5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ-SUMMARY 168
SUMMARY Due to its nature of multiple causatives and phenotypes, finding appropriate treatments and prediction strategies for cancer is one of the most challenging subjects for basic research and medicine. Moreover the prediction of cancer development in many cases is not sufficient to cure the disease and treatment strategies need to be developed. It is well documented that genetic lesions in key tumour suppressor genes like BRCA1 and BRCA2 breast cancer susceptibility genes and p53 are associated with the development of gynaecological cancers. Recent evidence connects BRCA1, BRCA2 and p53 tumour suppressor proteins to cell-cycle checkpoint control and DNA repair by homologous recombination. A case can be made that all three factors are central players in a network of processes that deal with lesions that block DNA replication, so preserving chromosome stability during the S and G 2 phases of the cell cycle. Replication-blocking lesions can be repaired and replication resumed through error-free processes that involve homologous recombination. The product of the Rad51 gene is central to these DNA homologous recombination reactions. Rad51 physically and functionally interacts with all key players of the network described. BRCA2 and Rad51 work directly in the process of recombination. BRCA1 and p53 work proximally to BRCA2 and Rad51 in homologous recombination performing several apparently discrete functions that serve both to activate cell-cycle checkpoint arrest after DNA damage and to regulate the efficiency of repair reactions. The breast cancer susceptibility gene BRCA1 is one of the most well studied genes in cancer research. BRCA1 mutations are found in approximately 50% of patients with inherited breast cancer, and up to 90% of families with breast and ovarian cancer susceptibility. BRCA1 mutations are particularly susceptible to the development of a breast cancer before age 35 40 and also of an ovarian cancer with a probability rate of, respectively, 45% 60% and 20% 40%, whereas women who inherit a BRCA2 mutation present a 25% 40% risk of developing a breast cancer and a 10% 20% risk of an ovarian cancer. BRCA1 mutations even if are more rare in sporadic cancers, the loss of subcellular localization is postulated to be important in these cases. 169
A large number of cancer-linked mutations are located in BRCT tandem repeats of BRCA1 and few of them may cause loss of the protein's function, abolition of protein interactions and proteins mislocalization. The functional and structural integrity of the BRCT tandem repeats is essential for the molecule's interaction with phosphorylated protein targets including the ACCA, p53, DNA helicase BACH1 and the CtBP-interacting protein CtIP. The binding of the BRCA1 BRCT domain to BACH1 and the transcriptional corepressor CtIP plays an important role in the control of the G2/M phase checkpoint. The abnormal subcellular distribution of the BRCT mutants correlates with their ability to disrupt BRCA1 terminal folding. Biophysical analysis of the secondary structure, the thermodynamic stability and the modification in binding affinity of the purified wt and mutated BRCT domains with BACH1 and CtIP have already studied in vitro at our laboratory, using Circular Dichroism (CD), Differential Scanning Microcalorimetry (DSC) and Isothermal Titration Calorimetry (ITC). The BRCT mutant M1652I, V1696L, M1775K, M1783T, V1809F and P1812A were investigated according the conditions established for the BRCT-wt. For the protein concentrations C t =0.3 and 0.4 mg/ml used, (ΓH)cal and Tm values were found to be independent of C t. All mutants were in monomeric state. Comparing the calorimetric results of M1775K and V1809F to those for BRCTwt it can readily be deduced that (ΓH)cal and Tm are affected. (ΓH)cal is lower of the corresponding enthalpic content for the denaturation of BRCT-wt and Tm exhibits a very significant decreased by almost 6 o C. In contrast, (ΔΗ)cal obtained for V1696L and M1652I are much more lower than the BRCT-wt even if the Tm are very similar. Of particular interest is the mutant P1812A. By comparing the calometric results of P1812A mutant to BRCT-wt and other studied BRCT mutations, it can readily be concluded that (ΓH)cal and Tm are restrictly affected. (ΓH)cal is lower of the corresponding enthalpic content for the denaturation of BRCT-wt and Tm exhibits a downwards shift by almost 4 o C. Finally, the (ΔΗ)cal and Tm of M1783T are considerably lower compared to BRCT-wt. 170
Moreover based on the interaction parameters of the BRCT-wt and the six variants of this study with pbach1 and pctip were draw the following conclusions: (a) the BRCT-wt bind to both pbach1 and pctip with binding parameters identical to those previously published, (b) in all cases thermally denatured proteins show no binding, (c) the mutants M1783T, P1812A were found to bind to both phosphopeptides, (d) the mutant V1696L binds only to pbach1, (e) the mutants M1652I, M1775K, V1809F show neither binding to pbach1 nor to pctip like M1775R and R1699W, previously published, (f) the BRCT-wt show stronger affinity with pbach1 compare with pctip. In all CD far-uv spectra of all variants is clear that they perfectly overlap with the corresponding spectrum of the BRCT-wt. In order to investigate the effects of the same pathogenic mutation of BRCA1- BRCT in vivo we have fused GFP with BRCA1 and BRCA1-BRCT mutants. Preliminary experiments in MCF7 have shown a dramatic alteration on their intracellular localization as well as the co-localization with p53, Rad51. The experiments were performed with use of fluorescence microscopy. Findings of previous studies predict similar enhanced cytoplasmic staining of BRCA1 in familial breast cancers that carry BRCT mutations which influence the stability. The experimental results presented may help to determine the functional and structural consequences of the selected mutants on certain interactions of BRCT with pbach1 and pctip. The present study demonstrates how the location of the selected mutants and the minor or not detectable differences of intramolecular and intermolecular atomic interactions caused by mutated residues may change the thermodynamic parameters and decrease the binding affinities of BRCT to pbach1 and pctip. It seems that mutation-induced destabilization of the hydrophobic inter-brct-repeat region is crucial for the structural integrity of the domain and consequently for its ability for peptide recognition. In conclusion, the remarked differences of the thermodynamic and binding properties of the BRCT mutants reported in this study clearly show alteration in protein s function, intramolecular localization and may reveal in molecular level the association of these variants with hereditary breast/ovarian. 171
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η εύρεση της κατάλληλης θεραπείας και πρόβλεψης για την αντιμετώπιση του καρκίνου είναι μια από τις κυριότερες προκλήσεις της σύγχρονης ιατρικής εξαιτίας της πολυπλοκότητας και πολυπαραγοντικής αιτιολογίας της ασθένειας. Επιπλέον σε αρκετές περιπτώσεις ακόμη και η επιτυχής πρόβλεψη δεν προϋποθέτει την αποτελεσματική αντιμετώπιση της νόσου. Μεταλλάξεις σε πρωτεΐνες ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου όπως οι ογκοκατασταλτικές BRCA1 και BRCA2 (η συμμετοχή των αντίστοιχων γονιδίων έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού), καθώς και στην p53 έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη καρκίνου σε γυναικείους πληθυσμούς. Πρόσφατα έχει προσδιοριστεί η συμμετοχή των πρωτεϊνών BRCA1, BRCA2 και p53 στις διαδικασίες ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και στην επιδιόρθωση του γενώματος μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Οι τρεις αυτές πρωτεΐνες είναι ρυθμιστικά μόρια ελέγχου της ορθής αντιγραφής του γονιδιώματος και διατήρησης της χρωμοσωμικής σταθερότητας κατά την διάρκεια των φάσεων S, G 2 του κυτταρικού κύκλου. Η διατήρηση της γενωμικής πιστότητας κατά την διαδικασία της αντιγραφής επιτυγχάνεται με την διαδικασία επιδιόρθωσης του ομόλογου ανασυνδυασμού με την πρωτεΐνη Rad51 να έχει κύριο ρόλο. Η Rad51 δομικά και λειτουργικά αλληλεπιδρά με σημαντικά μόρια ελέγχου της κυτταρικής λειτουργίας, με την BRCA2 να συνδέεται άμεσα μαζί της ελέγχοντας την πορεία του ομόλογου ανασυνδυασμού. BRCA1 και p53 δρουν συνεργατικά με τις BRCA2 και Rad51 στη διαδικασία επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, ελέγχοντας την πορεία του κυτταρικού κύκλου μετά από βλάβη του γενώματος και ρυθμίζοντας την αποτελεσματικότητα των διαδικασιών επιδιόρθωσης. Το γονίδιο BRCA1 είναι ένα από τα πιο καλά μελετημένα γονίδια που συμμετέχουν στην καρκινική ανάπτυξη. Μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA1 έχουν βρεθεί σε ποσοστό 30% σε ασθενείς με οικογενή καρκίνο του μαστού και ωοθηκών. Μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA1 συσχετίζονται με ανάπτυξη καρκίνου του μαστού και ωοθηκών σε ηλικίες μικρότερες από 35-40 έτη σε ποσοστά 45% 60% και 20% 40% αντίστοιχα, ενώ γυναίκες με μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA2 εμφανίζουν 25% 40% και 10% 20% πιθανότητες για ανάπτυξη καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών αντίστοιχα. Αν και μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA1 είναι περισσότερο σπάνιες σε σποραδικό 172
καρκίνο, η απώλεια της ενδοκυτταρικής τοπολογίας σε αυτές τις περιπτώσεις είναι ιδιαίτερα σημαντική. 'Ενας μεγάλος αριθμός μεταλλάξεων που σχετίζονται με την καρκινική ανάπτυξη εντοπίζονται στο καρβοξυτελικό άκρο της BRCA1 και ορισμένες από αυτές δύναται να προκαλούν απώλεια της λειτουργικής και δομικής ακεραιότητας, καθώς και της ενδοκυτταρικής τοπολογίας. H δομική και λειτουργική ομοιόσταση του καρβοξυτελικού άκρου BRCA1- BRCT είναι καθοριστική για την αλληλεπίδραση με φωσφοπρωτεΐνες όπως οι ACCA, DNA ελικάση BACH1 και τη CtIP (CtBP-interacting protein). Οι αλληλεπιδράσεις με τις πρωτεΐνες BACH1 και CtIP παίζουν σημαντικό ρόλο στο έλεγχο της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου τη φάση G2/M. H μεταβολή στην ενδοκυτταρική τοπολογία των μεταλλαγμένων μορφών της BRCA1 συνδέεται άμεσα με την επίδραση των μεταλλάξεων στην φυσιολογική δομή του καρβοξυτελικού άκρου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίσαμε την επίδραση συγκεκριμένων μεταλλάξεων της BRCA1-BRCT (οι οποίες σχετίζονται με την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού) στην δευτεροταγή δομή, τη θερμοδυναμική και λειτουργική σταθερότητα (ικανότητα αλληλεπίδρασης με τα πεπτίδια pbach1, pctip) του καρβοξυτελικού άκρου, με την χρήση των τεχνικών του κυκλικού δυχρωϊσμού (CD), της μικροθερμιδομετρίας διαφορικής σάρωσης (DSC) και θερμιδομετρίας ισόθερμης τιτλοδότησης (ITC). Τα μεταλλαγμένα καρβοξυτελικά άκρα M1652I, V1696L, M1775K, M1783T, V1809F και P1812A μελετήθηκαν με τις συνθήκες οι οποίες προσδιορίστηκαν για την κανονικού τύπου πρωτεΐνη BRCT-wt. H μονομερής μορφή των απομονωμένων πεπτιδων προσδιορίστηκε με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. H σύγκριση των θερμοδυναμικών αποτελεσμάτων M1775K, V1809F δείχνουν την επίδραση στην σταθερότητα σε σύγκριση με το BRCT-wt, με την (ΔΗ)cal να εμφανίζεται αρκετά χαμηλότερη και η Tm μειωμένη κατά 6 o C, ενώ επίσης και η Μ1783Τ επηρεάζει την θερμική σταθερότητα του καρβοξυτελικού άκρου. Για τις μεταλλάξεις V1696L και M1652I η θερμοκρασία αποδιάταξης εμφανίζεται όμοια με τη φυσικού τύπου BRCT ενώ η συνολική ενέργεια σημαντικά μειωμένη. 173
Αντίθετα η επίδραση της P1812A είναι περιορισμένη σε σχέση με τις υπόλοιπες μεταλλάξεις. Επιπρόσθετα, από την θερμοδυναμική ανάλυση των αλληλεπιδράσεων του φυσικού τύπου και των μεταλλαγμένων BRCA1-BRCT συμπεραίνουμε: (α) την σύνδεση του BRCT-wt με τα πεπτίδια pbach1 και pctip, (β) την απώλεια αλληλεπίδρασης των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών, (γ) οι μεταλλάξεις M1783T, P1812A συνδέονται και με τα δύο πεπτίδια, (δ) η μετάλλαξη V1696L συνδέεται μόνο με το pbach1, (ε) οι μεταλλάξεις M1652I, M1775K, V1809F εμφανίζουν απώλεια της αλληλεπίδρασης με τα δύο πεπτίδια, στ) το φυσικού τύπου καρβοξυτελικό άκρο συνδέεται ισχυρότερα με το pbach1 σε σύγκριση με το pctip. H δευτεροταγής δομή όλων των μεταλλαγμένων τμημάτων, όπως προσδιορίστηκε με την χρήση της τεχνικής κυκλικού διχρωϊσμού, δεν εμφανίζει διαφοροποίηση σε σύγκριση με αυτή του φυσικού τύπου. Στην προσπάθεια μας να προσδιορίσουμε αν και σε πιο βαθμό μεταλλάξεις στην περιοχή BRCT επηρεάζουν την ενδοκυτταρική τοπολογία της BRCA1, κατασκευάσαμε μεταλλαγμένες πρωτεΐνες ΒRCA1 συζευγμένες με GFP. Σε in vivo πειράματα σε κυτταρική σειρά MCF7, παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή στην ενδοκυτταρική τοπολογία της ΒRCA1 και στον ενδοκυτταρικό συνεντοπισμό σε σύγκριση με τις πρωτεΐνες p53, Rad51. Τα πειραματικά δεδομένα την παρούσα διατριβή δύναται να καθορίσουν πως η θέση των επιλεγμένων μεταλλάξεων προκαλεί δομικές και λειτουργικές συνέπειες στην ικανότητα αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης BRCA1. Συμπερασματικά οι διαφοροποιήσεις στην θερμοδυναμική σταθερότητα και στην ικανότητα αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμένων καρβοξυτελικών άκρων αποκαλύπτουν τις αλλαγές στην λειτουργικότητα της πρωτεΐνης, την ενδοκυτταρική τοπολογία και εν δυνάμει την συμμετοχή των συγκεκριμένων μεταλλάξεων στην ανάπτυξη του καρκίνου μαστού και ωοθηκών. 174