Φασματοσκοπία Raman (Raman Spectroscopy) Πέτρος Α. Ταραντίλης

Φασματοσκοπία Raman (Raman Spectroscopy) Πέτρος Α. Ταραντίλης 1

Ιστορική αναδρομή Η φασματοσκοπία Raman έχει πάρει το όνομα της από τον Ινδό Sir Chandrasekhra Venkata Raman Sir Chandrasekhara Venkata Raman The Nobel Prize in Physics Calcutta University 1930 Calcutta, India "for his work on the scattering of b.1888 light and for the discovery of the d.1970 effect named after him" 2

Βασικές αρχές της Φασματοσκοπίας Raman Η φασματοσκοπία Raman στηρίζεται στο φαινόμενο σκέδασης μιας ακτίνας φωτός καθώς αλληλεπιδρά με την ύλη. Σκέδαση Rayleigh 3

Σκέδαση Raman Η σκέδαση Raman είναι ένα από τα φαινόμενα που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση ακτινοβολίας και ύλης. Όταν μια ακτίνα φωτός πέσει σε ένα δείγμα, ένα πολύ μικρό μέρος του, λιγότερο από 0,001%, σκεδάζεται απότοδείγματαμεαλλαγή της συχνότητας του σε μια συχνότητα διαφορετική από αυτήν της αρχικής ακτίνας. Αυτή η μετατόπιση της συχνότητας καλείται φαινόμενο Raman και η σκεδαζόμενη ακτινοβολία, ακτινοβολία Raman. 4

Βασικές αρχές Η φασματοσκοπία Raman στηρίζεται στο φαινόμενο της σκέδασης μιας ακτίνας φωτός όταν πέφτει επάνω σε ένα δείγμα, διεγείροντας τις δονήσεις χαρακτηριστικών ομάδων. Η φασματοσκοπία Raman είναι φασματοκοπία εκπομπής, κατά την οποία η αλληλεπίδραση μεταξύ φωτονίων και μορίων γίνεται σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα και οι ταινίες του φάσματος Raman αντιστοιχούν σε φωτόνια, τα οποία "σκεδάζονται" ανελαστικά από τα μόρια. 5

Βασικές αρχές ιάγραμμα ενεργειακών επιπέδων για τη σκέδαση Raman (a) Stokes σκέδαση Raman (b) anti-stokes σκέδαση Raman. 6

Βασικές αρχές Οι φασματικές γραμμές των οποίων η συχνότητα είναι μικρότερη της συχνότητας της προσπίπτουσας ακτινοβολίας και καλούνται Stokes οφείλονται στη σύγκρουση φωτονίων με τα μόρια που βρίσκονται στη θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση, Οι φασματικές γραμμές μεσυχνότητα μεγαλύτερη οι οποίες καλούνται anti- Stokes οφείλονται στη σύγκρουση φωτονίων με μόρια που βρίσκονται σε διεγερμένες ενεργειακές καταστάσεις. Στη δεύτερη περίπτωση η περίσσεια ενέργειας μεταφέρεται στα φωτόνια καθώς τα μόρια επανέρχονται στην αρχική θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση. 7

Βασικές αρχές Ερμηνεία του φαινομένου Raman Η ενέργεια ενός μορίου μπορεί να χωριστεί σε τρεις συνιστώσες: α) την περιστροφή του μορίου σαν σύνολο, β) τις δονήσεις των ατόμων που το αποτελούν και γ) την κίνηση των ηλεκτρονίων του. Η Ενέργεια της κίνηση η των ηλεκτρονίων > της δόνησης ης των πυρήνων > της μοριακής περιστροφής. 8

Βασικές αρχές Η επίδραση ενός ηλεκτρομαγνητικού πεδίου (π.χ. φως από laser) πάνω σε ένα μόριο έχει ως αποτέλεσμα την απορρόφηση ενέργειας από αυτό όταν διεγείρεται από το Ε* στο Ε** ενώ εκπέμπει ακτινοβολία στην αντίθετη περίπτωση Ε** στο Ε* Ε=Ε**-Ε*=hv Ε είναι η διαφορά ενέργειας μεταξύ δύο κβαντικών καταστάσεων του μορίου, h η σταθερά του Planck (h=6.62626262 x 10-34 J s) και ν η συχνότητα του προσπίπτοντος φωτός. Το φαινόμενο Raman είναι ένα κβαντικό φαινόμενο και η θεωρία που το περιγράφει πλήρως κάνει ευρύτατη χρήση εννοιών της κβαντικής θεωρίας. 9

Βασικές αρχές Ένα χημικό μόριο μέσα σε ένα στατικό ηλεκτρικό πεδίο υφίσταται ένα είδος ελαστικής στρέβλωσης του σχήματος της δομής του, με αποτέλεσμα οι θετικά φορτισμένοι πυρήνες να έλκονται προς τον αρνητικό πόλο του πεδίου και τα ηλεκτρόνια προς τον θετικό. Η μετατόπιση των κέντρων των φορτίων προκαλεί μια επαγωγική διπολική ροπή (induced electric dipole moment) και το μόριο λέγεται ότι είναι πολωμένο. Η τιμή του επαγόμενου δίπολου, μ, εξαρτάται από το μέγεθος του εφαρμοζόμενου πεδίου και από την ευκολία με την οποία το σχήμα του μορίου μπορεί να στρεβλωθεί: μ = α E α = είναι η σταθερά επιδεκτικότητας πόλωσης (polarizability) του μορίου (ή πολωσιμότητα) Ε = ενέργεια. π.χ. Η 2 10

Βασικές αρχές Ένα δονούμενο δίπολο εκπέμπει ακτινοβολία της δικιάς του συχνότητα δόνησης (Rayleigh). Εάν, επιπλέον, τομόριουπόκειταισεεσωτερικήκίνηση, όπως δόνηση ή περιστροφή, ρ που μεταβάλλει περιοδικά την πολικότητά του,, τότε το δονούμενο δίπολο θα προσθέσει πάνω στην κύρια δόνηση και τη 1. δονητική ή 2. περιστροφική του δόνηση. Το φάσμα Raman παράγεται όταν η μοριακή δόνηση ή περιστροφή ενός μορίου προκαλεί κάποια μεταβολή στην πολικότητά του. Οι μεταβολές πολικότητας είναι δύο ειδών: (α) ποσοτική και (β) μεταβολή της κατεύθυνσης του ελλειψοειδούς πολικότητας. Η διαφορά των φασμάτων Raman από τα φάσματα IR είναι ότι σε αυτά η μοριακή δόνηση ή περιστροφή παράγει αλλαγές του ηλεκτρικού δίπολου και όχι της πολικότητας. 11

Βασικές αρχές Παράδειγμα οι διάφορες μεταβολές του ελλειψοειδούς πολικότητας στο μόριο του νερού Τα φάσματα Raman είναι συνδυασμός από αμιγή περιστροφικά φάσματα Raman και αμιγή δονητικά φάσματα Raman. ιατομικά και μικρού μοριακού βάρους τριατομικά μόρια παρουσιάζουν περιστροφικά φάσματα Raman και οι φασματικές γραμμές μπορούν να καταγραφούν με μεγάλη διακριτική ικανότητα. Ομοπυρηνικά μόρια,, όπως το Ο2,, το Η2 κ.λπ,, δεν προσφέρονται για φασματοσκοπία IR, γιατί δεν παρουσιάζουν διπολική ροπή, ενώ παρουσιάζουν περιστροφική κίνηση Raman. Τα περιστροφικά φάσματα Raman αποκαλύπτουν δομικές λεπτομέρειες που θα ήταν αδύνατο να μελετηθούν με άλλες φασματοσκοπικές μεθόδους. 12

Βασικές αρχές Στην περίπτωση των δονήσεων Raman, υπάρχουν δύο γενικοί κανόνες: (α) οι συμμετρικές δονήσεις εμφανίζουν έντονες φασματικές γραμμές, ενώ οι μη συμμετρικές δίνουν συνήθως ασθενείς και ορισμένες φορές πολύ ασθενείς, και (β) τον κανόνα του αμοιβαίου αποκλεισμού (rule of mutual exclusion), εάν ένα μόριο έχει κέντρο συμμετρίας τότε οι δονήσεις του είναι ενεργές στο φάσμα Raman, ενώ είναι ανενεργές στο φάσμα ΙR, και εκείνες που είναι ενεργές στο IR είναι ανενεργές στο φάσμα Raman. Εάν το μόριο δεν έχει κέντρο συμμετρίας, τότε μερικές (αλλά όχι απαραίτητα όλες) οι δονήσεις μπορεί να είναι ενεργές στα φάσματα Raman και IR. 13

Βασικές αρχές Γενικά συμπεράσματα της ερμηνεία του φαινομένου: 1. Το προσπίπτον φως πολώνει τα μόρια επάγωντας ταλαντούμενα ηλεκτρικά δίπολα. Τα επιταχυνόμενα φορτία έχουν τη δυνατότητα να ακτινοβολούν. Η δευτερογενής ερογε αυτή ακτινοβολία α των διπόλων είναι η σκέδαση. 2. Ησκέδασητης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας προέρχεται από την αλληλεπίδραση η των φωτονίων με τοηλεκτρονιακό νέφος. 3. Η σκέδαση Raman αποδίδεται στην σύζευξη των κινήσεων των ηλεκτρονίων και των πυρήνων. 14

Βασικές αρχές Κύρια προϋπόθεση για να είναι μια δόνηση ενεργή κατά Raman είναι να έχουμε μεταβολή της πολωσιμότητας κατά τη δόνηση. Ο ρόλος της συμμετρίας των μορίων και των τρόπων δόνησής τους σημαντικός στον προσδιορισμό της ενεργότητας κατά Raman. Συμπέρασμα: Το φάσμα Raman παράγεται όταν η μοριακή δόνηση ή περιστροφή ενός μορίου προκαλεί κάποια μεταβολή στην πολωσιμότητά του, Το φάσμα IR παράγεται όταν η μοριακή δόνηση ή περιστροφή προκαλεί αλλαγές του ηλεκτρικού διπόλου (μεταβολή της διπολικής ροπής). 15

Βασικές αρχές Τα φάσματα Raman είναι συνδυασμός από: 1. περιστροφικά φάσματα και 2. δονητικά φάσματα, που μπορούν να καταγραφούν με ευαίσθητα όργανα. 16

Βασικές αρχές Τα φάσματα Raman είναι συνδυασμός από: 1. περιστροφικά φάσματα και 2. δονητικά φάσματα που μπορούν να καταγραφούν με ευαίσθητα όργανα. Τα περιστροφικά φάσματα Raman δίνουν δομικές πληροφορίες που θα ήταν αδύνατο να πάρουμε με άλλες φασματοσκοπικές μεθόδους. Π.Χ. για διατομικά και τριατομικά μόρια. Τα μόρια αυτά δεν προσφέρονται για φάσματα IR, γιατί δεν παρουσιάζουν διπολική ροπή. Tα δονητικά φάσματα Raman παρουσιάζουν τα εξής χαρακτηριστικά: α) Οι συμμετρικές δονήσεις εμφανίζουν έντονες φασματικές γραμμές, οι μη συμμετρικές δίνουν ασθενείς. β) Εάν ένα μόριοέχεικέντροσυμμετρίαςτότε οι δονήσεις του είναι ενεργές στο φάσμα Raman, ενώ είναι ανενεργές στο φάσμα IR και εκείνες που είναι ενεργές στο φάσμα IR είναι ανενεργές στο φάσμα Raman. 17

Βασικές αρχές η Raman Ένταση Σύγκριση φασμάτων IR και Raman για το βενζοϊκό οξύ. 18

Οργανολογία Φασματομέτρου Raman 1928: Sir Chandrasekhra Venkata Raman εξοπλισμός Πηγή: ήλιος Συλλέκτης: τηλεσκόπιο Ανιχνευτής: τα μάτια του. 1953: εμπoρικό Raman Πηγή: ηλεκτρικής εκκένωσης Καταγραφή των φασμάτων σε φωτογραφικά φιλμ. 1960: η ηλεκτρική εκκένωση αντικαταστάθηκε από laser στο Vis, near IR. 19

Οργανολογία Φασματομέτρου Raman Φασματόμετρα μ Raman Ανιχνευτής σύζευξης φορτίου - charge-coupled device (CCD) Πηγή Laser Φασματόμετρο ιασποράς Raman ιάφραγμα είγμα Ακίνητο κάτοπτρο Πηγή Laser Κινητό κάτοπτρο Φασματόμετρο FT-Raman ιαχωριστής δέσμης Συμβολόμετρο Michelson Ανιχνευτής είγμα

Οργανολογία Φασματομέτρου FT- Raman Πλεονέκτημα του λέιζερ που εκπέμπει στην περιοχή του εγγύς IR (near-ir) ως πηγή διέγερσης. Αυτή η πηγή περιορίζει ή εξαλείφει το πρόβλημα φθορισμού. Πλεονεκτήματα της τεχνικής μετασχηματισμού κατά Fourier (Fourier Transform, FT): 1. Η αύξηση της συνολικής απόδοση της ακτινοβολία. 2. Η ακριβής βαθμονόμηση (καλιμπράρισμα) των κυματαριθμών του οργάνου. 3. Η σταθερή διαχωριστική ικανότητα 4. Η δυνατότητα να καταγράφονται φάσματα υψηλής διαχωριστικής ικανότητας με επαναλαμβανόμενο τρόπο. 21

Οργανολογία Φασματομέτρου FT- Raman Τo φασματόμετρο μ FT-Raman του εργαστηρίου μας 1. Πηγή ακτινοβολίας Laser: ιόντα νεοδυμίου και πυριτικά άλατα υττρίουαργιλίου (Nd +3 /YAG). Εκπομπή στα 2 3 1 1064 nm 2. Συμβολόμετρο Michelson: όπως στο FT-IR με διαχωριστή δέσμης CaF 2 3. Laser HeNe 4. Ανιχνευτής: ινδίου γαλλίου - 4 αρσενικού (Indium Galliumm - Arsenic, InGaAs) 22

Οργανολογία Φασματομέτρου Raman Τo φασματόμετρο μ Raman του εργαστηρίου μας 1. Πηγή ακτινοβολίας Laser 2. Ορατή Ακτινοβολία 785 nm 3. Φίλτρο 4. ιαχωριστής δέσμης 5. Φακός 6. ί είγμα 7. Ακτινοβολία Raman 8. ιάφραγμα Περίθλασης 9. Ανιχνευτής 10. Έλεγχος ηλεκτρονικών 23

Τεχνικές Λήψης Φάσματος 1. Υγρά δείγματα: 1-2 ml δείγματος σε λεπτούς σωλήνες τύπου NMR 2. Στερεά δί δείγματα: α) Με μορφή διαλύματος σε λεπτούς σωλήνες τύπου NMR β) Σε στερεή ρήμορφή σε λεπτούς σωλήνες τύπου NMR 3. Τεχνική SERS (Surface-Εnhanced Raman Scattering spectroscopy) α) σε κολλοειδή διαλύματα μετάλλων β) σε αντικειμενοφόρο πλάκα επιστρωμένη επιφανειακά με μέταλλο άργυρος (Ag), χρυσός (Au) και χαλκός (Cu) 4. Φυτικοί / Ζωικοί Ιστοί, Βιολογικά Υλικά, Πετρώματα κλπ ως έχουν με τη βοήθεια Κάμερας ή Μικροσκοπίου. 24

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Χώρος δείγματος του οργάνου Raman της εταιρείας Nicolet. Το δείγμα τοποθετείται σε δειγματοληπτικούς σωλήνες τύπου NMR 25

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Χώρος δείγματος του οργάνου Raman της εταιρείας DeltaNu. Το δείγμα τοποθετείται σε δειγματοληπτικούς σωλήνες τύπου NMR 26

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Χώρος δείγματος του οργάνου Raman της εταιρείας DeltaNu. Υποδοχέας δείγματος XYZ: Ογκώδη δείγματα τοποθετούνται ως έχουν. 27

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Χώρος δείγματος του οργάνου Raman της εταιρείας DeltaNu. Καταγραφή φάσματος με τη βοήθεια κάμερας από δείγμα ως έχει. 28

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Χώρος δείγματος του οργάνου Raman της εταιρείας DeltaNu. Καταγραφή φάσματος με τη βοήθεια κάμερας από δείγμα ως έχει. 29

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Καταγραφή φάσματος με τη βοήθεια κάμερας από δείγμα ως έχει. 30

Τεχνικές Λήψης Φάσματος Καταγραφή φάσματος με τη βοήθεια φορητού συστήματος Ramanτης εταιρείας DeltaNu. 31

Ταυτοποίηση με FT-Raman - Ερμηνεία Φασμάτων H φασματοσκοπία Raman δίνει πληροφορίες για το σκελετό του μορίου (δομικές πληροφορίες), ενώ η φασματοσκοπία IR για χαρακτηριστικές ομάδες Οι C=C δίνουν κορυφή στα 1700-1500 cm -1 Οι C-C δίνουν κορυφή στα 1300-1000 cm -1 Για την αναγνώριση και απόδοση των κορυφών ενός φάσματος υπάρχει η δυνατότητα αναφοράς σε πίνακες που περιέχουν τις διάφορες χαρακτηριστικές ομάδες με τους αντίστοιχους κυματαριθμούς. 32

Ταυτοποίηση με FT-Raman - Ερμηνεία Φασμάτων 33

Ταυτοποίηση με FT-Raman - Ερμηνεία Φασμάτων C=C C-C CH 3 CH 3 CH 3 H 3 C H 3 C 1517 1160 CH 3 CH 3 CH 3 all-trans β-καροτένιο CH 3 CH3 1540 1166 R 1 O CH 3 CH 3 O OR 2 1542 1166 O CH 3 CH 3 Κροκετίνη:R1=R2=H ιμεθυλοκροκετίνη:r1=r2=ch3 Κροκίνες: R1, R2 = γλυκοζυλ, ή γεντιοβιοζυλ 1540 1168 Στίγμα Saffron 1540 1160 38

Ταυτοποίηση με FT-Raman Όσο αυξάνει το μήκος της ανθρακικής αλυσίδας (στα καροτενοειδή), άρα και ο αριθμός των C=C μετατοπίζεται η φασματική κορυφή τους στο φάσμα προς τα δεξιά 39

Ταυτοποίηση με FT-Raman Φασματικές κορυφές Raman στην περιοχή 1300-1100 cm -1 ισομερών του β-καροτενίου 40

Ταυτοποίηση με FT-Raman 30 25 20 1547 Cis CRC R 1 O CH 3 CH 3 Int 15 10 5 6 1138 116 O 13-cis CH 3 Int 0 250 200 150 100 50 153 35 1165 TransCRC R 1 O CH 3 Κροκίνη: R=R2 = γεντιοβιοζυλ OR 2 O CH 3 CH 3 O OR 2 0 O All-trans CH 3 CH 3 1600 1400 1200 Raman shift (cm-1) 1000 41

Ταυτοποίηση με FT- IR / Raman H 3 CO CH 3 CH 3 O O CH 3 CH ιμέθυλοκροκετίνη 3 OCH 3 Τα φάσματα FT-IR FT-Raman είναι συμπληρωματικά 42

Ταυτοποίηση με FT- IR / Raman 43

I Φασματοσκοπία Raman (Raman Spectroscopy) Ποσοτική Ανάλυση με FT-Raman Προσδιορισμός α-πινενίου και β-μυρκενίου σε μαστιχέλαιο In nt 8 6 4 1659 16 634 Μαστιχέλαιο 2 Int 8 6 4 2 1660 α-πινένιο 2,6,6-Trimethyl-bicyclo[3.1.1]hept-2-ene 80 Int 60 40 1634 β-μυρκένιο 20 7-Methyl-3-methylene-octa-1,6-diene Int 100 50 Κυκλοεξάνιο 803 1500 Raman shift (cm -1 ) 1000 44

Ποσοτική Ανάλυση με FT-Raman Προσδιορισμός α-πενενίου και β-μυρκενίου σε μαστιχέλαιο Λ 24,0 22,0 20,0 18,0 16,0 14,0 12,0 10,00 30 40 50 60 70 80 90 Πινένιο (%) Λ 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0 20 40 60 80 Μυρκένιο (%) Η περιεκτικότητα του μαστιχελαίου σε α-πινένιο είναι 41 έως 70 % και σε β-μυρκένιο 7έως 58 % 45

Βιοχημικές / Βιοϊατρικές Εφαρμογές CH 3 CH 3 O H 3 CO OCH 3 O ιμέθυλοκροκετίνη CH 3 CH 3 Φάσματα Raman της DMCRT (α) σε διάλυμα, (β) σε καρκινικά κύτταρα HL-60 και (γ) σε καρκινικά κύτταρα Κ562. 46

Βιοχημικές / Βιοϊατρικές Εφαρμογές Φωτομικρογραφία και εικόνα Raman ιστών του εγκεφάλου ποντικού (οι έγχρωμες περιοχές αντιπροσωπεύουν το φάσμα offset Raman που παρουσιάζεται στα δεξιά) 47

Φασματοσκοπίες Υπερύθρου & Raman (IR & Raman Spectroscopies) Συμπεράσματα Οι φασματοσκοπίες Υπερύθρου και Raman: 1. Βοηθούν στην Ποιοτική και Ποσοτική Ανάλυση 2. Είναι συμπληρωματικές 3. Είναι ταχύτατες 4. Μπορούν να εφαρμοστούν χωρίς προηγούμενη κατεργασία του δείγματος 5. εν καταστρέφουν τα δείγματα 48