ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΑΡΧΕΣ ΓΟΝΙ ΙΑΚΟΥ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ ΙΙ (ΜΑΘΗΜΑ 3ο) 1
ΦΟΡΕΙΣ πλασµίδια βακτηρίων βακτηριοφάγοι ιοί συνδυασµός πλασµιδίου βακτηριοφάγου (κοσµίδια) 2
ΦΟΡΕΙΣ Βακτηριοφάγοι Χαρακτηριστικά βακτηριοφάγων λ: Γραµµικό DNA 50.000 βάσεων, µε άκρα cos (µονόκλωνα συµπληρωµατικά, που επιτρέπει να παίρνει κυκλική µορφή όπως το πλασµίδιο και να µεταµορφώνει βακτήρια) Στο βακτηριακό κύτταρο (Ε. coli) γίνεται κυκλικό και αντιγράφεται. Παρόλη την πολυπλοκότητα (µέγεθος) σε σχέση µε το πλασµίδιο είναι καλοί φορείς λόγω των πλεονεκτηµάτων τους Πλεονεκτήµατα του DNA των φάγων: 1. Το 1/3του DNAτου ιού µπορεί να αντικατασταθεί από ξένο DNA 2. Έχει ορισµένες θέσεις περιορισµού σε συγκεκριµένα σηµεία για την ένθεση του «ξένου» γονιδίου 3. Ανασυνδυασµένο ενσωµατώνεται επιτυχώς στην πρωτεϊνική κάψα του ιού 4. έχονται µεγάλο τµήµα «ξένου» DNA (12-22kb) 5. To µέγεθος του ένθετου τµήµατος δεν επηρεάζει την ικανότητα µόλυνσης Ανασυνδυασµός µόλυνση βακτηρίου πολ/σµός φάγου λύση βακτηρίου 1000 φάγοι 3
ΦΟΡΕΙΣ Βακτηριοφάγοι λ φορείς ένθεσης (για δηµιουργία cdna βιβλιοθηκών) : λ φορείς αντικατάστασης (για δηµιουργία γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών) : Εικ. 1.5 4
ΦΟΡΕΙΣ Βακτηριοφάγοι λ φορείς ένθεσης (για δηµιουργία cdna βιβλιοθηκών) : Εικ. 1.5 5
ΦΟΡΕΙΣ Βακτηριοφάγοι λ φορείς αντικατάστασης (για δηµιουργία γονιδιωµατικών βιβλιοθηκών) : 6 Εικ. 1.6
ΦΟΡΕΙΣ Κοσµίδιο: συνδυασµός φάγου και πλασµιδίου {cos+(plas)mid=cosmid} δέχεται ξένο DNA µεγέθους µέχρι 45 kb Πλεονεκτήµατα: 1. Μειώνεται ο απαιτούµενος αριθµός κλώνων 2. Μπορεί να συµπεριλάβει µεγάλα γονίδια (>20kb) ή οικογένειες γονιδίων 7 Εικ. 1.7
ΦΟΡΕΙΣ Κοσµίδιο: Εικ. 1.8 8
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ DNA Ηλεκτροφόρηση τεµαχισµένων DNA σε πηχτή αγαρόζης Πηχτή αγαρόζης: Σύµπλοκο πολυµερών σακχάρων µε µέγεθος πόρων εξαρτώµενο από τη σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος και της συγκέντρωσης (%) της αγαρόζης (όσο µικρότερη η συγκέντρωση τόσο µεγαλύτεροι οι πόροι) Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA εξαρτάται από το µέγεθος των πόρων της πηχτής (όσο µεγαλύτεροι πόροι τόσο µεγαλύτερα τµήµατα DNA διαχωρίζονται). Πχ σε πηχτή µε 0,8% αγαρόζη διαχωρίζονται τµήµατα DNA 10.000-12.000 βάσεων Με πολύ µεγάλους πόρους τα µικρά και µεγάλα τµήµατα αντίστοιχα έχουν την ίδια κινητικότητα και δεν διαχωρίζονται 9
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ DNA 1. Κατασκευή γενετικού χάρτη (restriction map) (αλληλούχιση των τµηµάτων DNA) 200 50 400 100 10
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ DNA 11 5 άκρο 3 άκρο 3 άκρο Θυµίνη Αδενίνη Θυµίνη Αδενίνη Κυτοσίνη Γουανίνη Αδενίνη Θυµίνη Γουανίνη Κυτοσίνη 5 άκρο
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ DNA 1. Κατασκευή γενετικού χάρτη (restriction map) (αλληλούχιση των τµηµάτων DNA) 200 50 400 100 bp Πηχτή µε πλήρη αποκοπή των DNA - Πηχτή µε µερική αποκοπή των DNA 800 700 600 500 400 400 750 650 550 500 450 400 300 200 200 250 200 100 100 100 0 50 + 50 12 Ζώνη που αντιστοιχεί σε τµήµα DNA µε ραδιενεργό ακτινοβολία
ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ 2. Υβριδισµός DNA κατά Southern Εικ. 1.11 13
ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ 2. Υβριδισµός DNA κατά Southern ανάλυση DNA διπλοειδούς (1, 2) και απλοειδούς (3, 4) καρότου Εικ. 1.15 14
3. Σάρωση βιβλιοθήκης ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Ανάπτυξη κλώνων σε θρεπτικό µέσο προσκόλληση σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης µετουσίωση DNA υβριδισµός µε κατάλληλο ανιχνευτή Εικ. 1.16 15
3. Σάρωση βιβλιοθήκης ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ 3.1. Σάρωση cdna βιβλιοθήκης για γονίδιο µε έντονη έκφραση Επιλογή τυχαίου δείγµατος cdna (πχ 20) προσκόλληση σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης µετουσίωση DNA υβριδισµός µε mrna αποµόνωση των mrna µετάφραση για την ταυτοποίηση της πρωτεϊνης 16
3. Σάρωση βιβλιοθήκης 3.2. Ετερόλογος υβριδισµός ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Εφαρµόζεται για τον εντοπισµό ενός γονιδίου µε ανιχνευτή από ανάλογο γονίδιο άλλου οργανισµού (ετερόλογος δείκτης) ανιχνευτής A G C T A A G C A T T G A A G C T A A G C A T T G A T C C A A T C G A A A C T A G C T A A G C A T T G A C C G A G T A G T A C C G 17
3. Σάρωση βιβλιοθήκης ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ 3.4. Χρωµοσωµικό «βάδισµα» Όταν γνωρίζουµε την απόσταση του επιθυµητού γονιδίου από µια γνωστή γονιδιακή θέση, και έχουµε ανασυνδυασµένο κλώνο µε τµήµα του γονιδιώµατος της γνωστής θέσης µπορούµε να βρούµε τον ανασυνδυασµένο κλώνο για το επιθυµητό γονίδιο, βρίσκοντας σταδιακά άλλους που έχουν τα ενδιάµεσα τµήµατα. Ο τελευταίος θα υβριδίσει στη γνωστή απόσταση. 8 7 6 5 4 3 2 1 γονίδιο 200 kb Κλωνοποιηµένη θέση Εικ. 1.18 18
3. Σάρωση βιβλιοθήκης 3.6. ιαφορική σάρωση ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Γίνεται για τον προσδιορισµό γονιδίων που εκφράζονται σε δύο διαφορετικούς ιστούς Ο ανιχνευτής ss DNA (µονόκλωνο cdna) προέρχεται από τον άλλο ιστό ώστε να προσδιοριστούν οι κοινοί κλώνοι 19 Εικ. 1.21
3. Σάρωση βιβλιοθήκης ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΓΟΝΙ ΙΩΝ 3.6. Αφαιρετικές βιβλιοθήκες Εφαρµόζεται όταν θέλουµε να αποµονώσουµε γονίδια που εκφράζονται µόνο στον ένα ιστό. Από τα mrna του ενός ιστού για τον οποίο επιδιώκεται η αφαιρετική βιβλιοθήκη, προκύπτουν ss cdna. Όσα αντιστοιχούν σε κοινά mrna υβριδίζουν µε mrna του άλλου ιστού. Αυτά που δεν υβριδίζουν διπλασιάζονται και δηµιουργείται η αφαιρετική βιβλιοθήκη. Εικ. 1.22 20
ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Ποιοτική ποσοτική έκφραση Υβριδισµόςκατά Northern: Χρησιµοποιώντας ως ανιχνευτή το γονίδιο υβριδίζεται το αντίστοιχο mrna και στη συνέχεια ηλεκτροφορείται ποσοτική έκφραση δύο γονιδίων καρότου σε συνθήκες κανονικές (c), και καταπόνησης Εικ. 1.24 21
Τοπική χρονική έκφραση ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Εντοπισµός έκφρασης ενός γονιδίου ελιάς σε τοµές νεαρού φύλλου (Α- ) και ωοθήκης (Ε- Ζ). Το µπλε αντιπροσωπεύει υβριδισµό, άρα και εντοπισµό του mrna σε πασαλλώδη (Pc)ή παρεγχυµατικά (Sc)κύτταρα. Έντονη έκφραση εντοπίζεται στα αγγεία (Vb) Α και Ε µάρτυρες (δεν εφαρµόστηκε υβριδισµός) εντοπισµός ιστών ελιάς που εκφράζουν ένα γονίδιο (υβριδισµός in situ µε το αντίστοιχο mrna) (Α, Ε µάρτυρες) Εικ. 1.25 22
ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Ανάλυση αλληλουχίας (ενζυµική µέθοδος) δεσοξυ-ριβονουκλεοτίδιο δι-δεσοξυ-ριβονουκλεοτίδιο Εικ. 1.27 23
ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Ανάλυση αλληλουχίας (ενζυµική µέθοδος) primer 5 3 T C G G A T C T G A 3 5 5 A-G-C-C-T-A-G-A-C-T 3 24
ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙ ΙΩΝ Ανάλυση αλληλουχίας (ενζυµική µέθοδος) primer 5 3 T C G G A T C T G A 3 5 dda ddg ddc ddt 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 5 A-G-C-C-T-A-G-A-C-T 3 25
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποια είναι τα χαρακτηριστικά και τα πλεονεκτήµατα των βακτηριοφάγων ως φορέων DNA στη δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών Πως αξιοποιούνται οι βακτηριοφάγοι ιοί ως φορείς για γενετική τροποποίηση; Πως αξιοποιούνται οι βακτηριοφάγοι λ φορείς ένθεσης στη δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών Πως αξιοποιούνται οι βακτηριοφάγοι λ φορείς αντικατάστασης στη δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών Τι είναι το κοσµίδιο και ποια τα πλεονεκτήµατα ως φορέα DNA στη δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών Πως αξιοποιούνται τα κοσµίδια στη δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών Ποια είναι τα χαρακτηριστικά και οι ιδιότητες της αγαρόζης ως µέσο ηλεκτροφόρησης DNA Να εξηγηθεί η τεχνική κατασκευής του χρωµοσωµικού χάρτη περιοριστικών θέσεων (από βιβλίο Γενετικής) Να περιγραφεί η διαδικασία του υβριδισµού DNA κατά Southern Να περιγραφεί η γενική διαδικασία εντοπισµού γονιδίου µε σάρωση βιβλιοθήκης Σάρωση βιβλιοθήκης για εντοπισµό γονιδίων µε έντονη έκφραση Σάρωση βιβλιοθήκης για εντοπισµό γονιδίων µε ετερόλογο υβριδισµό Σάρωση βιβλιοθήκης για εντοπισµό γονιδίων µε χρωµοσωµικό «βάδισµα» Στόχος και διαδικασία της διαφορικής σάρωσης Στόχος και διαδικασία δηµιουργίας αφαιρετικών βιβλιοθηκών Να περιγραφεί η ενζυµική µέθοδος ανάλυσης της αλληλουχίας DNA (από βιβλίο Γενετικής) 26
3. Οι βακτηριοφάγοι ιοί λόγω των χαρακτηριστικών τους εµφανίζουν σηµαντικά πλεονεκτήµατα όταν αξιοποιούνται ως φορείς «ξένου» γονιδίου για τη γενετική τροποποίηση των φυτών, όπως για παράδειγµα ότι µπορούν να δεχτούν µεγαλύτερο τµήµα «ξένου» DNA σε σύγκριση µε το πλασµίδιο. Μετά τον ανασυνδυασµό του DNA του ιού µε το «ξένο» γονίδιο και την ενσωµάτωσή του στην πρωτεϊνική κάψα του ιού, µολύνονται βακτήρια. Σε µολυσµένο βακτήριο το ανασυνδυασµένο DNA του ιού πολλαπλασιάζεται και δηµιουργεί µέχρι και 1000 αντίγραφα που στη συνέχεια προκαλούν την αποδιοργάνωση (λύση) του βακτηρίου µε αποτέλεσµα να ελευθερώνονται χιλιάδες ιοί φορείς του «ξένου» γονιδίου. Έτσι δηµιουργούνται πολλά αντίγραφα του φορέα που µπορεί να χρησιµοποιηθούν για τη µεταµόρφωση βακτηρίων και στη συνέχεια τη γενετική τροποποίηση των φυτών. 4. Οι βακτηριοφάγοι ιοί ως φορείς διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τους λ φορείς ένθεσης στους οποίους το «ξένο» γονίδιο τοποθετείται σε ένα σηµείο του DNA του ιού όπου αναγνωρίζεται από περιοριστικό ένζυµο µια θέση περιορισµού και δηµιουργεί µια τοµή, και στους λ φορείς αντικατάστασης στους οποίους η τοµή γίνεται σε δύο σηµεία (θέσεις περιορισµού) µε αποτέλεσµα το ενδιάµεσο τµήµα των δύο θέσεων να αντικαθίσταται από το «ξένο» γονίδιο.
5 Το τµήµα Τ3-Τ7 δείχνει διάφορα σηµεία περιορισµού που αναγνωρίζονται από διαφορετικά περιοριστικά ένζυµα. Ο χειρισµός του ιού µε ένα από τα ένζυµα αυτά δηµιουργεί µια τοµή, ώστε µε τη συνδροµή της λιγάσης να γίνει ανασυνδυασµός µε το «ξένο» γονίδιο. Η θέση Amp αναφέρεται σε γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό (αµπικιλίνη), οπότε η χρήση του αντιβιοτικού βοηθάει στο να επιλεγούν µόνο µεταµορφωµένα βακτήρια στα οποία περιλαµβάνεται ο ανασυνδυασµένος φάγος. Επειδή ουσιαστικά το «ξένο» γονίδιο προστίθεται χωρίς να αποµακρύνεται αντίστοιχο τµήµα στο DNA του ιού, οι λ φορείς ένθεσης µπορούν να αποτελέσουν φορείς µόνο µικρών τµηµάτων και έτσι χρησιµοποιούνται ως φορείς cdna γονιδίων στη δηµιουργία γενετικών βιβλιοθηκών. 6 Βλέπουµε για κάθε περιοριστικό ένζυµο περισσότερα απο ένα σηµεία περιορισµού, µε αποτέλεσµα να αποµακρύνεται τµήµα και να αντικαθίσταται από το «ξένο» DNA ολόκληρο τµήµα Μόνο οι ανασυνδυασµένοι φάγοι µπορούν να αναπτυχθούν γιατί βακτήρια που δεν τα περιλαµβάνουν αποµακρύνονται µε χρήση αντιβιοτικού. 7 Ο συνδυασµός DNA βακτηριοφάγου µε πλασµίδιο οδηγεί σε κοσµίδιο που έχει την ικανότητα να «φιλοξενήσει» ακόµη µεγαλύτερο τµήµα «ξένου» DNA. Έτσι για πολύ µεγάλα γενώµατα, πχ καλαµπόκι, στα οποία απαιτείται πολύ µεγάλος αριθµός κλώνων για τη δηµιουργία πλήρους γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης, προτιµώνται τεχνητοί φορείς όπως είναι τα κοσµίδια που δέχονται µεγάλα τµήµατα "ξένου" DNA, ώστε να µειωθεί ο απαιτούµενος αριθµός κλώνων. Η µορφή του κοσµιδίου είναι παρόµοια µε αυτή του πλασµιδίου, περιλαµβάνοντας αρχή αντιγραφής από όπου αρχίζει η αναπαραγωγή του, θέση κλωνοποίησης όπου ενσωµατώνεται το «ξένο» DNA, και γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό για την ταυτοποίηση µεταµορφωµένων µε το ανασυνδυασµένο κοσµίδιο βακτηρίων. 8 Τα κυκλικά µορια των κοσµιδίων γίνονται ευθύγραµµα µε ένζυµο περιορισµού (E/Π), και ανασυνδυάζονται όπου µε τη λιγάση ενώνονται µε ευκαρυωτικό «ξένο» DNA δηµιουργώντας µεγαλοµοριακές ενώσεις κοσµίδιο ευκαρυωτικό κοσµίδιο. Στη συνέχεια το ανασυνδυασµένο κοσµίδιο «πακετάρεται» στην κεφαλή (πρωτεϊνική κάψα) του ιού, και τέλος εισέρχεται στο βακτήριο όπου συµπεριφέρεται σαν πλασµίδιο.
9 Η ηλεκτροφόρηση κατάλληλων τµηµάτων DNA σε πηχτή αγαρόζης αναφέρεται στην κατασκευή γενετικού χάρτη, στον εντοπισµό ενός γονιδίου είτε σε ολόκληρο το γένωµα από φυτικούς ιστούς είτε σε ανασυνδυασµένο DNA σε κλώνους βιβλιοθηκών, και στην ποιοτική ή ποσοτική ανάλυση έκφρασης ενός γονιδίου 10 Η κατασκευή του γενετικού χάρτη αποσκοπεί στον εντοπισµό των σηµείων του γενώµατος, δηλ. κάθε χρωµοσώµατος, που αποτελούν σηµείο περιορισµού για ένα συγκεκριµένο περιοριστικό ένζυµο. Για τη διευκόλυνση της διαδικασίας τα δύο άκρα του χρωµοσώµατος επισηµαίνονται. 11 Η επισήµανση των δύο άκρων µπορεί να γίνει συµπεριλαµβάνοντας στη φωσφορική ρίζα των δύο 5 άκρων µε ραδιενεργό φώσφορο (στα 3 άκρα βρίσκονται αζωτούχες βάσεις) (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής) 12 (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής) 13 Για να εντοπιστεί το γονίδιο α, το συνολικό DNA τεµαχίζεται µε κατάλληλο ένζυµο περιορισµού, τα επιµέρους τµήµατα ηλεκτροφορούνται, στη συνέχεια µεταφέρονται σε νιτροκυτταρίνη σε αλκαλικές συνθήκες οπότε µετουσιώνονται και δίνουν µονόκλωνα τµήµατα, στα οποία ο ραδιενεργός ανιχνευτής που είναι οµόλογος του γονιδίου α υβριδίζεται µε αυτό και ακτινοβολώντας δείχνει εκείνα τα τµήµατα στα οποία βρίσκεται το γονίδιο α. 14 ο υβριδισµός µε γνωστό ανιχνευτή (γονίδιο hsp90) εντοπίζει τα γονίδια της οικογένειας hsp90 σε διπλοειδές απλοειδές καρότο (γιατί στο διπλοειδές (στήλες 1 και 2) εµφανίζονται περισσότερες ζώνες που ακτινοβολούν;). ΜΒ: γνωστά µοριακά βάρη εκφρασµένα σε kb. 15 Για τον εντοπισµό ενός γονιδίου σε µια γενετική βιβλιοθήκη εφαρµόζεται η τεχνική της σάρωσης της βιβλιοθήκης. Οι κλώνοι (βακτήρια) στους οποίους έχει κλωνοποιηθεί το DNA πχ ενός φυτού, αναπτύσσονται σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο. Στο µέσο εφαρµόζεται κατάλληλο αντιβιοτικό ώστε να επιβιώσουν µόνο εκείνα τα βακτήρια στα οποία υπάρχει µέρος της βιβλιοθήκης. Επάνω στο µέσο καλλιέργειας των κλώνων τοποθετείται φίλτρο νιτροκυτταρίνης στο οποίο προσκολλώνται τα βακτήρια. Τοποθετώντας το φίλτρο σε αλκαλικό περιβάλλον, λύνονται τα κύτταρα των βακτηρίων και ταυτόχρονα µετουσιώνεται το DNA σε µονόκλωνο. Ο κατάλληλος ανιχνευτής (µοριακός δείκτης) επισηµαίνεται µε ραδιενεργό φώσφορο, υβριδίζεται µε το µετουσιωµένο DNA και ακτινοβολώντας δείχνει σε ποιο κοµµάτι DNA ενώθηκε όπου βρίσκεται το ζητούµενο γονίδιο.
16 Αν το ζητούµενο είναι ένα γονίδιο µε έντονη έκφραση, η διαδικασία της σάρωσης βιβλιοθήκης απλουστεύεται γιατί απαιτείται µικρότερο δείγµα κλώνων. Λόγω της έντονης έκφρασης ένα µικρό τυχαίο δείγµα κλώνων (πχ 20) είναι πολύ πιθανό να περιέχει το γονίδιο στόχος. Στην περίπτωση αυτή ανιχνευτής µπορεί να είναι το αντίστοιχο mrna που υβριδίζεται µε το γονίδιο στο µετουσιωµένο DNA. 17 Αν για το γονίδιο στόχος δεν υπάρχει διαθέσιµος ανιχνευτής που έχει πλήρη αντιστοιχία µαζί του, εφαρµόζεται ο ετερόλογος υβριδισµός. Στον ετερόλογο υβριδισµό ο ανιχνευτής δεν έχει απόλυτη, αλλά µερική αντιστοιχία µε το γονίδιο στόχος. 18 Όταν γνωρίζουµε την απόσταση του επιθυµητού γονιδίου από µια γνωστή γονιδιακή θέση, και έχουµε ανασυνδυασµένο κλώνο µε τµήµα του γενώµατος της γνωστής θέσης µπορούµε να εφαρµόσουµε το χρωµοσωµικό βάδισµα. Προϋπόθεση να υπάρχουν αλληλοεπικαλυπτόµενοι ανασυνδυασµένοι κλώνοι που έχουν τα ενδιάµεσα τµήµατα. Έστω η γνωστή θέση είναι η 1 και επιζητείται ο εντοπισµός της 8 που βρίσκεται σε απόσταση 200 kb. Ο κλώνος 1 υβριδίζεται στη γνωστή θέση 1, ο 2 µε τον 1, ο 3 µε τον 2, ο 4 µε τον 3 κ.ο.κ. και όταν ο κλώνος 8 υβριδίζεται µε τον 7 διανύεται µια απόσταση 200 kb. Αυτό σηµαίνει ότι πάνω στο DNA η αντίστοιχη θέση µε τον κλώνο 8 ανήκει στο επιζητούµενο γονίδιο «στόχος» 19 Γίνεται για τον προσδιορισµό γονιδίων που εκφράζονται σε διαφορετικούς ιστούς ss cdna είναι µονόκλωνο cdna Ο ανιχνευτής προέρχεται από τον άλλο ιστό ώστε να προσδιοριστούν οι κοινοί κλώνοι 20 Εφαρµόζεται όταν θέλουµε να αποµονώσουµε γονίδια που εκφράζονται µόνο στον ένα ιστό. Από τα mrna του ενός ιστού για τον οποίο επιδιώκεται η αφαιρετική βιβλιοθήκη υβριδίζουν, προκύπτουν ss cdna. Όσα αντιστοιχούν σε κοινά mrna υβριδίζουν µε mrna του άλλου ιστού. Αυτά που δεν υβριδίζουν διπλασιάζονται και δηµιουργείται η αφαιρετική βιβλιοθήκη. 21 Ποιοτική: αν εκφράζεται ένα γονίδιο (αν υπάρχει ζώνη εκφράζεται) Ποσοτική: κατά πόσο εκφράζεται (όσο εντονότερη είναι η ζώνη τόσο περισσότερο εκφράζεται) Οι συνθήκες καταπόνησης αφορούν την εφαρµογή 38 βαθµών κελσίου για 1, 2, 3 ώρες. Το r δείχνει την έκφραση µετά από καταπόνηση για 2 ώρες και στη συνέχεια επαναφορά στις κανονικές συνθήκες
22 Εντοπισµός έκφρασης ενός γονιδίου ελιάς σε τοµές νεαρού φύλλου (Α- ) και ωοθήκης (Ε-Ζ). Το µπλε αντιπροσωπεύει υβριδισµό, άρα και εντοπισµό του mrna σε πασαλλώδη (Pc) ή παρεγχυµατικά (Sc) κύτταρα. Έντονη έκφραση εντοπίζεται στα αγγεία (Vb) Α και Ε µάρτυρες (δεν εφαρµόστηκε υβριδισµός) 23 Η αντικατάσταση του ΟΗ µε Η στην πεντόζη µετατρέπει ένα δεσοξυριβονουκλεοτίδιο σε δι- δεσοξυ-ριβονουκλεοτίδιο. Όταν στη σύνθεση DNA τοποθετηθεί δι- δεσοξυ-ριβονουκλεοτίδιο η παραπέρα σύνθεση αναστέλλεται. Η ιδιότητα αυτή αξιοποιείται στην διερεύνηση της αλληλουχίας του DNA (για περισσότερες πληροφορίες ανατρέξτε στο βιβλίο της Γενετικής)