ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Μαγδαληνής Χατζηκαμάρη-Παυλίδου Πτυχιούχος Γεωπόνος-Τεχνολόγος Τροφίμων, MSc. «ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΖΥΜΩΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗΣ ΡΕΒΙΘΟΜΑΓΙΑΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΡΕΒΙΘΕΝΙΟΥ ΨΩΜΙΟΥ (ΕΦΤΑΖΥΜΟ)» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Λιτοπούλου-Τζανετάκη Ευανθία Καθηγήτρια, τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

Μαγδαληνής Χατζηκαμάρη-Παυλίδου Πτυχιούχος Γεωπόνος-Τεχνολόγος Τροφίμων, MSc. «Μικροβιολογικές και βιοχημικές μεταβολές κατά τη ζύμωση της παραδοσιακής ρεβιθομαγιάς που χρησιμοποιείται για την παρασκευή ρεβιθένιου ψωμιού (εφτάζυμο)» Διδακτορική Διατριβή Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή, Τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Ημερομηνία δημόσιας παρουσίασης : 23 Ιουνίου 2009 Εξεταστική επιτροπή: - Ε. Λιτοπούλου-Τζανετάκη, Καθηγήτρια Γεωπονική Σχολή, ΑΠΘ (επιβλέπουσα καθηγήτρια) -Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου Καθηγήτρια, τμήμα Χημικών Μηχανικών ΑΠΘ, (μέλος τριμελούς επιτροπής) - Δ. Κυριακίδης, Καθηγητής, τμήμα Χημείας ΑΠΘ (μέλος τριμελούς επιτροπής) -Ν. Τζανετάκης, Καθηγητής, Γεωπονική Σχολή, ΑΠΘ -K. Μπιλιαδέρης, Καθηγητής, Γεωπονική Σχολή, ΑΠΘ -Ν. Ματσούκας, Λέκτορας, Γεωπονική Σχολή, ΑΠΘ -Μ. Γιάγκου, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΑΠΘ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

στο Χρήστο και το Θάνο, τα πολυτιμότερα δώρα που μου χάρισε η ζωή

Μαγδαληνή Χατζηκαμάρη-Παυλίδου Α.Π.Θ. «Μικροβιολογικές και βιοχημικές μεταβολές κατά τη ζύμωση της παραδοσιακής ρεβιθομαγιάς που χρησιμοποιείται για την παρασκευή ρεβιθένιου ψωμιού (εφτάζυμο)» «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από τη Σχολή Γεωπονίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

i ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μελετήθηκαν οι μικροβιολογικές και βιοχημικές μεταβολές κατά τη διάρκεια της ζύμωσης βυθού χονδροαλασμένων σπόρων ρεβιθιού (ρεβιθομαγιά) για την παρασκευή του παραδοσιακού εφτάζυμου ψωμιού. Οι βιοχημικές μεταβολές που μελετήθηκαν κατά την πορεία της ζύμωσης των σπόρων ρεβιθιού για 18 ώρες, ήταν η παρακολούθηση της δραστικότητας ενζύμων της υγρής φάσης (αμυλάση, πρωτεϊνάσες, κυταρινάση, α-γαλακτοσιδάση, ιμβερτάση) η μεταβολή του ph, της οξύτητας, των λιπαρών οξέων, η ελευθέρωση αμινοξέων και αναγόντων σακχάρων, η αποικοδόμηση του αμύλου και των πρωτεϊνών (SDS- PAGE), ο προσδιορισμός των μονο-, δι- και ολιγοσακχαριτών με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Επίσης ελέχθηκε η ασφάλεια του υγρού της ζύμωσης με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση σε ποντίκια. Για τη μελέτη των μικροβιολογικών μεταβολών μελετήθηκε η ανάπτυξη της μικροχλωρίδας, κατά τη διάρκεια της ζύμωσης των σπόρων για 18 ώρες, καθώς και κατόπιν ανάμιξής του ζυμωμένου υγρού με αλεύρι σίτου για την παραγωγή μιας προσαρμοσμένης καλλιέργειας, η οποία επωάστηκε για 2 ώρες. Απομονώθηκαν οι υπεύθυνοι για τη ζύμωση μικροοργανισμοί, ταξινομήθηκαν με φαινοτυπικά κριτήρια (μορφολογικοί και βιοχημικοί χαρακτήρες, ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ολόκληρου του κυττάρου με SDS-PAGE). Στη συνέχεια μελετήθηκε η ετερογένεια επιλεγμένων στελεχών με γενοτυπικά κριτήρια (RAPD-PCR), την ικανότητα ζύμωσης σακχάρων, την παραγωγή ενζύμων (αμυλάση, κυτταρινάση, πρωτεϊνάσες, α-γαλακτοσιδάση) με εργαστηριακές μεθόδους, καθώς και 19 ακόμη ενζύμων με το σύστημα ΑPI-ZYM. Η πτώση του ph και η αύξηση της οξύτητας ήταν σημαντική (p<0,05) από τη 10 η ώρα της ζύμωσης και μετά. Επίσης τα ελεύθερα λιπαρά οξέα αυξήθηκαν σημαντικά (p<0,05) από τη 10 η ώρα και έπειτα. Τα ανάγοντα σάκχαρα αυξάνονταν έως τη 12 η ώρα και μετά σταδιακά μειώνονταν. Τα ελεύθερα αμινοξέα αυξάνονταν συνεχώς έως το τέλος της ζύμωσης, οι α-γαλακτοζίτες μειώθηκαν με την πορεία της ζύμωσης και η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών ήταν εμφανής μετά τη 8 η ώρα της ζύμωσης. Η κυτταρινάση ήταν στο μέγιστο της δραστικότητάς της την 10 η ώρα, η α- γαλακτοσιδάση την 12 η, η ιμβερτάση την 8 η και η αμυλάση την 10 η ώρα. Οι πρωτεϊνάσες ανιχνεύτηκαν από την 12 η ώρα και εμφάνισαν ένα μέγιστο την 16 η ώρα. Στο υγρό της ζύμωσης αναπτύχθηκαν μόνο πληθυσμοί σποριογόνων βακτηρίων, βάκιλοι και κλωστρίδια. Οι βάκιλοι αυξάνονταν σημαντικά (p<0,05)

ii κατά τις πρώτες 8-10 ώρες της ζύμωσης φτάνοντας σε επίπεδα 10 6 cfu/ml, και στη συνέχεια έως το τέλος της ζύμωσης αναπτύσσονταν με μικρότερο ρυθμό, φτάνοντας σε τελικά επίπεδα 10 7-10 8 cfu/ml. Τα κλωστρίδια αναπτύσσονταν με αργό ρυθμό έως τις 10 ώρες (10 3 cfu/ml) και με γρηγορότερο ρυθμό στη συνέχεια, ενώ το ph στο υγρό της ζύμωσης μειώθηκε στο 5,4 (p<0,05) και τα ανάγοντα σάκχαρα αυξήθηκαν, καθιστώντας το περιβάλλον κατάλληλο για την ανάπτυξή τους. Υπεύθυνοι μικροοργανισμοί για την παραγωγή αερίου που προκαλεί το φούσκωμα του ψωμιού ήταν τα κλωστρίδια και η εμφάνιση φυσαλίδων ήταν ορατή στη μέση περίπου της ζύμωσης, ενώ στις 18 ώρες η παρουσία αφρού 3-4 δάχτυλα και η χαρακτηριστική οσμή δήλωνε το τέλος της ζύμωσης. Η παραγωγή αερίου συνεχίστηκε και στην επόμενη φάση, της προσαρμοσμένης μαγιάς, αν και οι πληθυσμοί των βακίλων και των κλωστριδίων μειώθηκαν ελαφρώς. Πιθανόν η διόγκωση της προσαρμοσμένης μαγιάς να συνεχίζεται με τη δράση ενζύμων που υπήρχαν στο υγρό ζύμωσης ή ελευθερώθηκαν με το θάνατο των κυττάρων. Σχεδόν το σύνολο των απομονώσεων είχαν φαινοτυπικούς χαρακτήρες της ομάδας του Bacillus cereus και Clostridium perfringens, ενώ βρέθηκαν και στελέχη των ειδών B. licheniformis και Cl. beijerinkii. Οι φαινοτυπικοί χαρακτήρες επιβεβαιώθηκαν με την SDS-PAGE για το Cl. perfringens, B. licheniformis και Cl. beijerinkii. Η μέθοδος διαχώρισε επίσης τα στελέχη της ομάδας του B. cereus στα είδη B. cereus και B. thuringiensis. Παρά την παρουσία των παραπάνω γνωστών παθογόνων το υγρό της ζύμωσης δεν ήταν τοξικό για τα ποντίκια όταν αυτά εμβολιάστηκαν ενδοπεριτοναϊκά. Τα στελέχη των βακίλων που παρήγαν αμυλάση, ιμβερτάση και α- γλυκοσιδάση εργαστηριακά, διαφοροποιήθηκαν ως προς την ικανότητα και ένταση παραγωγής των παραπάνω ενζύμων ενώ το ενζυμικό τους προφίλ με το API ZYM ήταν σχεδόν ομοιόμορφο και διαχώρισε την ομάδα B. cereus από το B. licheniformis και το Cl. perfringens από το Cl. beijerinckii. H RAPD-PCR έδειξε μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των απομονώσεων των βακίλων και διαφοροποίησε τις απομονώσεις του Cl. perfringens από αυτές του Cl. beijerinckii. Συμπερασματικά κατά τη ζύμωση των σπόρων ρεβιθιού σε νερό για την παρασκευή ρεβιθομαγιάς η αυτόχθονη μικροχλωρίδα μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στα συστατικά του, που οφείλονται στους βακίλους έως τη 8 η -10 η ώρα και μετέπειτα στα κλωστρίδια.

iii SUMMARY The microbiological and biochemical changes during a submerged fermentation of coarsely grounded chickpea seeds for 18 h, for the production of a chickpea-starter to be used as a leavening agent for the traditional bread eftazimo, as well as the heterogeneity of the strains involved in the fermentation were studied. For the biochemical study, changes in enzyme activities (cellulase, α- galactosidase, invertase, amylase and proteinase), changes in ph and acidity, liberation of FFA, FAA and reducing sugars, degradation of starch and protein (SDS- PAGE), determination of mono- di- and oligo-saccharides (HPLC) of the fermented liquid during the submerged fermentation have been explored, as well as the safety of the fermented liquid. For the microbiological examination, the development of the microflora during the fermentation for 18 h (primary starter) and during raising a dough from wheat flour (adapted starter) in 2-hours intervals was first studied. Bacteria involved in the fermentation were isolated and characterized with phenotypic criteria (morphological and biochemical characters, SDS-PAGE of the whole cell protein). Selected strains were screened for carbohydrate fermentation ability and enzyme activities with traditional methods (amylase, invertase, proteinase, cellulase) as well as by the API ZYM system (19 different enzymes) and were typed by RAPD- PCR. Cellulase, α-galactosidase, invertase, amylase and proteinase activities were detected in the fermented liquid and maxima were recorded at 10, 12, 8, 10 and 16 h of fermentation, respectively. A gradual decrease in ph (p<0.05) and an increase in acidity (p<0.05) were observed from 10 h onwards. Similarly, the concentration of free fatty acids increased (p<0.05), but appreciably after fermentation for 10 h. The amount of reducing sugars increased (p<0.05) on fermentation for 12 h and then gradually decreased (p<0.05). The α-galactosides also declined with fermentation and starch solubilization-degradation was detected after 8 h. The free amino acid content increased on fermentation, and protein degradation was evident after 8 h of incubation. In the fermenting liquid, only populations of Bacillus and Clostridium developed. Bacilli increased their loads significantly (p<0.05) during fermentation for 8-12 h and then remained constant. Clostridia developed (p<0.05) subsequently to levels of 10 7 cfu/ml at 18 h, when the ph of the fermenting liquid had decreased

iv (p<0.05) to ~ 5.4. It also seems that the rise of the adapted starter within 2 h was caused by enzymes present in the primary starter and those liberated after cell death by the declining populations of bacilli and clostridia. The principal groups of isolates in all fermentation experiments (with chickpea seeds from five different areas) seemed to have the phenotypic characteristics of B. cereus group and Cl. perfringens. SDS-PAGE of whole-cell proteins elucidated the taxonomic position of the B. cereus group of strains as B. cereus and B. thuringiensis and confirmed the phenotypic allocation of Cl. perfringens isolates. Strains phenotypically characterized as B. licheniformis and Cl. beijerinckii were also found to belong to these same species by SDS-PAGE. In addition, results showed that the fermenting broth was not toxic to mice when inoculated intraperitoneally and the product can thus be considered as safe for consumption. The results showed that bacilli exhibited amylase, invertase and proteinase activities. With the API ZYM system Cl. perfringens strains showed strong α- glucosidase, α-galactosidase, alkaline phosphatase, phosphohydrolase and esterase activities, medium esterase/lipase, β-galactosidase activities; some strains exhibited strong β-glucuronidase activities and weak or no leucine-, valine- and cystinearylamidase activities. B. cereus strains showed strong acid phosphatase activities, medium alkaline phosphatase, esterase, esterase/lipase, leucine arylamidase, phosphohydrolase and α-glucosidase activities and weak valine-, trypsin and α- chymotrypsin activities. API-ZYM proved to be a practical system for the rapid differentiation of Cl. perfringens from Cl. beijerinckii. Furthermore, RAPD-PCR results revealed a high heterogeneity in B. cereus strains and suggest the usefulness of RAPD-PCR for the differentiation of Cl. perfringens and Cl. beijerinckii isolates. Overall, the indigenous microbial population of the chickpea fermentation liquid may cause changes in its chemical constituents that can be attributed mainly to bacilli, until 8-10 h of fermentation, and to clostridia thereafter.

v ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα πρώτα απ όλους να ευχαριστήσω μέσα από την καρδιά μου την καθηγήτριά μου κ. Ευανθία Λιτοπούλου-Τζανετάκη που μου εμπιστεύτηκε το θέμα της διδακτορικής μου διατριβής και ήταν πάντα δίπλα μου προσφέροντας μου απλόχερα την επιστημονική της γνώση, την καθοδήγησή της, τις πολύτιμες συμβουλές της κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Επίσης την ευχαριστώ πολύ για τις διορθώσεις του κειμένου που συνέβαλλαν στην αρτιότερη παρουσίαση της διατριβής. Ευχαριστώ θερμά τον κ. Νικόλαο Τζανετάκη, καθηγητή του τομέα ΕΤΤ για τις πολύτιμες συμβουλές του κατά την διεκπεραίωση της διατριβής και την ανθρωπιά του. Επίσης θα ήθελα να τους ευχαριστήσω και τους δύο για τις γνώσεις και την εμπειρία που απέκτησα κοντά τους, την άριστη συνεργασία, την φιλία, την αγάπη τους, την ψυχολογική υποστήριξη και την κατανόηση και συμπαράσταση που μου έδειξαν σε δύσκολες ώρες όλα αυτά τα χρόνια που συνεργαζόμαστε. Ευχαριστώ το κ. Δημήτρη Κυριακίδη, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής καθηγητή στο εργαστήριο Βιοχημείας, του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. για την βοήθειά του στο βιοχημικό κομμάτι της διατριβής και την κ. Αναστασία Πανταζάκη επίκουρη καθηγήτρια του ιδίου εργαστηρίου, για την εκμάθηση των πειραμάτων που αφορούσαν τις ενζυμικές δράσεις. Ευχαριστώ την κ Μαρία Λιακοπούλου-Κυριακίδου καθηγήτρια του τμήματος Χημικών Μηχανικών της Πολυτεχνικής σχολής του Α.Π.Θ. για την προθυμία της και την τιμή που μου έκανε να είναι μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Ευχαριστώ τον κ. Κωνσταντίνο Μπιλιαδέρη Καθηγητή του τομέα ΕΤΤ, Α.Π.Θ., μέλος της επταμελούς επιτροπής, για την καθοριστική του βοήθεια και τις πολύτιμες γνώσεις και συμβουλές που μου πρόσφερε κατά την εκμάθηση της μεθόδου HPLC καθώς και τις διορθώσεις του κειμένου, που συνέβαλλαν στην αρτιότερη παρουσίαση της διατριβής. Ευχαριστώ την κ. Eleana Kristo και την κ. Χαρά Βαϊκούση, διδάκτορες του εργαστηρίου Χημείας και Βιοχημείας Τροφίμων του τομέα ΕΤΤ για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά την διεκπεραίωση των πειραμάτων με την μέθοδο HPLC. Ευχαριστώ τον κ. Μηνά Γιάγκου αναπληρωτή Καθηγητή του εργαστηρίου Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ. για τη συμμετοχή του στην επταμελή επιτροπή, τις διορθώσεις του κειμένου και

vi κυρίως για τη διεξαγωγή των πειραμάτων σε πειραματόζωα (Balb/c ποντίκια). Ευχαριστώ τον κ. Ανδρέα Κουρελή υποψήφιο διδάκτορα του ιδίου εργαστηρίου για την συμβολή του στην διεκπεραίωση των πειραμάτων αυτών. Ευχαριστώ τον κ. Νικήτα Ματσούκα, Λέκτορα του τομέα ΕΤΤ του Α.Π.Θ. για την προθυμία του και την τιμή που μου έκανε να είναι μέλος της επταμελούς επιτροπής. Ευχαριστώ ολόψυχα τη φίλη μου και συνάδελφο Ευγενία Χαριτωνίδου, μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα ΕΤΤ για την αμέριστη συμπαράσταση και απλόχερη βοήθειά της, κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων, την άριστη συνεργασία και πάνω απ όλα για την αγάπη και τη φιλία που μου προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια που εργαζόμαστε μαζί. Ευχαριστώ τους συναδέλφους του τομέα ΕΤΤ, Γεωργία Κολέτσου, Χρυσάνθη Χάιδα, Μαρία Σαμολαδά, Βασιλική Μπαξεβάνου, Κωνσταντίνο Βαμβακά, Παύλο Αμπατζίδη και Μισιρλή Χαράλαμπο για τη φιλία τους και την βοήθειά τους όποτε την χρειάστηκα. Ευχαριστώ την Λευκή Ψώνη και τον Στράτο Νικολάου, διδάκτορες του τομέα ΕΤΤ, για την ευχάριστη παρέα τους και τις στιγμές χαλάρωσης που μου προσέφεραν όταν ο φόρτος εργασίας με κατέβαλε. Ευχαριστώ θερμά όλο το ΔΕΠ του τομέα ΕΤΤ, της Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. για τις γνώσεις που μου πρόσφερε από τα φοιτητικά μου ακόμη χρόνια και ιδίως για την συμπαράστασή τους, την ανθρωπιά τους και την κατανόηση που συνεχίζουν να δείχνουν στην δύσκολη φάση της ζωής μου τα τελευταία περίπου δύο χρόνια. Χάρη στην στήριξη όλων σας η διατριβή αυτή ολοκληρώνεται με επιτυχία. Να σας έχει ο Θεός όλους καλά! Ευχαριστώ ολόψυχα την πεθερά μου κ. Μαρία Παυλίδου και τον πεθερό μου κ. Χρήστο Παυλίδη, για την φροντίδα των δύο ανήλικων παιδιών μου κατά την πολύωρη απουσία μου από το σπίτι, λόγω των υποχρεώσεων της διατριβής. Χωρίς την δική τους πολύτιμη βοήθεια, υποστήριξη και αγάπη η διατριβή αυτή δε θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί. Ευχαριστώ τους γονείς μου, Αικατερίνη και Αθανάσιο Χατζηκαμάρη που με πολύ αγάπη και κόπο με ανέθρεψαν, για όλα όσα μου χάρισαν, τις ευκαιρίες που μου

προσέφεραν να γίνω όσο το δυνατόν καλύτερη και τον δρόμο που μου άνοιξαν για μόρφωση. Χωρίς τον δικό τους μόχθο δεν θα είχα φτάσει ως εδώ. vii Ευχαριστώ τον σύζυγό μου Παναγιώτη Παυλίδη, για την αγάπη του και την υπομονή που έδειξε κατά τη διάρκεια εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής, την ψυχολογική υποστήριξη όταν κάτι πήγαινε στραβά, για τις όμορφες οικογενειακές στιγμές και τις ώρες χαλάρωσης που μου πρόσφερε ώστε να μπορώ να συνεχίζω. Πάνω απ όλους ευχαριστώ τα δύο μου παιδιά, το Χρηστάκη και το Θανούλη, έντεκα και δέκα χρονών, για την καρτερικότητά τους και τους ζητώ συγνώμη που τους στέρησα την παρουσία μου από κοντά τους, λόγω των πολλών υποχρεώσεων της διατριβής. Το γλυκό τους χαμόγελο που αντίκριζα όταν αργά το απόγευμα γυρνούσα σπίτι με έκανε να ξεχνάω όλες τις σκοτούρες της διατριβής, μου έδινε τη δύναμη να συνεχίσω και να φτάσω στο τέλος, όταν με λαχτάρα με ρωτούσαν: Πότε θα τελειώσεις τη δουλειά σου μαμά; Τέλειωσα αγόρια μου, να μαι! Σας αγαπώ πολύ και σας φιλώ γλυκά!

viii ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Σελίδα Περίληψη Summary Ευχαριστίες Δημοσιευμένες εργασίες i iii v x 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 2. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ... 4 2.1. Ζύμωση οσπρίων 4 2.2. Χαρακτηριστικά της ζύμωσης των οσπρίων... 10 2.3. Προϊόντα ζύμωσης ρεβιθιού 13 2.4. Το προζύμι στην παρασκευή του ψωμιού. 14 2.5. Παρασκευή ρεβιθομαγιάς και εφτάζυμου. 17 2.6. Χαρακτηριστικά της πρώτης ύλης 20 2.6.1. Χρήσεις. 20 2.6.2. Χημική σύσταση - Θρεπτική αξία ρεβιθιού.. 22 2.7. Bacillus cereus. 25 2.8. Clostridium perfringens 30 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ.. 34 4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 35 4.1. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ.. 35 4.1.1. Παρασκευή δειγμάτων.. 35 4.1.2. Μικροβιολογικές αναλύσεις.. 36 4.1.3. Απομόνωση μικροχλωρίδας.. 37 4.1.4. Ταυτοποίηση των απομονώσεων.. 37 4.1.4.1. Ταξινόμηση σε είδος στελεχών του γένους Bacillus.. 38 4.1.4.2. Ταξινόμηση σε είδος στελεχών του γένους Clostridium.. 41 4.1.4.3 Χαρακτηρισμός απομονώσεων με SDS-PAGE των πρωτεϊνών ολόκληρου του κυττάρου.. 43

ix 4.1.5. Μελέτη επιλεγμένων απομονώσεων. 45 4.1.5.1. Επιλεγμένα στελέχη.. 45 4.1.5.2. Παραγωγή οξέος από σάκχαρα. 45 4.1.5.3. Παραγωγή εξωκυτταρικών ενζύμων. 45 4.1.5.4. Εξακρίβωση τύπου απομονώσεων με RAPD-PCR... 47 4.1.6. Δοκιμή τοξινογονικότητας 51 4.2. ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ.. 52 4.2.1. Παρασκευή δειγμάτων.. 52 4.2.2. ph και ογκομετρούμενη οξύτητα. 52 4.2.3. Ελεύθερα λιπαρά οξέα... 52 4.2.4. Διαλυτοποίηση-αποικοδόμηση αμύλου 53 4.2.5. Αποικοδόμηση πρωτεΐνης. 53 4.2.6. Ανάγοντα σάκχαρα 53 4.2.7. Ελεύθερα αμινοξέα.... 54 4.2.8. Ενζυμικές δραστικότητες.. 54 4.2.9. Προσδιορισμός μονο-, δι- και ολιγο- σακχαριτών με HPLC 56 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 58 5.1. Βιοχημικές μεταβολές κατά τη ζύμωση 58 5.2. Μεταβολές στους αριθμούς και τα είδη των βακτηρίων κατά τη διάρκεια της ζύμωσης του εκχυλίσματος ρεβιθιών. 68 5.2.1. Εξέλιξη της μικροχλωρίδας 68 5.2.2. Ταυτοποίηση των απομονώσεων βακίλων και κλωστριδίων 71 5.3. Διαφοροποίηση απομονώσεων βακίλων και κλωστριδίων με βιοχημικές μεθόδους και την RAPD-PCR 79 5.3.1. Βιοχημική ετερογένεια απομονώσεων. 79 5.3.2. Εξακρίβωση τύπου με την RAPD-PCR... 87 6. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 92 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 95 8. ΑΝΑΤΥΠΑ ΔΗΜΟΣΙΕΥΜΕΝΩΝ ΕΡΓΑΣΙΩΝ

x ΔΗΜΟΣΙΕΥΜΕΝΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ: Hatzikamari, M., Kyriakidis, D.A., Tzanetakis, N., Biliaderis, C.G., Litopoulou- Tzanetaki, E.(2007). Biochemical changes during a submerged chickpea fermentation used as a leavening agent for bread production. European Food Research and. Technology, 224:715-723. Hatzikamari, M., Yiangou, M., Tzanetakis, N., Litopoulou-Tzanetaki, E. (2007). Changes in numbers and kinds of bacteria during a chickpea submerged fermentation used as a leavening agent for bread production. International Journal of Food Microbiology, 116:37-43.

1 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ψωμί αποτελεί βασική τροφή του ανθρώπου και η ιστορία του χάνεται στα βάθη των αιώνων. Η αρτοποιΐα χρονολογείται από το 4000 π.χ. στην αρχαία Αίγυπτο, αν και η παρασκευή ψωμιού με χρήση ζύμης από κρασί ανήκει στους Ρωμαίους. Παρασκευή ψωμιού με προζύμι (όξινο ζυμάρι) χρονολογείται από το 800 π.χ. (Desphande et al 2000). Αρχικά οι άνθρωποι έφτιαχναν χυλούς από χονδροαλεσμένα δημητριακά και νερό τους οποίους έψηναν σε καυτές πέτρες και αποτελούσε μια μορφή επίπεδου ψωμιού. Απόγονοι αυτών των επίπεδων ψωμιών υπάρχουν ακόμη και σήμερα σε πολλές περιοχές της γής όπως η αραβική pita, η μεξικάνικη tortilla, το περσικό lavash κ.α. Από τους Αιγύπτιους η τέχνη παρασκευής ψωμιού πέρασε στους Έλληνες και απ αυτούς μεταδώθηκε αρχικά στους Ρωμαίους και κατόπιν στην υπόλοιπη Ευρώπη 1. Σήμερα στην Ελλάδα καταναλώνεται ψωμί φουσκωμένο με ζύμη αρτοποιίας αν και τα τελευταία χρόνια η γενικότερη στροφή προς τα παραδοσιακά προϊόντα οδήγησε πολλούς αρτοποιούς στην παρασκευή παραδοσιακών άρτων με χρήση προζύμης (όξινου ζυμαριού). Τα ψωμιά αυτά έχουν χαρακτηριστική όξινη γεύση και άρωμα. Ένα ακόμη ιδιαίτερο παραδοσιακό ψωμί της Ελλάδας που δυστυχώς τα τελευταία χρόνια τείνει να εγκαταλειφθεί, λόγω της δυσκολίας παρασκευής του, είναι το «εφτάζυμο». Το εφτάζυμο ψωμί είναι ένα παραδοσιακό προϊόν της Ελλάδας και της Κύπρου, αλλά αναφορές υπάρχουν και για την παρασκευή του στην Τουρκία (Τulbek 2003). Για την παρασκευή του απαιτείται προσθήκη «ρεβιθομαγιάς» δηλ. ζυμωμένων σπόρων ρεβιθιού χωρίς την προσθήκη ζύμης αρτοποιίας. Το φούσκωμα και τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά οσμής και γεύσης του, οφείλονται στην αυτόχθονη μικροχλωρίδα των σπόρων ρεβιθιού. Οι υπεύθυνοι γι αυτό μικροοργανισμοί και οι παράγοντες που συμβάλλουν στην ιδιαίτερη οσμή και γεύση του θα αναλυθούν εκτενέστερα στο πειραματικό μέρος της παρούσας διατριβής. Το όνομά του εφτάζυμο προέκυψε από παρετυμολογία της λέξης «αυτόζυμο» προς το εφτά ( Μπαμπινιώτης, 2002), που δηλώνει κάτι που ζυμώνεται από μόνο του χωρίς την προσθήκη ζύμης (αρτοποιίας). Ο Αθήναιος στους Δειπνοσοφιστές αναφέρει μεταξύ των πολλών ειδών άρτου που υπήρχαν στην αρχαία Ελλάδα και τον «αυτόζυμο άρτο» δηλ. άρτος χωρίς προσθήκη «μαγιάς», αλλά με προσθήκη ζυμωμένου ρεβιθιού 1. 1 www.bread.info

2 Άλλες ονομασίες που χρησιμοποιούνται κατά τόπους είναι ρουφτένιορεβιθόψωμο (Δυτική Μακεδονία), φταζυμίτικο (Σέρρες) και επτάζυμο (χωρίς να σημαίνει ότι ζυμώνεται επτά φορές). Επίσης αφρένιο ή αρκατένο (Βουτσινά 2004). Ήταν το γιορτινό ψωμί και φτιαχνόταν κυρίως για το Πάσχα, αλλά κατά τόπους και σε γάμους, όπου κόβονταν σε κομμάτια με ειδικό μαχαίρι και μοιράζονταν στους καλεσμένους πριν την τελετή (Κοζάνη), ενώ όλοι στη συνέχεια χόρευαν και τραγουδούσαν: «πρώπκαστι, πρωτόπκαστι, ποιος σι προυτουζύμουσι; Η μάνα μου κι αφέντης μου, τα εννιά τ αδέρφια μου, δικουχτώ ξαδέρφια» Στην περίπτωση αυτή το ψωμί λεγόταν επίσης και «πρωτόπκαστος» εννοώντας τον πρωτοσερβιρόμενο, αυτόν που προσφέρεται για πρώτη φορά στο ξεκίνημα μιας νέας ζωής. Το ψωμί αυτό διατηρούσε για μεγάλο χρονικό διάστημα τη φρεσκάδα του και δε μούχλιαζε γρήγορα. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι προσθήκη ζυμωμένου ρεβιθιού σε αρτοσκευάσματα αυξάνει τη θρεπτική τους αξία, τη διατηρησιμότητά τους από μικροβιολογική άποψη και επιμηκύνει τη διάρκεια ζωής τους στο ράφι (καθυστερεί το μπαγιάτεμα) (Baik 2004, Tulbek 2004). Η ζύμωση ως μέθοδος παρασκευής και συντήρησης τροφίμων όπως και η αφυδάτωση, είναι από τις αρχαιότερες και οικονομικότερες μεθόδους συντήρησης τροφίμων, τόσο ζωϊκής όσο και φυτικής προέλευσης. Η ζύμωση είναι σχετικά απλή διαδικασία, με μικρό κόστος και δεν απαιτεί ιδιαίτερο μηχανολογικό εξοπλισμό. Εμπλουτίζει το διαιτολόγιο με ποικιλία προϊόντων με διαφορετικά γευστικά χαρακτηριστικά, αυξάνει τη διατηρησιμότητα των τροφίμων με τη μείωση του ph λόγω παραγωγής γαλακτικού και άλλων οργανικών οξέων, ή την ανύψωσή του μέσω αλκαλικών ζυμώσεων, εμπλουτίζει τα τρόφιμα με θρεπτικά συστατικά που δεν υπήρχαν στην πρώτη ύλη, μειώνει ή εξαλείφει ανεπιθύμητες ουσίες που μπορεί να υπάρχουν στην πρώτη ύλη και μειώνει σημαντικά το χρόνο και τις ενεργειακές απαιτήσεις μαγειρέματος των τροφίμων (Steinkraus 1996). Τα πλεονεκτήματα αυτά θα συζητηθούν εκτενέστερα στη συνέχεια. Μεγάλο μέρος του πληθυσμού των αναπτυσσόμενων χωρών με τα πενιχρά μέσα που διαθέτει, βασίζεται ακόμη και σήμερα στη ζύμωση για τη διατήρηση των τροφίμων και την παρασκευή νέων. 1 www.hellenicpantheon.com

3 Αρχαιολογικές έρευνες δείχνουν ότι ο άνθρωπος παρήγαγε ζυμωμένα προϊόντα χιλιετίες πριν. Υπάρχουν ευρήματα που μαρτυρούν την παραγωγή μπύρας και κρασιού στην αρχαία Αίγυπτο και Μεσοποταμία από το 6000-2000 π.χ. (Stanton 1993) ενώ οι Σουμέριοι γνώριζαν την οινοποιΐα από το 3500 π.χ. Ζυμωμένα γάλατα παρασκευάζονταν στη Ινδία από το 2000 π.χ., ενώ γιαούρτι και τυρί πιθανόν φτιάχτηκε από τότε που ο άνθρωπος εξέτρεφε ζώα για το γάλα τους. Ιστορικά ευρήματα επίσης στην Κίνα μαρτυρούν την παρασκευή ανατολίτικων ζυμωμένων προϊόντων σόγιας (soy sauce, miso), χιλιετίες πριν. Η Ευρώπη σήμερα είναι η σημαντικότερη περιοχή παραγωγής ζυμωμένων προϊόντων. Ωστόσο, αυτά είναι κυρίως ζυμωμένα προϊόντα γάλακτος, δημητριακών για παραγωγή αλκοολούχων ποτών, και κρέατος. Προϊόντα ζύμωσης αμυλούχων καλλιεργειών, οσπρίων και θαλλασινών παράγονται κυρίως σε αναπτυσσόμενες χώρες (Desphande et al 2000). Τα προϊόντα ζύμωσης ρεβιθιού που βρέθηκαν στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστα σε σχέση με την πληθώρα των ζυμωμένων προϊόντων από άλλα όσπρια και δεν έχουν μελετηθεί ακόμη εκτενώς. Η παραγωγή ρεβιθομαγιάς αποτελεί μοναδικό προϊόν, γι αυτό και η βιβλιογραφική ανασκόπηση που ακολουθεί αναφέρεται στη γενικότερη κατηγορία των προϊόντων ζύμωσης οσπρίων και τα χαρακτηριστικά της. Γίνεται επίσης αναφορά στο ρεβίθι ως πρώτη ύλη, με έμφαση στη θρεπτική του αξία και τις χρήσεις του σε προϊόντα για ανθρώπινη κατανάλωση. Επίσης, δίνονται πληροφορίες για τα είδη Bacillus cereus και Clostridium perfringens καθώς ήταν τα κύρια είδη που απονονώθηκαν κατά τη ζύμωση, δίνοντας έμφαση στην ικανότητά τους να παράγουν τοξίνες και να προκαλούν τροφοδηλητηριάσεις.

4 2. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 2.1. Ζύμωση οσπρίων Τα όσπρια κατέχουν εξέχουσα θέση στη διατροφή του ανθρώπου γιατί αποτελούν σημαντική πηγή πρωτεΐνης, παρέχουν ενέργεια, υδατάνθρακες, βιταμίνες (κυρίως του συμπλέγματος Β), ιχνοστοιχεία και απαραίτητα αμινοξέα (όπως λυσίνη) (Champ 2001). Στις ανεπτυγμένες χώρες οι ανάγκες σε πρωτεΐνη καλύπτονται από την κατανάλωση ζωϊκών τροφών (αυγά, κρέας, γάλα, ψάρια και πουλερικά) που περιέχουν υψηλής βιολογικής αξίας πρωτεΐνη, αλλά στις αναπτυσσόμενες χώρες η ζωϊκή πρωτεΐνη είναι πολύ ακριβή για να την προμηθευτούν και σε μερικές περιπτώσεις δεν είναι αποδεκτή λόγω θρησκευτικών πεποιθήσεων, όπως στην Ινδία. Στις χώρες αυτές οι ανάγκες των ανθρώπων σε πρωτεΐνη καλύπτονται από την κατανάλωση φυτικών τροφών, όπως οσπρίων και δημητριακών. Η πρωτεΐνη των οσπρίων δεν είναι υψηλής ποιότητας, όμως αυξάνεται όταν καταναλώνονται σε συνδυασμό με δημητριακά τα οποία είναι πλούσια σε θειούχα αμινοξέα (μεθειονίνη και κυστεΐνη) ενώ τα όσπρια είναι πλούσια σε λυσίνη. Ο συνδυασμός αυτός αυξάνει τη θρεπτική τους αξία και το μέγιστο επιθυμητό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται όταν η αναλογία των δύο πρωτεϊνών είναι 50:50 (Desphande et al. 2000). Μεγάλο μειονέκτημα των οσπρίων είναι ότι περιέχουν ανεπιθύμητους παράγοντες όπως ολιγοσακχαρίτες που προκαλούν φούκωμα αλλά και σημαντικούς αντιδιατροφικούς παράγοντες (Πίνακα 2.1.1.). Κάποιοι απ αυτούς μειώνουν τη θρεπτική τους αξία περιορίζοντας την πεπτικότητα των πρωτεϊνών και των υδατανθράκων (αναστολείς πρωτεασών και αμυλασών, λεκτίνες και ταννίνες) ενώ άλλοι περιορίζουν τη βιοδιαθεσιμότητα των ανόργανων συστατικών (π.χ.φυτικά, οξαλικά). Επίσης κάποια όσπρια περιέχουν επικίνδυνους κυανογόνους γλυκοζίτες οι οποίοι ελευθερώνουν HCN προκαλώντας σοβαρές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία. Τα κουκιά (Vicia faba) συνδέονται με τον φαβισμό, ασθένεια που προκαλεί αιμολυτική αναιμία. Με τη ζύμωση των οσπρίων ένα μεγάλο μέρος των μειονεκτημάτων αυτών εξαλείφεται ή μειώνεται σημαντικά και αυξάνεται έτσι η πεπτικότητά τους και η θρεπτική τους αξία (Desphande et al. 2000, Steinkraus 1996).

5 Πίνακας 2.1.1. Αντιδιατροφικοί παράγοντες οσπρίων και οι επιδράσεις τους Αντιδιατροφικός παράγοντας Φυτοαιμοσυγγολλητίνες (λεκτίνες) Αναστολείς πρωτεασών Αναστολείς αμυλασών Παράγοντες που προκαλούν φούσκωμα Φυτικά Οξαλικά Επιδράσεις Καταστολή ανάπτυξης, θανατηφόρες, ενεργοποίηση Τ λεμφοκυττάρων Υπερτροφία παγκρέατος, απώλεια S-αμινοοξέων, μειωμένη χρησιμοποίηση πρωτεϊνών Αναστολή αμυλασών, παρεμπόδιση χρησιμοποίησης υδατανθράκων Φούσκωμα που προκαλεί δυσφορία, κοιλιακές κράμπες, πόνους και διάρροια Μείωση βιοδιαθεσιμότητας ανόργανων συστατικών, επίδραση στη διαλυτοποίηση πρωτεΐνης, αναστολή ενζύμων Σχηματίζουν χηλικές ενώσεις με δισθενή κατιόντα μειώνοντας την βιοδιαθέσιμότητά τους Πολυφαινόλες (ταννίνες) Μείωση πεπτικότητας και χρησιμοποίησης πρωτεϊνών, ανασταλτική δράση σε πολλά ένζυμα Κυανογόνα Βρογχοκηλογόνα Σαπωνίνες Αλλεργιογόνα Λαθυρισμογόνα Φαβισμός Ανεπιθύμητη οσμή-γεύση (off-flavor) Φυτοαλεξίνες Οιστρογόνα Λυσινοαλανίνη Ρακεμοποίηση αμινοξέων Τοξικά αμινοξέα Αντι-βιταμίνες Πηγή: Desphande et al. (2000) Δηλητηρίαση από κυάνιο, δρά ως προβρογχοκηλογόνο Αναστολή δέσμευσης ιωδίου από το θυρεοειδή αδένα Πικρή γεύση, αφρισμός, αιμόλυση Διάφορες αλλεργικές αντιδράσεις Νευροτοξικά, νευρική παράλυση των κάτω άκρων, θανατηφόρα Αιμολυτική αναιμία Απώλεια συγκεκριμένων αμινοξέων, μειώνουν την αποδοχή των καταναλωτών Αιμόλυση Αναστολή ανάπτυξης, παρεμβολή στην αναπαραγωγή Νεφροτοξικότητα, μείωση διαθέσιμης λυσίνης, μεγέθυνση των πυρήνων και του κυτοπλάσματος των κυττάρων των νεφρών Δημιουργία D- αμινοξέων, μπορεί να δράσει συνεργιστικά με την λυσινοαλανίνη στην έκφραση της νεφροκυτομεγαλίας Δομικά ανάλογα με τα πρωτεϊνικά αμινοξέα, δρουν ως αντιμεταβολίτες και αναστολείς αρκετών ενζυμικών συστημάτων Αυξάνουν τις ανάγκες σε βιταμίνες, πρόκληση ραχίτιδας, νέκρωση συκωτιού, μυϊκή δυστροφία

6 Ωστόσο, υπάρχει και η αντίθετη γνώμη μερικών ερευνητών που υποστηρίζουν ότι κάποιοι από αυτούς τους ανεπιθύμητους παράγοντες (των οποίων η αντιδιατροφική δράση έχει μελετηθεί κυρίως σε ζώα) μπορεί τελικά να είναι ευεργετικοί για τον άνθρωπο. Οι Clemente και Domoney (2001) αναφέρουν πειράματα άλλων ερευνητών για την αντικαρκινική δράση του αναστολέα της πρωτεάσης σόγιας, καθότι οι πρωτεάσες παίζουν σημαντικό ρόλο στα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης και της μετάστασης. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις για μείωση του καρκίνου του παχέως εντέρου από την κατανάλωση των οσπρίων που οφείλεται πιθανόν στα φυτοοιστρογόνα, όπως αναφέρει η Champ (2001), καθώς και ότι οι α- γαλακτοζίτες πέρα από το πρόβλημα του φουσκώματος δρούν και ως πρεβιοτικά. Στις αναπτυσσόμενες χώρες η ζύμωση των οσπρίων ή μίγματος οσπρίωνδημητριακών αποτελεί παραδοσιακή μέθοδο επεξεργασίας και συναντάται μεγάλη ποικιλία ζυμωμένων προϊόντων (Πίνακας 2.1.2.). Στον πίνακα αναφέρονται αυτά που έχουν μελετηθεί περισσότερο. Υπάρχουν ακόμη αρκετές παραλλαγές των προϊόντων αυτών και πολλά άλλα για τα οποία δεν υπάρχουν αρκετές πληροφορίες και δεν αναφέρονται στον πίνακα. Από τα πιο δημοφιλή είναι το miso, natto και tempe με πάρα πολλές παραλλαγές και οι διάφοροι τύποι soy sauce που χρησιμοποιούνται ακόμη και στο Δυτικό κόσμο. Η ανάγκη να τραφούν οι άνθρωποι των αναπτυσσόμενων χωρών με πρωτεΐνη υψηλής διατροφικής αξίας οδήγησε τα τελευταία χρόνια τους επιστήμονες όχι μόνο των χωρών αυτών αλλά και των αναπτυγμένων, στην εκτενή μελέτη και καταγραφή των παραδοσιακών ζυμωμένων προϊόντων οσπρίων (Steinkraus 1996, Reddy et al.1982, Sarkar et al. 1994, Antai και Ibrahim 1986, Sarkar et al. 1997a,b, Baumann και Bisping 1995, Kiers et al. 2000, Yadav και Khetarpaul 1994, Omafuvbe et al. 2000, Sherfi και Hamad 2001, Sarkar και Tamang 1995 ). Η μελέτη έχει επίσης επεκταθεί και στο πεδίο βελτίωσης της θρεπτικής αξίας των οσπρίων που μπορεί να προκύψει με φυσική ή ελεγχόμενη ζύμωση από διάφορους μικροοργανισμούς (Granito et al. 2001, Granito et al. 2002, Porres et al. 2003, Frias et al. 1996) καθώς και με τη χρησιμοποίηση ενζύμων (Clemente et al. 1999, Frias et al. 2001, Mansour και Khalil, 1998). Αναλυτικότερα οι Granito et al. (2002) βρήκαν ότι βελτιώθηκε η θρεπτική αξία των φασολιών (Phaseolus vulgaris) κατόπιν φυσικής ζύμωσής τους η πεπτικότητα των πρωτεϊνών και η βιταμίνη Β 2 αυξήθηκαν, ενώ οι α-ολιγοσακχαρίτες, οι ταννίνες και ο αναστολέας της τρυψίνης μειώθηκαν.

7 Πίνακας 2.1.2. Ζυμωμένα προϊόντα με βάση τα όσπρια. Όνομα προϊόντος Πρώτες ύλες Μικροοργανισμοί που εμπλέκονται Χρήση Περιοχή Dawadawa (Iru) Χαρούπι (locust bean) Bacillus pumilus, B. licheniformis, B. subtilis, B. spp. Σε σούπες και βραστά Δ. και Κ. Αφρική Dhokla Ρεβίθι (bengal gram) και ρύζι ή σιτάρι Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus fermenti, Enterococcuss feacalis Πρωινό ή κολατσιό Ινδία Dosa Φασόλια (black gram) ή άλλο όσπριο και ρύζι Leuc. mesenteroides, Lb. delbrueckii, Lb. fermenti, E. feacalis, Bacillus spp., yeasts Πρωινό ή κολατσιό Ινδία Gergoush Φακές ή άλλο όσπριο και γάλα Bacillus spp., Clostridium spp. Lactic acid bacteria Πρωινό Σουδάν Idli Φασόλια (black gram) και ρύζι Leuc. mesenteroides, Lb. delbrueckii, Lb. fermenti, Lc. lactis, E. feacalis, Pediococcus cerevisiae, yeasts Πρωινό Ινδία, Σρι-Λάνκα Kecap Σόγια και αλεύρι σίτου Aspergillus oryzae, Lactobacillus spp., Hansenula spp., Saccharomyces spp. Αρωματική ύλη Ινδονησία Kenima Σόγια (soybeans) Acid-producing bacteria Πρωινό ή αρτυματικό Νεπάλ, Σικίμ, Β. Ινδία

8 Πίνακας 2.1.2. (συνέχεια) Όνομα προϊόντος Πρώτες ύλες Μικροοργανισμοί που εμπλέκονται Χρήση Περιοχή Ketjap Σόγια A. oryzae Αρτυματικό Ινδονησία Khaman Ρεβίθι Leuc. mesenteroides, Lb. fermenti,lc. lactis. Bacillus spp P. acidilactici Πρωινό ή κολατσιό Ινδία Meju Σόγια A. oryzae, Rhizopus spp. Αρτυματικό Κορέα Milk and related products Σόγια Lactic acid bacteria, Lactobacillus spp. Ρόφημα Κίνα, Ιαπωνία, Ταϊβάν Meitauza Σόγια (soybean press cake) Mucor meitauza, Actinomucor elegans Κολατσιό Κίνα, Ταϊβάν Miso Σόγια και ρύζι ή σιτάρι ή κριθάρι A. oryzae, E. feacalis, Bacillus spp P. acidilactici, P. halophilus, Micrococcus spp., S. rouxii, yeasts Ενισχυτικό γεύσηςαρώματος Α.Ασία, Κίνα, Ιαπωνία Natto Σόγια B. natto Υποκατάστατο κρέατος Ιαπωνία Oncom Φυστίκι (peanut press cake) Neurospora intermedia, R. oligosporus Κολατσιό Ινδονησία Papadam, Padam Φασόλια Sacharomyces spp. Αρτυματικό Ινδία,Πακιστάν Μ. Ανατολή

9 Πίνακας 2.1.2. (συνέχεια) Όνομα προϊόντος Πρώτες ύλες Μικροοργανισμοί που εμπλέκονται Χρήση Περιοχή Soy sauce (soyu) Σόγια και σιτάρι A. oryzae, S. rouxii, P. halophilus, Lb. delbrueckii Sofu Σόγια Actinomucor elegans, A. oryzae M. hiemalis, Mucor spp., Αρτυματικό Τυρί Ιαπωνία, Κίνα, Ταϊβάν, ΗΠΑ Κίνα, Ιαπωνία Tao-si Σόγια και αλεύρι σίτου A. oryzae Αρτυματικό Φιλιππίνες Tao-tjo Σόγια και καβουρδισμένο σιτάρι ή ρύζι A. oryzae Αρτυματικό Ανατολικές Ινδίες Tauco Σόγια και δημητριακά R. oligosporus, A. oryzae Αρτυματικό Ινδονησία, Δ. Ιάβα Tempe Σόγια R. oligosporus, A. oryzae Κολατσιό Ινδονησία, Ν.Γουϊνέα, ΗΠΑ Ολλανδία, Καναδάς Ugba Αφρικανικός ελαιώδης καρπός (African oil bean) Leuc. mesenteroides, Bacillus spp., Staphylococcus spp., Micrococcus spp. Αρτυματικό Δυτική και Κεντρική Αφρική Waries Φασόλια, ή ρεβίθια S. cerevisiae, Candida krusei, Acid-producing bacteria Πηγή: Desphande et al. (2000) Αρτυματικό Ινδία, Πακιστάν

10 Οι Clemente et al. (1999) βρήκαν ότι η διαλυτότητα της απομονωμένης πρωτεΐνης από ρεβίθια (Cicer arietinum L) αυξήθηκε ενώ ταυτόχρονα υπήρξε μείωση του αναστολέα της τρυψίνης κατά 80 %, ύστερα από ενζυμική υδρόλυση με εμπορικά σκευάσματα ενδο- και εξω-πρωτεασών κι έτσι γίνεται καταλληλότερη για χρήση στη βιομηχανία τροφίμων, ενώ ταυτόχρονα ενισχύεται η θρεπτική της αξία. Η κατανόηση της θρεπτικής αξίας των ζυμωμένων προϊόντων οσπρίων και η συμβολή τους στη διατροφή του ανθρώπου τα τελευταία χρόνια καθιστά σημαντική την κατανάλωσή τους όχι μόνο από τους λαούς της Ανατολής αλλά και της Δύσης, οι οποίοι έχουν στραφεί στην κατανάλωση περισσότερο υγιεινών τροφίμων (Reddy et al.1982). 2.2. Χαρακτηριστικά της ζύμωσης των οσπρίων Οι παραδοσιακές ζυμώσεις των οσπρίων μπορούν να χωριστούν σε δύο βασικές κατηγορίες: (α) ζύμωση στερεού υποστρώματος (solid substrate fermentations-ssf) με επιφανειακή ανάπτυξη και δράση της μικροχλωρίδας και (β) ζύμωση βυθού, δηλ. ζύμωση μέσα σε υγρή φάση (submerged culture fermentations-scf), που προκύπτει από την προσθήκη νερού ή άλλου υγρού μέσου όπου η μικροβιακή δράση γίνεται με μικρότερη συγκέντρωση βιομάζας. Τα προϊόντα tempe, miso και natto προέρχονται κατόπιν ζύμωσης σε στερεό υπόστρωμα (SSF), ενώ παράδειγμα ζύμωσης σε υγρή φάση (SCF) είναι η δεύτερη φάση παραγωγής της soy sauce. Ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά που διαχωρίζει τις δύο ζυμώσεις είναι ότι η SSF πραγματοποιείται συνήθως με μικρά ποσοστά υγρασίας (π.χ. 10-20 %) και η ενεργότητα του νερού ευνοεί την ανάπτυξη μυκήτων, ωστόσο μπορούν να βρεθούν διάφοροι συνδυασμοί βακτηρίων, μυκήτων και ζυμών (Paredes Lopez 1992). Χαρακτηριστικό των ζυμώσεων που γίνονται με μύκητες σε στερεό υπόστρωμα (SSF) είναι το μαλάκωμα της υφής των οσπρίων που προκαλείται τόσο από την ελευθέρωση υδρολυτικών ενζύμων όσο και από τη διείσδυση των μυκηλιακών υφών στο υπόστρωμα. Ιδιαίτερη προσοχή στα προϊόντα αυτά πρέπει να δίνεται ώστε να αποτραπεί η παραγωγή μυκοτοξινών από ανεπιθύμητα στελέχη μυκήτων, λόγω ακατάλληλης πρώτης ύλης, μολύνσεων και κακών συνθηκών υγιεινής κατά τη διαδικασία της ζύμωσης ή της διατήρησης του τελικού προϊόντος (Steinkraus 1986, Desphande et al. 2000, Chu 1996).

11 Οι ζυμώσεις στις οποίες επικρατούν βακτήρια μπορεί να είναι όξινες λόγω παραγωγής γαλακτικού και άλλων οξέων, όπως συμβαίνει στις περιπτώσεις που επικρατούν γαλακτικά ή άλλα οξεοπαραγωγά βακτήρια ή αλκαλικές στις περιπτώσεις που επικρατούν πρωτεολυτικοί βάκιλοι. Στη δεύτερη αυτή περίπτωση το ph είναι > 7,0 και αναδύεται οσμή αμμωνίας (Steinkraus 1996, Desphande et al. 2000). Ο κύριος σκοπός της ζύμωσης είναι να καταστήσει τα θρεπτικά συστατικά των οσπρίων περισσότερο διαθέσιμα για τον οργανισμό του ανθρώπου και αυτό επιτυγχάνεται μέσω υδρολύσεων των μεγαλομοριακών πρωτεϊνών και υδατανθράκων. Γενικά η σύσταση των οσπρίων δεν μεταβάλλεται σημαντικά με τη ζύμωση, αυξάνει όμως σημαντικά το διαλυτό κλάσμα και επομένως η διαθεσιμότητά τους. Οι μεταβολές που υφίστανται τα μεγαλομοριακά κλάσματα των οσπρίων οφείλονται στην έκκριση υδρολυτικών ενζύμων από τους μικροοργανισμούς, αλλά και στη δράση ενδογενών ενζύμων (Prinyawiwatkul et al. 1996) Υπάρχουν εκτεταμένες μελέτες για τη μεταβολή διαφόρων ενζύμων (πρωτεολυτικά, αμυλολυτικά, σακχαρολυτικά, λιπολυτικά) κατά τη διάρκεια των ζυμώσεων και πολλά απ αυτά έχουν απομονωθεί και μελετηθεί περαιτέρω (Aderebigbe και Odunfa 1990, Mansour και Khalil 1998, Odunfa 1983a, Omafuvbe et al. 2000, Baumann και Bisping 1995). Οι πρωτεάσες αποικοδομούν τα σύνθετα μόρια των πρωτεϊνών σε απλούστερα, πεπτίδια και αμινοξέα, καθιστώντας το πρωτεϊνικό κλάσμα πιο εύπεπτο. Μικτές ζυμώσεις οσπρίων-δημητριακών είναι πολύ σημαντικές λόγω της συμπληρωματικότητας των αμινοξέων (λυσίνη, μεθειονίνη-κυστεΐνη). Τα θειούχα αμινοξέα μεθειονίνη και κυστεΐνη είναι περιοριστικά στα όσπρια ενώ η λυσίνη είναι περιοριστικό αμινοξύ στα δημητριακά. Είναι γνωστό ότι η θρεπτική αξία ενός τροφίμου καθορίζεται από την ισορροπία των αμινοξέων μεταξύ τους και όχι από το συνολικό περιεχόμενό τους. Σε αρκετά απ αυτά τα προϊόντα είναι γνωστό το προφίλ των αμινοξέων όπως στο kinema (Sarkar et al. 1997b) και το tempe (Steinkraus 1996). Έντονη πρωτεόλυση όμως μπορεί να επιφέρει πλήρη διάσπαση των πρωτεϊνικών κλασμάτων, που συνεπάγεται μείωση της θρεπτικής αξίας. Γι αυτό η μελέτη της πρωτεόλυσης στα προϊόντα αυτά (Baumann και Bisping 1995, Allagheny et al. 1996, Kiers et al. 2000, Sarkar και Tamang 1995) και η κατανόησή της μπορεί

12 να οδηγήσει στον έλεγχο μιας ζύμωσης και τον καθορισμό της διάρκειά της ως το επιθυμητό αποτέλεσμα. Έκκριση αμυλάσης, κυτταρινάσσης και πηκτινο-μεθυλ-εστεράσης από τους μικροοργανισμούς προκαλεί διάσπαση των μεγαλομοριακών υδατανθράκων του αμύλου, της κυτταρίνης και της πηκτίνης αντίστοιχα, συμβάλλει στο μαλάκωμα της υφής και ελευθερώνει σάκχαρα που διαφορετικά δεν θα ήταν αφομοιώσιμα από τον οργανισμό του ανθρώπου, παρέχοντας άμεσα διαθέσιμη ενέργεια. Ελευθερώνονται επίσης θρεπτικά συστατικά που πριν ήταν εγκλωβισμένα σε άπεπτες κυτταρικές δομές. Δράση των λιπασών αυξάνει σε κάποια προϊόντα τα ελεύθερα λιπαρά οξέα συμπεριλαμβανομένων του λινολεϊκού και του λινολενικού καθιστώντας τα αφομοιώσιμα όπως στο tempe (Steinkraus 1996) αλλά και άλλα προϊόντα (Prinyawiwatkul et al.1996). Πολλοί μικροοργανισμοί που συμμετέχουν στις ζυμώσεις έχουν την ικανότητα να συνθέτουν βιταμίνες εμπλουτίζοντας το περιεχόμενο των ζυμωμένων τροφίμων σε βιταμίνες. Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση εμπλουτισμού του tempe με τη βιταμίνη Β12 που συντίθεται από το βακτήριο Klebsiella pneumonieae, που συμμετέχει στη ζύμωση του συγκεκριμένου προϊόντος, κυρίως όταν αυτό παρασκευάζεται παραδοσιακά (Steinkraus 1996). Σε πολλά ζυμωμένα προϊόντα επιτυγχάνεται μείωση ή εξάλλειψη ορισμένων αντιδιατροφικών παραγόντων. Η μείωση αυτή επιτυγχάνεται σε κάποιο βαθμό και από τις διαδικασίες που προηγούνται της ζύμωσης, όπως πλύσιμο ή μούλιασμα με νερό και θέρμανση με ψήσιμο ή βράσιμο, αλλά πολύ μεγαλύτερη μείωση των ανεπιθύμητων συστατικών επιτυγχάνεται κατά την κύρια διαδικασία της ζύμωσης. Οι διαδικασίες όμως αυτές επιφέρουν παράλληλα και απώλεια υδατοδιαλυτών ή θερμοευαίσθητων θρεπτικών ουσιών, όπως ανόργανα συστατικά και βιταμίνες (Prinyawiwatkul et al.1996, Sánchez-Mata et al. 1999). Στα ζυμωμένα προϊόντα οσπρίων αναπτύσσονται οσμή γεύση και υφή διαφορετική του αρχικού προϊόντος, χαρακτηριστικά αρεστά στους καταναλωτές των χωρών που τα παράγουν. Αρκετά από αυτά έχουν χαρακτηριστική οσμή κρέατος πού οφείλεται στο γλουταμικό (glutamate) το οποίο σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης όπως π.χ. στο dawadawa (Beaumont 2002). Ορισμένοι εξάλλου μύκητες που αναπτύσσονται κατά τη ζύμωση των οσπρίων παράγουν γλουταμινάση (ένζυμο που διασπά τη γλουταμίνη) και συμβάλλουν στην δημιουργία αρώματος κρέατος, όπως τα

13 είδη του Aspergillus που αναπτύσσονται στην πρώτη φάση παραγωγής της soy sauce. Εξίσου σημαντική είναι η συμβολή και άλλων αμινοξέων, και αρωματικών ουσιών. Το miso και η soy sauce έχουν επίσης χαρακτηριστικό άρωμα και γεύση κρέατος. Πάνω από 100 αρωματικές ενώσεις βρέθηκαν κατά την ανάλυση διαφόρων κλασμάτων της soy sauce (Reddy et al. 1982). Μεταξύ αυτών συμπεριλαμβάνονται πυραζίνες, πυριδίνες, οξαζόλες, εστέρες, αλκοόλες, καρβονύλια, λακτόνες, φουράνια, φουρανόνες, πυράνια, φαινόλες, οξέα και άλλες 16 διαφορετικές ενώσεις. Στο natto (SSF σόγιας) αναπτύσσεται χαρακτηριστική οσμή αμμωνίας, λόγω της αλκαλικής ζύμωσης που λαμβάνει χώρα από τον Bacillus natto, στέλεχος του B. subtilis. Η οσμή αυτή είναι αρεστή, αλλά αν η συγκέντρωσή της ξεπεράσει το 0,2 % το προϊόν γίνεται ανεπιθύμητο. Η επιφανειακή υφή του προϊόντος αυτού είναι γλοιώδης λόγω ουσιών που παράγονται από τον Β. natto, επιθυμητή στους καταναλωτές των χωρών που το παράγουν αλλά δύσκολα αποδεκτή από τους καταναλωτές του Δυτικού κόσμου. Όλες οι παραπάνω μεταβολές που συμβαίνουν σε πολλά από τα προϊόντα του πίνακα 2.1.2. καθιστούν τα προϊόντα αυτά υποκατάστατα του κρέατος για τους λαούς των αναπτυσσόμενων χωρών παρέχοντάς τους πρωτεΐνη υψηλής ποιότητας. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια αρκετά απ αυτά άρχισαν να γίνονται δημοφιλή και στο Δυτικό κόσμο (soy sauce σε Αμερική και Ευρώπη, miso και tempeh σε Αμερική). Συμπερασματικά, τα οφέλη της ζύμωσης των οσπρίων συνοψίζονται ως εξής (Steinkraus 1996): -Εμπλουτισμός του διαιτολογίου με προϊόντα που ποικίλουν σε γεύση, άρωμα, δομή και εμφάνιση. -Συντήρηση των προϊόντων μέσω της ζύμωσης (γαλακτική, αλκοολική, οξική, αλκαλική). -Μείωση αντιδιατροφικών παραγόντων. -Μείωση χρόνου και κατανάλωσης καυσίμου που απαιτούνται για το μαγείρεμα. 2.3. Προϊόντα ζύμωσης ρεβιθιού Η βιβλιογραφία αναφέρει κυρίως προϊόντα ζύμωσης που να χρησιμοποιούν ως πρώτη ύλη σπέρματα ρεβιθιών σε συνδυασμό με κάποιο δημητριακό ή/και πηγμένο γάλα, όπως το Dhokla, το Khaman και το Dosa στην Ινδία, το Waries στην Ινδία και το Πακιστάν (Πίνακας 2.1.3). Το Dhokla και το Khaman είναι παρόμοια και μπορούν να παρασκευάστουν μόνο από σπόρους ρεβιθιού χωρισμένους στη μέση

14 (dhal) ή σπόρους ρεβιθιού και άλλο όσπριο ή δημητριακό όπως π.χ. ρύζι. (Chavan et al. 1986, Reddy et al. 1982). Στα προϊόντα αυτά προστίθεται σχεδόν πάντα και πηγμένο γάλα ή βουτυρόγαλο οπότε στη ζύμωση εισέρχονται και οι μικροοργανισμοί του γάλακτος και επικρατούν είδη γαλακτικών βακτηρίων, όπως Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus fermenti, Lb. delbrueckii, L. lactis, Pediococcus acidilactici, ζύμες αλλά και Bacillus sp. Τα προϊόντα αυτά έχουν σπογγώδη υφή, καταναλώνονται με μορφή κέικ μαγειρεμένο στον ατμό (Dhokla, Khaman) ή ως αρτύματα σε μαγειρεμένα λαχανικά (Waries). Στο σχήμα 2.3.1. δίνεται συνοπτικά η παρασκευή του Dhokla και του Khaman. Ζυμωμένο ρεβίθι δηλαδή «ρεβιθομαγιά» ως διογκωτικός παράγοντας για την παρασκευή ψωμιού δεν συναντάται στη βιβλιογραφία. Η τεχνολογία παρασκευής της περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο 2.5. 2.4. Το προζύμι στην παρασκευή του ψωμιού Παραδοσιακά στην Ελλάδα χρησιμοποιείται ακόμη και σήμερα προζύμι (όξινο ζυμάρι) από αλεύρι και νερό τόσο στο σπίτι όσο και στην βιομηχανία άρτου. Δεν υπάρχει μια συγκεκριμένη τεχνική παρασκευής και η κάθε νοικοκυρά ή ο κάθε αρτοποιός χρησιμοποιεί τη δική του τεχνική. Μια τυπική συνταγή παρασκευής είναι η παρακάτω: Tο ζύμωμα με προζύμι γίνεται σε δύο φάσεις. H πρώτη είναι το «ανάπιασμα», δηλαδή η δημιουργία μιας ζύμης με το 1/3 ή 1/4 της συνολικής ποσότητας του αλεύρου που θα χρησιμοποιηθεί και νερό. H πρώτη αυτή ζύμη σκεπάζεται και μένει 8-10 ώρες και στη συνέχεια προστίθεται και το υπόλοιπο αλεύρι και γίνεται το τελικό ζύμωμα. Από την αναλογία του αλεύρου που χρησιμοποιείται για το «ανάπιασμα» εξαρτάται η «ξινάδα» του ψωμιού. Oσο περισσότερο αλεύρι από τη συνολική ποσότητα αναπιάνεται, τόσο πιο ξινό θα γίνει το ψωμί. Aυτό ρυθμίζεται από τοπικές ή οικογενειακές συνήθειες. Ο χρόνος ανάμεσα στα «αναπιάσματα» και το πόσα «αναπιάσματα» θα γίνουν ποικίλουν από περιοχή σε περιοχή (Βουτσινά 2004). Στη βιομηχανία χρησιμοποιούνται και έτοιμα σκευάσματα «όξινης ζύμης» (Παραμυθιώτης 2007), ενώ η ρεβιθομαγιά σήμερα χρησιμοποείται από ελάχιστο αριθμό παραδοσιακών φούρνων λόγω της δυσκολίας στην παρασκευή της και της μη σίγουρης επιτυχίας της. Προζύμι έφτιαχναν, ή «έπιαναν» όπως λέγανε παλαιότερα οι νοικοκυρές στο σπίτι από τον αγιασμό και το βασιλικό που έπαιρναν την ημέρα εορτής του «Τιμίου

Σπόροι ρεβιθιού χωρισμένοι στη μέση (100 gr) Εμβάπτιση σε 100 ml νερό με 25% βουτυρόγαλο ή πήγμα γάλακτος Επώαση 12, ώρες 32 ο C Προσθήκη αρτυματικών (τζίντζερ, σκόρδο, πράσινες καυτερες πιπεριές, αλάτι, ζάχαρη, σόδα) Σχηματισμός χυλού Άτμιση 10-15 min σε αβαθές σκεύος με λίγο λάδι Προσθήκη καρυκευμάτων όπως σπόροι μουστάρδας, φύλλα κόλλιανδρου κ.α. Σερβίρισμα σε κομμάτια Σπόροι ρεβιθιού χωρισμένοι στη μέση (150 gr) + αλεύρι από Vinga mungo (150 gr) + ρύζι (300 gr) Χονδροάλεσμα Εμβάπτιση σε βουτυρόγαλο για 8 ώρες Προσθήκη αρτυματικών (αλάτι, κόλλιανδρο, πράσινες καυτερες πιπεριές, σόδα) Άτμιση 10 min σε αβαθές σκεύος με λίγο λάδι Προσθήκη καρυκευμάτων όπως σπόροι μουστάρδας, Σερβίρισμα σε κομμάτια KΗΑΜΑΝ 15 DHOKLA Σχήμα 2.3.1. Παρασκευή δύο παραδοσιακών ζυμωμένων προϊόντων της Ινδίας (Dhokla και Khaman) με βάση το ρεβίθι.

16 Σταυρού», την 14 η Σεπτεμβρίου κάθε έτους. Ανακάτευαν τον αγιασμό και τα φύλλα του βασιλικού με αλεύρι και το άφηναν 1-2 ημέρες να φουσκώσει. Στη συνέχεια πρόσθεταν και άλλο αλεύρι και νερό και το άφηναν άλλες 1-2 ημέρες. Το χωρίζανε σε μικρές μπάλλες οι οποίες αφού ξεραίνονταν μπορούσαν να διατηρηθούν αρκετό καιρό και να χρησιμοποιούνται ξανά για επόμενες παρασκευές ψωμιού κατόπιν ενυδάτωσης (προφορική παράδοση). Προζύμι με βασιλικό παρασκεύαζαν ακόμη και στην Αρχαία Ελλάδα 1. Kαι άλλες, πιο εξεζητημένες τεχνικές για τη δημιουργία προζυμιού υπάρχουν, αλλά είναι σπανιότερες. Πρόκειται για το «ψωμί του λουλουδιού». Mαζεύονται τα λουλούδια του λυκίσκου (μπιρόχορτο) και ξεραίνονται στη συνέχεια βράζονται, προστίθεται λίγη ζάχαρη και φτιάχνεται μια μικρή ζύμη που στη συνέχεια τρίβεται και ξεραίνεται κι έτσι διατηρείται για πολύ καιρό με τη μορφή τραχανά. Oταν θέλουν να ζυμώσουν, μουλιάζουν λίγο από αυτό το υλικό και ακολουθούν τη διαδικασία ζυμώματος με προζύμι (Βουτσινά, 2004). Για τα προζύμια αυτά με βασιλικό και λυκίσκο δεν βρέθηκαν βιβλιογραφικές αναφορές για τη σύνθεση της μικροχλωρίδας και το ρόλο των συγκεκριμένων φυτών στη διόγκωση του ψωμιού. Η ζύμη αρτοποιίας αποτελείται από στελέχη της ζύμης Saccharomyces cereviseae, ενώ στην «όξινη ζύμη» συνυπάρχουν στελέχη ζυμών και λακτοβακίλων, τόσο ομοζυμωτικών όσο και ετεροζυμωτικών. Από τις ζύμες συχνότερα απαντώνται τα είδη Saccharomyces cereviseae, S. exiguous, Candita krusei, Pichia norvegensis και Hansenula aromata, ενώ από τα γαλακτικά βακτήρια συχνότερα απαντώνται τα είδη Lactobacillus sanfranciensis, Lactobacillus plantarum και Lactobacillus brevis ενώ περιστασιακά μπορούν να βρεθούν Leuconostocs sp., Pediococcus sp. (Gobbetti 1998). Στη διεθνή βιβλιογραφία αναφέρεται και η παραγωγή ενός ψωμιού χωρίς προσθήκη ζύμης, αλλά με ένα προζύμι όπου υπεύθυνος μικροοργανισμός για τη διόγκωση είναι το Clostridium perfringens (Juckett et al. 2008). Ονομάζεται Salt Rising Bread (SRB) και για την παρασκευή του αναμιγνύεται αλεύρι με γάλα ή νερό, πατάτες και αλάτι. Είναι ένα παραδοσιακό ψωμί που γίνεται ακόμη και σήμερα στα Απαλάχεια όρη, στη Βιρτζίνια των ΗΠΑ, αλλά αναφορές για την παρασκευή του υπάρχουν και στην Αυστρία και Γερμανία όπου είναι γνωστό ως Hefefreibrot (ψωμί ελεύθερο ζύμης) ή Südstaatenbrot (ψωμί νοτίων πολιτειών). 1 www.hellenicpantheon.gr

17 Τα πλεονεκτήματα που έχει το ψωμί που φτιάχνεται με προζύμι είναι η χαρακτηριστική του γεύση, η μεγαλύτερη διατηρησιμότητά του στο ράφι (κοινώς μπαγιάτεμα) και η καθυστέρηση ανάπτυξης μούχλας στην επιφάνειά του, σε σχέση με το ψωμί που για την παρασκευή του χρησιμοποιείται ζύμη αρτοποιίας, χωρίς την προσθήκη συντηρητικών για αναχαίτηση των μυκήτων (Gobetti 1998). 2.5. Παρασκευή ρεβιθομαγιάς και εφτάζυμου Η ρεβιθομαγιά είναι το προϊόν της ζύμωσης των σπόρων ρεβιθιού που παραδοσιακά χρησιμοποιείται για την παρασκευή του εφτάζυμου ψωμιού και συμβάλλει στην διόγκωσή του, στα οργανοληπτικά του χαρακτηριστικά και στη συντήρησή του. Είναι σύνθετη λέξη: ρεβίθι + μαγιά. Η λέξη «μαγιά» είναι τούρκικης προέλευσης (maya, Μπαμπινιώτης 2002 ) αλλά χρησιμοποιείται ευρέως στην Ελλάδα για να χαρακτηρίσει οποιαδήποτε καλλιέργεια μικροοργανισμών που χρησιμοποιείται για παραγωγή ζυμωμένων προϊόντων. Η αντίστοιχη ελληνική λέξη είναι «ζύμη». Η παραδοσιακή παρασκευή της ρεβιθομαγιάς για την παραγωγή του εφτάζυμου, όπως την αφηγήθηκαν ηλικιωμένες κυρίες από το Σκαλοχώρι του νομού Κοζάνης και την ακολουθούσαν πιστά από τα παιδικά τους χρόνια, είναι η εξής: «Έσπαζαν μια καλή χούφτα ρεβίθια σε αδρόκοκκα κομμάτια με μεταλλικό γουδί και γουδοχέρι και τα τοθετούσαν σε πήλινο κιούπι. Στη συνέχεια πρόσθεταν ένα μπρίκι βραστό νερό και προαιρετικά 1 κλωνάρι ξερό βασιλικό. Σκέπαζαν το κιούπι με πετσέτα, το τύλιγαν με κουβέρτες για να κρατηθεί ζεστό και έπρεπε να μείνει ακίνητο κοντά στο τζάκι για να «φουσκώσουν» τα ρεβίθια. Αυτό γινόταν αργά το απόγευμα και την άλλη μέρα το πρωί άνοιγαν το κιούπι και η παρουσία αφρού πάχους 3-4 δάχτυλα καθώς και το χαρακτηριστικό άρωμα που ανέδιδε δήλωναν την επιτυχία της ζύμωσης. Στη συνέχεια το ζυμωμένο εκχύλισμα μεταφερόταν σε ρηχό πήλινο σκεύος και πρόσθεταν τόση ποσότητα αλεύρου έως ότου γίνει ένας χυλός, τον οποίο διατηρούσαν επίσης ζεστό για 1-2 ώρες. Αφού φούσκωνε και ο χυλός πρόσθεταν και άλλο αλεύρι, χλιαρό νερό και λίγα ακόμη σπασμένα ρεβίθια έως ότου γίνει μια κανονική ζύμη για ψωμί. Τη ζύμη αυτή την έπλαθαν σε στρόγγυλες κουλούρες τις οποίες τοποθετούσαν σε λαδωμένο ταψί, τις αφήνανε σε ζεστό μέρος για να φουσκώσουν και στη συνέχεια τις ψήνανε.» Η παραπάνω τεχνολογία παρασκευής με ποσοτικοποιημένα τα μεγέθη δίνεται παραστατικά με φωτογραφίες στο σχήμα 2.4.1.