Νυχάς Γεώργιος - Ιωάννης

Ταχείες Μέθοδοι Αποτίμησης (μικροβιακής) του κρέατος Νυχάς Γεώργιος - Ιωάννης Σχολή Τροφίμων, Βιοτεχνολογίας & Ανάπτυξης, Τμήμα Επιστήμης & Διατροφής του Ανθρώπου, Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τροφίμων, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, 3/17/2015 1

INTRODUCTION -What is Process Analytical Technologies -Τι είναι «Διεργασία Αναλυτικής Τεχνολογίας» -The Quality by Design concept -Τι είναι «Ποιότητα βάσει Σχεδιασμού» -How microbes can be measured? -Πως υπολογίζουμε τους μικροβιακούς πληθυσμούς METHODS/RESULTS/TOOLS -Beef/pork (μοσχάρι vs χοιρινό) -Vibrational Spectroscopy (FTIR) -Multispectral Imaging GENERAL CONCLUSIONS -Safety by Design? 3/17/2015 2

Process Analytical Technology Recently, the term Process Analytical Technology (PAT) (instead of the existing Process Analytical Chemistry) has been used to describe this area that is the application of analytical chemistry and process chemistry with multivariate tools for process understanding. Ο όρος Διεργασία Αναλυτικής Τεχνολογίας περιγράφει την εφαρμογή της Αναλυτικής Χημείας & Χημικών διεργασιών με πολυμεταβλητά εργαλεία για την κατανόηση της διαδικασίας From Chemical and Pharmaceutical Industry to Food Industry?! 3/17/2015 3

Ταυτότητα / Ιστορία Προϊόντος Σύγχρονα όργανα ανάλυσης + FTIR, RAMAN - ανάλυση Εικόνας /σήματος Παραγωγή προϊόντος δειγματοληψία Δείγμα No Διεργασία προϊόντος Διεργασία μετρήσεων ProcessIQ Cloud Data Storage Αποθετήριο μετρήσεων ΑΠΟΔΕΚΤ Ο σύμφωνα με την Νομοθεσία Εργαστηριακή ανάλυση Μεταφορά δείγματος No Διεργασί ες Ελέγχου Κέντρο αποφάσεων Yes Current Processing Yes Προτεινόμενη Διεργασία ΑΓΟΡΑ/ ΕΜΠΟΡΙΟ ΑΓΟΡΑ / ΕΜΠΟΡΙΟ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ; Το Πρόβλημα Η ποσοτική εκτίμηση της αλλοίωσης και της ασφάλειας των τροφίμων βασίζεται σήμερα σε μικροβιολογικές και οργανοληπτικές αναλύσεις.

INTRODUCTION; Quantitative Food Microbiology (Where?) (EC) No 1441/2007 of 5 December 2007 amending Regulation (EC) No 2073/2005 on microbiological criteria for foodstuffs Chapter 2. Process hygiene criteria 2.1 Meat and products thereof Carcases of cattle, sheep, goats and horses Aerobic colony count 3,5 to 5,0 log cfu/cm 2 Enterobacteriaceae 1,5 to 2,5 log cfu/cm 2 Carcases after dressing but before chilling Minced beef Aerobic colony count 5 10 5-5 10 6 cfu/g End of the manufacturing process LEGISLATION 17/03/2015 6

ΕΙΣΑΓΩΓΗ; Πως μετράμε τα μικρόβια στα τρόφιμα? Conventional microbiology Method Pre-treatment Time required for the results Microbial population counts Direct microscopy count of organism Optical Density (OD) Sampling Depended on tested microbiota e.g.total viable counts 48h, enterobacteria 18-24h, yeast and molds 72-120h <1 hour <1 hour Enumeration 3/17/2015 8

ΕΙΣΑΓΩΓΗ; Πως μετράμε τα μικρόβια στα τρόφιμα? Molecular Molecular tools Technique Pre-treatment Time required for the results Species -specific PCR Isolation, culture, DNA extraction 1 day PCR-DGGE DNA extraction 2 days T-RFLP DNA extraction 1 day Real-Time PCR RNA/DNA extraction 1 day SDS-PAGE Protein extraction 1-3 days RAPD Isolation, culture, DNA extraction 1 day rep-pcr Isolation, culture, DNA extraction 1-2 days RFLP Isolation, culture, DNA extraction 1 day PFGE Isolation, culture 4-7 days 2-DE Protein extraction 3-4 days Microarrays DNA/RNA extraction 2-3 days FISH 1-3 days 3/17/2015 9 Doulgeraki et al. 2012 IJFM 157, 130-141 (review)

ΕΙΣΑΓΩΓΗ; Το Πρόβλημα Οι αναλύσεις όμως αυτές χαρακτηρίζονται από υψηλό κόστος, απαιτούν ανθρώπινο δυναμικό και εξοπλισμό υψηλού επιπέδου, ενώ τα αποτελέσματά τους είναι ετεροχρονισμένα. Επιπλέον, το κυριότερο μειονέκτημα της οργανοληπτικής μεθόδου είναι η εξάρτησή της από εξειδικευμένη ομάδα δοκιμαστών και δεν ενδείκνυται για αναλύσεις ρουτίνας. Τέλος, η εν λόγω προσέγγιση δεν είναι επαρκής γιατί στηρίζεται σε δειγματοληπτικό έλεγχο του τελικού προϊόντος και ως εκ τούτου δεν προσφέρει πλήρη προστασία στον καταναλωτή.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ; Εναλλακτική προσέγγιση Οι βιοχημικές μεταβολές που λαμβάνουν χώρα στα τρόφιμα κατά τη συντήρησή τους θα μπορούσαν να αποτελέσουν αντικειμενικούς δείκτες αλλοίωσης, δεδομένου ότι αποτελούν χαρακτηριστικό μεταβολικό αποτύπωμα του τροφίμου. Προς την κατεύθυνση αυτή θα μπορούσαν να συμβάλλουν σημαντικά συγκλίνουσες τεχνολογίες (π.χ. ενόργανη ανάλυση, βιοπληροφορική, βιολογικά συστήματα, μεταβολομική), που η εφαρμογή τους στην τεχνολογία τροφίμων είναι σήμερα περιορισμένη.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ανάλυση σήματος Οι οπτικές ιδιότητες ενός τροφίμου μπορεί να δώσουν χρήσιμες πληροφορίες για την ποιότητα του τροφίμου και αποτελούν σημαντικό εν δυνάμει δείκτη ποιότητας. Όμως, η αντίληψη της ποιότητας ενός τροφίμου μέσω της ανθρώπινης όρασης είναι υποκειμενική και δε μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Για το λόγο αυτό η Ανάλυση Εικόνας (Image Analysis) θα μπορούσε να αποτελέσει ένα σύγχρονο, αξιόπιστο και απλό εργαλείο για τον προσδιορισμό της ποιότητας των τροφίμων.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ; Αλλοίωση ποιότητα τροφίμων Λυπόλυση Κακή εμφάνιση αποδόμηση Μαλάκωμα Κακή γεύση acceptable ταγγιση deterioration Αποτίμηση της αλλοίωσης Finger Printing Hyper/Multi Spectral imaging Vibrational Spectroscopy FTIR RAMAN Microbiological Measurement Counts omics /sensors HPLC/GCMS/ GS/ NMR e-nose 3/17/2015 13

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αλλοίωση Τροφίμων Αλλοίωησ κρέατος/ νοθεία MLR ANN,SVM Finger Printing Omics Vibrational spectroscopy Νοθεία Συμβατική μικροβιολογία PLS-DA PLS-R, PCR 3/17/2015 14

Materials and methods Meat samples: Fresh deboned beef fillets (80 mm x 10 mm x 5 mm). Packaging: Aerobic conditions. Storage temperatures: 0, 5, 10, 15 and 20 C in high precision (± 0.5 C) incubation chambers for an overall period of 350 hours. Microbiological analyses: PCA, CFC, VRBG, LAB Organoleptic assessment: Spoilage detection based on changes in colour, odour and taste based on a five member taste panel. Scoring scale: range 1-3; 1=Fresh or TVC <5.5logcfu/gr; 1.5 Semi-Fresh, or TVC >5.5 & <7.5 logcfu/gr; 2-3 Spoiled or TVC >7.5logcfu/gr. Sampling frequency: 24h at 0 and 5 C; 8, 6, 4 h at 10, 15, and 20 C. FT-IR analysis: Spectra collected in parallel to monitor biochemical changes in meat during storage.

(Vibrational Spectroscopy) FTIR

FT-IR, RAMAN Analysis

Fat Fat Fat Amide Amines Amide III Fat / Amide III Amines Moisture + Amide I Amide II AUA Typical FTIR spectra in the range of 1800 to 1000 cm -1 collected from beef fillets stored at 5 C for 10 days e c n a b r o s b A 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 ***F1a ***F1b ***10F2 ***10F3 ***10F5 ***10F6 ***10F7 ***10F8 ***10F9 ***10F10 ***10F11 ***10F12 ***10F13 ***10F14 ***10F15 ***10F16 ***10F17 ***10F18 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 2000 1800 1600 1400 Wavenumbers (cm-1) 1200 1000 Different colours represent different sampling days.

Hyper/Multispectral Imaging analysis Surface Chemistry

VideometerLab Zone Wave length (nm) 1 405 2 435 3 450 4 470 5 505 6 525 7 570 8 590 9 630 10 645 11 660 12 700 13 850 14 870 15 890 16 910 17 940 18 970

Reflectance Reflectance AUA Beef fillets aerobic packaging UV 405 nm 0 C 24 h Wavelength UV 405 nm 0 C 383 h 590 nm (orange) 700 nm (red) Wavelength

Image processing pipeline raw image

Image processing pipeline transformation

Image processing pipeline segmentation

Predicted counts AUA Comparison between observed and predicted total viable counts (TVC) by ANNs on beef fillets Observed counts

3/17/2015 26

3/17/2015 27

3/17/2015 28

3/17/2015 29

3/17/2015 30

3/17/2015 31

Concluding remarks FTIR Spectral and MultiSpectral Imaging analysis spectral data, in combination with an appropriate machine learning strategy could become an effective tool to monitor beef fillets spoilage REGARDLESS packaging and Temperature of storage Further training of the taste panel and/or development of a common protocol for meat sensory evaluation will increase the efficacy of the method. SAFETY by DESIGN!?

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΉ ΣΑΣ 3/17/2015 33