ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΣΤΗΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ FUSARIUM OXYSPORUM

ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΣΤΗΝ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ ΚΑΙ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΜΥΚΗΤΑ FUSARIUM OXYSPORUM Θωμάς Πάσχος Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 15780, Ζωγράφου, Αθήνα. Χαρίλαος Ξηρός Division of Agriculture, School of Agriculture, forestry and food science, Bern University of applied sciences, Längasse 85, 3052 Zollikofen, Switzerland Παύλος Χριστακόπουλος Biochemical I Process Engineering, Division of Chemical Engineering, Department of Civil, Environmental and Natural Resources Engineering, Luleå University of Technology, SE-971 87 Luleå, Sweden paul.christakopoulos@ltu.se ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη της μεταβολικής ενεργότητας και της κυτταρινολυτικής δράσης των ενζύμων του μύκητα Fusarium oxysporum παρουσία αιθανόλης. Η μελέτη της ανάπτυξης του μύκητα έγινε με αρχικές συγκεντρώσεις αιθανόλης μεταξύ 0% και 6% β/ο σε υπόστρωμα γλυκόζης συγκέντρωσης 2% β/ο. Από τα πειραματικά δεδομένα εξάγεται το συμπέρασμα της παρεμπόδισης της αιθανόλης κατά την ανάπτυξη σε αερόβιες συνθήκες του μύκητα F. οxysporum, η παρουσία αιθανόλης φαίνεται να έχει σημαντική αρνητική επίδραση και στο ρυθμό ανάπτυξης. Η παρουσία 4% (β/ο) αιθανόλης στο μέσο ανάπτυξης αναστέλλει το ποσοστό παραγωγής βιομάζας σε βαθμό μεγαλύτερο του 70%. Η μελέτη της παρεμπόδισης της ζύμωσης από την αιθανόλη πραγματοποιήθηκε επίσης με αρχικές συγκεντρώσεις αιθανόλης μεταξύ 0% και 6% β/ο με υπόστρωμα γλυκόζης. Παρατηρήθηκε ότι η παρεμπόδιση της αιθανόλης στη μεταβολική δράση του μύκητα σε αναερόβιες συνθήκες είναι ακόμα πιο έντονη από αυτήν της ανάπτυξης. Για υπόστρωμα γλυκόζη συγκέντρωσης 2% β/ο, και αρχική συγκέντρωση αιθανόλης 4% β/ο προκύπτει μείωση της καθαρής παραγωγής αιθανόλης κατά 84%, ενώ για μεγαλύτερες αρχικές συγκεντρώσεις αιθανόλης, ο αναερόβιος μεταβολισμός των κυττάρων του μύκητα πρακτικά σταματά. Η κυτταρινολυτική δράση του ενζυμικού συστήματος του μύκητα φαίνεται να επηρεάζεται λιγότερο από την παρουσία αιθανόλης, ενώ η επιρροή της αιθανόλης αυξάνεται αυξανομένης της θερμοκρασίας. Για να είναι εφικτή η βιομηχανική χρήση του μύκητα F. oxysporum στην παραγωγή αιθανόλης κρίνεται απαραίτητη η μειωμένη παρουσία αιθανόλης στο μίγμα της ζύμωσης. Μια πρώτη προσπάθεια για in situ αφαίρεση της παραγόμενης αιθανόλης πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή κενού στην καλλιέργεια. ΕΙΣΑΓΩΓΗ O Fusarium oxysporum είναι ένας νηματοειδής μύκητας ικανός για παραγωγή αιθανόλης, όχι μόνο από εξόζες αλλά και από πεντόζες. Διαθέτει επίσης την ικανότητα να εκκρίνει πληθώρα κυτταρινολυτικών και ημικυτταρινολυτικών ενζύμων, παρουσιάζοντας την ικανότητα να αναπτύσσεται σε λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα σε βυθισμένες ή στερεές καλλιέργειες [1-3]. Ο μύκητας αυτός είναι ικανός να διασπά και να ζυμώνει μια μεγάλη ποικιλία από υποστρώματα υπό αναερόβιες ή μίκρο-αερόβιες συνθήκες, παρουσία παρεμποδιστικών ενώσεων όπως φουράνες, φενολικές ενώσεις και ασθενή οξέα [4]. Αντιθέτως, ο αργός ρυθμός παραγωγής αιθανόλης και σε αρκετές περιπτώσεις ο σχηματισμός οξικού οξέος ως παραπροϊόντος, θεωρούνται εμπόδια για την βιομηχανική εκμετάλευση του. Παρ όλα αυτά, έχει αποδειχτεί ότι τα αποτελεσματικά λιγνινοκυτταρινολυτικά ένζυμα του μικροοργανισμού καθώς και η ικανότητά του να ζυμώνει πεντόζες (ξυλόζη) μπορούν να βελτιώσουν σημαντικά την παράγωγη βιοαιθανόλης από λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα, σε μικτές καλλιέργειες με τον Saccharomyces serevisiae [5]. Οι ιδιότητες αυτές του F. oxysporum θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν επαρκώς σε μια ενοποιημένη βιοδιεργασία (ΕΒΔ), όπου ένα μικροβιακό σύστημα ικανό να υδρολύει τα υποστρώματα και να ζυμώνει τα παραγόμενα σάκχαρα τίθεται σε εφαρμογή σε ένα μόνο αντιδραστήρα [5]. Η ΕΒΔ μειώνει τόσο το κόστος της διεργασίας όσο και τις περιβαλλοντικές επιπτώσεις της, ελαχιστοποιώντας την προσθήκη εξωγενώς παρηγμένων εμπορικών ενζύμων. Η οικονομική απόδοση μιας τέτοιας διεργασίας μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω εάν λειτουργεί σε συνθήκες υψηλής συγκέντρωσης στερεών (ολική συγκέντρωση στερεών πάνω από 20% β/ο). Παρά το ότι η λειτουργία σε τόσο υψηλές συγκεντρώσεις δημιουργεί τεχνικά προβλήματα όπως η ανεπαρκής ανάδευση και ανάμιξη των μιγμάτων, έχει κερδίσει το ενδιαφέρων διότι είναι ικανή να πετύχει τελικές συγκεντρώσεις αιθανόλης πάνω από 4% β/ο [6], κάτι που

μπορεί να μειώσει το κόστος της απόσταξης [7]. Η αντοχή στην αιθανόλη των μικροοργανισμών που θα χρησιμοποιηθούν είναι κρίσιμη για την απόδοσή τους σε μεγάλης κλίμακας διεργασίες. Η αιθανόλη επηρεάζει τις κυτταρικές μεμβράνες, τον κυτταρικό μεταβολισμό και την βιοσύνθεση μακρομορίων, μειώνει το ρυθμό συσσώρευσης RNA και πρωτεϊνών [8], ενισχύει τη συχνότητα μεταλλάξεων, αποδιατάσει τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες και τα γλυκολυτικά ένζυμα μειώνοντας την ενεργότητα τους [9]. Αυτά τα παρεμποδιστηκά αποτελέσματα αποτυπώνονται στο μειωμένο ρυθμό κυτταρικής διαίρεσης, στο χαμηλό ρυθμό ανάπτυξης και στο μικρό όγκο των κυττάρων, καθώς οι υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης μειώνουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων [10]. Εύρωστοι αιθανολοπαραγωγοί μικροοργανισμοί όπως ο S. serevisiae, έχουν αναπτύξει κατάλληλους μηχανισμούς για να αντιμετωπίζουν αρκετές καταστροφές που παρουσιάζονται από την υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης. Η ζύμη αντιδρά επαναπρογραμματίζοντας τις κυτταρικές λειτουργίες της για να διασφαλίσει την επιβίωση της υπό αντίξοες συνθήκες, προστατεύοντας τα απαραίτητα κυτταρικά συστατικά επιτρέποντας στο κύτταρο να επιστρέψει στην κανονική μεταβολική του κατάσταση [11]. Η μελέτη της επίδρασης της αιθανόλης όχι μόνο προς την τελική απόδοση αλλά και προς τον ρυθμό κυτταρικής ανάπτυξης και παραγωγής αιθανόλης είναι κρίσιμα για την αξιολόγηση ενός μικροοργανισμού ως προς την ικανότητά του να χρησιμοποιηθεί σε διεργασίες παραγωγής βιοκαυσίμων. Επιπλέων, η πιθανότητα χρησιμοποίησης λιγνινοκυτταρινολυτικών ενζύμων σε διεργασίες ταυτόχρονης σακχαροποίησης και ζύμωσης (ΤΣΖ) εξαρτάται από την σταθερότητά τους σε τέτοιες διεργασίες. Η αιθανόλη θεωρείται ένας μη συναγωνιστικός παρεμποδιστής των κυτταρινασών [12]. Η αιθανόλη όπως και άλλα οργανικά μόρια, όπως η βουτανόλη και η ακετόνη, προσδένεται στη μη καταλυτική περιοχή του ενζύμου προκαλώντας μεταβολές στο σχήμα του πρωτεϊνικού μόριο, οι οποίες με τη σειρά τους επιδρούν στην καταλυτική ενεργότητα. Όμως όλα τα ένζυμα δεν επηρεάζονται από την αιθανόλη με τον ίδιο τρόπο. Όπως έδειξαν οι Chen και Jin η παρουσία αιθανόλης είχε θετική επίδραση στην β-γλυκοζιδάση του Penicillium decumbens, ειδικά σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 40 C [13]. Έτσι, η μελέτη της επίδρασης της αιθανόλης στην κυτταρινολυτική ενεργότητα των ενζύμων που είναι πιθανό να χρησιμοποιηθούν σε μια διεργασία ΤΣΖ είναι πρωταρχικής σημασίας. Η παρούσα εργασία μελετά την επίδραση της αιθανόλης στην ενζυμική και μεταβολική ενεργότητα του μύκητα F. oxysporum, στην ανάπτυξη παρουσία γλυκόζης υπό αερόβιες συνθήκες και στην παραγωγή αιθανόλης σε συνθήκες μειωμένης παρουσίας οξυγόνου. Επιπλέον, για να υπερκεραστούν οι αρνητικές επιπτώσεις της αιθανόλης, στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε μια εναλλακτική διεργασία ζύμωσης με μερική αφαίρεση της παραγόμενης από το σύστημα αιθανόλης. Η παρούσα μελέτη δίνει στην επιστημονική κοινότητα μια νέα προοπτική για την μελέτη του μύκητα F. oxysporum στην πιθανή του χρήση σε μια ΕΒΔ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Μικροοργανισμός Ο Fusarium oxysporum F3 που έχει απομονωθεί από κύμινο [1], καλλιεργήθηκε σε στερεό θρεπτικό μέσο (PDA) για 5 μέρες στους 30 C. Το θρεπτικό μέσο με τον μικροοργανισμό διατηρείται στους 4 C. Χημικά - πηγές άνθρακα Όλα τα χημικά προέρχονται από την εταιρία Sigma-Aldrich (USA). Το υπόλειμμα βύνης (BG) και ο σπάδικας αραβοσίτου (CC) προέρχονται από την Αθηναϊκή Ζυθοποιία και το Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθήνας, αντίστοιχα. Τα εμπορικά ένζυμα Celluclast 1.5L και Novozyme 188 προέρχονται από την εταιρία Novozymes (Denmark). Χρησιμοποιήθηκαν σε αναλογία 5:1 ο/ο. Αερόβια ανάπτυξη βυθισμένης καλλιέργειας (Ανάπτυξη βιομάζας Παραγωγή ενζύμων) Οι αερόβιες βυθισμένες καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε κωνικές φιάλες (Erlenmeyer flasks) όγκου 250 ml (ενεργού όγκου 100 ml). Οι καλλιέργειες περιέχουν το ακόλουθο θρεπτικό μέσο: (σε g L -1 ) 1.00 KH 2 PO 4, 0.30 CaCl 2 2H 2 O, 0.30 MgSO 4 7H 2 O, 10.00 (NH 4 ) 2 HPO 4, 6.94 NaH 2 PO 4 2H 2 O, 9.52 Na 2 HPO 4 2H 2 O σε ph ίσο με 6.0). Ως θρεπτικό μέσο χρησιμοποιήθηκε γλυκόζη (2 % β/ο) (αποστειρωμένη ξεχωριστά στους 109 C για 40 λεπτά) για τις καλλιέργειες μελέτης ανάπτυξης, και BG/CC 4% β/ο (για την παραγωγή ενζύμων). Οι φιάλες επωάστηκαν στους 30 C για 7 ημέρες με ανάδευση 200 rpm. Για την μελέτη επίδρασης της αιθανόλης στην αερόβια ανάπτυξη, αιθανόλη σε συγκέντρωση έως 6% β/ο προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας πριν τον εμβολιασμό του μικροοργανισμού.

Μέτρηση βιομάζας Η μέτρηση της βιομάζας έγινε με τον προσδιορισμό του βάρους φιλτραρισμένων και ξηρών δειγμάτων [4]. Επίδραση της αιθανόλης στην ενζυμική ενεργότητα Η ενζυμική ενεργότητα μετρήθηκε με τη μέθοδο Filter paper activity (FPA) όπως έχει περιγραφεί από τους Wood και Bhat [14]. Για την μελέτη της επίδρασης της αιθανόλης στην ενζυμική ενεργότητα, η παραπάνω μέτρηση πραγματοποιήθηκε παρουσία αιθανόλης έως 10% β/ο στο διάλυμα της αντίδρασης. Η αιθανόλη προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης πριν από την προσθήκη των ενζύμων, και πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασίες 30 C και 50 C. Μικρό αερόβια ανάπτυξη (Παραγωγή αιθανόλης) Βυθισμένες καλλιέργειες υπό συνθήκες χαμηλού αερισμού πραγματοποιήθηκαν σε κωνικές φιάλες (Erlenmeyer flasks) όγκου 250 ml (ενεργού όγκου 100 ml). Οι φιάλες περιείχαν 2% β/ο γλυκόζη (αποστειρωμένη ξεχωριστά στους 109 C για 40 λεπτά) και σε αυτές προστεθήκαν 100 ml καλλιέργειας πλήρως ανεπτυγμένης υπό αερόβιες συνθήκες. Οι φιάλες επωάστηκαν στους 30 C για 7 ημέρες με ανάδευση 80 rpm. Μερική απομάκρυνση της αιθανόλης Πραγματοποιήθηκαν βυθισμένες καλλιέργειες υπό μικρό αερόβιες συνθήκες με αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 9.5% β/ο. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 30 C για 7 μέρες με ανάδευση 80 rpm. Κάθε δύο μέρες η καλλιέργεια φυγοκεντρείται ασηπτικά και η υγρή φάση της μεταφέρεται σε περιστροφικό εξατμιστήρα όπου υπόκειται σε κενό για 10 λεπτά στους 75 C. Υπό αυτές τις συνθήκες μέρος της αιθανόλης που περιέχεται στο σύστημα απομακρύνεται. Εν συνεχεία το υγρό μέσο επιστρέφεται στις κωνικές φιάλες μαζί με την φυγοκεντρημένη βιομάζα. Σε αυτή τη φάση αέριο άζωτο διοχετεύεται στην καλλιέργεια για να διασφαλιστούν οι αναερόβιες συνθήκες με απομάκρυνση του διαλυμένου οξυγόνου. Επιπλέον, για να μην παρατηρηθεί συμπύκνωση της καλλιέργειας, η απώλεια υγρού μετρήθηκε με υπολογισμό της απώλειας βάρους και αποστειρωμένο απιονισμένο νερό προστίθεται για να αποκαταστήσει τις απώλειες. Αναλυτικές μέθοδοι Τα ολικά αναγωγικά σάκχαρα (TRS) μετρήθηκαν με την μέθοδο του δίνιτρο-3,5-σαλυκιλικού οξέος (DNS) [15]. Η γλυκόζη μετρήθηκε με χρήση του εμπορικού ενζυμικού σκευάσματος GOD/PAP (glucose oxidase/ peroxidase assay) (Biosis, Ελλάδα). Οι μετρήσεις αιθανόλης έγιναν με τη χρήση Υγρής Χρωματογραφίας (HPLC) με ένα σύστημα εξοπλισμένο με στήλη Aminex HPX-87H για το διαχωρισμό των ουσιών και ανιχνευτή μέτρησης του δείκτη διάθλασης του πολωμένου φωτός (Refractive Index). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση της αιθανόλης στην ανάπτυξη F. oxysporum Μελετήθηκε η ικανότητα του F. οxysporum να αναπτύσσεται παρουσία αιθανόλης υπό αερόβιες συνθήκες. Διάφορες συγκεντρώσεις αιθανόλης από 0 έως 6% β/ο προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας πριν από τον εμβολιασμό του μικροοργανισμού. Η επίδραση της αιθανόλης στην ανάπτυξη ήταν εμφανής ήδη μετά από 15 ώρες ενώ μεγιστοποιήθηκε στις 44 ώρες μετά τον εμβολιασμό του μύκητα. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, η μέγιστη συγκέντρωση βιομάζας μειώνεται όσο η συγκέντρωση αιθανόλης στο μέσο καλλιέργειας αυξάνεται. Με την παρουσία 30 g/l αιθανόλης η παράγωγη βιομάζας μειώθηκε στο 77% σε σχέση με την μη παρουσία αιθανόλης. Όταν η αρχική συγκέντρωση αιθανόλης αυξήθηκε στα 40 g/l παρουσιάστηκε δραματική μείωση στην βιομάζα, ενώ δεν μετρήθηκε παραγωγή βιομάζας για συγκέντρωση αιθανόλης 60 g/l. Επιπροσθέτως, η παρεμποδιστική δράση της αιθανόλης αποτυπώθηκε και στον ρυθμό ανάπτυξης του μύκητα. Όπως παρουσιάζεται στον πίνακα 1, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μειώθηκε δραματικά με την αύξηση της συγκέντρωσης αιθανόλης στο μέσο καλλιέργειας. Πίνακας 1. Ρυθμοί ανάπτυξης και φάση στασιμότητας στην αερόβια ανάπτυξη του F.oxysporum παρουσία αιθανόλης. Αιθανόλη % (β/ο) μ (h -1 ) Φάση στασιμότητας (h) 0 0.045 ± 0,002 9 1 0.038 ± 0.001 9 2 0.035 ± 0.003 17 3 0.033 ± 0.003 28 4 0.009 ± 0.003 44 5 0.002 ± 0.002 -- 6 -- --

Σχήμα 1. Επίδραση της αιθανόλης στην ανάπτυξη του F. oxysporum. Αιθανόλη σε συγκεντρώσεις έως 6% β/ο προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας πριν τον εμβολιασμό. Χωρίς αιθανόλη ( ), 1% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 2% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 3% β/ο αρχική αιθανόλη (Δ), 4% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 5% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 6% β/ο αρχική αιθανόλη ( ). Επίδραση της αιθανόλης στην αναερόβια ανάπτυξη (ζύμωση) του F. oxysporum Για να διερευνηθεί η επίδραση της αιθανόλης στην ικανότητα του μύκητα να μετατρέπει τα σάκχαρα σε αιθανόλη, πραγματοποιήθηκαν βυθισμένες καλλιεργείς του μύκητα, υπό αναερόβιες συνθήκες με την ταυτόχρονη προσθήκη αιθανόλης (0 6% β/ο) στην αρχή της ζύμωσης. Στο σχήμα 2 παρουσιάζεται η καθαρή παραγωγή αιθανόλης από τον F. οxysporum παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων αιθανόλης. Η ολική συγκέντρωση αιθανόλης στην οποία είναι εκτεθειμένα τα κύτταρα, είναι το άθροισμα της αρχικής αιθανόλης και της αιθανόλης που έχει παραχθεί. Τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι, η τελική συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης καθώς και ο ρυθμός παραγωγής της επηρεάζονται από την παρουσία αιθανόλης στην καλλιέργεια. Η προσθήκη 2%, 3% και 4% β/ο αιθανόλης στην καλλιέργεια μείωσε την παραγωγή αιθανόλης κατά 46%, 65% και 74%, αντίστοιχα. Ενώ δεν παρατηρήθηκε παραγωγή αιθανόλης για αρχικές συγκεντρώσεις άνω του 5% β/ο. Σχήμα 2. Επίδραση της αιθανόλης στην ζύμωση της γλυκόζης από τον F. oxysporum. Αιθανόλη σε συγκεντρώσεις έως 6% προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Χωρίς αιθανόλη ( ), 1% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 2% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 3% β/ο αρχική αιθανόλη (Δ), 4% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 5% β/ο αρχική αιθανόλη ( ), 6% β/ο αρχική αιθανόλη ( ). Επίδραση της αιθανόλης στο κυτταρινολυτικό ενζυμικό σύστημα του F. oxysporum. Για να αξιολογηθεί η πιθανή χρήση του ενζυμικού συστήματος του F. oxysporum σε μια ΕΒΔ ή μια ΤΣΖ, μελετήθηκε η επίδραση της αιθανόλης στην κυτταρινολυτική δράση του ενζυμικού συστήματος παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων αιθανόλης. Για να είναι δυνατή η αξιολόγηση των δεδομένων, οι ίδιες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και στο εμπορικό ενζυμικό σύστημα Celluclast 1,5L - Novozyme 188. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 3. Οι μετρήσεις ενζυμικής ενεργότητας πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασίες 30 C

και 50 C. Η πρώτη είναι η πιο συνηθισμένη θερμοκρασία για διεργασίες παραγωγής αιθανόλης (η βέλτιστη θερμοκρασία ζύμωσης των μικροοργανισμών), ενώ η δεύτερη είναι η τυπική θερμοκρασία μέτρησης ενζυμικών λιγνινοκυτταρινολυτικών ενεργοτήτων. Το ενζυμικό σύστημα του F. oxysporum δεν επηρεάστηκε σημαντικά στους 30 C για συγκέντρωση αιθανόλης 2% β/ο. Ενώ παρά την εμφανή μείωση για υψηλότερες συγκεντρώσεις, η εναπομένουσα ενεργότητα μετρήθηκε στο 72% και στο 63% της αρχικής για συγκεντρώσεις αιθανόλης 6% β/ο και 8% β/ο, αντίστοιχα. Όπως θα ήταν αναμενόμενο, η παρεμποδιστική δράση της αιθανόλης ήταν πιο ισχυρή για θερμοκρασία 50 C, όπου η ενζυμική ενεργότητα μειώθηκε στο 64% και το 47% της αρχικής παρουσία 6% και 8% β/ο αιθανόλης, αντίστοιχα. Συγκριτική ήταν η επίδραση της αιθανόλης και στο εμπορικό ενζυμικό σκεύασμα, όπου η μείωση της δράσης ακολούθησε αντίστοιχη τάση με αυτή των ενζύμων του F. οxysporum (σχήμα 3). Σχήμα 3. Επίδραση της αιθανόλης στην κυτταρινολυτική ενζυμική ενεργότητα. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με την προσθήκη αιθανόλης στο μέσο της αντίδρασης. Τα ένζυμα του F. oxysporum συγκρινόμενα με το εμπορικό μίγμα Celluclast 1,5 L Novozyme 188. ( ) Ενζυμικό σύστημα F. oxysporum στους 50 C και (Δ) στους 30 C. ( ) Εμπορικά ένζυμα στους 50 C και ( ) στους 30 C. Αφαίρεση αιθανόλης κατά τη ζύμωση Όπως δείχτηκε στα προηγούμενα (Σχήμα 2), η αιθανόλη παρουσιάζει παρεμποδιστική δράση στην ικανότητα ζύμωσης του F. oxysporum. Για να μελετηθεί αν η παρουσία αιθανόλης έχει αντιστρεπτό αποτέλεσμα στον κυτταρικό μεταβολισμό, πραγματοποιήθηκε αφαίρεση της αιθανόλης (υπό κενό) από το σύστημα ζύμωσης κάθε 48 ώρες. Ζυμώσει υπό κενό έχουν εφαρμοστεί και σε προηγούμενες μελέτες για να ξεπεραστεί η παρεμποδιστική δράση της αιθανόλης [16,17]. Στο σχήμα 4, φαίνεται ότι με την αφαίρεση της αιθανόλης από το σύστημα παρουσιάστηκε αύξηση της απόδοσης στην ζύμωση της γλυκόζης από τον F. oxysporum κατά 22.5%. Το αποτέλεσμα αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα πως όταν η υπέρμετρη ποσότητα αιθανόλης αφαιρεθεί από το σύστημα, ο μύκητας ανακτά την μεταβολική του δράση, αποδεικνύοντας τον αντιστρεπτό χαρακτήρα της παρεμποδιστικής δράσης της αιθανόλης υπό τις συνθήκες της ανωτέρω μελέτης [16,17]. Σχήμα 4. Επίδραση της αιθανόλης στη διαδικασία ζύμωσης. Η παραγόμενη αιθανόλη αφαιρείται από το σύστημα κάθε 48 ώρες. Αιθανόλη στην καλλιέργεια ( ), Συνολική αιθανόλη (αιθανόλη στην καλλιέργεια συν αιθανόλη που έχει αφαιρεθεί) ( ), κατανάλωση γλυκόζης ( ), παραγωγή αιθανόλης στο πείραμα αναφοράς ( ) κατανάλωση γλυκόζης στο πείραμα αναφοράς ( ).

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα ανωτέρω αποτελέσματα παρουσιάζουν την επίδραση της αιθανόλης ως προς τρεις διαφορετικές πτυχές του μύκητα F. oxysporum, την επίδραση, (α) στην αερόβια ανάπτυξη, (β) την αναερόβια ζύμωση και (γ) στην κυτταρινολυτική ενεργότητα των ενζύμων που εκκρίνει. Από αυτά μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι ο μύκητας αυτός είναι ικανός να χρησιμοποιηθεί ως αιθανολοπαραγωγός μικροοργανισμός σε μια ΕΒΔ παραγωγής βιοαιθανόλης. Τα αποτελέσματα αντοχής σε αιθανόλη καταδεικνύουν ότι ο μύκητας μπορεί να αξιοποιηθεί κατά τα αρχικά στάδια της ζύμωσης, όπου τα επίπεδα της συγκέντρωσης αιθανόλης δεν ξεπερνούν τα όρια αντοχής του μικροοργανισμού. Επιπλέον τα ικανοποιητικά επίπεδα αντοχής στην αιθανόλη του ενζυμικού του συστήματος, μπορούν να επιτρέψουν τη χρήση του σε διεργασίες παραγωγής αιθανόλης υψηλής συγκέντρωσης υποστρώματος. Αυτό το ενδεχόμενο (της χρήσης των ενδογενώς παραγμένων ενζύμων) μπορεί να βοηθήσει σημαντικά στη μείωση του κόστους μιας διεργασίας μειώνοντας την απαραίτητη ποσότητα εμπορικών ενζύμων που θα προστεθούν στη διεργασία. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, σε συνδυασμό με άλλες μελέτες αντοχής και προσαρμοστικότητας στη βιβλιογραφία [3,4], υποδεικνύουν ότι ο F. oxysporum είναι ικανός να ανταπεξέλθει στην παρουσία αιθανόλης, καθιστώντας τον κατάλληλο για περαιτέρω μελέτη σε ενοποιημένες βιοδιεργασίες. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ The research leading to these results has received funding from the European Community s 7th Framework Program (FP7/2007-2013) under grant agreement 213139 the HYPE project. Ο Θωμάς Πάσχος ευχαριστεί το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών, για την χορήγηση υποτροφίας. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Christakopoulos P., Macris B.J., Kekos D., Enzym Microb Technol, 11:236 (1989). [2]. Xiros C. and Christakopoulos P., Biotechnol Biofuels, 2:4 (2009) [3]. Hennesey R.C., Doohan F., Mullins E., Plos One. 8(10):e77501 (2013). [4]. Xiros C., Vafiadi C., Paschos T., Christakopoulos P., J Chem Technol Biotechnol, 86(2):223 (2011). [5]. Panagiotou G., Topakas E., Moukouli M., Christakopoulos P., Olsson L., Biomass Bioenergy, 35:3727 (2011). [6]. Koppram R., Tomás-Pejó E., Xiros C., Olsson L., Trends Biotechnol, 32(1):46 (2014). [7]. Galbe M, Sassner P, Wingren A, Zacchi G. Adv Biochem Eng/Biotechnol, 108:303 (2007). [8]. Chandler M., Stanley G.A., Rogers P., Chambers P., Ann Microbiol, 54:427 (2004). [9]. Hu X.H., Wang M.H., Tan T., Li J.R., Yang H., Genetics, 175:1479 (2007). [10]. Birch R.M., Walker G.M., Enzym Microb Technol., 26:678 (2000). [11]. Stanley D., Bandara A., Fraser S., Chambers P.J., Stanley G.A., J Appl Microbiol, 109:13 (2010). [12]. Gomma E.O., Ann Microbiol, 62:1403 (2011). [13]. Chen H., Jin S., Enzym Microb Technol, 39(7):1430 (2006). [14]. Wood T.M., Bhat K.M., Methods Enzymo, 160:87 (1988). [15]. Miller G.L., Anal Chem, 31:426 (1959). [16]. Nguyen V.D., Auresenia J., Kosuge H., Tan R.R., Brondial Y., Biochem Eng, 55(3):208 (2011). [17]. Lee J.H., Woodard J.C., Pagan R.J., Rogers P.L., Biotechnol Lett, 3(4):177 (1981).