QUANTA Lite TM ENA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM ENA 5 708610 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM ENA 5 αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων IgG έναντι Sm, RNP, SS-Α (60kDa & 52kDa), SS-B και Scl-70 σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλα ορολογικά τεστ και κλινικά ευρήματα με σκοπό τη διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου(sle) και άλλων σχετικών μολύνσεων του συνδετικού ιστού όπως το σύνδρομο Sjorgen s. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA s) ευρίσκονται σε μεγάλο εύρος μολύνσεων του συνδετικού ιστού και έτσι χρησιμοποιούνται σαν ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης. 1 Ενώ και ο έλεγχος των ΑΝΑ είναι μία υπέροχη ευρεία μέθοδος ανίχνευσης για SLE (ένα αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει απουσία ενεργού SLE) 2 δεν είναι εξειδικευμένος έλεγχος. Τα αντισώματα έναντι εκχυλισμένων πυρήνων (ENA) μπορούν να συμβάλλουν σημαντικά στη πρόγνωση και διάγνωση όταν υπάρχουν υποψίες ότι ο ασθενής πάσχει από νόσο του συνδετικού ιστού όπως του συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου(sle),σύνδρομο Sjorgen s, σκληροδερμία,πολυμυοσίτις. Εξι από τά πλέον χρήσιμα και συχνά ελεγχόμενα αυτοαντισώματα για ΕΝΑ αντιδρούν με τα Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 αντιγόνα. Η δοκιμασία QUANTA Lite TM ENA 5 ELISA επιτρέπει τον έλεγχο του ορού του ασθενούς ταυτοχρόνως για τα 5 αυτοαντισώματα Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 σε ένα πηγαδάκι. Οροί αρνητικοί σε αυτή την ευαίσθητη ομαδική δοκιμασία μπορούν να χαρακτηρισθούν σαν αρνητικοί ως προς τα SS-Α, SS-B, Sm, RNP και Scl-70. Οροί θετικοί σε αυτή την ομαδική δοκιμασία πρέπει να επανελεγχθούν με άλλες ειδικές ΈΝΑ δοκιμασίες όπως ανοσοενζυματική ELISA ή Διπλή Ανοσοδιάχυση (Ouchterlony) για επιβεβαίωση και εξακρίβωση του αντισώματος και ποσοτικής στάθμης του αντισώματος. Ποικίλες μέθοδοι συμπεριλαμβανομένης της διπλής ανοσοδιάχυσης (Ouchterlony) και παθητικής συγκόλλησης χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl- 70. Εχουν επίσης αναπτυχθεί κλινικώς χρήσιμες ανοσοενζυματικές μέθοδοι ανάλυσης (ELISA). Η τεχνική ELISA αυτης της μεθόδου είναι ημιποσοτική και μπορεί εύκολα να ελέγχει μεγάλο αριθμό δείγμάτων ασθενών. Αρχη Μεθοδου Τα συγγενικά κεκκαθαρμένα Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 αντιγόνα είναι συνδεδεμένα σε πηγαδάκια μικροπλάκας πολυστερίνης κάτω από συνθήκες που θα συγκρατήσουν το αντιγόνο στην φυσική του κατάσταση. Έτοιμοι μάρτυρες (control ) και αραιωμένος ορός ασθενούς προσθέτονται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο αντι-sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο του δείγματος ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων(conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετράται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται. Η επεξεργασία μπορεί να κριθεί με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια πρότυπων ορών ελέγχου (control). Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα Sm, RNP, SS-A, SS-B και Scl-70 ) 3. ENA 5 ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο RNP, προαραιωμένο, 1.2ml 4. ENA 5 ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο RNP, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 1

2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 3 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 2

Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 EΝΑ 5 ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος EΝΑ 5 ELISA Low Χαμηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος EΝΑ 5 ELISA High Υψηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 3

2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του ENA 5 ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του ENA 5 ELISA Low. Η τιμή του ENA 5 ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X ENA 5 oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. ENA 5 ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί μετά να ταξινομηθεί σαν αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον πίνακα παρακάτω. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενώς θετικό 20-39 Ενδιάμεσο θετικό 40-80 Ισχυρώς θετικό >80 Όλα τα θετικά δείγματα πρέπει να δοκιμαστούν με ειδική δοκιμασία κατά Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 για τον ποσοτικό προσδιορισμό και ειδικοτητα του παρόντος αντισώματος. 1. Ενα θετικό αποτέλεσμα δείχνει τη παρουσία Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 αντισωμάτων καί την πιθανότητα συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου (SLE) και άλλων σχετικών μολύνσεων του συνδετικού ιστού όπως το σύνδρομο Sjorgen s. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70 ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM ΕΝΑ 5 ELISA.Οι τιμές που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλέγματος στο δείγμα μπορεί να οφείλεται στήν αυξημένη στάθμη μη ειδικής σύνδεσης, και συνεπώς ψευδές αποτέλεσμα. 2. Δέν είναι όλοι οι ασθενείς συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου(sle) θετικοί κατά Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl-70. 4

3. Τα αποτελέσματα της μεθόδου αυτής πρέπει να δίδονται σε συνδιασμό με τά κλινικά ευρήματα και τα ευρήματα από άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 4. Μερικά δείγματα μπορεί να έχουν χαμηλή συγκέντρωση αντισωμάτων Sm, RNP, SS-Α, SS-B και Scl- 70 κάτω απο το θετικό όριο αποκοπής άν και μπορεί να εμφανίζεται θετικό αποτέλεσμα. 5. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η δυνατότητα της δοκιμασίας QUANTA Lite TM ENA 5 ELISA για ανίχνευση αντισωμάτων έναντι Sm, RNP, SS-A, SS-B και Scl-70 εκτιμήθηκε σε σύγκριση με τις διαθέσιμες εμπορικές δοκιμασίες διπλής διάχυσης από τη INOVA Diagnostics, Inc. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας Ouchterlony προσδιορίστηκαν ως θετικά αν ήταν παρούσα μια γραμμή κατακρήμνισης και αρνητική αν δεν είχε παρατηρηθεί η γραμμή. Τα δείγματα με αντιδραστικότητα στη μέθοδο ELISA ίση ή μεγαλύτερη από 20 μονάδες κρίθηκαν ως θετικά ενώ τα δείγματα με χαμηλότερη αντιδραστικότητα ήταν αρνητικά. Φυσιολογικές τιμές Επιλέχτηκαν 117 τυχαία δείγματα ορού και εξετάστηκαν με ανάλυση ENA 5 ELISA. Με τις δοκιμασίες ανάλυσης ELISA, η οριακή τιμή ορίζεται στις 20 μονάδες. Η μέση τιμή του πληθυσμού δειγμάτων ήταν 6.23 μονάδες, με τυπική απόκλιση 2.04 μονάδων. Το εύρος τιμών του πληθυσμού ήταν 4.0 έως 15 μονάδες. Αυτή η δοκιμή δηλώνει ότι ο φυσιολογικός μέσος όρος είναι πάνω από 6.74 τυπικές αποκλίσεις κάτω από την οριακή τιμή. Ευαισθησία και Ειδικότητα Για να καθορίσετε τη σχετική ευαισθησία και την ειδικότητα της ανάλυσης, εξετάστηκαν 136 θετικά δείγματα πασχόντων από ANA που περιείχαν μεγάλη ποικιλία αντισωμάτων έναντι πυρηνικών αντιγόνων χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες ανίχνευσης ENA 4 και ENA 5 καθώς και τις 5 ειδικές μεθόδους ELISA. Από τα 136 δείγματα που εξετάστηκαν, τα 76 βρέθηκαν θετικά και τα 55 βρέθηκαν αρνητικά από τη δοκιμή ανίχνευσης ENA 5 και από μία ή περισσότερες από τις 5 ειδικές μεθόδους ENA ELISA. Συνεπώς, υπήρχαν μόνο 5 ασύμφωνα δείγματα, 3 ψευδή θετικά και 2 ψευδή αρνητικά. Οι τιμές και για τα 3 ψευδή θετικά ήταν ίσες ή λίγο μεγαλύτερες από την οριακή τιμή των 20 μονάδων. Η μέτρηση των δειγμάτων 1712 και 1713 έδωσε 20 μονάδες, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ENA 5 και 19 και 21 μονάδες αντιστοίχως, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ENA 4. Και τα δύο δείγματα είχαν μικρές ποσότητες RNP και Scl-70 (αν και ήταν κάτω από την οριακή τιμή για τις συγκεκριμένες δοκιμές ELISA). Η μέτρηση του δείγματος 1712 έδωσε στις 16 μονάδες RNP και 12 μονάδες Scl-70. Το δείγμα 1713 έδωσε 15 και 12 μονάδες αντιστοίχως. Η μέτρηση του δείγματος 13 έδωσε 37 μονάδες με τη μέθοδο ENA 5 και 47 μονάδες με τη μέθοδο ENA 4. Περιείχε μια μικρή ποσότητα RNP που υπολογίστηκε στις 13 μονάδες. Και με τις δύο δοκιμές ανίχνευσης ENA 4 και ENA 5 έχει προβλεφθεί ένας μικρός βαθμός υπερευαισθησίας. Καθώς πολλαπλά ξεχωριστά αντιγόνα επικαλύπτονται στη στέρεα φάση, υπάρχει ένα πρόσθετο αποτέλεσμα όταν τα δείγματα περιλαμβάνουν μικρές συγκεντρώσεις περισσοτέρων από ένα αντισωμάτων. Τα δύο ψευδή αρνητικά με τη μέθοδο ENA 5 αναφορικά με τα συγκεκριμένα ELISA ήταν τα δείγματα #57 και #5040. Το δείγμα 57 ήταν αρνητικό και για τις δύο μεθόδους ENA 5 και ENA 4, δίνοντας 14 και 16 μονάδες, ωστόσο αυτό το δείγμα βρέθηκε ασθενές θετικό σε RNP, δίνοντας 37 μονάδες. Το δείγμα 5040 ήταν αρνητικό με τη μέθοδο ENA 5, δίνοντας 16 μονάδες, ασθενές θετικό στο ENA 4, δίνοντας 38 μονάδες και εμφανίστηκε θετικό μόνο σε SS-B, δίνοντας 35 μονάδες, χρησιμοποιώντας συγκεκριμένο SS-B ELISA. Αυτό το δείγμα εκτιμήθηκε περαιτέρω με δοκιμασία Ouchterlony διπλής διάχυσης και βρέθηκε να είναι αρνητικό για SS-B. Το αποτέλεσμα της δοκιμασίας ανίχνευσης συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα. ELISA + - + 76 2 Σχετική Ευαισθησία 97.4% Ειδικό Σχετική Ειδικότητα 94.8% - 3 55 Σχετική Ευκρίνεια 96.3% Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και η δυνατότητα επανάληψης της δοκιμασίας μετρήθηκαν με την επανάληψη της διαδικασίας σε έξι ισχυρώς αντιδρώντα και έξι ασθενώς αντιδρώντα δείγματα σε έξι ξεχωριστές δοκιμασίες. Η μέση αντίδραση των ισχυρώς αντιδρώντων δειγμάτων ήταν 102 μονάδες (units) ενώ η μέση αντίδραση των ασθενώς αντιδρώντα δειγμάτων ήταν 25. Η πρότυπη απόκλιση και o συντελεστής απόκλισης για κάθε δείγμα φαίνονται παρακάτω. Ισχυρώς Θετικό Ασθενώς Θετικό S.D. C.V. S.D. C.V. Σύνολο 4.2 4.1% 0.88 3.5% Εντός Διαδικασίας 3.0 2.9% 0.90 3.6% Ενδιάμεσα της Διαδικασίας 4.2 4.1% 0.81 3.2% 5

Βιβλιογραφία 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. 2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. 3. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628610 May 2005 Revision GRC9 6