Οδηγίες χρήσης για το CRC RAScan Combination Kit KRAS and NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD για τα συστήματα DHPLC

1 Κατασκευαστής Οδηγίες χρήσης για το CRC RAScan Combination Kit KRAS and NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD για τα συστήματα DHPLC ιαβάστε προσεκτικά αυτές τις οδηγίες χρήσης προτού χρησιμοποιήσετε αυτό το προϊόν. Φυλάξτε αυτές τις οδηγίες χρήσης για μελλοντική αναφορά. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 0

Αυτή η σελίδα έχει παραμείνει σκόπιμα κενή Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 1

Πίνακας περιεχομένων 1 Κατασκευαστής... 3 2 CRC RAScan Combination Kit... 3 2.1 Χρήση για την οποία προορίζεται... 3 2.2 Ενδείξεις χρήσης... 3 3 Αρχές του προσδιορισμού ανίχνευσης μεταλλάξεων CRC RAScan KRAS και NRAS... 4 3.1 KRAS και NRAS... 4 3.2 Ανάλυση δειγμάτων ασθενών με χρήση των κιτ SURVEYOR Scan... 4 3.3 SURVEYOR Nuclease... 5 4 Ιχνηλασιμότητα των μαρτύρων του κιτ... 6 5 Συστατικά... 7 5.1 Κουτί SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107)... 7 5.2 Κουτί SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400)... 8 5.3 Αριθμός δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με ένα κιτ... 8 5.4 Προσδιορισμός αλληλουχίας DNA... 9 6 Επιπλέον απαιτούμενος εξοπλισμός και αντιδραστήρια... 9 7 Παρασκευή αντιδραστηρίων... 9 8 Φύλαξη και διάρκεια ζωής... 10 9 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις... 10 10 Συλλογή, χειρισμός και φύλαξη πρωτογενών δειγμάτων... 10 11 ιαδικασία προσδιορισμού... 11 11.1 Ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων με τα κιτ SURVEYOR Scan Επισκόπηση... 11 12 Οδηγίες βήμα προς βήμα... 12 12.1 ΑΡΧΙΚΗ προετοιμασία/βαθμονόμηση του συστήματος DHPLC... 12 12.2 Ζητήματα που πρέπει να ληφθούν υπόψη πριν από την ανάλυση δείγματος για KRAS και NRAS... 12 12.3 Ζητήματα σχετικά με τη μήτρα... 12 12.4 Ζητήματα σχετικά με τη ροή εργασίας... 12 12.5 Πρωτόκολλο ενίσχυσης... 16 12.6 Πρόγραμμα θερμικού κυκλοποιητή για το πρωτόκολλο ενίσχυσης... 18 12.7 Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων PCR... 18 12.8 Πέψη με SURVEYOR Nuclease... 19 13 ιαδικασίες ελέγχου... 21 13.1 Ποιοτικός έλεγχος του κιτ CRC RAScan Combination Kit... 21 13.2 Χρήση μαρτύρων πλασμιδιακού DNA... 22 14 Ερμηνεία των αποτελεσμάτων... 23 14.1 Ανάλυση των Exons 2, 3 και 4 του KRAS και NRAS με SURVEYOR Nuclease... 23 14.2 Επισκόπηση δεδομένων των αποτελεσμάτων SURVEYOR Scan... 23 14.3 Παραδείγματα αποτελεσμάτων... 24 15 Χαρακτηριστικά απόδοσης... 31 15.1 Επίπεδο ανίχνευσης μεταλλάξεων με τα κιτ SURVEYOR Scan... 31 15.2 Επιβεβαίωση αλληλουχίας... 31 15.3 Περιορισμοί της διαδικασίας προσδιορισμού... 32 Παράρτημα A... 33 A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για τα κιτ SURVEYOR Scan... 33 A.2 Σφραγίδες DNA μάρτυρα... 33 A.3 Απαιτήσεις του συστήματος αποδιατακτικής HPLC (DHPLC)... 34 A.4 Διάταξη εργαστηρίου για τους προσδιορισμούς PCR... 36 A.5 Βιβλιογραφικές αναφορές... 37 Παράρτημα B... 38 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων... 38 Στοιχεία παραγγελίας... 44 Στοιχεία επικοινωνίας... 44 Μετάφραση Αποποίηση... 44 Άδειες, εμπορικά σήματα και πνευματικά δικαιώματα... 45 Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 2

1 Κατασκευαστής 1 Κατασκευαστής Κατασκευαστής Αντιπρόσωπος στην Ε.Ε. M P Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Αρ. τηλ. 1-402-452-5400 Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Αρ. τηλ. +44-141-892-8800 2 CRC RAScan Combination Kit 2.1 Χρήση για την οποία προορίζεται Μόνο για επαγγελματική χρήση. Το κιτ CRC RAScan Combination Kit της Transgenomic είναι μια in vitro διαγνωστική δοκιμασία που ανιχνεύει σωματικές μεταλλάξεις στα Exons 2, 3 και 4 των γονιδίων KRAS και NRAS. Αυτές οι μεταλλάξεις υποδεικνύονται από τις κορυφές διάσπασης με SURVEYOR Nuclease και περιλαμβάνουν τις μεταλλάξεις με γνωστή δυνατότητα κλινικής σπουδαιότητας. Αυτό το κιτ είναι σχεδιασμένο για χρήση σε κλινικό διαγνωστικό εργαστήριο, από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό που διενεργεί εξετάσεις σε DNA εκχυλισμένο από ιστούς που έχουν μονιμοποιηθεί σε φορμόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη. Αυτό το κιτ έχει αριθμό καταλόγου 710077. Αυτές οι οδηγίες χρήσης είναι διαθέσιμες για λήψη στη διαδικτυακή τοποθεσία http://world.transgenomic.com/files/literature/482427-el.pdf. 2.2 Ενδείξεις χρήσης Οι κλινικοί ιατροί μπορούν να χρησιμοποιούν το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC, επικουρικά, ώστε να μπορέσουν να αποφασίσουν εάν οι όγκοι ορθοκολικού καρκίνου των ασθενών μπορεί να μην ανταποκριθούν σε κάποιον θεραπευτικό παράγοντα αντι- EGFR (υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα), όπως είναι το panitumumab. Το κιτ CRC RAScan Combination Kit δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τη διάγνωση του ορθοκολικού καρκίνου ή οποιουδήποτε άλλου τύπου καρκίνου. Το κιτ CRC RAScan Combination Kit είναι ένας προσδιορισμός που ανιχνεύει την παρουσία πιθανών σωματικών μεταλλάξεων στα Exons 2, 3 και 4 των γονιδίων KRAS και NRAS, αλλά δεν επιβεβαιώνει την ταυτότητα της αλληλουχίας της μετάλλαξης. Για την ταυτοποίηση της ακριβούς μετάλλαξης που ανιχνεύθηκε, απαιτείται περαιτέρω ανάλυση, όπως προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA. Παρότι τα αποτελέσματα της ανάλυσης με αυτά τα κιτ θα υποδείξουν την κατάσταση μετάλλαξης του ασθενούς, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη άλλοι κλινικοί παράγοντες. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με χρήση του κιτ CRC RAScan Combination Kit δεν θα πρέπει να αποτελούν τη μοναδική μέθοδο λήψης αποφάσεων σχετικά με οποιαδήποτε θεραπεία ασθενών με ορθοκολικό καρκίνο. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η χρήση του DHPLC για την ταυτοποίηση των θετικών για μετάλλαξη KRAS ή NRAS δειγμάτων με αυτό το κιτ θα πρέπει να αποτελεί μόνο την κατευθυντήρια γραμμή και ότι όλες οι μεταλλάξεις πρέπει να επιβεβαιώνονται με περαιτέρω ανάλυση, όπως με προσδιορισμό της αλληλουχίας DNA. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 3

3 Αρχές του προσδιορισμού ανίχνευσης μεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS και NRAS 3 Αρχές του προσδιορισμού ανίχνευσης μεταλλάξεων CRC RAScan KRAS και NRAS 3.1 KRAS και NRAS Οι θεραπευτικοί παράγοντες που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) έχει καταδειχτεί ότι είναι αποτελεσματικοί έναντι του ορθοκολικού καρκίνου. Η έρευνα έχει καταδείξει ότι περίπου 40% των ορθοκολικών όγκων φέρουν σωματικές μεταλλάξεις του γονιδίου KRAS και οι κλινικές μελέτες κατέδειξαν ότι οι μεταλλάξεις του Exon 2 του KRAS (κωδικόνια 12 και 13) προβλέπουν την απουσία ανταπόκρισης σε θεραπείες αντι-egfr. Πρόσφατες ερευνητικές μελέτες έχουν καταδείξει ότι ο πληθυσμός των ασθενών μπορεί να κατηγοριοποιηθεί περαιτέρω, καθώς οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι μεταστατικού ορθοκολικού καρκίνου (mcrc) φέρουν μια επιπλέον μετάλλαξη στα Exons 3 και 4 του KRAS ή στα Exons 2, 3 και 4 του NRAS τείνουν επίσης να μην ανταποκρίνονται σε θεραπεία που περιέχει αντι-egfr 1-7. Αυτό το κιτ είναι σχεδιασμένο για χρήση σε διαγνωστική ανάλυση των σωματικών μεταλλάξεων των Exons 2, 3 και 4 των KRAS και NRAS. Το κιτ CRC RAScan Combination Kit είναι ένας προσδιορισμός για ανίχνευση όλων των αλλαγών στην αλληλουχία και των μικρών προσθηκών/ελλείψεων στα Exon 2, 3 και 4 των γονιδίων KRAS και NRAS. Μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12, 13, 59, 61, 117 και 146 των KRAS και NRAS έχουν συσχετισθεί με την έλλειψη αποτελεσματικότητας του panitumumab. Σε αυτό το κιτ παρέχονται Positive Controls για μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12, 61, 117 και 146. Αυτό το κιτ χρησιμοποιεί την αποκλειστική τεχνολογία SURVEYOR Nuclease της Transgenomic και, όταν συνδυάζεται με την τεχνολογία του συστήματος DHPLC System, προσφέρει απλή και ευαίσθητη ανάλυση των πιθανών μεταλλάξεων. Μπορεί να ανιχνεύσει ένα μίγμα 2-5% μεταλλαγμένου DNA σε υπόβαθρο μη μεταλλαγμένου DNA. Μελέτες επαλήθευσης έχουν καταδείξει εξαιρετικά υψηλή αντιστοιχία με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας σε καλά χαρακτηρισμένα δείγματα ορθοκολικού καρκίνου. Η χρήση του κιτ CRC RAScan Combination Kit αφενός θα μειώσει τον φόρτο εργασίας που ενέχει ο προσδιορισμός αλληλουχίας για τον χρήστη και αφετέρου θα βοηθήσει στον προσδιορισμό της αλληλουχίας, στις περιπτώσεις που το λογισμικό αυτοματοποιημένου προσδιορισμού της αλληλουχίας αποτυγχάνει να επιβεβαιώσει την παρουσία μιας μετάλλαξης χαμηλού επιπέδου. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας αυτού του προσδιορισμού σε σχέση με τον προσδιορισμό αλληλουχίας κατά Sanger, συνιστάται η βελτιστοποίηση της εργαστηριακής οργάνωσης ώστε να αποφευχθεί τυχόν διασταυρούμενη επιμόλυνση δειγμάτων ή μαρτύρων. Για ένα παράδειγμα ιδανικής εργαστηριακής οργάνωσης, βλ. Παράρτημα A.4 Εργαστηριακή οργάνωση για προσδιορισμούς PCR. 3.2 Ανάλυση δειγμάτων ασθενών με χρήση των κιτ SURVEYOR Scan Το κιτ CRC RAScan Combination Kit θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο στο πλαίσιο της ροής εργασίας που υποδεικνύονται παρακάτω. Ροή εργασίας είγμα ασθενούς Εξέταση KRAS και NRAS Αναφορά αποτελέσματος Σχήμα 1 Ροή εργασίας κιτ CRC RAScan Combination Kit για διαλογή KRAS και NRAS Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 4

3 Αρχές του προσδιορισμού ανίχνευσης μεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS και NRAS Για μια πρόταση σχετικά με την προετοιμασία πλακών 96 πηγαδιών για ανάλυση όλων των Exons 2-4 των KRAS και NRAS, βλ. Παράρτημα A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για το κιτ CRC RAScan Combination Kit. 3.3 SURVEYOR Nuclease Το ένζυμο SURVEYOR Nuclease της Transgenomic είναι φυτική ενδονουκλεάση DNA, ειδική για τις λανθασμένα ζευγαρωμένες βάσεις του DNA, η οποία μπορεί να ανιχνεύσει γνωστές ή άγνωστες μεταλλάξεις και πολυμορφισμούς σε ετερόδιπλα μόρια DNA 8. Το ένζυμο διασπά το DNA, με υψηλή ειδικότητα, σε θέσεις λανθασμένου ζευγαρώματος βάσης που έχει προκύψει από αντικατάσταση βάσης, καθώς και σε θέσεις άλλων διαταραχών των βάσεων του DNA. Αυτή η ενδονουκλεάση DNA κόβει και τους δύο κλώνους ενός ετερόδιπλου μορίου DNA στο 3 άκρο της θέσης λανθασμένου ζευγαρώματος βάσεων. Το λανθασμένο ζευγάρωμα βάσεων που έχει προκύψει με εισαγωγή/έλλειψη βάσεων και όλα τα λανθασμένα ζευγαρώματα που έχουν προκύψει από αντικατάσταση βάσης αναγνωρίζονται, αλλά η αποτελεσματικότητα της διάσπασης ποικίλλει ανάλογα με την αλληλουχία στο σημείο του λανθασμένου ζευγαρώματος βάσεων. Σχήμα 2. Τρόπος δράσης του SURVEYOR Nuclease. Η ενδονουκλεάση αναγνωρίζει ένα λανθασμένο ζευγάρωμα βάσεων και κόβει στο 3 άκρο των λανθασμένα ζευγαρωμένων βάσεων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση του δίκλωνου DNA, αφήνοντας προεξέχον 3 άκρο μιας μεμονωμένης βάσης. Το ένζυμο SURVEYOR Nuclease έχει χρησιμοποιηθεί σε ένα ευρύ φάσμα περιπτώσεων για την ακριβή ανίχνευση μιας ποικιλίας μεταλλάξεων και πολυμορφισμών των γονιδίων. Αξίζει να σημειωθεί ότι το SURVEYOR Nuclease έχει χρησιμοποιηθεί για την επιβεβαίωση της παρουσίας γνωστών μεταλλάξεων σε έναν αριθμό γονιδίων που συσχετίζονται με τον καρκίνο του νεφρού, του πνεύμονα, της κεφαλής και του τραχήλου, τη λευχαιμία, τον καρκίνο του ενδομητρίου, αλλά και με την πρόγνωση του αποτελέσματος της ακτινοθεραπείας 9,10,11. Το κιτ CRC RAScan Combination Kit έχει σχεδιαστεί για τη διάσπαση λανθασμένα ζευγαρωμένων βάσεων στα Exons 2, 3 & 4 των KRAS και NRAS για επακόλουθη ανάλυση με DHPLC. Σημείωση: εάν κάποιο δείγμα DNA είναι μεταλλαγμένο σε ποσοστό 100%, δεν μπορούν να σχηματιστούν ετερόδιπλα μόρια και το δείγμα θα εμφανίζεται ως «Wild-Type». Ωστόσο, τα δείγματα βιοψίας όγκου θα περιέχουν κύτταρα Wild-Type λόγω της ετερογένειας του όγκου ή/και της επιμόλυνσης με φυσιολογικό ιστό. Πρέπει να σημειωθεί ότι δείγματα με 5% και 95% μεταλλαγμένο DNA θα έχουν πανομοιότυπα ηλεκτροφορογραφήματα. Σημείωση: Για το τμήμα του προσδιορισμού που αφορά στην αντίδραση PCR, θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο το ένζυμο DNA Polymerase που παρέχεται με αυτό το κιτ. Σημείωση: Ακολουθήστε τις ειδικές οδηγίες που αναφέρονται στο εγχειρίδιο του συστήματος DHPLC που διαθέτετε. Για την αποτελεσματική χρήση αυτού του κιτ, συνιστάται ιδιαίτερα να διαβάσετε διεξοδικά αυτό το εγχειρίδιο και να ακολουθήσετε προσεκτικά τις οδηγίες και κατευθυντήριες γραμμές που δίνονται. Οι νέοι χρήστες θα πρέπει να διενεργήσουν τα πειράματα ελέγχου που περιγράφονται στην ενότητα Χρήση των μαρτύρων πλασμιδιακών DNA. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 5

3 Αρχές του προσδιορισμού ανίχνευσης μεταλλάξεων SURVEYOR Scan KRAS και NRAS Εάν έχετε περαιτέρω απορίες ή χρειάζεστε βοήθεια, καλέστε στον αριθμό τηλεφώνου (888) 233-9283 (μόνο για τη Βόρεια Αμερική), +1 (402) 452-5400 ή +44 (0) 141 892 8800 (Ευρώπη) και ζητήστε το «τμήμα υποστήριξης KRAS και NRAS». Εναλλακτικά, μπορείτε να μας αποστείλετε μήνυμα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου στη διεύθυνση: SURVEYORscan@Transgenomic.com 4 Ιχνηλασιμότητα των μαρτύρων του κιτ Οι μάρτυρες που παρέχονται με αυτό το κιτ είναι πλασμιδιακοί κλώνοι των αλληλουχιών των Exons 2, 3 & 4των KRAS και NRAS. Έχει πραγματοποιηθεί προσδιορισμός αλληλουχίας όλων των κλώνων για τον έλεγχο της πιστότητας της αλληλουχίας σε σύγκριση με τις αλληλουχίες αναφοράς NCBI Reference Sequences: NG_007524.1 (KRAS) και NG_007572 (NRAS). Οι μάρτυρες έχουν γενετική «σφραγίδα». Βλ. Παράρτημα A.2 Σφραγίδες μαρτύρων DNA. Αυτές οι διακυμάνσεις σε σχέση με την αλληλουχία KRAS ή NRAS Wild-Type, σε μια περιοχή στην οποία δεν αναμένεται να υπάρχουν μεταλλάξεις, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση προβλημάτων επιμόλυνσης δείγματος από τους μάρτυρες Positive Controls. Βλ. Παράρτημα B - Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, Πρόβλημα 8, για ένα παράδειγμα ίχνους τέτοιου είδους επιμόλυνσης με το SURVEYOR Scan. Το «KRAS Control Wild-Type» κατασκευάστηκε με σύνθεση και κλωνοποίηση των Exons 2, 3 και 4 του KRAS χρησιμοποιώντας την αλληλουχία αναφοράς NCBI Reference Sequence NG_007524.1. Το «KRAS Positive Control Exon 2» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 2 του KRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη G12D. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 12, με αλλαγή G12D, GGT>GAT. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του KRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. Το «KRAS Positive Control Exon 3» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 3 του KRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη Q61H. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 61, με αλλαγή Q61H, CAA>CAC. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του KRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. Το «KRAS Positive Control Exon 4A» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 4 του KRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη K117N. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 117, με αλλαγή K117N, AAA>AAT. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του KRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. Το «KRAS Positive Control Exon 4B» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 4 του KRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη A146T. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 146, με αλλαγή A146T, GCA>ACA. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του KRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. Το «NRAS Control Wild-Type» κατασκευάστηκε με σύνθεση και κλωνοποίηση των Exons 2, 3 και 4 του NRAS χρησιμοποιώντας την αλληλουχία αναφοράς NCBI Reference Sequence NG_007572. Το «NRAS Positive Control Exon 2» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 2 του NRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη G12D. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 12, με αλλαγή G12D, GGT>GAT. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του NRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. Το «NRAS Positive Control Exon 3» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 3 του NRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη Q61K. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 6

4 Ιχνηλασιμότητα των μαρτύρων του κιτ είναι στο κωδικόνιο 61, με αλλαγή Q61K, CAA>AAA. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του NRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. Το «NRAS Positive Control Exon 4» κατασκευάστηκε με σύνθεση του Exon 4 του NRAS, χρησιμοποιώντας την παραπάνω αλληλουχία αναφοράς, η οποία όμως περιείχε τη μετάλλαξη A146T. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας DNA επιβεβαίωσε ότι η μόνη αλλαγή στην αλληλουχία είναι στο κωδικόνιο 146, με αλλαγή A146T, GCC>ACC. Στη συνέχεια, αυτός ο κλώνος αναμειγνύεται με το DNA του NRAS Control Wild-Type, ώστε να δημιουργηθεί ένα μίγμα ετερόζυγων μορίων. 5 Συστατικά Το κιτ CRC RAScan Combination Kit παρέχεται σε έναν μόνο φάκελο, σε δύο ξεχωριστά κουτιά: (α) ένα κουτί αντιδραστηρίων για την ανάλυση των Exons 2, 3 & 4 του KRAS και (β) ένα κουτί αντιδραστηρίων για την ανάλυση των Exons 2, 3 & 4 του NRAS. Συνολικά, τα κουτιά περιέχουν επαρκή αριθμό αντιδραστηρίων για τη διενέργεια του αριθμού των αναλύσεων που αναφέρεται στην ενότητα 5.3. 5.1 Κουτί SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710107) Το κουτί με τα συστατικά για την ανάλυση των Exons 2, 3 & 4του KRAS περιέχει δύο εσωτερικά κουτιά: (1) ένα κουτί συστατικών πέψης SURVEYOR με 10 σωληνάρια αντιδραστηρίων και (2) μια εξωτερική βάση σωληναρίων συστατικών και μαρτύρων PCR που περιέχει 20 σωληνάρια αντιδραστηρίων. Αριθμός καταλόγου Συστατικό Κουτί συστατικών πέψης SURVEYOR Χρώμα πώματος σωληναρίου Όγκος που παρέχεται για κιτ 130 αντιδράσεων 710160 SURVEYOR Nuclease W Μωβ 3 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Μαύρο 2 x 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Ροζ 2 x 105 µl 708027 0.15 M MgCl 2 Solution Καφέ 2 x 105 µl 708030 Stop Solution Κόκκινο 250 µl Κουτί συστατικών και μαρτύρων PCR 703310 DNA Polymerase Άχρωμο 2 x 100 µl 703315 10x DNA Polymerase Reaction Buffer Άχρωμο 1 ml 703065 dntps (10 mm) Άχρωμο 2 x 500 µl 710155F KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µm) Μπλε 125 µl 710155R KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µm) Μπλε 125 µl 710157F KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µm) Μπλε 90 µl 710157R KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µm) Μπλε 90 µl 710154F KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µm) Μπλε 90 µl 710154R KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µm) Μπλε 90 µl 710156F KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µm) Μπλε 90 µl 710156R KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µm) Μπλε 90 µl 710131 KRAS Control Wild-Type Κίτρινο 120 µl 710135 KRAS Positive Control Exon 2 Πράσινο 40 µl 710136 KRAS Positive Control Exon 3 Πράσινο 40 µl 710137 KRAS Positive Control Exon 4A Πράσινο 40 µl 710138 KRAS Positive Control Exon 4B Πράσινο 40 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Πορτοκαλί 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Πορτοκαλί 125 µl Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 7

5 Συστατικά 5.2 Κουτί SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 (h 710400) Το κουτί με τα συστατικά για την ανάλυση των Exons 2, 3 & 4του NRAS περιέχει δύο εσωτερικά κουτιά: (1) ένα κουτί συστατικών πέψης SURVEYOR με 10 σωληνάρια αντιδραστηρίων, χωρίς καμία κενή οπή και (2) μια εξωτερική βάση σωληναρίων συστατικών και μαρτύρων PCR που περιέχει 14 σωληνάρια αντιδραστηρίων. Αριθμός καταλόγου Συστατικό Κουτί συστατικών πέψης SURVEYOR Χρώμα πώματος σωληναρίου Όγκος που παρέχεται για κιτ 100 αντιδράσεων 710160 SURVEYOR Nuclease W Μωβ 2 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Μαύρο 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Ροζ 105 µl 708027 0.15 M MgCl 2 Solution Καφέ 105 µl 708030 SURVEYOR Stop Solution Κόκκινο 250 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Πορτοκαλί 2 x 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Πορτοκαλί 2 x 125 µl Κουτί συστατικών και μαρτύρων PCR 703310 DNA Polymerase (250 U) Κόκκινο 100 µl 703312 DNA Polymerase (50 U) Κόκκινο 20 µl 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Άχρωμο 1 ml 703065 dntps (10 mm) Άχρωμο 500 µl 710452F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Μπλε 90 µl 710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Μπλε 90 µl 710453F NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µm) Μπλε 90 µl 710453R NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µm) Μπλε 90 µl 710454F NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µm) Μπλε 90 µl 710454R NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µm) Μπλε 90 µl 710441 NRAS Control Wild-Type Mix Κίτρινο 120 µl 710442 NRAS Positive Control Exon 2 Πράσινο 40 µl 710443 NRAS Positive Control Exon 3 Πράσινο 40 µl 710444 NRAS Positive Control Exon 4 Πράσινο 40 µl 5.3 Αριθμός δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με ένα κιτ Το κιτ CRC RAScan Combination Kit είναι σχεδιασμένο ώστε να επιτρέπει την πραγματοποίηση 230 αντιδράσεων εξέτασης. Ο συνολικός αριθμός δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με το κιτ εξαρτάται από το μέσο μέγεθος της παρτίδας που εξετάζεται οποιαδήποτε στιγμή, επειδή ένα σετ αντιδράσεων μαρτύρων (Μάρτυρες άγριου τύπου Wild-Type Controls, θετικοί μάρτυρες Positive Controls και μάρτυρες χωρίς μήτρα) πρέπει να συμπεριλαμβάνεται σε κάθε πλάκα αντίδρασης. Ο παρακάτω πίνακας δείχνει τον αριθμό των δειγμάτων που μπορούν να αναλυθούν με το κιτ KRAS και NRAS, ανάλογα με το μέσο μέγεθος παρτίδας δειγμάτων. Λαμβάνονται υπόψη (α) οι 21 μάρτυρες (7x Wild-Type, 7x Positive Controls, 7x μάρτυρες χωρίς μήτρα) που απαιτούνται για κάθε εκτέλεση ανάλυσης και (β) το όριο των 230 αντιδράσεων ανά κιτ. Σημείωση: Εάν εκτελείται ανάλυση σε πολλές πλάκες, πρέπει να βρίσκεται σε κάθε πλάκα ένα σετ των 21 μαρτύρων που παρατίθενται παραπάνω. Κατά συνέπεια, δύο πλάκες απαιτούν συνολικά 42 αντιδράσεις μαρτύρων, 3 πλάκες απαιτούν 63 αντιδράσεις μαρτύρων, κ.λπ. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 8

5 Συστατικά Όταν το μέγεθος παρτίδας δειγμάτων αυξάνεται, ο αριθμός των δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με ένα κιτ αυξάνεται, μειώνοντας το μέσο κόστος αντιδραστηρίων ανά δείγμα. Ο παρακάτω πίνακας αποτελεί έναν οδηγό για τον αριθμό τον δειγμάτων που μπορούν να εξεταστούν με τα κιτ. Μέγεθος παρτίδας δειγμάτων Αρ. αντιδράσεων μαρτύρων + Αρ. ενισχυμένων τμημάτων δειγμάτων Αρ. αντιδράσεων που απαιτούνται ανά εκτέλεση ανάλυσης Συνολικός αρ. εκτελέσεων ανάλυσης παρτίδας δειγμάτων ανά κιτ Συνολικά δείγματα που εξετάζοντ αι ανά κιτ 1 21 + 7 28 8 8 2 21 + 14 35 6 12 3 21 + 21 42 5 15 4 21 + 28 49 4 16 5 21 + 35 56 4 20 5.4 Προσδιορισμός αλληλουχίας DNA Οι εκκινητές προσδιορισμού αλληλουχίας (κωδικοί είδους 710153F και 710153R) παρέχονται για χρήση, για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας DNA όλων των δειγμάτων που εξετάζονται. Για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν τα ενισχυμένα τμήματα PCR που δημιουργούνται πριν από την πέψη με SURVEYOR Nuclease. 6 Επιπλέον απαιτούμενος εξοπλισμός και αντιδραστήρια Στα επιπλέον συστατικά και εξοπλισμό που απαιτούνται για τη χρήση του κιτ CRC RAScan Combination Kit με DHPLC συγκαταλέγονται τα εξής: Σύστημα DHPLC, στήλη, ρυθμιστικά διαλύματα, πρότυπο μεγέθους DNA- Για τα χαρακτηριστικά ενός κατάλληλου συστήματος DHPLC για χρήση με αυτό το κιτ, βλ. Παράρτημα A.3.1 Προδιαγραφές DHPLC για εφαρμογές SURVEYOR Scan Νερό καθαρότητας μοριακής βιολογίας Σωληνάρια PCR των 0,2 ml, ταινίες ή πλάκα 96 πηγαδιών Μικροπιπέτες Ρύγχη πιπετών Λουτρό πάγου Αναδευτήρας τύπου vortex Μικροφυγόκεντρος Θερμικός κυκλοποιητής Πηκτώματα αγαρόζης και εξοπλισμός ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. ιάλυμα λευκαντικού μέσου 10% ή παρόμοιος παράγοντας καθαρισμού 7 Παρασκευή αντιδραστηρίων Όλα τα αντιδραστήρια που παρέχονται με αυτό το κιτ είναι έτοιμα προς χρήση. Ορισμένα συστατικά θα χρειαστούν απόψυξη, ανακίνηση σε αναδευτήρα τύπου vortex ή μικροφυγοκέντρηση πριν από τη χρήση. Για λεπτομέρειες, ανατρέξτε παρακάτω, στην ενότητα ιαδικασία προσδιορισμού. Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να συνδυαστούν μεταξύ τους προκειμένου να παραχθούν κύρια μίγματα και μίγματα αντίδρασης. Πλήρεις λεπτομέρειες παρέχονται παρακάτω, στην ενότητα ιαδικασία προσδιορισμού. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 9

8 Φύλαξη και διάρκεια ζωής 8 Φύλαξη και διάρκεια ζωής Το κιτ θα πρέπει να φυλάσσεται σε θερμοκρασία μεταξύ -18 ºC και -25 C, σε καταψύκτη σταθερής θερμοκρασίας μέχρι να χρησιμοποιηθεί. ίνετε προσοχή στην ημερομηνία λήξης του κάθε κιτ που παραλαμβάνετε. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ μετά την παρέλευση της ημερομηνίας λήξης. Το μίγμα SURVEYOR Nuclease που παρασκευάστηκε στο βήμα 7 της πέψης με SURVEYOR Nuclease θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί αμέσως, καθώς το SURVEYOR Nuclease W αδρανοποιείται με την πάροδο του χρόνου, όταν είναι παρόντα τα υπόλοιπα συστατικά του μίγματος αντίδρασης SURVEYOR Nuclease. 9 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Κανένα από τα αντιδραστήρια αυτού του κιτ δεν αποτελεί κίνδυνο για την υγεία στις ποσότητες που παρέχονται. Το έγγραφο υπ αριθ. MSD-710077 της Transgenomic μπορεί να ληφθεί από τη διαδικτυακή τοποθεσία http://world.transgenomic.com/files/literature/710077-en.pdf εν υπάρχουν ουσίες ζωικής ή ανθρώπινης προέλευσης σε αυτό το κιτ που να παρουσιάζουν κίνδυνο πρόκλησης λοίμωξης. Αυτό το κιτ θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από άτομα που έχουν εκπαιδευτεί στις κατάλληλες εργαστηριακές τεχνικές. Όταν εργάζεστε με τα περιεχόμενα αυτού του κιτ, να φοράτε πάντοτε την κατάλληλη ρόμπα εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά ματιών. Μετά τη χρήση, τα συστατικά του κιτ θα πρέπει να απορρίπτονται ως κλινικά απόβλητα και σύμφωνα με τους τοπικούς κανόνες και κανονισμούς. Τα κλάσματα των αντιδραστηρίων που μεταφέρονται με πιπέτα από τα σωληνάρια αυτού του κιτ προορίζονται για μία μόνο χρήση. Έχει αποδειχθεί ότι τα συστατικά αυτού του κιτ διατηρούν τη σταθερότητά τους για 25 κύκλους κατάψυξης-απόψυξης. Μη χρησιμοποιήσετε αυτό το κιτ, εάν έχετε υπερβεί τον αριθμό των κύκλων κατάψυξης-απόψυξης. 10 Συλλογή, χειρισμός και φύλαξη πρωτογενών δειγμάτων Το κιτ CRC RAScan Combination Kit έχει επικυρωθεί για χρήση με DNA που εκχυλίζεται από δείγματα όγκου ορθοκολικού καρκίνου, τα οποία έχουν μονιμοποιηθεί σε φορμόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη (FFPE). Για βέλτιστη εκχύλιση του DNA, ο ιστός θα πρέπει να έχει μονιμοποιηθεί στη φορμόλη για 14 24 ώρες πριν από τον εγκλεισμό του σε παραφίνη. Οι βιοψίες όγκων είναι ένα ετερογενές μίγμα καρκινικών και μη καρκινικών κυττάρων. Επιπρόσθετα, ο ίδιος ο όγκος είναι ένα ετερογενές μίγμα καρκινικών κυττάρων με μεταλλάξεις και καρκινικών κυττάρων χωρίς μεταλλάξεις. Επειδή αυτές οι σωματικές μεταλλάξεις ενδέχεται να μην είναι ομοιόμορφα κατανεμημένες στον όγκο, η επακόλουθη ανάλυση μεταλλάξεων των διαφόρων τμημάτων του ίδιου όγκου μπορεί να διαφέρει. Για να αυξήσετε την πιθανότητα ανίχνευσης κάποιας μετάλλαξης, το DNA από την περιοχή του ιστού στην οποία βρίσκεται ο όγκος θα πρέπει να απομονωθεί με απόξεση μόνο της περιοχής του όγκου από τη γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα, χρησιμοποιώντας ένα καθαρό, αποστειρωμένο νυστέρι για κάθε νέα αντικειμενοφόρο πλάκα. Για την επιτυχή χρήση αυτού του κιτ, το εκχυλισμένο DNA θα πρέπει να πληροί τα κριτήρια που παρατίθενται στην ενότητα Ζητήματα σχετικά με τη μήτρα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα εκχυλισμένα δείγματα DNA που δεν προορίζονται άμεσα για ανάλυση με αυτό το κιτ θα πρέπει να φυλάσσονται στην κατάψυξη, σε θερμοκρασία -20 ºC έως -80 ºC. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 10

11 ιαδικασία προσδιορισμού 11 ιαδικασία προσδιορισμού 11.1 Ανίχνευση σωματικών μεταλλάξεων με τα κιτ SURVEYOR Scan - Επισκόπηση Η ανίχνευση και η επιβεβαίωση μίας μετάλλαξης με το SURVEYOR Nuclease περιλαμβάνουν τρία βήματα: Βήμα 1 - Προετοιμάστε τα ενισχυμένα τμήματα PCR από το μεταλλαγμένο DNA (προς εξέταση) και το φυσιολογικό DNA (αναφοράς), συνεχίζοντας από τον τελευταίο κύκλο ενίσχυσης με PCR για να αποδιατάξετε όλα τα δίκλωνα μόρια και, κατόπιν, ψύξτε αργά για βέλτιστο σχηματισμό ετερόδιπλων και ομόδιπλων μορίων (τα ετερόδιπλα μόρια προκύπτουν όταν ένας κλώνος με αλληλουχία Wild-Type υβριδοποιείται με έναν κλώνο με μεταλλαγμένη αλληλουχία). Βήμα 2 - Υποβάλλετε ένα μερίδιο του μίγματος υβριδοποιημένων ετερόδιπλων/ομόδιπλων μορίων σε επεξεργασία με το ένζυμο SURVEYOR Nuclease. Το ένζυμο SURVEYOR Nuclease θα κόψει και τους δύο κλώνους του ετερόδιπλου DNA δημιουργώντας θραύσματα DNA. Με παρόμοια επεξεργασία, το Control Wild-Type DNA χρησιμεύει ως μάρτυρας υποβάθρου. Βήμα 3 - Αναλύστε τα θραύσματα DNA σε ένα σύστημα DHPLC. Ο σχηματισμός νέων προϊόντων διάσπασης λόγω της παρουσίας ενός ή περισσοτέρων λανθασμένων ζευγαρωμάτων βάσεων, υποδεικνύεται από την παρουσία επιπλέον κορυφών χρωματογραφίας. Οι χρόνοι μετανάστευσης των προϊόντων διάσπασης υποδεικνύουν το μέγεθος των θραυσμάτων και, κατά συνέπεια, τη θέση του λανθασμένου ζευγαρώματος ή των λανθασμένων ζευγαρωμάτων βάσεων, κατά προσέγγιση. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 11

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα 12 Οδηγίες βήμα προς βήμα 12.1 ΑΡΧΙΚΗ προετοιμασία/βαθμονόμηση του συστήματος DHPLC Όταν προετοιμάζετε την πλάκα SURVEYOR Nuclease για ανάλυση με DHPLC, ανατρέξτε στο Παράρτημα A.3 Απαιτήσεις του συστήματος αποδιατακτικής HPLC (DHPLC). 12.2 Ζητήματα που πρέπει να ληφθούν υπόψη πριν από την ανάλυση δείγματος για KRAS και NRAS Πριν από την εκτέλεση ανάλυσης δειγμάτων σε ένα σύστημα DHPLC, πρέπει να αναλυθεί ένα κατάλληλο πρότυπο μεγέθους DNA, προκειμένου να διασφαλιστεί ότι το σύστημα λειτουργεί κανονικά. Το προσωπικό του εργαστηρίου που χρησιμοποιεί το όργανο θα πρέπει να ελέγχει την ποιότητα της διακριτικής ικανότητας του προτύπου μεγέθους DNA προτού προχωρήσει στην ανάλυση. 12.3 Ζητήματα σχετικά με τη μήτρα 1. Για μήτρα DNA που έχει απομονωθεί από δείγμα FFPE, ακολουθήστε τις συνήθεις εργαστηριακές διαδικασίες για την εκτίμηση της ποιότητας και της ποσότητας του εκχυλισμένου DNA, έτσι ώστε να διασφαλίσετε ότι υπάρχει αρκετή μήτρα για PCR. 2. Ο λόγος απορρόφησης 260/280 θα πρέπει να είναι υψηλότερος από 1,80. 3. Για να επισπεύσετε την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, προσαρμόστε τη συγκέντρωση εργασίας της μήτρας σε 12,5 ng/µl περίπου. Αραιώστε τη μήτρα DNA σε νερό καθαρότητας μοριακής βιολογίας, όταν απαιτείται. 12.4 Ζητήματα σχετικά με τη ροή εργασίας Το κιτ έχει σχεδιαστεί ώστε να επιτρέπει την ανάλυση 230 αντιδράσεων. Μπορεί να εκτελεστεί ανάλυση μικρότερων παρτίδων δειγμάτων, αλλά με κάθε παρτίδα δειγμάτων πρέπει να περιλαμβάνονται οι μάρτυρες του κιτ και ένας «μάρτυρας χωρίς μήτρα». Το κιτ περιέχει υλικά μαρτύρων που επαρκούν για 230 αντιδράσεις για όλους τους συνδυασμούς μεγεθών παρτίδας δειγμάτων προς χρήση. Γενικά, η επεξεργασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται από την αρχή έως το τέλος, όπως περιγράφεται σε αυτές τις οδηγίες χρήσης. Εάν η επεξεργασία ενός δείγματος πρέπει να διακοπεί πριν από την ολοκλήρωση όλων των βημάτων, το DNA θα πρέπει να φυλάσσεται στους -20 C στα χρονικά σημεία που υποδεικνύονται. Ωστόσο, θα πρέπει να αποφεύγεται η έκθεση οποιουδήποτε κατεψυγμένου δείγματος σε επαναλαμβανόμενους κύκλους κατάψυξης-απόψυξης, καθώς και η φύλαξη στην κατάψυξη (-18 έως -25 C) του DNA που έχει ενισχυθεί με PCR ή των προϊόντων πέψης με SURVEYOR Nuclease για παρατεταμένες χρονικές περιόδους (>1 εβδομάδα). Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 12

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα Η ανάλυση δειγμάτων θα πρέπει να ακολουθεί τη ροή εργασιών που παρατίθεται παρακάτω: Απόξεση ιστού 1 Απομόνωση DNA και PCR 2 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 3 5 Αποτυχία SURVEYOR Scan Αξιολόγηση ισχυρού/ασθενούς προϊόντος PCR SURVEYOR Nuclease και ανάλυση DHPLC 4 Θετικό αποτέλεσμα SURVEYOR Scan Αρνητικό αποτέλεσμα SURVEYOR Scan 7 6 Επιβεβαίωση αλληλουχίας NVD 8 Αποτυχία ποιότητας αλληλουχίας Επιτυχία ποιότητας αλληλουχίας 9 Μεταλλάξεις στα κωδικόνια G12, G13, A59, Q61, K117 ή A146 του KRAS ή NRAS NVD Σχήμα 3: Ροή εργασίας του κιτ ανάλυσης CRC RAScan Combination Kit Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 13

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα Σημειώσεις για το Σχήμα 3 1. Απομονώστε το DNA από τον ιστό FFPE χρησιμοποιώντας τυπικές εργαστηριακές διαδικασίες. 2. Εκτελέστε PCR και ελέγξτε την ποιότητα του DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα. 3. Καταγράψτε εάν η ζώνη PCR είναι Ισχυρή ( 20 ng/µl) ή Ασθενής (<20 ng/µl). Εάν υπάρχουν πολλές ζώνες PCR, προετοιμάστε νέο γονιδιωματικό DNA από ιστό FFPE. 4. Στην περίπτωση δειγμάτων που χαρακτηρίζονται είτε ως Ισχυρό προϊόν PCR είτε ως Ασθενές προϊόν PCR μετά από ενίσχυση με PCR, συνεχίστε με επεξεργασία με SURVEYOR Nuclease και ανάλυση στο σύστημα DHPLC. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι με ένα δείγμα χαρακτηρισμένο ως Ασθενές προϊόν PCR μπορεί να μην υπάρχει αρκετό DNA για τη δημιουργία ουσιαστικών αποτελεσμάτων με DHPLC, αλλά μπορεί να υπάρχει αρκετό DNA για τον προσδιορισμό αλληλουχίας. 5. Βλ. Παράρτημα B Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων για παραδείγματα ανεπιτυχών αποτελεσμάτων SURVEYOR Scan. Όλα τα δείγματα με ανεπιτυχές αποτέλεσμα SURVEYOR Scan θα πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε επεξεργασία με: a. επανάληψη της αντίδρασης PCR, εάν έχει απομένει αρκετό γονιδιωματικό DNA ή b. επανάληψη της εκχύλισης DNA από τον ιστό FFPE. Αυτή η επιλογή θα πρέπει να είναι δευτερεύουσα, καθώς συνήθως δεν είναι επιθυμητή η κοπή ενός άλλου τεμαχίου FFPE, ή c. εάν χρησιμοποιηθεί μια άλλη τομή ή τεμάχιο, θα πρέπει να επαναληφθεί ολόκληρος ο προσδιορισμός, επειδή μπορεί να υπάρχουν ασυμφωνίες στις πέψεις λόγω της ετερογένειας του όγκου. 6. Εάν δεν υπάρχουν ορατές κορυφές διάσπασης, καταγράψτε αρνητικό αποτέλεσμα SURVEYOR Scan, δηλαδή NVD = No Variant Detected ( εν ανιχνεύθηκε καμία παραλλαγή). 7. Εάν ένα δείγμα εμφανίζει προϊόντα διάσπασης με SURVEYOR Nuclease (τα οποία δεν αντιστοιχούν στον αντίστοιχο μάρτυρα Wild-Type Control), τα προϊόντα θα πρέπει να αποστέλλονται για επιβεβαίωση με προσδιορισμό αλληλουχίας. 8. Εάν η ανάλυση επιβεβαίωσης αλληλουχίας δεν είναι αποδεκτή, τότε: a. επαναλάβετε την αντίδραση PCR, εάν έχει απομένει αρκετό γονιδιωματικό DNA ή b. επαναλάβετε την εκχύλιση DNA από τον ιστό FFPE. Αυτή η επιλογή θα πρέπει να είναι δευτερεύουσα, καθώς συνήθως δεν είναι επιθυμητή η κοπή επιπλέον δειγμάτων από ένα τεμάχιο FFPE. 9. Εάν η ανάλυση επιβεβαίωσης αλληλουχίας είναι αποδεκτή, τα αποτελέσματα θα πρέπει να υποδεικνύουν είτε: a. Αλληλουχία Wild-Type, δηλαδή ότι δεν ανιχνεύθηκε καμία παραλλαγή (NVD) είτε b. ότι ανιχνεύθηκε παραλλαγή. Εάν η επιβεβαίωση αλληλουχίας υποδεικνύει αλλαγή οποιασδήποτε βάσης η οποία οδηγεί σε μια αλλαγή αμινοξέος: i. κωδικόνια 12 ή 13 ii. κωδικόνιο 59 ή 61 iii. κωδικόνιο 117 ή iv. κωδικόνιο 146 αξιολογήστε το δείγμα ως θετικό για μετάλλαξη KRAS ή NRAS. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 14

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα Σημείωση: είναι δυνατό να υπάρχει ένα θετικό αποτέλεσμα με τον προσδιορισμό SURVEYOR Scan που μπορεί επίσης να έχει ως αποτέλεσμα «δεν ανιχνεύθηκε παραλλαγή» από μια εξέταση επιβεβαίωσης με προσδιορισμό αλληλουχίας. Το επίπεδο ανίχνευσης (LOD) του SURVEYOR Nuclease σε ένα σύστημα DHPLC είναι έως και 2% μεταλλαγμένου DNA σε 98% DNA Wild-Type για κάποιες μεταλλάξεις, ενώ το LOD του προσδιορισμού αλληλουχίας είναι περίπου 10-25% μεταλλαγμένου DNA σε 90-75% DNA Wild-Type. Σημείωση: εάν κάποιο δείγμα DNA είναι μεταλλαγμένο σε ποσοστό 100%, δεν μπορούν να σχηματιστούν ετερόδιπλα μόρια και το δείγμα θα εμφανίζεται ως «Wild-Type». Ωστόσο, τα δείγματα βιοψίας όγκου θα περιέχουν κύτταρα Wild-Type λόγω της ετερογένειας του όγκου ή/και της επιμόλυνσης με φυσιολογικό ιστό. Σημείωση: τα δείγματα με 5% και 95% μεταλλαγμένου DNA θα έχουν πανομοιότυπα ηλεκτροφορογραφήματα. Σημείωση: μπορούν να προκύψουν θετικά αποτελέσματα SURVEYOR Scan λόγω αλλαγών βάσεων διαφορετικών από εκείνες για τις οποίες έχει καταδειχτεί ότι οδηγούν σε μεταλλάξεις ενεργοποίησης του KRAS ή NRAS. Παρότι αυτές οι μεταλλάξεις είναι σπάνιες, θα απαιτηθεί επιβεβαίωση με μια άλλη μέθοδο, όπως ο προσδιορισμός αλληλουχίας DNA, προκειμένου να καθοριστεί εάν ένα θετικό αποτέλεσμα SURVEYOR Scan είναι μια μετάλλαξη ενεργοποίησης του KRAS ή NRAS. Σημείωση: η διαδικασία μονιμοποίησης σε φορμόλη που χρησιμοποιείται κατά την προετοιμασία των δειγμάτων βιοψίας όγκων FFPE μπορεί να προκαλέσει απαμίνωση κυτοσινών. Αυτή η απαμίνωση μετατρέπει την κυτοσίνη σε ουρακίλη. Η πολυμεράση θα «διαβάσει» αυτή την ουρακίλη ως θυμίνη και θα ενσωματώσει μια αδενίνη στους κλώνους που αντιγράφονται. Έτσι, αυτό θα φαίνεται ως μετάλλαξη, όπου το φυσιολογικό G θα έχει πλέον αντικατασταθεί με ένα A, προκαλώντας μία μετάλλαξη GC σε AT, η οποία είναι ένα τέχνημα που προκύπτει από τη διαδικασία μονιμοποίησης και όχι μια πραγματική σωματική μετάλλαξη. Πρόκειται για σπάνιες περιπτώσεις, οι οποίες ωστόσο, εάν αντιγραφούν στους πρώτους κύκλους της αντίδρασης PCR, θα «μοιάζουν» με μεταλλάξεις. εν επαναλαμβάνονται κατά την εκ νέου ανάλυση. Παραδείγματα πιθανών μεταλλάξεων απαμίνωσης κυτοσίνης οι οποίες θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τον καθορισμό της θεραπείας του ασθενούς είναι τα εξής για το KRAS: - Κωδικόνιο 12: AGT (G12S) και GAT (G12D) - Κωδικόνιο 13: AGC (G13S), GAC (G13D) και GGT (G13G, μια σιωπηλή μετάλλαξη) - Κωδικόνιο 146: GCA>ACA (A146T) Παραδείγματα πιθανών μεταλλάξεων απαμίνωσης κυτοσίνης οι οποίες θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τον καθορισμό της θεραπείας του ασθενούς είναι τα εξής για το NRAS: - Κωδικόνιο 12: GGT> AGT (G12S) ή GAT (G12D) - Κωδικόνιο 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) ή GGC (G13G, μια σιωπηλή μετάλλαξη) - Κωδικόνιο 146: GCC>ACC (A146T) Συνεπώς, συνιστάται οποιαδήποτε τέτοιου είδους μετάλλαξη να επιβεβαιώνεται με ανάλυση επαναληπτικού δείγματος του ίδιου γονιδιωματικού DNA ή όλα τα δείγματα να υπόκεινται σε ανάλυση επαναληπτικού δείγματος από την αρχή της ανάλυσης. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 15

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα 12.5 Πρωτόκολλο ενίσχυσης 1. Τα προαναμεμειγμένα διαλύματα dntp της Transgenomic (PN 703065 και 705020) παρέχονται με μια λειτουργική συνολική συγκέντρωση δεοξυ-νουκλεοτιδίων ίση με 10 mm (2,5 mm από το κάθε ένα εκ των τεσσάρων δεοξυ-νουκλεοτιδίων). 2. Οι εκκινητές PCR KRAS και NRAS Forward και Reverse (KRAS κωδ. είδους 710155F/R, 710157F/R, 710154F/R και 710156F/R, NRAS κωδ. είδους 710452F/R, 710453F/R και 710454F/R) παρέχονται σε συγκέντρωση 10 µm. 3. Βγάλτε τους εκκινητές 10 µm, το διάλυμα dntps 10 mm και το DNA Polymerase 10X PCR Buffer (κωδ. είδους 703315) από τον καταψύκτη και αφήστε τα να αποψυχθούν στον πάγο. 4. Μόλις αποψυχθούν, αναδεύστε όλα τα συστατικά του κιτ σε αναδευτήρα τύπου vortex ~10 δευτερόλεπτα, έτσι ώστε να αναμειχθούν καλά, εκτελέστε σύντομη φυγοκέντρηση ~10 δευτερόλεπτα, έτσι ώστε να διασφαλίσετε ότι δεν έχουν απομείνει καθόλου υγρά στα πώματα των σωληναρίων και τοποθετήστε τα στον πάγο. 5. Προετοιμάστε τα κύρια μίγματα στον πάγο. 6. Χρησιμοποιήστε τον παρακάτω πίνακα ως οδηγό για την παρασκευή του κύριου μίγματος για κάθε αντίδραση KRAS Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 και NRAS Exon 4: Αριθμός αντιδράσεων (7 δείγματα + 3 μάρτυρες): 10 Υπολογισμός όγκου: Όγκος νερού (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntps (µl) 40 Forward Primer (µl) 25 Reverse Primer (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Συνολικός όγκος κύριου μίγματος 48,0 **Σημείωση: Ο στόχος του χρήστη θα πρέπει είναι τουλάχιστον 25 ng DNA ανά 50 µl αντίδρασης PCR. Όταν οι συγκεντρώσεις του εκχυλισμένου DNA είναι χαμηλότερες από 12,5 ng/µl, αυξήστε αναλογικά τον όγκο του εκχυλισμένου DNA, έτσι ώστε να εξασφαλίσετε 25 ng ανά αντίδραση. Επίσης, μειώστε από τον όγκο του νερού των κύριων μιγμάτων ποσότητα ίση με την αύξηση του όγκου του εκχυλισμένου DNA, ώστε να προκύψουν 50 µl ανά αντίδραση. Σε όλα τα δείγματα που έχουν παρασκευαστεί με αυτά τα κύρια μίγματα, το εκχυλισμένο DNA θα πρέπει να είναι αραιωμένο περίπου στο ίδιο χαμηλότερο επίπεδο συγκέντρωσης. εν συνίσταται η χρήση συγκεντρώσεων εκχυλισμένου DNA χαμηλότερων από 5 ng/µl. 7. Υπολογίστε τους απαιτούμενους όγκους για οποιοδήποτε δεδομένο κύριο μίγμα, ανατρέχοντας στο παραπάνω διάγραμμα. Πρέπει να σημειωθεί ότι: (a) Για το κύριο μίγμα 1, KRAS Exon 2, θα απαιτηθούν τρεις επιπρόσθετες αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων: ο μάρτυρας άγριου τύπου KRAS Control Wild- Type, ο θετικός μάρτυρας KRAS Positive Control Exon 2 και ο μάρτυρας χωρίς μήτρα KRAS Exon 2 (NTC1). (b) Για το κύριο μίγμα 2, KRAS Exon 3, θα απαιτηθούν τρεις επιπρόσθετες αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων: ο μάρτυρας άγριου τύπου KRAS Control Wild- Type, ο θετικός μάρτυρας KRAS Positive Control Exon 3 και ο μάρτυρας χωρίς μήτρα KRAS Exon 3 (NTC2). (c) Για το κύριο μίγμα 3, KRAS Exon 4A θα απαιτηθούν τρεις επιπρόσθετες αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων: ο μάρτυρας άγριου τύπου KRAS Control Wild- Type, ο θετικός μάρτυρας KRAS Positive Control Exon 4A και ο μάρτυρας χωρίς μήτρα KRAS Exon 4A (NTC3). Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 16

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα (d) Για το κύριο μίγμα 4, KRAS Exon 4B θα απαιτηθούν τρεις επιπρόσθετες αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων: ο μάρτυρας άγριου τύπου KRAS Control Wild- Type, ο θετικός μάρτυρας KRAS Positive Control Exon 4B και ο μάρτυρας χωρίς μήτρα KRAS Exon 4B (NTC4). (e) Για το κύριο μίγμα 5, NRAS Exon 2, θα χρειαστούν τρεις επιπλέον αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων για τον μάρτυρα άγριου τύπου NRAS Control Wild-Type, τον θετικό μάρτυρα NRAS Positive Control Exon 2 και τον μάρτυρα χωρίς μήτρα NRAS Exon 2 (NTC5). (f) Για το κύριο μίγμα 6, NRAS Exon 3, θα χρειαστούν τρεις επιπλέον αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων για τον μάρτυρα άγριου τύπου NRAS Control Wild-Type, τον θετικό μάρτυρα NRAS Positive Control Exon 3 και τον μάρτυρα χωρίς μήτρα NRAS Exon 3 (NTC6). (g) Για το κύριο μίγμα 7, NRAS Exon 4, θα χρειαστούν τρεις επιπλέον αντιδράσεις ανά πλάκα δειγμάτων για τον μάρτυρα άγριου τύπου NRAS Control Wild-Type, τον θετικό μάρτυρα NRAS Positive Control Exon 4 και τον μάρτυρα χωρίς μήτρα NRAS Exon 4 (NTC7). Σημείωση: λάβετε υπόψη ότι θα χρειαστεί όγκος κύριου μίγματος ελαφρώς μεγαλύτερος από εκείνον που προκύπτει με αυτό τον υπολογισμό, για την αντιμετώπιση τυχόν απωλειών κατά τη διάρκεια της μεταφοράς με πιπέτα. 8. Επισημάνετε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml ή τα πηγάδια μιας πλάκας 96 πηγαδιών με τις αντίστοιχες πληροφορίες δείγματος. 9. Επισημάνετε σωληνάρια φυγοκέντρησης 2,0 ml για την παρασκευή του κύριου μίγματος. 10. Προσθέστε τον απαιτούμενο όγκο νερού καθαρότητας μοριακής βιολογίας στα σωληνάρια φυγοκέντρησης 2,0 ml που φέρουν την επισήμανση «κύριο μίγμα». 11. Προσθέστε την απαιτούμενη ποσότητα DNA Polymerase 10X PCR Buffer στα σωληνάρια του κύριου μίγματος. 12. Προσθέστε τον απαιτούμενο όγκο 10 mm dntps στα σωληνάρια του κύριου μίγματος. 13. Προσθέστε τον απαιτούμενο όγκο εκκινητών KRAS ή NRAS Forward Primers στα αντίστοιχα σωληνάρια του κύριου μίγματος. 14. Προσθέστε τον απαιτούμενο όγκο εκκινητών KRAS ή NRAS Reverse Primers στα αντίστοιχα σωληνάρια του κύριου μίγματος. 15. Βγάλτε το ένζυμο DNA Polymerase (κωδ. είδους 703310) από τον καταψύκτη. 16. Φυγοκεντρήστε το ένζυμο DNA Polymerase για ~10 δευτερόλεπτα. 17. Ανακινήστε το ένζυμο DNA Polymerase σε αναδευτήρα τύπου vortex για ~10 δευτερόλεπτα. 18. Προσθέστε τον απαιτούμενο όγκο DNA Polymerase στα σωληνάρια του κύριου μίγματος. 19. Πωματίστε τα σωληνάρια του κύριου μίγματος. 20. Πριν από τη χρήση, ανακινήστε τα σωληνάρια του κύριου μίγματος σε αναδευτήρα τύπου vortex για ~30 δευτερόλεπτα και, κατόπιν εκτελέστε σύντομη φυγοκέντρηση για ~10 δευτερόλεπτα. 21. Φυλάξτε τα στον πάγο μέχρι τη χρήση. 22. Μεταφέρετε με την πιπέτα 48,0 µl (δείτε την παραπάνω σημείωση στο βήμα 6) από το κύριο μίγμα στα κατάλληλα πηγάδια, αλλάζοντας τα ρύγχη πιπέτας από δείγμα σε δείγμα, εάν χρησιμοποιείτε μονοκάναλη πιπέτα. Εάν χρησιμοποιείτε μια επαναληπτική πιπέτα, βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχει έκχυση ή εκτίναξη υγρού από πηγάδι σε πηγάδι. ιατηρήστε την πλάκα στον πάγο. 23. Στα κατάλληλα πηγάδια, προσθέστε 2,0 µl (δείτε την παραπάνω σημείωση στο βήμα 6) από κάθε μήτρα DNA ή 2,0 µl νερό (μάρτυρας χωρίς μήτρα, NTC). Χρησιμοποιήστε ξεχωριστά ρύγχη πιπέτας για κάθε δείγμα και αποφύγετε τη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων από τυχόν εκτίναξη υγρού. Πωματίστε τα πηγάδια που περιέχουν τα δείγματα DNA και τον μάρτυρα NTC με τις ταινίες 8 πωμάτων (εάν χρησιμοποιείτε πλάκα 96 Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 17

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα πηγαδιών) ή πωματίστε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml. Βεβαιωθείτε ότι τα πώματα έχουν σφραγιστεί καλά. 24. Μόνο τότε ανοίξτε τα σωληνάρια των μαρτύρων μήτρας DNA των κιτ (κωδ. είδους 710131, 710135, 710136, 710137, 710138, 710441, 710442, 710443 και 710444), ένα κάθε φορά. Μεταφέρετε με την πιπέτα 2,0 µl κάθε μήτρας μαρτύρων τελευταία, έτσι ώστε να μειώσετε την πιθανότητα επιμόλυνσης οποιουδήποτε δείγματος DNA. Πωματίστε ξανά όλα τα πηγάδια με τις ταινίες 8 πωμάτων (εάν χρησιμοποιείτε πλάκα 96 πηγαδιών) ή πωματίστε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml. Βεβαιωθείτε ότι τα πώματα έχουν σφραγιστεί καλά. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ορθή πρακτική υπαγορεύει την τοποθέτηση μαρτύρων χωρίς μήτρα (NTC) σε πηγάδια τα οποία δεν βρίσκονται δίπλα στους θετικούς μάρτυρες Positive Controls ή στα δείγματα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για μια πρόταση σχετικά με την προετοιμασία πλακών 96 πηγαδιών για ανάλυση όλων των exons 2-4 των KRAS και NRAS, βλ. Παράρτημα A.1 Σχέδιο διάταξης πλάκας για τα κιτ SURVEYOR Scan. 25. Ανακινήστε σε αναδευτήρα τύπου vortex (~1/2 ταχύτητα) για 10 δευτερόλεπτα. 26. Φυγοκεντρήστε για 1-2 λεπτά για να διασφαλίσετε ότι όλη η ποσότητα των διαλυμάτων είναι συγκεντρωμένη στον πυθμένα των πηγαδιών ή των σωληναρίων. Βεβαιωθείτε ότι τα διαλύματα βρίσκονται στον πυθμένα κάθε πηγαδιού ή σωληναρίου. Εάν δεν βρίσκονται, επαναλάβετε τη φυγοκέντρηση. 12.6 Πρόγραμμα θερμικού κυκλοποιητή για το πρωτόκολλο ενίσχυσης 1. Χρησιμοποιήστε το ακόλουθο πρωτόκολλο θερμικού κυκλοποιητή για ενίσχυση με PCR και σχηματισμό ετερόδιπλων μορίων: 15 κύκλοι 30 κύκλοι Αρχική αποδιάταξη 95 C 5 λεπτά Ενίσχυση Touchdown 95 C 30 δευτερόλεπτα 62 C, -0,5 ºC/κύκλο 30 δευτερόλεπτα 72 C 25 δευτερόλεπτα Ενίσχυση 95 C 30 δευτερόλεπτα 55 C 30 δευτερόλεπτα 72 C 25 δευτερόλεπτα Τελική επέκταση 1 κύκλος 72 C 2 λεπτά Σχηματισμός ετερόδιπλων μορίων 95 ºC 2 λεπτά 12 C Αναμονή 12.7 Ποιοτικός έλεγχος προϊόντων PCR 1. Συνιστάται να ελέγξετε την ποιότητα και την ποσότητα του ενισχυμένου τμήματος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (ή αντίστοιχα μέσα) προτού προχωρήσετε σε πέψη με SURVEYOR Nuclease. 2. Αναλύστε ένα κλάσμα του προϊόντος PCR μαζί με διαφορετικές ποσότητες ενός δείκτη μοριακού βάρους DNA των 100 bp. 3. Χρησιμοποιήστε τον δείκτη μοριακού βάρους για να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του ενισχυμένου DNA. 4. Θα πρέπει να παρατηρηθεί μόνο μία μονή ζώνη, με συγκέντρωση υψηλότερη από 20 ng/µl, η οποία αντιστοιχεί στο κύριο προϊόν PCR. 5. Εάν παρατηρηθούν πολλές ζώνες, βεβαιωθείτε ότι η ποιότητα του αρχικού δείγματος μήτρας DNA ήταν επαρκής (βλ. Παράρτημα Β Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων). Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 18

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα 6. Εάν δεν παρατηρηθεί κανένα προϊόν, βεβαιωθείτε ότι η ποιότητα του αρχικού δείγματος μήτρας DNA ήταν επαρκής (βλ. Παράρτημα Β Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων). Εάν η ποιότητα είναι σύμφωνη με τις προδιαγραφές, αυξήστε τον όγκο της μήτρας σε 4,0 µl ανά 50 µl αντίδρασης (μειώστε τον όγκο νερού ανά αντίδραση σε 31,0 µl). 7. Κανένα προϊόν PCR δεν θα πρέπει να είναι ορατό στο δείγμα μάρτυρα χωρίς μήτρα. Εάν είναι ορατά προϊόντα DNA με αυτό τον μάρτυρα, είναι πιθανό να υπάρχει επιμόλυνση. Βλ. Παράρτημα Β - Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων. 8. Χαρακτηρίστε την αντίδραση PCR ως Ισχυρό προϊόν PCR ή Ασθενές προϊόν PCR. a. Το ισχυρό προϊόν PCR θα πρέπει να έχει μία μόνο ζώνη μεγαλύτερη από ή ίση με 20 ng/µl. b. Το ασθενές προϊόν PCR θα πρέπει να έχει μία μόνο ζώνη μικρότερη από 20 ng/µl. c. Προχωρήστε στην πέψη με SURVEYOR Nuclease, τόσο για το ισχυρό προϊόν PCR όσο και για το ασθενές προϊόν PCR. ΣΥΜΒΟΥΛΗ: σε αυτό το στάδιο τα προϊόντα PCR μπορούν να φυλαχθούν στους -20 ºC ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία επί έως και μία εβδομάδα. 12.8 Πέψη με SURVEYOR Nuclease 1. Αφού το δείγμα PCR κριθεί επαρκές ως προς την ποιότητα και την ποσότητά του, εκτελέστε την αντίδραση πέψης με SURVEYOR Nuclease, όπως περιγράφεται παρακάτω. Για τη βέλτιστη πέψη με SURVEYOR Nuclease, απαιτείται συγκέντρωση δείγματος ίση με 40 ng/µl ή μεγαλύτερη από αυτήν. 2. Αφήστε τα σωληνάρια που περιέχουν τα διαλύματα 0.15 M MgCl 2 Solution και SURVEYOR Enhancer Cofactor να αποψυχθούν στον πάγο. 3. Προσθέστε 10,0 µl από καθένα από τα παραπάνω δείγματα που έχουν ενισχυθεί με PCR σε ένα νέο σωληνάριο PCR των 0,2 ml ή σε πηγάδι πλάκας 96 πηγαδιών. 4. Παρασκευάστε ένα νέο μίγμα με 0.15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 και SURVEYOR Nuclease W (μίγμα με SURVEYOR Nuclease). Χρησιμοποιήστε τον παρακάτω πίνακα ως οδηγό για την παρασκευή του κύριου μίγματος πέψης με SURVEYOR Nuclease για την ανάλυση πολλαπλών δειγμάτων. Το παρακάτω παράδειγμα περιλαμβάνει τους όγκους για ένα κύριο μίγμα 10 δειγμάτων. Λάβετε υπόψη ότι θα χρειαστεί όγκος κύριου μίγματος ελαφρώς μεγαλύτερος από εκείνον που προκύπτει με αυτό τον υπολογισμό, για την αντιμετώπιση τυχόν απωλειών κατά τη διάρκεια της μεταφοράς με πιπέτα. Αριθμός αντιδράσεων πέψης με SURVEYOR Nuclease: Υπολογισμός όγκου: 0.15 M MgCl 2 Solution (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10,0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20,0 Συνολικός όγκος κύριου μίγματος: 50,0 10 Προσθέστε 5 µl κύριου μίγματος SURVEYOR Nuclease δείγμα που έχει ενισχυθεί με PCR (µl) 10,0 Συνολικός όγκος αντίδρασης πέψης με SURVEYOR Nuclease: 15,0 a. Φυγοκεντρήστε κάθε αντιδραστήριο πριν από τη χρήση. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 19

12 Οδηγίες βήμα προς βήμα b. Πριν από τη μεταφορά με πιπέτα, ανακινήστε ήπια κάθε αντιδραστήριο σε αναδευτήρα τύπου vortex. Εκτελέστε σύντομη φυγοκέντρηση για ~10 δευτερόλεπτα μετά από κάθε βήμα ανακίνησης σε αναδευτήρα τύπου vortex. c. Για κάθε πέψη, προσθέστε τα ακόλουθα συστατικά σε ένα σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης PCR των 0,2 ml (ή μεγαλύτερο). 1,0 µl 0.15 M MgCl 2 Solution (κωδ. είδους 708027) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (κωδ. είδους 708049) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (κωδ. είδους 710161) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (κωδ. είδους 710160) ή προσθέστε 5 µl κύριου μίγματος, όπως έχει παρασκευαστεί σύμφωνα με τον παραπάνω πίνακα. 5. Ανακινήστε ήπια το κύριο μίγμα πέψης με SURVEYOR Nuclease σε αναδευτήρα τύπου vortex για 10 δευτερόλεπτα, σε χαμηλή ταχύτητα 6. Φυγοκεντρήστε το κύριο μίγμα πέψης με SURVEYOR Nuclease για 10 δευτερόλεπτα, σε χαμηλή ταχύτητα. 7. Τοποθετήστε το κύριο μίγμα πέψης με SURVEYOR Nuclease στον πάγο έως ότου το χρησιμοποιήσετε. Σημείωση: Το κύριο μίγμα πέψης με SURVEYOR Nuclease που παρασκευάστηκε στο βήμα 7 θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί άμεσα, καθώς το ένζυμο SURVEYOR Nuclease W αδρανοποιείται με την πάροδο του χρόνου, όταν είναι παρόντα τα υπόλοιπα συστατικά του κύριου μίγματος πέψης με SURVEYOR Nuclease. 8. Μεταφέρετε με πιπέτα ένα κλάσμα 5,0 µl κύριου μίγματος πέψης με SURVEYOR Nuclease σε κάθε σωληνάριο ή πηγάδι το οποίο περιέχει 10,0 µl προϊόντος που έχει ενισχυθεί με PCR (βλ. παραπάνω, το βήμα 3). 9. Όταν ολοκληρωθεί η μεταφορά με πιπέτα, φυγοκεντρήστε τα σωληνάρια PCR των 0,2 ml ή την πλάκα 96 πηγαδιών για 10 δευτερόλεπτα. 10. Ανακινήστε ήπια τα σωληνάρια δείγματος PCR των 0,2 ml ή την πλάκα 96 πηγαδιών σε αναδευτήρα τύπου vortex, για 10 δευτερόλεπτα. 11. Φυγοκεντρήστε για 10 δευτερόλεπτα σε χαμηλή ταχύτητα (αυτό το βήμα είναι ιδιαιτέρως σημαντικό, εάν η πέψη πραγματοποιείται σε ένα όργανο χωρίς θερμαινόμενο καπάκι). 12. Επωάστε στους 42 C για 30 λεπτά. 13. Προσθέστε 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (κωδ. είδους 708030) σε κάθε σωληνάριο ή πηγάδι και ανακινήστε ήπια σε αναδευτήρα τύπου vortex (ο συνολικός όγκος αντίδρασης με SURVEYOR Nuclease είναι 16,0 µl). ΣΥΜΒΟΥΛΗ: Τα προϊόντα πέψης SURVEYOR μπορούν να φυλαχθούν σε θερμοκρασία -20 ºC επί έως και μία εβδομάδα. 14. Φορτώστε τις αντιδράσεις πέψης των δειγμάτων σε ένα σύστημα DHPLC. Σημείωση: Για τις προτεινόμενες ρυθμίσεις κλίσης συγκέντρωσης για την ανάλυση των αντιδράσεων πέψης με SURVEYOR Nuclease στο σύστημα DHPLC, επισκεφθείτε τη διαδικτυακή τοποθεσία http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysiskits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. Οδηγίες χρήσης για το κιτ CRC RAScan Combination Kit με τα συστήματα DHPLC Σελίδα 20