ως υπόστρωμα εκτός από το H 2 O 2 και υδροϋπεροξείδια λιπιδίων (lipid hydroperoxides, LOOH). Ένας πολύ σημαντικός ρόλος της GSH προκύπτει από τη συμμετοχή της στο μεταβολισμό παρασιτοκτόνων, εντομοκτόνων και γενικά ξένων προς τον οργανισμό μορίων, γνωστά ως ξενοβιοτικά μόρια (xenobiotics) (Halliwell & Gutteridge, 1999). Αυτό επιτυγχάνεται με τις μεταφοράσες της GSH (glutathione transferases, GSTs) οι οποίες συνδέουν τα ξενοβιοτικά μόρια με τη GSH και αποτοξικοποιούν τον οργανισμό. Η αναλογία GSH/GSSG σε φυσιολογικά κύτταρα συνήθως είναι υψηλή και διατηρείται χάρη στη λειτουργία της αναγωγάσης του δισουλφιδίου της γλουταθειόνης (GSSG Reductase, GR), που αναλαμβάνει να ανάγει το GSSG σε GSH καταναλώνοντας NADPH (που παρέχεται κυρίως από τον κύκλο των φωσφορικών πεντοζών) (Sies, 1999; Berg et al., 2002; Ghezzi, 2005). 1.6.3. Τεχνητή αύξηση ή μείωση των επιπέδων των θειολών του κυττάρου Στη βασική έρευνα είναι συνήθως απαραίτητη η τεχνητή αλλαγή της ΘΟΚ, μέσω χημικών ουσιών. Οι συχνότερα χρησιμοποιούμενες χημικές ενώσεις για την αύξηση της κυτταρικής GSH είναι η NAC, το L-2-όξο-θειαζολιδίνη-4-καρβοξυλικό οξύ (L-2-oxothiazolidine-4-carboxylate, OTC), η GSH και οι μονο- ή διαιθυλεστέρες της GSΗ. Αντίθετα, οι συχνότερα χρησιμοποιούμενες χημικές ενώσεις για τη μείωση των επιπέδων της GSH στα κύτταρα, είναι ο αναστολέας της γ-gcs L- βουτυλοθειονίνη-s,r-σουλφοξιμίνη (L-buthionine-S,R-sulfoximine, BSO) και η ένωση καρμουστίνη [carmustine ή 1,3-bis(2-chloroethyl)-N-nitrosourea, BCNU] που αναστέλλει την αναγωγάση του GSSG. Επιπρόσθετα, για τη γενική μείωση των πρωτεϊνικών και μη πρωτεϊνικών θειολικών επιπέδων των κυττάρων χρησιμοποιούνται και οι γενικευμένοι θειολικοί οξειδωτές (thiol oxidizers) διαμίδιο (diamide), διαιθυλομαλεΐκό οξύ (diethyl malaete) και ιωδοοξικό οξύ (iodoacetic acid) (Halliwell & Gutteridge, 1999; Szaszi et al., 2005). 24

Η NAC είναι ένα μικρό υδατοδιαλυτό αντιοξειδωτικό μόριο που περιέχει μια ελεύθερη σουλφυδρυλομάδα και που χρησιμοποιείται κλινικά και πειραματικά από το 1950 (Cotgreave, 1997). Η NAC είναι παράγωγο του αμινοξέος CSH με μια ακέτυλο-ομάδα προσδεμένη στο άτομο αζώτου. Η ενζυμική αποακετυλίωση της NAC οδηγεί σε σχηματισμό CSH που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή GSH. Πειραματικά χρησιμοποιήθηκε ως αντιοξειδωτής αφού διαπιστώθηκε η αντίδρασή της με τη ρίζα υδροξυλίου (HO ), με υποχλωριώδες οξύ (HOCl), με το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και με O - 2 (Aruoma et al., 1989; Benrahmoune et al., 2000). 1.6.4 Πρωτεϊνικές θειόλες (PSH), πρωτεϊνικά δισουλφίδια (PSSP) και μεικτά πρωτεϊνικά δισουλφίδια (PSSΝΡ) Πολλές πρωτεϊνικές θειόλες (PSH), συνεισφέρουν στη διαμόρφωση της ΘΟΚ, αφού πολλά ένζυμα και μεμβρανικοί υποδοχείς περιέχουν σουλφυδρυλομάδες στο μόριό τους (Sies, 1999). Το 30% περίπου της αμινοξικής σύστασης των μεταλλοθειονινών από διάφορους οργανισμούς είναι κυστεΐνη (Halliwell & Gutteridge, 1999). Από τις παραπάνω πρωτεϊνικές θειόλες (PSH), σχηματίζονται πρωτεϊνικά δισουλφίδια (PSSP) είτε ενζυμικά είτε μη ενζυμικά (Wetlaufer, 1984). Αυτά διακρίνονται σε ενδομοριακά δισουλφίδια, (intramolecular disulfides, ο δισουλφιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ κυστεϊνών του ίδιου μορίου) και σε διαμοριακά δισουλφίδια, (intermolecular disulfides, ο δισουλφιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ διαφορετικών μορίων) (Dalle-Donne et al., 2007). Τα τελευταία οδηγούν στο σχηματισμό πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων (protein aggregates), φαινόμενο που έχει παρατηρηθεί σε περιπτώσεις παθολογικών καταστάσεων σε ζωικά κύτταρα και σε φυτά που αναπτύσσονται σε συνθήκες στρες (Levitt, 1972; Gilbert, 1995). Λίγα είναι γενικά γνωστά για τους in vivo μηχανισμούς του σχηματισμού των δισουλφιδικών γεφυρών στις πρωτεΐνες. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο σχηματισμός τους λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια ή και αμέσως μετά τη δημιουργία της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Όταν οι θειολικές ομάδες των πρωτεϊνών αντιδρούν με GSH, GSSG, κυστεΐνη, ομοκυστεΐνη, γ-γλουταμυλοκυστεΐνη και άλλες θειόλες τότε παράγονται τα μεικτά δισουλφίδια (PSSΝΡ) (Halliwell & Gutteridge, 1999; Sies, 1999; Ghezzi, 2005). Στα κύτταρα η συγκέντρωση των πρωτεϊνικών σουλφυδρυλομάδων (PSH, PSSP, PSSNP) είναι πολύ μεγαλύτερη από της GSH. Οι αντιδράσεις S-θειολίωσης (S-thiolation) για την παραγωγή PSSΝΡ και S-αποθειολίωσης (S-dethiolation) για τη διάσπασή τους, είναι μέρος μιας δυναμικής κατάστασης που συμβαίνει φυσιολογικά στο κύτταρο, είναι αντιστρεπτές και ο ρυθμός με τον οποίο εξελίσσονται εξαρτάται από τη φύση των σουλφυδρυλομάδων στις πρωτεΐνες. Η δημιουργία συγκεκριμένα των PSSG (παράγονται μετά από αντίδραση των PSH με τη GSH) θεωρείται μια πρώιμη κυτταρική απόκριση στο οξειδωτικό στρες και επηρεάζει το οξειδοαναγωγικό περιβάλλον του κυττάρου (Schafer & Buettner, 2001). Ως εκ τούτου οι σουλφυδρυλομάδες των πρωτεϊνών παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο ως ρυθμιστές της σουλφυδρυλικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης και της διατήρησης του οξειδοαναγωγικού δυναμικού του ζεύγους GSSG/2GSH. Τα υψηλά αποθέματα σε PSH μπορούν να 25