IMMUNORADIOMETRIC ASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF FREE PROSTATE-SPECIFIC ANTIGEN (PSA) IN HUMAN SERUM AND PLASMA

DiaSorin S.p.A. Strada per Crescentino 134 Saluggia (Vercelli) Italy Tel. 39.161.487.93 Fax 39.161.487.628 Free PSA IRMA R15 IMMUNORADIOMETRIC ASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF FREE PROSTATESPECIFIC ANTIGEN (PSA) IN HUMAN SERUM AND PLASMA 1. PRINCIPLE OF THE ASSAY The determination of prostate specific antigen (PSA) is a "sandwich" type assay. In the kit, mouse monoclonal antibodies directed against two different epitopes of PSA and hence not competing are used. The samples, the controls and standards are incubated in monoclonal antibodycoated tubes with the second 125 Ilabelled antibody, specific for free PSA. After incubation, the contents of tubes is aspirated and the tubes are rinsed so as to remove unbound 125 Ilabeled antibody. The bound radioactivity is then determined in a gamma counter. The free PSA concentrations in the samples are obtained by interpolation from the standard curve. The concentration of free PSA in the samples is directly proportional to the radioactivity. 2. REAGENTS PROVIDED All reagents of the kit are stable until the expiry date indicated on the kit label, if stored at 28 C. Storage conditions for reagents after reconstitution or dilution are indicated in paragraph Assay Procedure. 2.1. AntiPSA monoclonal antibodycoated tubes: 5 tubes (readytouse). Each tube must be used only once. 2.2. 125 Ilabelled monoclonal antipsa antibody: one 5.5 ml vial (readytouse) The vial contains less than 275 kbq (at the date of manufacture) of 125 Ilabelled antibody in buffer containing bovine serum albumin, sodium azide (<.1%, see Precautions) and a dye. 2.3. Standards: five 1 ml vials and one 2 ml vial with zero standard (readytouse) The vials contain from to 3 ng/ml of human free PSA in buffer with bovine serum albumin and sodium azide (<.1%, see Precautions). The exact concentration is indicated on each vial label. 2.4. Control sera: two vials (lyophilized) The vials contain human free PSA lyophilized in bovine serum and sodium azide (<.1%, see Precautions). The volume for reconstitution is indicated on the vial label, the concentration range after reconstitution is given on a supplement. 2.5. Wash solution (5x): one 1 ml vial Concentrated solution has to be diluted before use. Note: Temperatures and expiry dates printed on component vial labels apply to the longterm storage by manufacturer only, prior to assembling of the kit. Do not take into account. 3. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED In addition to standard laboratory equipment, the following items are required: precision micropipets (2 µl). semiautomatic pipets (1 µl, 2 ml). vortextype mixer. horizontal or orbital shaker. aspiration system. gamma counter set for 125 I. 4. PRECAUTIONS 4.1. General remarks Bring all reagents to room temperature before pipeting. Do not mix the reagents from kits of different lots. A standard curve must be included with each assay. The correct setting of the shaker is very important for the reproducibility of the assay. It is recommended to perform the assay in duplicate. 4.2. Basic rules of radiation safety The purchase, possession, utilization, and transfer of radioactive material is subject to the regulations of the country of use. Adherence to the basic rules of radiation safety should provide adequate protection: No eating, drinking, smoking or application of cosmetics should be carried out in the presence of radioactive materials. No pipeting of radioactive solutions by mouth. Avoid all contact with radioactive materials by using gloves and laboratory overalls. All manipulation of radioactive substances should be done in an appropriate place, distant from corridors and other busy places. Radioactive materials should be stored in the container provided in a designated area. A record of receipt and storage of all radioactive products should be kept up to date. Laboratory equipment and glassware which are subject to contamination should be segregated to prevent crosscontamination of different radioisotopes. Each case of radioactive contamination or loss of radioactive material should be resolved according to established procedures. Radioactive waste should be handled according to the rules established in the country of use. 4.3. Sodium azide Some reagents contain sodium azide as a preservative. Sodium azide can react with lead, copper or brass to form explosive metal azides. Dispose of the reagents by flushing with large amounts of water through the plumbing system. 4.4. Human serum The materials of human origin, contained in this kit, were found negative for the presence of antibodies to HIV1 and HIV2, antibodies to HCV, as well as of Hepatitis B surface antigen (HBsAg). However, they should be handled as if capable of transmitting disease. No known test method can offer total assurance that no virus is present. Handle this kit with all necessary precautions. All serum and plasma samples should be handled as if capable of transmitting hepatitis or AIDS and waste should be discarded according to the country rules. 5. SPECIMEN COLLECTION, PROCESSING AND STORAGE Collect blood in tubes either not containing any additive or containing heparin, EDTA or sodium citrate. Separate serum or plasma from cells by centrifugation. Serum and plasma samples may be stored at 28 C, if the assay is to be performed within 24 hours. For longer storage keep frozen (at < 18 C) after aliquoting so as to avoid repeated freezing and thawing. Thawing of sample must be performed at room temperature. The samples need not to be diluted, as it is recommended to analyse samples containing concentrations of total PSA up to 2 ng/ml. 1

6. ASSAY PROCEDURE 6.1. Preparation and storage of reagents Bring all the reagents to room temperature. 6.1.1. Reconstitution of control sera The contents of the vials is reconstituted with the volume of distilled water indicated on the vial label. Wait at least 1 minutes and mix gently to avoid foaming before dispensing. Store the reconstituted solutions frozen at < 18 C until the expiry date of the kit. 6.1.2. Preparation of the wash solution Pour the contents of the vial into 5 ml of distilled water and homogenize. The diluted solution may be stored at 28 C until the expiry date of the kit. 6.2. Assay procedure Step 1 Additions * To antibody coated tubes add successively: 2 µl of standard, control or sample and 1 µl of tracer Mix Step 2 Incubation Incubate for 2 hours at 1825 C with shaking (> 28 rpm) Step 3 Counting Aspirate carefully the contents of tubes (except the 2 tubes «total cpm») Wash twice with 2 ml of wash solution and aspirate Count bound cpm (B) and total cpm (T) for 1 min * Add 1 µl of tracer to 2 additional tubes to obtain total cpm. 7. RESULTS Results are obtained from the standard curve by interpolation. The curve serves for the determination of free PSA concentrations in samples measured at the same time as the standards. 7.1. Standard curve The results in the package insert were calculated using a loglog curve fit ("spline" mode) with determined radioactivity (cpm std cpm std ) on vertical axis and the free PSA concentration of the standards on the horizontal axis (ng/ml). Other data reduction methods may give slightly different results. Total activity: 239264 cpm Standards Free PSA cpm cpm (n=3) B/T (%) std (ng/ml) cpm std 1 2 3 4 5.3 1. 3. 1. 3. 3 1598 4437 1235 39754 1291.13.67 1.85 5.16 16.6 43. 1298 4137 125 39454 1261 Example of standard curve, do not use for calculation. 7.2. Samples For each sample or control, locate the (cpm sample cpm std ) value on the vertical axis and read off the corresponding free PSA concentration in ng/ml on the horizontal axis. 8. QUALITY CONTROL Good laboratory practices imply that control samples must be used regularly to ensure the quality of the results obtained. These samples must be processed exactly the same way as the assay samples, and it is recommended to analyse their results using appropriate statistical methods. 9. EXPECTED VALUES It is suggested that each laboratory establishes its own range of values to distinguish benign and malignant prostate disease, on the basis of the number of clinically characterized samples. Results should be interpreted in the light of the total clinical presentation of the patient, including clinical history, data from additional tests and other appropriate information. We recommend choosing samples in which the total PSA concentration falls in the range from 4 to 2 ng/ml. Samples showing the ratio of FPSA/TPSA lower than.15 to.2 indicate higher probability of the presence of carcinoma. In those cases it is recommended to support the diagnosis by other examinations (ultrasonography, biopsy etc.). 1. PERFORMANCE CHARACTERISTICS for more details, see the data sheet APPENDIX 1.1. Analytical sensitivity:.2 ng PSA/mL. 1.2. Specificity The antibodies used in this kit do not crossreact with human CEA, AFP, prolactin, hcg and PAP. The crossreactivity with PSAα 1 antichymotrypsin complex was determined to be less than 1%. 1.3. Precision 1.3.1. Intraassay Serum samples were assayed in 1 replicates in the same series. The coefficients of variation were found below or equal to 4.1%. 1.3.2. Interassay Serum samples were assayed in duplicate in 9 different series. Coefficients of variation were found below or equal to 5.8%. 1.4. Accuracy 1.4.1. Dilution test Three serum samples were diluted with the zero standard and assayed. The recovery percentages obtained were between 86% and 116%. 2

DiaSorin S.p.A. Strada per Crescentino 134 Saluggia (Vercelli) Italy Tel. 39.161.487.93 Fax 39.161.487.628 PSA libre IRMA R15 TROUSSE IMMUNORADIOMETRIQUE POUR LE DOSAGE QUANTITATIVE DE L ANTIGENE PROSTATIQUE SPECIFIQUE (PSA) LIBRE DANS LE SERUM ET LE PLASMA HUMAIN 1. PRINCIPE DU DOSAGE Le dosage de l antigène prostatique spécifique (PSA) est un dosage de type "sandwich". La trousse utilise des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre deux épitopes différents du PSA. Les échantillons, les contrôles et les standards sont incubés dans des tubes recouverts d anticorps monoclonal en présence du deuxième anticorps, marqué à l iode 125, spécifique du PSA libre. Après incubation, le contenu des tubes est aspiré et les tubes sont rincés afin d éliminer l anticorps marqué non lié. La radioactivité liée est alors mesurée dans un compteur gamma. Les concentrations de PSA libre dans les échantillons sont obtenues par interpolation à l aide de la courbe standard. La concentration en PSA libre dans les échantillons est directement proportionnelle à la radioactivité. 2. REACTIFS FOURNIS Tous les réactifs de la trousse conservés à 28 C sont stables jusqu à la date de péremption mentionnée sur la trousse. Les conditions de conservation des réactifs après reconstitution ou dilution sont indiquées dans le paragraphe Mode Opératoire. 2.1. Tubes revêtus d anticorps monoclonal antipsa: 5 tubes (prêts à l emploi). Chaque tube ne doit être utilisé qu une seule fois. 2.2. Anticorps monoclonal antipsa marqué à l iode 125: un flacon de 5,5 ml (prêt à l emploi) Le flacon contient en début de lot 275 kbq d anticorps marqué à l iode 125 dans un tampon contenant de l albumine sérique bovine, de l azide de sodium (<,1%, voir Précautions) et un colorant. 2.3. Standards: 5 flacons de 1 ml et un flacon de 2 ml de standard zéro (prêts à l emploi) Les flacons contiennent de à 3 ng/ml de PSA libre humain dans du tampon en présence d albumine sérique bovine et d azide de sodium (<,1%, voir Précautions). La concentration exacte est indiquée sur l étiquette de chaque flacon. 2.4. Sérums de contrôle: 2 flacons (lyophilisés) Les flacons contiennent du PSA libre humain lyophilisé dans du sérum bovin et de l azide de sodium (<,1%, voir Précautions). Le volume de reconstitution est indiqué sur l étiquette du flacon, la fourchette de concentration après la reconstitution est donnée dans un supplément. 2.5. Solution de lavage (5x): un flacon de 1 ml Diluer la solution concentrée avant utilisation. Remarque: Les températures et dates d'expiration imprimées sur les étiquettes des flacons concernent uniquement le stockage à long terme des réactifs par le fabricant, avant l'assemblage de la trousse. Ne pas en tenir compte. 3. MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI En plus de l'équipement de laboratoire habituel, il est nécessaire d'utiliser le matériel suivant: micropipettes de précision (2 µl). pipettes semiautomatiques (1 µl, 2 ml). mélangeur de type Vortex. agitateur à mouvement de va et vient horizontal ou à plateau oscillant. système d aspiration. 3 compteur gamma calibré pour l iode 125. 4. PRECAUTIONS 4.1. Précautions générales Equilibrer les réactifs à température ambiante avant utilisation. Ne pas mélanger des réactifs de lots différents. Effectuer simultanément la courbe standard et le dosage des échantillons. Le bon réglage de l agitateur est une condition importante pour la reproductibilité du dosage. Il est recommandé de réaliser les dosages en doublets. 4.2. Protection contre les rayonnements ionisants L achat, la possession, l utilisation et l échange de matières radioactives sont soumis aux réglementations en vigueur dans le pays de l utilisateur. L application des règles de base de protection contre les rayonnements ionisants assure une protection adéquate. Ne pas manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer de cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche. Eviter le contact direct avec tout produit radioactif en utilisant des blouses et des gants de protection. Toute manipulation de matières radioactives se fera dans un local approprié, éloigné de tout passage. Les produits radioactifs seront stockés dans leur conditionnement d'origine dans un local approprié. Un cahier de réception et de stockage de produits radioactifs sera tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la verrerie qui ont été contaminés doivent être éliminés au fur et à mesure afin d éviter une contamination croisée de plusieurs isotopes. Chaque cas de contamination ou perte de substance radioactive devra être résolu selon les procédures établies. Toute mise aux déchets de matière radioactive se fera en accord avec les règlements en vigueur. 4.3. Azide de sodium Certains réactifs contiennent de l azide de sodium comme agent conservateur. L azide de sodium peut réagir avec le plomb, le cuivre et le laiton, et former des azides métalliques explosifs. Lors du rejet de telles solutions à l évier, laisser couler un volume important d eau dans les canalisations. 4.4. Sérum humain Les produits d origine humaine contenus dans les réactifs de cette trousse ont subi un dépistage négatif, concernant les anticorps antivih1, et VIH2, les anticorps VHC, et l antigène de surface HBs, mais doivent cependant être manipulés comme des produits infectieux. En effet, aucune méthode connue ne peut assurer l absence complète de virus, c est pourquoi il est nécessaire de prendre des précautions lors de leur manipulation. Tous les échantillons de sérum ou de plasma doivent être manipulés comme étant susceptibles de contenir les virus de l hépatite ou du SIDA et les déchets doivent éliminés selon les réglementations nationales en vigueur.

5. PRELEVEMENT, PREPARATION ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS Recueillir le sang dans des tubes sec ou contenant de l héparine, de l EDTA ou du citrate de sodium. Séparer le sérum ou le plasma des cellules par centrifugation. Les échantillons sériques ou plasmatiques peuvent être conservés à 28 C si le dosage est réalisé dans les 24 heures. Pour des périodes plus longues, il est préférable de les conserver congelés, de préférence aliquotés (à < 18 C). La décongélation de l échantillon peut être réalisée à température ambiante. Comme il est recommandé d analyser des échantillons contenant des concentrations de PSA total jusqu à 2 ng/ml, il n est pas nécessaire de diluer les échantillons. 6. MODE OPERATOIRE 6.1. Préparation et conservation des réactifs Equilibrer les réactifs à température ambiante. 6.1.1. Reconstitution des sérums de contrôle Le contenu des flacons est reconstitué avec le volume d eau distillée indiqué sur l étiquette du flacon. Attendre au moins 1 minutes et agiter doucement en évitant la formation de mousse avant de répartir dans les tubes. Conserver les solutions reconstituées à une température inférieure à 18 C jusqu à la date de péremption de la trousse. 6.1.2. Preparation de la solution de lavage Verser le contenu du flacon dans 5 ml d eau distillée et homogénéiser. La solution diluée peut être conservée à 28 C jusqu à la date de péremption de la trousse. 6.2. Mode opératoire du dosage Etape 1 Répartition * Dans les tubes recouverts d anticorps distribuer successivement: 2 µl de standard, de contrôle ou d échantillon et Etape 2 Incubation Incuber 2 heures à 1825 C avec agitation (> 28 rpm) Etape 3 Comptage Aspirer soigneusement le contenu de chaque tube (sauf les 2 tubes «cpm totaux») Laver 2 fois avec 2 ml de solution de lavage et aspirer 1 µl de traceur Compter les cpm liés (B) et Agiter cpm totaux (T) pendant 1 minute * Ajouter 1 µl de traceur dans 2 tubes supplémentaires pour obtenir les cpm totaux. 7. RESULTATS Les résultats sont déduits de la courbe standard par interpolation. La courbe sert à déterminer les taux de PSA libre des échantillons dosés en même temps que les standards. 7.1. Courbe standard Les résultats présentés dans cette notice ont été calculés en employant un mode de tracé loglog (mode "spline") avec en ordonnée la radioactivité mesurée (cpm std cpm std ) et en abscisse la concentration en PSA libre des standards (ng/ml). L utilisation d un autre mode de calcul peut conduire à des résultats légèrement différents. Activité totale: 239264 cpm Standards PSA libre (ng/ml) cpm (n=3) B/T (%) 3,13 1,3 1598,67 2 1, 4437 1,85 3 3, 1235 5,16 4 1, 39754 16,6 5 3, 1291 43, cpm std cpm std 1298 4137 125 39454 1261 Exemple de courbe standard, ne pas utiliser pour les calculs. 7.2. Echantillons Pour chaque échantillon ou contrôle, repérer la valeur (cpm échant cpm std ) sur l axe vertical, puis le point correspondant de la courbe standard sur l axe horizontal et en déduire par lecture la concentration en ng/ml de PSA libre. 8. CONTROLE DE QUALITE Les bonnes pratiques de laboratoire impliquent que des échantillons de contrôle soient utilisés dans chaque série de dosage pour s assurer de la qualité des résultats obtenus. Ces échantillons devront être traités de la même façon que les prélèvements à doser et il est recommandé d en analyser les résultats à l aide de méthodes statistiques appropriées. 9. VALEURS ATTENDUES Il est conseillé à chaque laboratoire d établir sa propre fourchette de valeurs pour faire la distinction entre une pathologie de la prostate bénigne ou maligne, en se basant sur un nombre suffisant d échantillons cliniques avérés. Les résultats doivent être interprétés à la lumière du tableau clinique complet du patient, incluant notament l'historique clinique et les résultats de tout autre test ou information relevante. Nous recommandons de choisir des échantillons dans lesquels la concentration en PSA total est comprise entre 4 et 2 ng/ml. Des échantillons présentant un rapport PSAL/PSAT inférieur à,15 et,2 indique une plus forte probabilité de présence de carcinome. Dans ce cas il est recommandé de compléter le diagnostic par un autre examen (ultrasonographie, biopsie, etc.). 1. CARACTERISTIQUES DU DOSAGE voir la feuille APPENDIX pour plus de détails 1.1. Sensibilité analytique:,2 ng/ml. 1.2. Spécificité Il n existe pas de réactivité croisée significative avec l'ace, l'afp, la prolactine, l'hcg et la PAP humains. La réactivité croisée obtenue avec le complexe PSAα 1 antichymotrypsine est inférieure à 1%. 1.3. Précision 1.3.1. Intraessai Des échantillons sériques ont été dosés 1 fois dans une même série. Les coefficients de variation obtenus sont inférieurs ou égaux à 4,1%. 1.3.2. Interessai Des échantillons sériques ont été dosés dans 9 séries différentes en doublets. Les coefficients de variation obtenus sont inférieurs ou égaux à 5,8%. 1.4. Exactitude 1.4.1. Epreuve de dilution Trois échantillons sériques ont été dilués dans le standard zéro et dosés. Les pourcentages de recouvrement s échelonnent entre 86% et 116%. 4

DiaSorin S.p.A. Strada per Crescentino 134 Saluggia (Vercelli) Italy Tel. 39.161.487.93 Fax 39.161.487.628 Freies PSA IRMA R15 RADIOIMMUNASSAY FÜR DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON DEM FREIEN PROSTATASPEZIFISCHEN ANTIGEN (PSA) IN HUMANSERUM UND PLASMA 1. TESTPRINZIP Der Radioimmunassay für die Bestimmung des Prostataspezifischen Antigens (PSA) basiert auf dem typischen Sandwichprinzip. Der Kit verwendet monoklonale Mausantikörper, wobei es sich um zwei nicht gegeneinander konkurrierende Epitope des PSA handelt. Die Proben bzw. Standards werden mit einem an der Röhrchenwand immobilisierten Antikörper inkubiert, in Anwesenheit des zweiten monoklonalen freiespsaspezifischen, 125 Jmarkierten Antikörpers. Nach der Inkubation wird die Flüssigkeit abgesaugt, und die Röhrchen gewaschen, um die ungebundenen 125 Jmarkierten Antikörper zu entfernen. Die gebundene Radioaktivität wird in einem GammaCounter gemessen. Die Konzentrationen des freien PSA werden mittels Interpolation aus der Standardkurve bestimmt und sind direkt proportional zur gebundenen Radioaktivität. 2. REAGENZIEN Die Reagenzien sind bis zum Verfallsdatum stabil, wenn sie bei 2 8 C gelagert werden. Lagerungskonditionen der Reagenzien nach der Wiederherstellung oder Verdünnung werden im Paragraphen Testdurchführung erläutert. 2.1. Röhrchen mit antipsa Antikörpern beschichtet: 5 Röhrchen (gebrauchsfertig). Jedes Röhrchen darf nur einmal verwendet werden. 2.2. 125 Jmarkierte monoklonale antipsaantikörper Lösung: ein 5,5 ml Fläschchen (gebrauchsfertig) Das Fläschchen enthält 275 kbq (am Tag der Herstellung) des 125 Jmarkierten Immunglobulins in Puffer mit Rinderserumalbumin, Natriumazid (<,1%, siehe Warnungen und Sicherheitshinweise) und einem Farbstoff. 2.3. Standards: fünf 1 ml Fläschchen + ein 2 ml Nullstandard Fläschchen (gebrauchsfertig) Die Standardfläschchen enthalten zwischen und 3 ng/ml humanes freies PSA in Puffer mit Rinderserumalbumin und Natriumazid (<,1%, siehe Warnungen und Sicherheitshinweise). Die genaue Konzentration ist auf jedem Fläschchen angegeben. 2.4. Kontrollseren: zwei Fläschchen (lyophilisiert) Die Fläschchen enthalten lyophilisiertes humanes freies PSA, Rinderserumalbumin und Natriumazid (<,1%, siehe Warnungen und Sicherheitshinweise). Das Volumen für Auflösung ist auf dem Etikett angegeben. Der Konzentrationsbereich nach Auflösung ist auf dem Blatt der Qualitätskontrolle angegeben. 2.5. Waschlösung (5x): ein 1 ml Fläschchen Die konzentrierte Lösung muss vor Gebrauch verdünnt werden. Anmerkung: Auf die Fläschchen gedruckte Temperaturen und Verfallsdaten betreffen nur die Langzeitlagerung beim Hersteller, vor der Zusammensetzung des Kits. Bitte nicht beachten. 3. ERFORDERLICHE, ABER NICHT MITGELIEFERTE GERÄTE Zusätzlich zu der Standardlaborausstattung werden die folgenden Geräte benötigt: Präzisionspipetten (2 µl). Halbautomatische Pipetten (1 µl, 2 ml). VortexMixer. Horizontal oder Orbitalschüttler. Absaugsystem. 5 GammaCounter für 125 J. 4. WARNUNGEN UND SICHERHEITSHINWEISE 4.1. Allgemeinhinweise Die Reagenzien sollten vor dem Pipettieren Raumtemperatur haben. Reagenzien aus Kits von verschiedenen Chargen sollten nicht miteinander vermischt werden. Eine Standardkurve ist für jeden Assay notwendig. Die korrekte Einstellung des Schüttlers ist sehr wichtig für die Reproduzierbarkheit des Assays. Der Assay sollte als Doppelbestimmung durchgeführt werden. 4.2. Schutz vor radioaktiver Strahlung Annahme, Besitz und Verwendung, Lagerung, Transport und Beseitigung unterliegen den Vorschriften der Atomenergie bzw. der jeweiligen staatlichen Behörde. Die Einhaltung der Grundregeln beim Umgang mit Radioaktivität sollte eine ausreichende Sicherheit gewährleisten: In Räumen, in denen mit radioaktiven Materialien gearbeitet wird, sollte Essen, Trinken, Rauchen und Schminken vermieden werden. Keine Mundpipette verwenden. Direkter Kontakt mit radioaktiven Materialien sollte durch Tragen entsprechender Schutzkleidung (Laborkittel, Handschuhe) vermieden werden. Das Arbeiten mit radioaktiven Stoffen muss in dafür speziell gekennzeichneten Bereichen, die vom normalen Laborbetrieb abgetrennt sind, erfolgen. Radioaktive Materialien sollten in einem speziell gekennzeichneten Bereich gelagert werden. Ein Register der Eingänge und Lagerung aller radioaktiven Produkte sollte ständig aktualisiert werden. Kontaminierte Labor und Glasgeräte sollten isoliert werden, um eine Kreuzkontamination von verschiedenen Radioisotopen zu verhindern. Kontaminationen des Arbeitsplatzes müssen unverzüglich sorgfältig nach den üblichen Verfahren entfernt werden. Radioaktiver Abfall muss entsprechend den Richtlinien jedes Einsatzortes entsorgt werden. 4.3. Natriumazid Zur Vermeidung mikrobieller Kontamination enthalten einige Reagenzien Natriumazid. Natriumazid kann mit Blei, Kupfer oder Messing zu explosiven Metallaziden reagieren. Um dies zu vermeiden, sollte bei einer Entsorgung über Rohrleitungen mit viel Wasser nachgespült werden. 4.4. Humanserum Bestandteile menschlichen Ursprungs, die für diesen Kit verwendet wurden, sind auf HIV1 und HIV2 Antikörper, HCV Antikörper und Hepatitis B OberflächenAntigen (HBsAg) getestet und als nicht reaktiv befunden worden. Es ist so vorzugehen, als ob eine tatsächliche Ansteckungsgefahr bestehen würde. Keine Testmethode kann völlige Sicherheit bieten. Der Kit sollte mit allen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen behandelt werden. Alle Serum und Plasmaproben sollten als potentielle Überträger von Hepatitis und AIDS behandelt und Abfälle entsprechend den jeweiligen Länderbestimmungen entsorgt werden.

5. PROBENENTNAHME, BEHANDLUNG UND LAGERUNG Sammeln Sie das Blut in Röhrchen, die entweder keine Antikoagulanzien oder Heparin, EDTA oder Natriumzitrat enthalten. Trennen Sie die Zellen vom Serum oder Plasma durch Zentrifugation. Serum und Plasmaproben können bei 28 C gelagert werden, wenn der Assay innerhalb von 24 Std. durchgeführt wird. Für eine längere Lagerung sollten die Proben portioniert eingefroren werden (< 18 C), um wiederholtes Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. Auftauen sollte bei Raumtemperatur stattfinden. Proben sollten nicht verdünnt werden, da die Bestimmung von Proben mit totaler PSAKonzentration bis 2 ng/ml empfohlen ist. 6. TESTDURCHFÜHRUNG 6.1. Präparation der Reagenzien Die Reagenzien sollten Raumtemperatur haben. 6.1.1. Wiederaufnahme der Kontrollseren Der Inhalt der Fläschchen wird mit einem auf dem Etikett angegebenen Volumen destilliertem Wassers wiederaufgenommen. Eine Wartezeit von 1 Minuten und leichtes Mischen sollten jegliches Schäumen vor dem Verteilen vermeiden. Die wiederaufgenommenen Lösungen sollten bei < 18 C gelagert werden, bis zum Verfallsdatum des Kits. 6.1.2. Präparation der Waschlösung Den Inhalt des Fläschchens in 5 ml destilliertes Wasser schütten und homogenisieren. Die verdünnte Lösung ist bei 28 C bis zum Verfallsdatum haltbar. 6.2. Testdurchführung Schritt 1 Zugabe * Zugabe zu den mit Antikörpern beschichteten Röhrchen (in dieser Reihenfolge): 2 µl Standard, Kontrolle oder Probe und 1 µl Tracer Mischen Schritt 2 Inkubation 2 Stunden bei 1825 C unter Schütteln (> 28 U/m) inkubieren Schritt 3 Messung Vorsichtig den Inhalt der Röhrchen absaugen (außer den zwei Röhrchen für Totalaktivität) Zweimal mit 2 ml Waschlösung waschen und absaugen Gebundene cpm (B) und Totalaktivität (T) bestimmen (1 Min) * Fügen Sie 1 µl Tracer in 2 zusätzliche Röhrchen hinzu, um die Totalaktivität zu erhalten. 7. ERGEBNISSE Die Ergebnisse werden aus der Standardkurve mittels Interpolation ermittelt. Die Kurve kann für die Bestimmung der freien PSAKonzentration in den Proben dienen, die zur gleichen Zeit wie die Standardkurve gemessen wurden. 7.1. Standardkurve Die Ergebnisse in der Packungsbeilage wurden errechnet mittels einer loglog Kurvenanpassung ("spline" mode) aus der bestimmten Radioaktivität (cpm Std cpm ) auf der yachse und den PSA Konzentrationen der Standards auf der xachse (ng/ml). Andere DatenreduktionsMethoden können zu leicht abweichenden Ergebnissen führen. Totalaktivität: 239264 cpm Freies PSA cpm Standards cpm (n=3) B/T (%) Std 1 2 3 4 5 (ng/ml),3 1, 3, 1, 3, 3 1598 4437 1235 39754 1291,13,67 1,85 5,16 16,6 43, cpm 1298 4137 125 39454 1261 Beispiel einer Standardkurve, nicht zur Berechnung benutzen. 7.2. Proben Für jede Probe wird der (cpm Probe cpm )Wert auf der yachse bestimmt und die entsprechende freiespsakonzentration auf der xachse abgelesen. 8. QUALITÄTSKONTROLLE Zur Einhaltung der Laborgrundregeln sollten regelmäßig Kontrollproben benutzt werden, um die Qualität der Ergebnisse zu sichern. Diese Proben müssen in genau derselben Weise wie die Assay Proben getestet werden, und die Analyse der Ergebnisse sollte mit angemessenen statistischen Methoden stattfinden. 9. ERWARTETE WERTE Jedes Labor sollte seine eigenen Bezugswerte festlegen, um zwischen gutartigen und bösartigen ProstataKrankheiten zu unterscheiden, auf Grund einer ausreichenden Anzahl klinisch validierter Proben. Die erhaltenen Ergebnisse sind vor dem Hintergrund der gesamten klinischen Situation des Patienten unter Berücksichtigung seiner klinischen Vorgeschichte, den Ergebnissen anderer Testergebnisse sowie weiteren vorliegenden Informationen zu interpretieren. Wir empfehlen, Proben mit einem totalen PSAKonzentrationsbereich zwischen 4 und 2 ng/ml zu testen. Proben mit einem FPSA/TPSAVerhältnis niedriger als,15,2 zeigen mit hoher Wahrscheinlichkeit die Anwesenheit eines Karzinoms. In diesem Fall empfiehlt man eine weitere Untersuchung, um die Diagnose zu bestätigen (Ultrasonographie, Biopsie, usw.). 1. SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE für weitere Details, siehe die Beilage APPENDIX 1.1. Analytische Sensitivität:,2 ng PSA/mL. 1.2. Spezifität Die in diesem Immunassay verwendeten Antikörper zeigen keine Kreuzreaktionen mit HumanCEA, AFP, Prolaktin, hcg und PAP. Die Kreuzreaktion gegen PSAα 1 Antichymotrypsin Komplex war niedriger als 1%. 1.3. Präzision 1.3.1. IntraAssay Serumproben aus derselben Serie wurden 1mal getestet. Der Variationskoeffizient war jeweils niedriger oder gleich 4,1%. 1.3.2. InterAssay Serumproben aus 9 verschiedenen Serien wurden als Doppelbestimmungen getestet. Der Variationskoeffizient war jeweils niedriger oder gleich 5,8%. 1.4. Genauigkeit 1.4.1. Verdünnungstest Drei Serumproben wurden mit Nullstandard verdünnt und getestet. Die erhaltene Wiederfindung lag zwischen 86% und 116%. 6

DiaSorin S.p.A. Strada per Crescentino 134 Saluggia (Vercelli) Italy Tel. 39.161.487.93 Fax 39.161.487.628 PSA libero IRMA R15 KIT IMMUNORADIOMETRICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELL ANTIGENE PROSTATASPECIFICO (PSA) LIBERO IN SIERO E PLASMA UMANI 1. PRINCIPIO DEL METODO Il dosaggio dell antigene prostataspecifico (PSA) è un metodo immunoradiometrico tipo "sandwich". Nel kit sono utilizzati anticorpi monoclonali da topo, diretti contro due differenti epitopi del PSA e, quindi, non in competizione fra loro. Campioni, controlli e standard vengono incubati in provette sensibilizzate con il primo anticorpo monoclonale in presenza del secondo anticorpo monoclonale, marcato con 125 I, specifico per il PSA libero. Al termine dell incubazione le provette vengono aspirate per rimuovere l anticorpo marcato con 125 I non legato. La radioattività legata viene quindi misurata con un contatore gamma. Le concentrazioni di PSA libero nei campioni vengono ricavate per interpolazione dalla curva standard. La concentrazione di PSA libero nei campioni è direttamente proporzionale alla radioattività. 2. CONTENUTO DEL KIT I reattivi, conservati a 28 C, sono stabili fino alla data di scadenza riportata sul kit. Le modalità di conservazione dei reattivi dopo ricostituzione o diluizione sono riportate nel paragrafo Metodo del dosaggio. 2.1. Provette sensibilizzate con anticorpo monoclonale anti PSA: 5 provette (pronte per l uso). Ogni tubo va usato una volta sola. 2.2. Anticorpo monoclonale antipsa 125 I: un flacone (5,5 ml) (pronto per l uso) Il flacone contiene meno di 275 kbq, alla data di marcatura, di anticorpi marcati con 125 I in tampone con albumina sierica bovina, sodio azide (<,1%; vedi Precauzioni) e un colorante. 2.3. Standard: cinque flaconi (1 ml) e un flacone (2 ml) di standard zero (pronti per l uso) I flaconi contengono PSA libero umano in tampone con albumina sierica bovina e sodio azide (<,1%; vedi Precauzioni), a concenrazioni comprese tra e 3 ng/ml. L esatta concentrazione degli standard è riportata sulle etichette dei flaconi. 2.4. Sieri di controllo: due flaconi (liofilizzati) I flaconi contengono PSA libero umano liofilizzato in siero bovino e sodio azide (<,1%; vedi Precauzioni). Il volume di ricostituzione è indicato sull etichetta dei flaconi. L intervallo dei valori attesi dopo la ricostituzione è riportato sul foglio del controllo di qualità. 2.5. Soluzione di lavaggio (5x): un flacone (1 ml) Soluzione concentrata da diluire prima dell uso. Nota: Le temperature di conservazione e le date di scadenza riportate sulle etichette di ciascun flacone si riferiscono alla conservazione dei reattivi stabilita in produzione, prima del loro inserimento nel kit. Non tenerne conto. 3. MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO Oltre alla normale attrezzatura da laboratorio, è richiesto il materiale seguente: micropipette di precisione (2 µl). pipette semiautomatiche (1 µl, 2 ml). agitatore tipo Vortex. agitatore oscillante per provette. sistema di aspirazione. contatore gamma programmato per leggere 125 I. 4. PRECAUZIONI 4.1. Considerazioni generali Prima dell uso lasciar equilibrare i reattivi a temperatura ambiente. Non utilizzare reattivi di lotti diversi. Inserire la curva standard in ogni esperimento. Per ottenere una migliore riproducibilità è necessario programmare correttamente l agitatore oscillante. Eseguire il dosaggio in duplicato. 4.2. Norme di radioprotezione L acquisto, la detenzione, l utilizzo e il trasporto di materiale radioattivo sono soggetti a regolamentazione locale. Lo scrupoloso rispetto delle norme per l uso di sostanze radioattive fornisce una protezione adeguata agli utilizzatori: Nei luoghi dove si usano sostanze radioattive non è consentito consumare cibi o bevande, fumare o usare cosmetici. Non pipettare materiale radioattivo con pipette a bocca. Usare sempre guanti e camici da laboratorio quando si manipola materiale radioattivo. Le sostanze radioattive devono essere conservate in propri contenitori in appositi locali che devono essere interdetti alle persone non autorizzate. Deve essere tenuto un registro di carico e scarico del materiale radioattivo. Il materiale di laboratorio e la vetreria devono essere dedicati all uso di isotopi specifici per evitare crosscontaminazioni. In caso di contaminazione o dispersione di materiale radioattivo, fare riferimento alle norme locali di radioprotezione. I rifiuti radioattivi devono essere smaltiti secondo le norme locali di radioprotezione. 4.3. Sodio azide Alcuni reattivi contengono sodio azide come conservante, che può reagire con piombo, rame o ottone presenti nelle tubature di scarico per formare metalloazidi esplosive. Smaltire questi reattivi facendo scorrere abbondante acqua negli scarichi. 4.4. Siero umano Alcuni reattivi presenti nel kit sono di origine umana e si sono rivelati negativi per antihiv1 e HIV2, antihcv e antigene di superficie del virus dell epatite B (HBsAg). Questi reattivi devono essere manipolati come in grado di trasmettere malattie infettive. Non sono disponibili metodi in grado di offrire la certezza assoluta che questi o altri agenti infettivi siano assenti. Manipolare questi reattivi come potenziali fonti di infezioni. Manipolare tutti i campioni di sangue come potenziali fonti di infezioni (ad es. epatite o AIDS). I rifiuti devono essere smaltiti secondo le disposizioni legislative e la regolamentazione vigente in ciascun Paese. 5. RACCOLTA, MANIPOLAZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Raccogliere i campioni in provette senza anticoagulante o con eparina, EDTA o sodio citrato. Separare per centrifugazione il siero o il plasma dalla parte corpuscolata. I campioni di siero o di plasma possono essere conservati fino a 24 ore a 28 C o, suddivisi in aliquote, a 2 C o a temperature 7

inferiori per periodi più lunghi. Evitare ripetuti cicli di congelamentoscongelamento dei campioni. Lo scongelamento deve avvenire a temperatura ambiente. I campioni non devono essere diluiti, in quanto si raccomanda di analizzare campioni con concentrazioni di PSA totale fino a 2 ng/ml. 6. METODO DEL DOSAGGIO 6.1. Preparazione e conservazione dei reattivi Portare i reattivi a temperatura ambiente. 6.1.1. Ricostituzione dei sieri di controllo Ricostituire il contenuto dei flaconi con il volume di acqua distillata riportato sull etichetta di ciascun flacone. Lasciar riposare per almeno 1 minuti e mescolare con delicatezza per evitare la formazione di schiuma prima di pipettare. Conservare le soluzioni ricostituite a < 18 C fino alla scadenza del kit. 6.1.2. Preparazione della soluzione di lavaggio Diluire il contenuto del flacone con 5 ml di acqua distillata e agitare con cura. La soluzione diluita è stabile a 28 C fino alla data di scadenza del kit. 6.2. Schema del dosaggio Fase 1 Dispensazione * Aggiungere in successione alle provette sensibilizzate: 2 µl di standard, controlli o campioni 1 µl di marcato Fase 2 Incubazione Incubare 2 ore a 1825 C in agitazione (> 28 rpm) Fase 3 Conteggio Aspirare con cura il contenuto delle provette (eccetto le 2 provette per l attività totale) Lavare 2 volte con 2 ml di soluzione di lavaggio Agitare Contare la radioattività legata (B) e l attività totale (T) per un minuto * Aggiungere 1 µl di marcato a 2 provette non sensibilizzate per la determinazione dell attività totale. 7. RISULTATI Le concentrazioni di PSA vengono calcolate per interpolazione sulla curva standard. Campioni e controlli devono essere dosati insieme agli standard. 7.1. Curva standard I risultati contenuti nelle istruzioni sono stati calcolati utilizzando una curva logaritmicalogaritmica (modo "spline") con la radioattività determinata (cpm std cpm std ) sull asse verticale (asse delle ordinate) e la concentrazione di PSA libero degli standard sull asse orizzontale (asse delle ascisse) (ng/ml). Altri metodi di interpolazione dei risultati possono dare risultati leggermente diversi. Attività totale: 239264 cpm PSA libero cpm Standard cpm (n=3) B/T (%) std 1 2 3 4 5 (ng/ml),3 1, 3, 1, 3, 3 1598 4437 1235 39754 1291,13,67 1,85 5,16 16,6 43, cpm std 1298 4137 125 39454 1261 Esempio di curva standard. Non usare per calcolare il valore dei propri campioni. 7.2. Campioni Per ogni campione o controllo, riportare il valore (cpm camp cpm std ) sull asse delle ordinate e leggere le concentrazioni di PSA libero in ng/ml sull asse delle ascisse. 8. CONTROLLO DI QUALITÀ Si consiglia ad ogni laboratorio di dosare regolarmente sieri di controllo per verificare la qualità dei risultati ottenuti. Questi campioni devono essere manipolati esattamente come i campioni in esame; i risultati devono essere analizzati con metodi statistici appropriati. 9. VALORI ATTESI Ogni laboratorio deve stabilire i propri valori di riferimento per distinguere tra patologie prostatiche benigne e maligne, sulla base di un numero sufficientemente ampio di campioni clinicamente convalidati. I risultati devono essere valutati alla luce dei dati clinici del paziente inclusi la sua storia clinica, risultati di altri test e altre informazioni correlate. Si raccomanda di scegliere campioni in cui la concentrazione di PSA totale cade nell intervallo tra 4 e 2 ng/ml. I campioni che presentano un rapporto FPSA/TPSA inferiore a,15,2 indicano con elevata probabilità la presenza di carcinoma. In tali casi si raccomanda di convalidare la diagnosi con un ulteriore indagine (ultrasonografia, biopsia, ecc.). 1. CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO Ulteriori dati sono riportati in Appendice. 1.1. Sensibilità analitica:,2 ng PSA/mL. 1.2. Specificità Gli anticorpi utilizzati nel kit non presentano reazioni crociate con CEA, AFP, prolattina, hcg e PAP umani. La reazione crociata con il complesso PSAα 1 antichimotripsina è inferiore all 1%. 1.3. Precisione 1.3.1. Intrasaggio Alcuni campioni sono stati analizzati 1 volte in uno stesso esperimento; è stato trovato un coefficiente di variazione del 4,1% o inferiore. 1.3.2. Intersaggio Alcuni campioni sono stati analizzati in duplicato in 9 esperimenti differenti; è stato trovato un coefficiente di variazione del 5,8% o inferiore. 1.4. Accuratezza 1.4.1. Test di diluizione Tre campioni di siero sono stati diluiti con lo standard zero e analizzati. Le percentuali di recupero ottenute sono comprese tra 86% e 116%. 8

DiaSorin S.p.A. Strada per Crescentino 134 Saluggia (Vercelli) Italy Tel. 39.161.487.93 Fax 39.161.487.628 PSA libre IRMA R15 ANÁLISIS INMUNORADIOMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL ANTÍGENO LIBRE ESPECÍFICO DE LA PRÓSTATA (PSA) EN SUERO Y PLASMA HUMANOS 1. PRINCIPIO DEL ENSAYO La determinación del antígeno específico de la próstata (PSA) es un análisis de tipo sándwich. En el equipo, se utilizan dos anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra dos epitopes diferentes del PSA no competitivos entre sí. Los estándares, las muestras de suero o plasma y los controles se incuban en tubos recubiertos con el primer anticuerpo monoclonal en presencia del segundo anticuerpo monoclonal, específico para el PSA libre el cual está marcado con I 125. Después de la incubación se aspira el contenido de los tubos y estos se lavan para retirar el anticuerpo marcado con I 125 pero no enlazado. Se determina la actividad enlazada mediante un contador gamma. La concentración de PSA libre en las muestras se obtiene por interpolación a partir de una curva estándar y es directamente proporcional a la radiactividad medida. 2. REACTIVOS PROPORCIONADOS Todos los reactivos son estables entre 2 y 8 C hasta la fecha de caducidad del equipo indicada en las etiquetas. Las condiciones de almacenamiento de los reactivos después de la reconstitución o dilución se indican en el inciso Procedimiento del Análisis. 2.1. Tubos recubiertos con anticuerpo antipsa: 5 tubos (listos para su uso). Cada tubo debe estar utilizado solamente una vez. 2.2. Anticuerpo monoclonal antipsa marcado con 125 I: un frasco de 5,5 ml (listo para su uso) El frasco contiene < 275 kbq, en la fecha de fabricación, de inmunoglobulinas marcadas con I 125 en tampón con albúmina sérica bovina, azida de sodio (<,1%, véase el inciso sobre las precauciones), y un colorante. 2.3. Estándares: cinco frascos de 1 ml + un frasco de estándar cero de 2 ml (listos para su uso) Los frascos de los estándares contienen de a 3 ng/ml de PSA libre humano en albúmina sérica bovina y azida de sodio (<,1%, véase el inciso sobre las precauciones). La concentración exacta se indica en la etiqueta de los frascos. 2.4. Controles: dos frascos (liofilizados) Los frascos contienen PSA libre humano liofilizado en suero bovino y azida de sodio (<,1%, véase el inciso sobre las precauciones). El volumen para la reconstitución se indica en la etiqueta. La concentración después de la reconstitución se indica en la hoja suplemento. 2.5. Solución de lavado (5x ): un frasco de 1 ml La solución de lavado debe diluirse antes de su uso. Nota: La fecha de caducidad y la temperatura impresa en las etiquetas de los reactivos son válidas sólo para el fabricante, durante su almacenamiento a largo plazo hasta antes de ser ensamblados. No tomar en cuenta. 3. MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO Además del equipo normal de laboratorio se requiere lo siguiente: micropipetas de precisión (2 µl). pipetas semiautomáticas (1 µl, 2 ml). mezclador tipo vórtex. mezclador horizontal u orbital. sistema de aspiración. 9 contador gamma calibrado para I 125. 4. PRECAUCIONES 4.1. Generales Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. No mezclar los reactivos de lotes diferentes. Incluir una curva estándar en cada ensayo. La calibración correcta del agitador es muy importante para la reproducibilidad del análisis. Se recomienda realizar el ensayo por duplicado. 4.2. Seguridad radiológica La compra, posesión, uso y transferencia de material radiactivo están sujetos a las disposiciones legales del país en el que se utiliza. El cumplimiento de las normas básicas de seguridad radiológica proporciona protección adecuada. No se debe comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en presencia de materiales radiactivos. No pipetear las soluciones radiactivas con la boca. Evitar cualquier contacto con materiales radiactivos mediante el uso de guantes y bata de laboratorio. Toda manipulación de material radiactivo debe realizarse en el lugar adecuado, alejado de corredores y espacios ocupados. Los materiales radiactivos deben almacenarse en el contenedor aprobado en una zona especializada. Se debe llevar y conservar actualizado un registro de las entradas y almacenamiento de todos los productos radiactivos. El equipo y la vidriería de laboratorio que son objeto de contaminación se deben separar para evitar la contaminación con otros radioisótopos. Cada caso de contaminación radiactiva o de pérdida de materiales radiactivos se debe resolver de acuerdo con los procedimientos establecidos. El desecho radiactivo debe manipularse de acuerdo a las reglas establecidas por el país donde se utiliza. 4.3. Azida de sodio Algunos reactivos contienen azida de sodio como conservador. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo, el cobre y el bronce para formar azidas metálicas explosivas. Deseche los reactivos a través del sistema de drenaje mediante lavado con grandes cantidades de agua. 4.4. Suero humano Ciertos reactivos de este equipo son de origen humano y fueron negativos a las pruebas de HIV1, de HIV2, de HCV, así como de hepatitis B (HBs Ag). Sin embargo, deben manejarse como si fueran capaces de transmitir enfermedades. Ninguna prueba conocida puede ofrecer la seguridad completa de la ausencia de agentes virulentos. Maneje estos reactivos con todas las precauciones necesarias. Todas las muestras de sangre deben manejarse como si fueran capaces de transmitir enfermedades (por ej. hepatitis o SIDA). Por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país.

5. COLECCIÓN, PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Colectar la sangre en tubos secos o bien que contengan heparina, EDTA o citrato de sodio. Separar el suero o el plasma de las células mediante centrifugación. Si el análisis habrá de realizarse dentro de las 24 horas siguientes las muestras pueden almacenarse entre 2 y 8 C. Si se requiere almacenar las muestras durante un periodo mayor, preparar alícuotas para evitar repetidas descongelaciones y congelaciones y almacenar las muestras a < 18 C. La descongelación de las muestras debe realizarse a temperatura ambiente. Las muestras no deben ser diluidas. Se recomienda el análisis de muestras con concentraciones de PSA total hasta 2 ng/ml. 6. PROCEDIMIENTO DEL ANÁLISIS 6.1. Preparación de los reactivos Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente. 6.1.1. Reconstitución de los controles Reconstituir el contenido de los frascos con el volumen de agua destilada (4 C) señalado en la etiqueta. Después de la reconstitución, esperar 1 minutos y agitar vigorosamente evitando la formación de espuma antes de repartir la solución en los tubos. Almacenar las soluciones reconstituidas a < 18 C hasta la fecha de caducidad del equipo. 6.1.2. Preparación de la solución de lavado Diluir el contenido del frasco con 5 ml de agua destilada y homogenizar. El reactivo es estable entre 2 y 8 C hasta la fecha de caducidad del equipo. 6.2. Procedimiento del análisis PASO 1 ADICIONES* A LOS TUBOS RECUBIERTOS DE ANTICUERPO AGREGAR SUCESIVAMENTE: 2 µl DE ESTÁNDAR, CONTROL Y MUESTRA 1 µl DE TRAZADOR Mezclar PASO 2 INCUBACIÓN Incubar 2 horas a 1825 C con agitación (> 28 rpm) PASO 3 CONTEO ASPIRAR CUIDADOSAMENT E EL CONTENIDO DE LOS TUBOS (EXCEPTO EL DE DOS TUBOS CPM TOTAL ) LAVAR DOS VECES CON LA SOLUCIÓN DE LAVADO Y ASPIRAR Determinar las cpm incorporadas (B) y las cpm totales (T) por 1 min *Agregar 1 µl de trazador a 2 tubos adicionales para obtener las cpm totales. 7. RESULTADOS Los resultados se obtienen por interpolación de la curva estándar. La curva sirve para la determinación de las concentraciones del PSA libre en las muestras medidas al mismo tiempo que los estándares. 7.1. Curva estándar Los resultados que vienen en el equipo se calcularon usando una curva loglog (modo "spline") haciendo una interrelación de la radioactividad medida (cpm std cpm std ) en el eje vertical respecto a la concentración del PSA de los estándares en el eje horizontal (ng/ml). La utilización de otros métodos de cálculo puede dar resultados ligeramente diferentes. Actividad total: 239264 cpm Estándares PSA libre (ng/ml) cpm (n=3) B/T (%) 3,13 1,3 1598,67 2 1, 4437 1,85 3 3, 1235 5,16 4 1, 39754 16,6 5 3, 1291 43, cpm std cpm std 1298 4137 125 39454 1261 Ejemplo de curva estándar, no utilizar como modelo para realizar los cálculos. 7.2. Muestras Para cada muestra o control localizar en el eje vertical el valor (cpm muestra cpm std ), marcar sobre el eje horizontal la concentración correspondiente del PSA libre en ng/ml. 8. CONTROL DE CALIDAD La buena obtención de resultados implica que los controles sean usados en cada serie de experimentos para asegurar la calidad de los resultados obtenidos. Dichos controles deben ser procesados de la misma manera que las muestras a analizar. Es recomendado que los resultados sean analizados utilizando los métodos estadísticos apropiados. 9. VALORES ESPERADOS Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia para distinguir una enfermedad maligna o benigna de la próstata, en base a un numero suficiente de muestras probadas clinicamente. Los resultados deberan ser interpretados como una ayuda dentro de la situación clínica del paciente, incluyendo la historia clínica, asi como los datos provenientes de otros test adicionales. Recomendamos trabajar con muestras donde la concentración de PSA total se encuentre en un rango de 4 a 2 ng/ml. Una relación de FPSA/TPSA menor de,15 a,2 indica una gran posibilidad de presencia de carcinoma. En esos casos, se recomienda realizar una diagnosis por otros métodos de examinación (ultrasonido, biopsia, etc.). 1. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO DEL ANÁLISIS para mayores detalles véase la página: APÉNDICES 1.1. Sensibilidad analítica:,2 ng PSA/mL. 1.2. Especificidad Los anticuerpos utilizados en este equipo no presentan reactividad cruzada con CEA, AFP, prolactina, hcg y PAP humanos. La reactividad cruzada con el complejo PSAα 1 antiquimiotripsina fue menor de 1%. 1.3. Precisión 1.3.1. Intraanálisis Las muestras de suero se evaluaron en 1 duplicados en las mismas series. Los coeficientes de variación fueron iguales o por debajo de 4,1%. 1.3.2. Interanálisis Las muestras de suero se evaluaron en duplicado en 9 series diferentes. Los coeficientes de variación fueron iguales o por debajo de 5,8%. 1.4. Exactitud 1.4.1. Prueba de dilución Las muestras altamente concentradas se diluyeron en serie con el estándar cero. Los porcentajes recuperados fueron entre 86% y 116%. 1