ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΙΧΘΥΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ Υ ΑΤΙΝΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μικροβιολογικές και οργανοληπτικές µεταβολές και χηµικοί δείκτες αλλοίωσης κατά την συντήρηση της νωπής τσιπούρας» ΖΟΥΜΠΟΥΛΑ ΝΙΚΗ ΒΟΛΟΣ 2010

«Μικροβιολογικές και οργανοληπτικές µεταβολές και χηµικοί δείκτες αλλοίωσης κατά την συντήρηση της νωπής τσιπούρας» 2

Τριµελής Εξεταστική Επιτροπή 1) Μποζιάρης Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής, Υγιεινής και Συντήρησης Ιχθυηρών, Τµήµα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή Γεωπονικών Επιστηµών, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας, Επιβλέπων, 2) Κλαουδάτος Σπυρίδων, Καθηγητής, Υδατοκαλλιέργειες, Τµήµα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή Γεωπονικών Επιστηµών, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας, Μέλος, 3) Κορµάς Κωνσταντίνος, Μόνιµος Επίκουρος Καθηγητής, Οικολογία υδάτινης στήλης µε έµφαση στα µικροβιακά και τροφικά είδη, Τµήµα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή Γεωπονικών Επιστηµών, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας, Μέλος. 3

Στους γονείς µου Σπύρο και ήµητρα 4

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς µου ευχαριστίες σε όλους αυτούς τους ανθρώπους που συνέβαλλαν στο να φέρω εις πέρας την παρούσα Προπτυχιακή ιπλωµατική Εργασία. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επιβλέποντα της εργασίας αυτής, τον κ. Ι. Μποζιάρη για την πολύτιµη βοήθειά του και τη διαρκή υποστήριξή του, τόσο κατά τη διεξαγωγή του πειράµατος όσο και κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας, καθώς και τα µέλη της εξεταστικής επιτροπής µου, αποτελούµενη από τους κ. Κ. Κορµά και κ. Σ. Κλαουδάτο για τις συµβουλές τους στην προπτυχιακή εργασία και για τις γνώσεις που µου παρείχαν κατά τη διάρκεια των σπουδών µου. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τη συµφοιτήτριά µου Χαραλαµπάκη Μαρία και τον Οικονόµου Γεώργιο για τη βοήθειά τους. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στην οικογένεια µου για την αµέριστη συµπαράσταση, βοήθεια και προ πάντων κατανόηση και ανοχή όλο το χρονικό διάστηµα των σπουδών µου. 5

Περίληψη Τα αλιεύµατα είναι φθαρτά προϊόντα και θεωρούνται ιδιαιτέρως ευαίσθητα τα οποία κατά τη διατήρησή τους κάτω από ορισµένες συνθήκες υφίστανται ποιοτική υποβάθµιση και αλλοίωση. Ως αλλοίωση θεωρείται κάθε µεταβολή η οποία καθιστά το προϊόν ακατάλληλο για ανθρώπινη κατανάλωση. Η αλλοίωση προέρχεται από µικροβιολογικές και χηµικές µεταβολές και προκαλεί αλλαγή στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίµου µε αποτέλεσµα να το κάνουν µη αποδεκτό από τους καταναλωτές. Υπάρχουν διάφορες µέθοδοι για τον προσδιορισµό του εµπορικού χρόνου ζωής των ιχθύων. Οι µέθοδοι αυτοί περιλαµβάνουν µικροβιολογικές, χηµικές και οργανοληπτικές αναλύσεις. Σκοπός της παρούσας προπτυχιακής διατριβής είναι ο προσδιορισµός του εµπορικού χρόνου ζωής τσιπούρας αποθηκευµένης σε πάγο (0 o C) και σε θερµοκρασία ψυγείου (5 o C) όπως προκύπτει από την οργανοληπτική αξιολόγηση χρησιµοποιώντας απλούς καταναλωτές και η συσχέτιση µε την αύξηση του πληθυσµού των αλλοιογόνων µικροοργανισµών καθώς και µε τις µεταβολές χηµικών δεικτών αλλοίωσης όπως το ολικό πτητικό βασικό άζωτο (TVBN) και η τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ). Πιο συγκεκριµένα στην παρούσα µελέτη τσιπούρες ιχθυοκαλλιέργειας αποθηκεύτηκαν σε χαµηλές θερµοκρασίες (0 ο C και 5 ο C) και µελετήθηκε η µεταβολή του µικροβιακού πληθυσµού, οι µεταβολές των χηµικών δεικτών αλλοίωσης και η συσχέτισή τους µε την οργανοληπτική εκτίµηση και τον προσδιορισµό του εµπορικού χρόνου ζωής από απλούς καταναλωτές. Μελετήθηκε ο ρυθµός αύξησης της ολικής µεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ), του γένους Pseudomonas sp., των βακτηρίων που παράγουν υδρόθειο (Shewanella putrefaciens), των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae, των 6

οξυγαλακτικών και του βακτηρίου Brochothrix thermosphacta. Από τα αποτελέσµατα των µικροβιολογικών αναλύσεων προέκυψε ότι ο κυρίαρχος µικροβιακός πληθυσµός και για τις δύο θερµοκρασίες είναι τα βακτήρια του γένους Pseudomonas και τα βακτήρια που παράγουν υδρόθειο. Ο πληθυσµός των υπόλοιπων βακτηρίων που µελετήθηκαν ήταν ιδιαίτερα χαµηλός και για τις δύο θερµοκρασίες αποθήκευσης. Ως χηµικοί δείκτες αλλοίωσης χρησιµοποιήθηκε το ολικό πτητικό βασικό άζωτο (TVB-N) και η τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ). Το TVB-N παράγεται σε ικανοποιητικές ποσότητες όταν η µικροβιολογική δραστηριότητα έχει προχωρήσει αρκετά, γι αυτό θεωρείται αξιόπιστος δείκτης για τα τελευταία στάδια της αλλοίωσης. Για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 0 ο C έγινε και οργανοληπτική αξιολόγηση από απλούς καταναλωτές για διάφορα εξωτερικά χαρακτηριστικά όπως χρώµα δέρµατος, διαύγεια και µορφή οφθαλµών, οσµή, υφή, παραγωγή βλέννας και χρώµα βραγχίων. Τα αποτελέσµατα της έρευνας έδειξαν ότι σύµφωνα µε µικροβιολογικές, χηµικές και οργανοληπτικές αναλύσεις ο εµπορικός χρόνος ζωής για τσιπούρες που αποθηκεύθηκαν στον πάγο είναι 11 ηµέρες, ενώ για εκείνες που αποθηκεύθηκαν στους 5 ο C ήταν περίπου 5 ηµέρες. Σε σχέση µε µελέτες άλλων ερευνητών, οι καταναλωτές σε αντίθεση µε τους εκπαιδευµένους κριτές, αξιολόγησαν αυστηρά τα χαρακτηριστικά όπως, χρώµα οφθαλµών και βραγχίων, εµφάνιση βλέννας κτλ σε σχέση µε την οσµή. Λαµβάνοντας υπόψη µόνο την αξιολόγηση της οσµής ο χρόνος ζωής και η συσχέτιση µε τους χηµικούς δείκτες αλλοίωσης συµπίπτει µε αυτά άλλων ερευνητών, και φθάνει τις 14 µε 15 ηµέρες. ιαφαίνεται ότι οι Έλληνες καταναλωτές αξιολογούν οργανοληπτικά κυρίως την νωπότητα και όχι την βρωσιµότητα όπως αυτή προσδιορίζει τον εµπορικό χρόνο ζωής. 7

Περιεχόµενα 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 10 1.1 Γενικά... 10 1.2 Αλλοίωση τροφίµων αλιευµάτων... 11 1.3 Ειδικοί Αλλοιογόνοι Μικροοργανισµοί... 12 1.4 Χηµικοί δείκτες αλλοίωσης... 14 1.5 Οργανοληπτική αξιολόγηση τροφίµων... 15 1.6 H τσιπούρα... 16 1.7 Οικονοµική Σηµασία Τσιπούρας... 17 1.8 Η τσιπούρα ως τρόφιµο... 18 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ... 20 2.1 Γενικά... 20 2.2 Παραλαβή και αποθήκευση τσιπούρων... 21 2.3 Μικροβιολογικές αναλύσεις... 21 2.4 Παρασκευή θρεπτικών υποστρωµάτων... 25 2.5 Χηµικοί είκτες Αλλοίωσης... 28 2.6 Οργανοληπτική αξιολόγηση... 30 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 32 3.1 Μικροβιακή ανάπτυξη... 32 3.2 Χηµικοί δείκτες αλλοίωσης... 37 8

3.3 Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά... 40 3.4 Συσχέτιση αποτελεσµάτων... 46 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 53 5. Βιβλιογραφία... 61 6. Abstract... 66 9

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Γενικά Τα τρόφιµα είναι προϊόντα πρωτογενούς παραγωγής ή προϊόντα που προέρχονται από αυτά µε κατάλληλη επεξεργασία (Μπλούκας, 2004). ιατίθενται νωπά, επεξεργασµένα ή σε τυποποιηµένη µορφή και καταναλώνονται από τους ανθρώπους για ανάπτυξη, καλή υγεία και ικανοποίηση. Τα βασικά συστατικά των τροφίµων είναι νερό, πρωτεΐνες, λίπη, υδατάνθρακες, και σε µικρά ποσοστά απαντώνται ανόργανες ενώσεις υπό µορφή αλάτων, καθώς και οργανικές ουσίες όπως βιταµίνες, οργανικά οξέα, διάφορα αντιοξειδωτικά, πολυφαινόλες, αρώµατα κτλ (Rahman, 2007). Ως επεξεργασία τροφίµων εννοούµε τη µετατροπή της πρωτογενούς παραγωγής, σε συνδυασµό ή όχι µε άλλα συστατικά, σε προϊόντα κατάλληλα για ανθρώπινη κατανάλωση. Τα προϊόντα που προκύπτουν από την επεξεργασία των προϊόντων της πρωτογενούς παραγωγής χαρακτηρίζονται ως επεξεργασµένα τρόφιµα. Τα επεξεργασµένα τρόφιµα είναι πολυάριθµα. Ορισµένα αντιπροσωπευτικά προϊόντα αποτελούν τα κονσερβοποιηµένα, τα κατεψυγµένα και τα αφυδατωµένα τρόφιµα, τα καπνιστά ψάρια και άλλα προϊόντα αλιευµάτων, τα προϊόντα αρτοποιίας και πολλά άλλα (Μπλούκας, 2004). Οι αλλαγές στη συµπεριφορά των καταναλωτών τα τελευταία χρόνια έχει οδηγήσει σε αυξηµένες απαιτήσεις όπως η επιµήκυνση της εµπορικής διάρκειας ζωής, η ευκολότερη αποθήκευση και προετοιµασία για κατανάλωση, η υψηλή ποιότητα και νωπότητα, η θρεπτική αξία, η υγιεινή και άλλα (Barbosa Canovas and Gould, 2002). 10

Ως συντήρηση ορίζεται η λήψη µέτρων που συµβάλλουν στην σταθεροποίηση των τροφίµων σε σχέση µε τους παράγοντες που προκαλούν την ποιοτική υποβάθµιση ή αλλοίωσή τους. Στόχος των διεργασιών συντήρησης είναι η επιβράδυνση των αντιδράσεων καταβολισµού, ο περιορισµός της ανάπτυξης µικροοργανισµών και η αποφυγή αλλοιώσεων καθώς και ο περιορισµός απώλειας υγρασίας από το προϊόν. Επειδή οι αλλοιώσεις των τροφίµων προκαλούνται κυρίως από µικροοργανισµούς και ένζυµα, οι περισσότερες µέθοδοι συντήρησης στηρίζονται στη λήψη µέτρων για την αντιµετώπισή τους. Οι µέθοδοι συντήρησης διακρίνονται σε φυσικές, χηµικές και βιολογικές (Αρβανιτογιάννης και Μποσνέα, 2001). 1.2 Αλλοίωση τροφίµων αλιευµάτων Τα τρόφιµα θεωρούνται γενικά ως φθαρτά προϊόντα τα οποία κατά τη διατήρησή τους κάτω από ορισµένες συνθήκες υφίστανται ποιοτική υποβάθµιση και αλλοίωση, η έκταση των οποίων εξαρτάται από τη φύση του προϊόντος και τις συνθήκες διατήρησής του (Μπλούκας, 2004). Ως αλλοίωση τροφίµων θεωρείται κάθε µεταβολή η οποία καθιστά το προϊόν ακατάλληλο για ανθρώπινη κατανάλωση (Huis in t Veld, 1996). Η αλλοίωση προέρχεται από µικροβιολογικές και χηµικές µεταβολές και προκαλεί αλλαγή στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίµου µε αποτέλεσµα να το κάνουν µη αποδεκτό από τους καταναλωτές (Leisner and Gram, 1999). Είναι µία σύνθετη διαδικασία η οποία οφείλεται σε φυσικούς, χηµικούς και µικροβιολογικούς παράγοντες. Οι ενζυµικές και χηµικές αντιδράσεις προκαλούν την αρχική υποβάθµιση της ποιότητας, ενώ η µικροβιολογική δραστηριότητα ευθύνεται για την αλλοίωση και τελικά καθορίζει τη διάρκεια ζωής (Erkan, 2007). Η επέκταση της διάρκειας ζωής κατά 11

την αποθήκευση σε χαµηλές θερµοκρασίες οφείλεται στη µείωση του ρυθµού αύξησης και της µεταβολικής δραστηριότητας των αλλοιογόνων µικροοργανισµών (Cakli et al., 2007). Η αλλοίωση µπορεί να είναι φανερή όπως π.χ. φυσική φθορά, ορατή ανάπτυξη µικροοργανισµών, ανάπτυξη βλέννας ή προσβολή από έντοµα. Όταν όµως οφείλεται σε αλλαγές στη δοµή ή στην ανάπτυξη δυσάρεστων οσµών προκαλείται από χηµικές βιοχηµικές ή µικροβιολογικές αντιδράσεις και οι βασικοί µηχανισµοί ίσως είναι δύσκολο να αναγνωριστούν. Για το λόγο αυτό η εκτίµηση της αλλοίωσης γίνεται άµεσα ή έµµεσα µε οργανοληπτική αξιολόγηση (Huis in t Veld, 1996). Η οργανοληπτική αξιολόγηση καθορίζεται µε βάση τις αλλαγές της οσµής, της γεύσης και της υφής κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Όταν οι ιχθύς είναι νωποί έχουν χαρακτηριστική γεύση και άρωµα που εξαφανίζεται µετά από µερικές ηµέρες αποθήκευσης. Ύστερα υπάρχει οσµή αµµωνίας η οποία γίνεται πιο έντονη κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης ώσπου η αλλοίωση πλέον είναι φανερή (Dalgaard, 2003). Τα σύγχρονα συστήµατα ποιοτικού ελέγχου απαιτούν γρήγορο προσδιορισµό των παραµέτρων σχετικών µε τα ποιοτικά χαρακτηριστικά. Έτσι, υπάρχει προσπάθεια αντικατάστασης των οργανοληπτικών και µικροβιολογικών αναλύσεων µε χηµικές µεθόδους οι οποίες στοχεύουν στην ανίχνευση χηµικών ουσιών, ιδιαίτερα µικροβιακών µεταβολιτών, που σχετίζονται µε την αλλοίωση / νωπότητα του προϊόντος (Olafsdottir et al., 1997). 1.3 Ειδικοί Αλλοιογόνοι Μικροοργανισµοί Τα νωπά τρόφιµα µολύνονται από µια ποικιλία µικροοργανισµών, αλλά µόνο µία οµάδα από αυτούς έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται σε υψηλούς πληθυσµούς 12

και να συµµετέχει στη διαδικασία της αλλοίωσης. Αυτοί οι µικροοργανισµοί ονοµάζονται ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί. Οι µηχανισµοί σύµφωνα µε τους οποίους µία οµάδα βακτηρίων επικρατεί έναντι άλλων, δεν είναι πάντα πλήρως κατανοητοί (Gram and Huss, 1996: Leisner and Gram, 1999). Στις διάφορες συνθήκες αποθήκευσης, οι ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί αυξάνονται γρηγορότερα από την υπόλοιπη µικροχλωρίδα και παράγουν µεταβολίτες οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για δυσάρεστες οσµές (off-flavors) και τελικά προκαλούν οργανοληπτική απόρριψη. Ο πληθυσµός των ειδικών αλλοιογόνων µικροοργανισµών στο σηµείο της οργανοληπτικής απόρριψης είναι συνήθως της τάξεως του 10 7 10 8 cfu/g (Dalgaard, 2003). Οι ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί είναι διαφορετικοί για κάθε αλίευµα και µπορεί να αποτελούνται µόνο από ένα είδος βακτηρίων (Gram and Dalgaard, 2002). Στους ιχθύς από τη Μεσόγειο οι ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί είναι συνήθως οι Pseudomonas sp.(pacquit et al., 2006) και ειδικά για συντήρηση σε πάγο ειδικός αλλοιογόνος των ιχθύων που προέρχονται από τις βόρεις θάλασσες, θεωρείται το βακτήριο Shewanella putrefaciens (Koutsoumanis & Nychas, 1999: Gram and Huss, 1996). Οι περισσότεροι ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί παράγουν µία ή περισσότερες πτητικές ουσίες. Το βακτήριο S. putrefaciens παράγει υδρόθειο (H 2 S) από αµινοξέα που περιέχουν θείο, όπως η κυστεϊνη. (Gram and Huss, 1996). Τα βακτήρια που παράγουν θειούχες ουσίες ευθύνονται για τη δηµιουργία της δυσάρεστης οσµής που επικρατεί στην αλλοίωση (Lougovois et al., 2003). Αντιθέτως οι Pseudomonas sp. δεν παράγουν σηµαντικές ποσότητες H 2 S αλλά αζωτούχες πτητικές ουσίες όπως αµµωνία (NH 3) (Gram and Huss, 1996). 13

1.4 Χηµικοί δείκτες αλλοίωσης ιάφοροι χηµικοί και βιοχηµικοί παράµετροι χρησιµοποιούνται ως δείκτες αξιολόγησης της ποιότητας των ιχθύων και καταγράφουν τις αλλαγές που λαµβάνουν χώρα, όπως η αλλοίωση. Βιοχηµικοί παράµετροι αφορούν τις συγκεντρώσεις ATP και των προϊόντων της διάσπασής του, ενώ χηµικοί είναι η περιεκτικότητας σε τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ), ολικό πτητικό βασικό άζωτο (TVB-N), καθώς και βιογενείς αµίνες και κυρίως ισταµίνη (Ozogul et al., 2004). H δηµιουργία δυσάρεστων οσµών (off-flavours-off odours) είναι κοινή αιτία αλλοίωσης σε όλους τους κλάδους της βιοµηχανίας τροφίµων, και οι οικονοµικές επιπτώσεις µπορεί να είναι µεγάλες (Dainty, 1996). Η οδηγία της Ευρωπαϊκής Ένωσης (Counsil Directive 91/493/EEC, 1991) για την υγιεινή ιχθύων προσδιορίζει ότι εάν υπάρχει οποιαδήποτε αµφιβολία στην οργανοληπτική εξέταση ως προς τη φρεσκότητα των ψαριών, οι επιθεωρητές πρέπει να χρησιµοποιήσουν το ολικό πτητικό άζωτο (TVBN) ως χηµικό έλεγχο (Castro et al., 2006). To TVBN αποτελείται από διάφορες ουσίες όπως NH 3, τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ), βιογενείς αµίνες. Στις χηµικές µεθόδους συνήθως χρησιµοποιούνται µερικές ειδικές πτητικές ουσίες όπως π.χ. η τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ), ως δείκτες για τη φρεσκότητα των θαλασσινών, ειδικά στη βιοµηχανία ιχθύων. Η υποβάθµιση της ποιότητας των θαλασσινών όχι µόνο συνδέεται µε την υποβάθµιση της σάρκας, αλλά συνδέεται µε την αλλαγή των πτητικών χαρακτηριστικών (Zhang et al., 2010). Η τριµεθυλαµίνη προέρχεται από τη µετατροπή του οξειδίου της τριµεθυλαµίνης (ΤΜΑΟ) σε τριµεθυλαµίνη λόγω βακτηριολογικής δραστηριότητας (Cakli et al., 2006a). Το TMAO είναι ένα µέρος του µη πρωτεϊνικού αζώτου (non- 14

protein-nitrogen, NPN) και παρουσιάζεται σε όλα τα ψάρια του αλµυρού και σε µερικά του γλυκού νερού (Gram and Huss, 1996). Η ΤΜΑ χρησιµοποιείται για να επιβεβαιώσει την αλλοίωση και την καταλληλότητα ή µη του τροφίµου για ανθρώπινη κατανάλωση (Kilinc et al., 2007). Προκειµένου να ελεχθεί η φρεσκότητα των ιχθύων, είναι σηµαντικό να µπορούν να ανιχνευτούν πολύ µικρές αλλαγές στη συγκέντρωση της ΤΜΑ. Οι µέθοδοι που χρησιµοποιούνται ευρύτατα για την αξιολόγηση της ποιότητας είναι βασισµένες στην παρακολούθηση των αλλαγών της ολικής πτητικής βάσης (total volatile base), χρησιµοποιώντας τεχνικές απόσταξης ατµού και άλλες µεθόδους (Adhoum et al., 2003). 1.5 Οργανοληπτική αξιολόγηση τροφίµων Η αποδοχή των τροφίµων από τους καταναλωτές προσδιορίζεται από την οργανοληπτική ποιότητα. Για δεκαετίες η οργανοληπτική ανάλυση είναι ένα από τα βασικά κριτήρια στον καθορισµό της ποιότητας των περισσότερων προϊόντων αλιείας. Η απώλεια της φρεσκότητας είναι συνέπεια βιοχηµικών, φυσικοχηµικών και µικροβιολογικών διαδικασιών, χαρακτηριστικές για κάθε είδος. Αυτές οι αλλαγές µπορούν να εκτιµηθούν µε την εµφάνιση, την οσµή, την υφή και τη γεύση (Huidobro et al., 2000). Η φρεσκότητα ενός τροφίµου αναφέρεται στο βαθµό αποδοχής ορισµένων οργανοληπτικών παραµέτρων όπως η εµφάνιση, η υφή και η οσµή. Στα θαλασσινά η φρεσκότητα είναι το πιο σηµαντικό κριτήριο για την εκτίµηση της ποιότητας (Azam et al., 2008). Οι χηµικές και µικροβιολογικές µέθοδοι για την αξιολόγηση της φρεσκότητας και του εµπορικού χρόνου ζωής είναι χρήσιµες για την έρευνα αλλά δεν είναι πρακτικές 15

για καθηµερινή χρήση, καθώς απαιτείται ακριβός εργαστηριακός εξοπλισµός, εκπαιδευµένο προσωπικό, εντατική εργασία και είναι χρονοβόρες (Lougovois et al., 2003). Οι οργανοληπτικές µέθοδοι, σε αντίθεση µε τις µη οργανοληπτικές, µας δίνουν την ευκαιρία να αποτυπώσουµε την άποψη των καταναλωτών. Άλλωστε οι καταναλωτές παρέχουν γρήγορα πληροφορίες για την ποιότητα (Alasalvar et al., 2001). 1.6 H τσιπούρα Το σώµα της τσιπούρας είναι επίµηκες, πεπλατυσµένο και πλευρικά πιεσµένο µε κυρτή ράχη και κοντό ρύγχος. Τα µάτια της είναι µικρά και τα χείλη της χονδρά. Στις δύο σιαγόνες του στόµατός της φέρει 4 6 κυρτούς και µυτερούς κυνόδοντες και πίσω από αυτούς φέρει 2 4 σειρές πιο στρογγυλεµένων δοντιών, τα οποία σταδιακά µε την πάροδο της ηλικίας γίνονται τραπεζίτες. Το ραχιαίο και εδρικό πτερύγιο αποτελούνται από µαλακές και σκληρές ακτίνες µε αριθµό DXI/13 14 και AIII/11 12. Ο αριθµός των λεπιών της πλευρικής γραµµής είναι 73 85 και φθάνουν µέχρι τη βάση του ουραίου πτερυγίου. Το µέγιστο µήκος της τσιπούρας φθάνει στα 70 cm, µε πιο σύνηθες τα 30-35 cm (Νεοφύτου, 2007). Το βιολογικό θερµοκρασιακό εύρος της τσιπούρας κυµαίνεται από περίπου 4 o C έως 30 o C, ενώ η µέγιστη τιµή του ρυθµού αναπτύξεώς της παρατηρείται στους 22-24 o C και η αναπαραγωγική της δραστηριότητα ευνοείται ιδιαίτερα στους 13-17 o C περίπου. Τα όρια της αλατότητας του νερού στο οποίο επιβιώνει µπορεί να φθάσουν µέχρι του επιπέδου του 40 psu, ενώ η µέγιστη ανάπτυξή της παρατηρείται σε νερά αλατότητας από 28 psu έως 32 psu, κορεσµένα σε O 2 και τιµής του ph κυµαινόµενη από 7,8 έως 8,3. Ενδηµεί σε περιοχές ποικίλου βάθους και ποικίλης συστάσεως 16

πυθµένων. Τα νεαρά άτοµα συνήθως βρίσκονται σε περιοχές όχι µεγαλύτερες από 30 m βάθους, ενώ ενήλικα άτοµα µπορεί να βρεθούν µέχρι του βάθους των 100-150 m, τα οποία κατά την αναπαραγωγική τους περίοδο συγκροτούν αγέλες πολλών εκατοντάδων ατόµων (Παπουτσόγλου, 2008). Η τσιπούρα ανήκει στα σαρκοφάγα ψάρια και τρέφεται κυρίως µε µαλάκια, µύδια (τα οποία µπορεί εύκολα και να τα σπάσει), οστρακοειδή και µικρά ψάρια. Η αναπαραγωγή της λαµβάνει χώρα την περίοδο Οκτωβρίου εκεµβρίου. Είναι ερµαφρόδιτο είδος µε πρωτανδρική εµφάνιση και µετά το δεύτερο έτος της ηλικίας της πολλά άτοµα µετατρέπονται σε θηλυκά. Συναντάται στην κεντρική και δυτική Μεσόγειο θάλασσα, λιγότερο συχνά στις ανατολικές και νότιο-ανατολικές περιοχές και πολύ σπάνια στη Μαύρη θάλασσα (FAO, 2010). Επίσης, απαντάται από την περιοχή της Αγγλίας µέχρι το Πράσινο ακρωτήρι και τα Κανάρια νησιά. Η τσιπούρα είναι ψάρι που εκτρέφεται σε ιχθυοτροφεία, έχει µεγάλη εµπορική αξία και είναι πολύ αγαπητό στην ερασιτεχνική αλιεία (Νεοφύτου, 2007). 1.7 Οικονοµική Σηµασία Τσιπούρας Η τσιπούρα είναι ένα (ίσως το πρώτο) από τα θαλάσσια είδη των ιχθύων της Μεσογείου στα οποία έχει εφαρµοσθεί επιτυχώς εντατική ελεγχόµενη µαζική του εκτροφή. Η µαζική εκτροφή της τσιπούρας άρχισε από το τέλος της δεκαετίας του 1980 (Σχ. 1) και έκτοτε αναπτύχθηκε µε ιδιαίτερα έντονα αυξανόµενο ρυθµό η εκτροφή της, µε εντατικά συστήµατα παραγωγής και στην Ελλάδα, η οποία έχει καταστεί η πρώτη σε παραγωγή χώρα της Μεσογείου και της Ευρώπης (Παπουτσόγλου, 2008). 17

Σχήµα 1.1: Παγκόσµια παραγωγή τσιπούρας Η µεγαλύτερη παραγωγή παγκοσµίως εµφανίζεται στη Μεσόγειο, µε την Ελλάδα να πρωτοπορεί (49%), ενώ ακολουθούν η Τουρκία (15%), η Ισπανία (14%) και η Ιταλία (6%) (FAO, 2010). Η αύξηση της παραγωγής της εκτρεφόµενης τσιπούρας αλλά και οι ανάγκες διεύρυνσης της αγοράς έχουν οδηγήσει τους παραγωγούς στη βελτίωση της εµπορευµατοποίησης και στη διερεύνηση καλύτερων πρακτικών συντήρησης ώστε να επιµηκυνθεί η εµπορική ζωή του προϊόντος (Tejada and Huidobro, 2002). 1.8 Η τσιπούρα ως τρόφιµο Τα είδη των υδάτινων οικοσυστηµάτων είναι γνωστό ότι είναι κύρια πηγή ω-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA), ειδικά του εικοσιπεντανοϊκού οξέος (EPA) και του εικοσιδιεξανοϊκού οξέος (DHA). Οι άνθρωποι λαµβάνουν τις µεγαλύτερες ποσότητες EPA και DHA καταναλώνοντας ψάρια και υδρόβια ασπόνδυλα (Bhouri et al., 2010). 18

Η τσιπούρα έχει λευκό κρέας, ήπια γεύση και χαµηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά. Αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν κάνει δηµοφιλή την τσιπούρα και θεωρείται παγκοσµίως τρόφιµο υψηλής θρεπτικής αξίας (Kilinc et al., 2007). Σκοπός της παρούσας πτυχιακής είναι ο προσδιορισµός του εµπορικού χρόνου ζωής τσιπούρας αποθηκευµένης σε πάγο (0 o C) και σε θερµοκρασία ψυγείου (5 o C) όπως προκύπτει από την οργανοληπτική αξιολόγηση χρησιµοποιώντας απλούς καταναλωτές και η συσχέτιση µε την αύξηση του πληθυσµού των αλλοιογόνων µικροοργανισµών καθώς και µε τις µεταβολές χηµικών δεικτών αλλοίωσης όπως TVBN και ΤΜΑ. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης αναµένεται να αποδειχτούν χρήσιµα σε κλάδους οι οποίοι ασχολούνται µε την ποιότητα των νωπών αλιευµάτων, όπως ιχθυοκαλλιεργητές, βιοµηχανίες επεξεργασίας και µεταποίησης αλιευµάτων. 19

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Γενικά Στο πλαίσιο της παρούσας πειραµατικής εργασίας µελετήθηκαν ο µικροβιολογικός πληθυσµός σε νωπές τσιπούρες, οι χηµικοί δείκτες αλλοίωσης, οι οργανοληπτικές µεταβολές, και ο εµπορικός χρόνος ζωής της τσιπούρας (Sparus aurata) κατά την αποθήκευσή της σε θερµοκρασία 0 o C και 5 o C. Πιο αναλυτικά µελετήθηκαν: α) η επίδραση της θερµοκρασίας και του χρόνου συντήρησης στη µεταβολή των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών της τσιπούρας και κατ επέκταση στον εµπορικό χρόνο ζωής της, β) οι µεταβολές του πληθυσµού των αλλοιογόνων µικροοργανισµών κατά την αποθήκευση της τσιπούρας σε θερµοκρασία 0 o C και 5 o C. Ειδικότερα, µελετήθηκαν η Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (ΟΜΧ), οι Ψευδοµονάδες (Pseudomonas sp.), βακτήρια που παράγουν H 2 S (Shewanella putrefaciens), το Brochothrix thermosphacta, οξυγαλακτικά βακτήρια και βακτήρια της οικογένειας Enterobacteriaceae γ) ο προσδιορισµός των χηµικών δεικτών αλλοίωσης (ολικό πτητικό βασικό άζωτο (TVB-N), τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ)) κατά τη διάρκεια αποθήκευσης στις δύο παραπάνω θερµοκρασίες, δ) η µεταβολή του ph στη σάρκα της τσιπούρας ανάλογα µε το χρόνο και την θερµοκρασία αποθήκευσης. 20

2.2 Παραλαβή και αποθήκευση τσιπούρων Τα δείγµατα προήλθαν από τις ιχθυοκαλλιέργειες ίας. Οι τσιπούρες αµέσως µετά την εξαλίευσή τους τοποθετούνταν σε κυτία από φελιζόλ στα οποία τοποθετούνταν τριµµένος πάγος σε αναλογία 1:1 (w/w), και εντός τεσσάρων ωρών µεταφέρονταν στο εργαστήριο (Εικόνα 2.1). Οι θερµοκρασίες αποθήκευσης ήταν: ψύξης (5 o C) πάγου (0 o C) Στις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 0 o C, γινόταν προσθήκη τριµµένου πάγου ανά τακτά χρονικά διαστήµατα ώστε να διατηρείται σταθερή η θερµοκρασία αποθήκευσης. Εικόνα 2.1: Τσιπούρες σε κυτία από φελιζόλ µε πάγο όπως µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο. 2.3 Μικροβιολογικές αναλύσεις Σε κάθε δειγµατοληψία λαµβάνονταν ασηπτικά 10g από τη σάρκα της τσιπούρας εις τριπλούν, το οποίο τοποθετούνταν σε αποστειρωµένη σακούλα και προσθέτονταν 90ml Maximun Recovery Diluent (MRD). Πραγµατοποιούνταν οµογενοποίηση του δείγµατος σε συσκευή τύπου Stomacher για 1 min και ακολουθούσαν διαδοχικές αραιώσεις. Ο εµβολιασµός του βακτηριακού εναιωρήµατος 21

σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα έγινε µε δύο τεχνικές ανάλογα µε το θρεπτικό υπόστρωµα: 1) Με την τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης (spread plate technique) που αφορά την εξάπλωση γνωστού όγκου (0,1ml) βακτηριακού εναιωρήµατος σε στερεό θρεπτικό υλικό. Εφαρµόζεται γενικά στους αερόβιους µικροοργανισµούς. 2) Με την τεχνική της ενσωµάτωσης (pour plate technique) που αποτελείται από τα εξής στάδια: α) Τοποθέτηση γνωστού όγκου (1ml) βακτηριακού εναιωρήµατος σε τρυβλίο και β) µετάγγιση θρεπτικού υλικού που περιέχει άγαρ θερµοκρασίας 45 o C (ρευστή κατάσταση). Αυτή η τεχνική εφαρµόζεται γενικά στους µικροαερόφιλους και προαιρετικά αναερόβιους µικροοργανισµούς. Όλα τα µικροβιολογικά υλικά προµηθεύτηκαν από την εταιρεία LAB M (Lancashire UK), εκτός από το Streptomycin Thallate Actidione Agar (STAA) του οποίου η προµήθεια έγινε από τη Biolife (Biolife Italiana Srl, Milano) Οι µικροοργανισµοί που καταµετρήθηκαν ήταν οι ακόλουθοι: Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (ΟΜΧ) Ο προσδιορισµός της ΟΜΧ έγινε µε τη µέθοδο της επιφανειακής επίστρωσης σε θρεπτικό υπόστρωµα Tryptone Soy Agar (TSA) και επώαση για 48 h στους 25 o C (Εικόνα 2.2). 22

Εικόνα 2.2: Θρεπτικό υπόστρωµα TSA στο οποίο έχουν αναπτυχθεί αποικίες Ψευδοµονάδες (Pseudomonas sp.) Η καταµέτρηση των Ψευδοµονάδων έγινε µε επιφανειακή επίστρωση στο θρεπτικό υπόστρωµα Cetrimide Fusidin Cephaloridine agar (CFC), και επώαση για 48 h στους 25 o C (Εικόνα 2.3). Εικόνα 2.3: Θρεπτικό υπόστρωµα CFC στο οποίο έχουν αναπτυχθεί αποικίες του γένους Pseudomonas sp. 23

Βακτήρια που παράγουν H 2 S (Shewanella putrefaciens) Ο προσδιορισµός του πληθυσµού τους έγινε µε την τεχνική της ενσωµάτωσης σε Iron Agar (ΙΑ), και επώαση για 48 h στους 25 o C (Εικόνα 2.4). Εικόνα 2.4: Αποικίες Shewanella putrefaciens που έχουν αναπτυχθεί σε θρεπτικό υπόστρωµα Iron Agar. Βακτήρια της οικογένειας Enterobacteriaceae Ο προσδιορισµός των Εντεροβακτηριδίων πραγµατοποιήθηκε µε την τεχνική της ενσωµάτωσης στο θρεπτικό υλικό Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA), και επώαση για 24 h στους 37 o C (Εικόνα 2.5). Εικόνα 2.5: Τρυβλίο µε το θρεπτικό υπόστρωµα VRBGA 24

Οξυγαλακτικά βακτήρια Ο προσδιορισµός των οξυγαλακτικών βακτηρίων έγινε µε τη µέθοδο της ενσωµάτωσης στο θρεπτικό υπόστρωµα Mann Rogosa Sharpe agar (MRS), και επώαση για 96 h στους 37 o C (Εικόνα 2.6). Εικόνα 2.6: Τρυβλίο µε το θρεπτικό υπόστρωµα MRS Brochothrix thermosphacta Η καταµέτρηση του πληθυσµού του βακτηρίου Brochothrix thermosphacta έγινε µε τη µέθοδο της επιφανειακής επίστρωσης στο θρεπτικό υλικό Streptomycin Sulphate Thallus Acetate Cyloheximide Actidion Agar (STAA), και επώαση για 96 h στους 25 o C. αραίωσης. Τέλος ως ph της σάρκας µετρούνταν συµβατικά το pη της πρώτης δεκαδικής 2.4 Παρασκευή θρεπτικών υποστρωµάτων Η διαδικασία παρασκευής των θρεπτικών υποστρωµάτων που χρησιµοποιήθηκαν περιγράφεται παρακάτω 25

Maximum Recovery Diluent (MRD) 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε: 8,5g χλωριούχο νάτριο και 1,0g πεπτόνη και προσθέτουµε 1000ml απιονισµένο νερό. 2. Αν χρειάζεται αναδεύουµε µε µαγνητικό αναδευτήρα έτσι ώστε να διαλυθούν τα συστατικά 3. Με τη χρήση διανοµέα (dispenser) µεταγγίζουµε 9ml MRD σε δοκιµαστικούς σωλήνες και τοποθετούνται τα πώµατα. 4. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. Iron Agar (ΙΑ) 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε και προσθέτουµε: πεπτόνη 20g, εκχύλισµα κρέατος 3,0g, εκχύλισµα ζύµης 3,0g, κιτρικός σίδηρος 3,0g/l, θειοθειικό νάτριο 0,3g, NaCl 5g, L-κυστείνη 0,6g, άγαρ 14g. 2. Συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό 3. Ρυθµίζουµε το ph στην τιµή 7,4. 4. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε και προσθέτουµε: εκχύλισµα ζύµης 3,0g, πεπτόνη 7,0g, χλωριούχο νάτριο 5,0g, χολικά άλατα 1,5g, γλυκόζη 10,0g, χρωστική Neutral red 0,03g, χρωστική Crystal violet 0,002g, άγαρ 12,0g 2. Συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό 26

3. Τοποθετούµε τη φιάλη σε συσκευή βρασµού και αναδεύουµε µε µαγνητικό αναδευτήρα έτσι ώστε να διαλυθούν τα υλικά (δεν χρειάζεται επιπλέον αποστείρωση) Mann Rogosa Sharpe agar (MRS) 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε και προσθέτουµε: µίγµα από πεπτόνες 10,0g, εκχύλισµα ζύµης 5,0g, εκχύλισµα κρέατος 10,0g, γλυκόζη 20,0g, φωσφορικό κάλιο 2.0g, οξικό νάτριο 5,0g, θειικό µαγνήσιο 0,2g, θειικό µαγγάνιο 0.05g, Tween 1,08g, κιτρικό αµµώνιο 2,0g 2. Συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό 3. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. Tryptone Soy Agar (TSA) 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε και προσθέτουµε: τρυπτόνη 15,0g, πεπτόνη σόγιας 5,0g, χλωριούχο νάτριο 5,0g, άγαρ 15,0g 2. Συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό 3. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. 4. Μοιράζουµε σε τρυβλία Thallus Acetate Cyloheximide Actidion Agar (STAA) 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε και προσθέτουµε: πεπτόνη 20,0g, εκχύλισµα ζύµης 2,0g, όξινο φωσφορικό κάλιο 1,0g, θειικό µαγνήσιο 1,0g, άγαρ 13,0g 2. Συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό 27

3. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. 4. Προστίθενται τα αντιβιοτικά Thallus Acetate, Cyloheximide, Actidion 5. Μοιράζουµε σε τρυβλία CFC 1. Σε µία φιάλη των 1000ml ζυγίζουµε και προσθέτουµε: πεπτόνη από ζελατίνη 16.0g, υδρόλυµα καζείνης 10,0g, θειικό κάλιο 10,0g, χλωριούχο µαγνήσιο 1,4g, άγαρ 11,0g 2. Συµπληρώνουµε µε απιονισµένο νερό 3. Ακολουθεί αποστείρωση στους 121 o C για 15 λεπτά. 4. Προστίθενται τα αντιβιοτικά Cetrimide, Fusidin και Cephaloridine 5. Μοιράζουµε σε τρυβλία 2.5 Χηµικοί είκτες Αλλοίωσης Στην παρούσα πειραµατική διαδικασία προσδιορίστηκαν η τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ) και το Ολικό Πτητικό Βασικό Άζωτο (TVB-N). Τα δείγµατα λαµβάνονταν κάθε δύο µέρες εις τριπλούν. ιαδικασία προσδιορισµού τριµεθυλαµίνης (ΤΜΑ) 1. Ποσότητα 10g δείγµατος σάρκας τσιπούρας οµογενοποιείται σε συσκευή τύπου Stomacher µε 90ml διαλύµατος TCA 6% για 2min 2. Ακολουθεί διήθηση µέσω ηθµού Whatman Νο. 1 σε ογκοµετρική φιάλη 100ml. Προσθέτουµε TCA 6% µέχρι τη χαραγή 28

3. Ποσότητες 1ml από πρότυπα διαλύµατα 0, 0,05, 0,1, 0,15, και 2,0 mg/ml τριµεθυλαµίνης σε TCA 6% αλλά και ποσότητα 1ml διηθήµατος µεταφέρονται σε σειρά δοκιµαστικών σωλήνων όπου προστίθεται 3ml τουλουόλιο, 200µl φορµόλη, 500µl καυστικό κάλιο (ΚΟΗ) 90% και ακολουθεί ανατάραξη σε Vortex (2 x 5 sec) και ηρεµία για 15min 4. ηµιουργούµε δεύτερη σειρά σωλήνων όπου προστίθεται στον καθένα ποσότητα 0,5g θειϊκό νάτριο (NaSO 4 ) καθώς και 3 ml πικρικού οξέως (0,02g πικρικό οξύ σε 100 ml τουλουόλιο) 5. Από την πρώτη σειρά σωλήνων λαµβάνεται 1ml της υπερκείµενης φάσης και µεταφέρεται στη δεύτερη σειρά σωλήνων. Ακολουθεί ανατάραξη σε Vortex και ηρεµία για 10 min 6. Ακολουθεί µέτρηση της απορρόφησης των προτύπων διαλυµάτων στα 410nm και κατασκευάζεται η καµπύλη αναφοράς 7. Ακολουθεί έλεγχος της απορρόφησης του άγνωστου διαλύµατος στα 410nm σε σχέση µε το τυφλό (0,0mg/ml τριµεθυλαµίνη). 8. Από την καµπύλη αναφοράς υπολογίζεται η συγκέντρωση της ΤΜΑ στο δείγµα σάρκας ιαδικασία προσδιορισµού Ολικού Πτητικού Βασικού Αζώτου (TVB-N) 1. Ποσότητα 10 g δείγµατος σάρκας τσιπούρας οµογενοποιείται σε συσκευή τύπου Stomacher µε 90 ml διαλύµατος TCA 6 % για 2 min 2. Ακολουθεί διήθηση µέσω ηθµού Whatman Νο. 1 σε ογκοµετρική φιάλη 100ml. 3. Ποσότητα 50 ml του εκχυλίσµατος τοποθετούνται σε συσκευή απόσταξης ατµού 29

4. Προσθέτουµε στο εκχύλισµα 6 ml NaOH 20 % 5. Η απόσταξη του ατµού ρυθµίζεται ώστε να παράγονται περίπου 100 ml/10 min 6. Ο σωλήνας απαγωγής του αποστάγµατος καταδύεται σε δέκτη που περιέχει 100 ml βορικού οξέος 3 % στον οποίο έχουν προστεθεί 3-5 σταγόνες δείκτη (2 g ερυθρό του µεθυλίου και 1 g κυανούν του µεθυλενίου διαλύονται σε 1000ml αιθανόλης 95 %) 7. Ο σωλήνας απαγωγής του αποστάγµατος αποµακρύνεται από το δέκτη και ξεπλένεται µε νερό 8. Οι πτητικές βάσεις καθορίζονται µε τιτλοδότηση, µε τη βοήθεια πρότυπου διαλύµατος HCl 0,01 Ν 9. Στο τυφλό αντί εκχυλίσµατος χρησιµοποιούνται 50 ml TCA 6% 10. Υπολογίζουµε µε τον τύπο: TVB-N = ( 1 0 V V ) 0,14 2 100 M Όπου: V1 = όγκος 0,01 mol διαλύµατος υδροχλωρικού οξέος σε ml για το δείγµα V 0 = όγκος 0,01 mol διαλύµατος υδροχλωρικού οξέος σε ml για την τυφλή δοκιµή M = βάρος δείγµατος σε g Το TVB-N εκφράζεται σε mg / 100 g δείγµατος 2.6 Οργανοληπτική αξιολόγηση Η οργανοληπτική αξιολόγηση της τσιπούρας, κατά τη διάρκεια αποθήκευσής της στους 0 o C, πραγµατοποιήθηκε από µη-εκπαιδευµένο πάνελ 5 ατόµων µε σκοπό την προσοµοίωση του απλού καταναλωτή. Για τον προσδιορισµό των οργανοληπτικών 30

µεταβολών, ανά δύο ηµέρες γινόταν παρατήρηση και καταγραφή των εξωτερικών µεταβολών των ιχθύων. Πιο συγκεκριµένα αξιολογήθηκαν οι ακόλουθοι παράµετροι ποιότητας: δέρµα (χρώµα εµφάνιση, παραγωγή βλέννας, οσµή, υφή), µάτια (διαύγεια, κόρη µατιού, µορφή), βράγχια (χρώµα) και ολική αξιολόγηση. Η κλίµακα αξιολόγησης ήταν από 1 έως 5 για κάθε χαρακτηριστικό (5 άριστη ποιότητα, 4 φρέσκο, 3 υποβαθµισµένο αλλά αποδεκτό, 2 υποβαθµισµένο αλλά µη αποδεκτό, 1 αλλοιωµένο). Παρακάτω δίνεται το υπόδειγµα του ερωτηµατολογίου που χρησιµοποιήθηκε. Πίνακας 2.1: Υπόδειγµα ερωτηµατολογίου για οργανοληπτική αξιολόγηση Παράµετροι ποιότητας Πολύ Άριστη/ο καλή/ο Μη Μέτρια/ο αποδεκτή/ο Απαράδεκτη/ο Χρώµα - εµφάνιση 5 4 3 2 1 έρµα Βλέννα 5 4 3 2 1 Οσµή 5 4 3 2 1 Υφή 5 4 3 2 1 ιαύγεια 5 4 3 2 1 Μάτια Κόρη µατιού 5 4 3 2 1 Μορφή 5 4 3 2 1 Βράγχια Χρώµα 5 4 3 2 1 Ολική Αξιολόγηση 5 4 3 2 1 31

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Μικροβιακή ανάπτυξη Τα αποτελέσµατα των µικροβιολογικών εξετάσεων του πειράµατος της συντήρησης της τσιπούρας (Sparus aurata) παρουσιάζονται παρακάτω. Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (ΟΜΧ) Η µεταβολή του ολικού µικροβιακού πληθυσµού (ΟΜΧ) που καταµετρήθηκε σε υπόστρωµα TSA, κατά τη συντήρηση της τσιπούρας σε θερµοκρασία 0 o C και 5 o C παρουσιάζονται στα Σχήµατα 3.1 και 3.2 αντίστοιχα. Σχήµα 3.1: Μεταβολή της ΟΜΧ της τσιπούρας (Sparus aurata) κατά τη διάρκεια συντήρησής της στους 0 o C και στους 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση 32

Κατά την αποθήκευση της τσιπούρας στους 0 o C, η ΟΜΧ παρουσιάζει σχετικά αργή ανάπτυξη µε φάση προσαρµογής που διήρκησε περίπου δύο ηµέρες. Μετά την 2 η ηµέρα οι µικροοργανισµοί φαίνεται να βρίσκονται στη φάση της λογαριθµικής αύξησης. Κατά τη διάρκεια συντήρησης στους 5 o C η µεταβολή της ΟΜΧ παρουσιάζει ταχεία αύξηση ενώ δεν παρατηρείται φάση προσαρµογής, καθώς στη 2 η ηµέρα αποθήκευσης ο πληθυσµός έχει ήδη φτάσει τα 6,4 logs cfu/g. Μεταβολή ψευδοµονάδων (Pseudomonas sp.) Η µεταβολή του πληθυσµού των ψευδοµονάδων κατά τη διάρκεια αποθήκευσης φαίνεται στο Σχήµα 3.2 για θερµοκρασίες αποθήκευσης 0 o C και 5 o C. Σχήµα 3.2: Μεταβολή των ψευδοµονάδων (Pseudomonas sp.) κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. Ο πληθυσµός των ψευδοµονάδων αυξάνεται ταχύτερα στους 5 o C φτάνοντας την 8 η ηµέρα αποθήκευσης τα 8,9 logs cfu/g ενώ στους 0 o C την ίδια µέρα ο πληθυσµός 33

είναι 5,24 logs cfu/g. Επίσης κατά τη συντήρηση στους 0 o C παρατηρείται φάση προσαρµογής που διήρκησε περίπου 2 ηµέρες. Μεταβολή πληθυσµού βακτηρίων που παράγουν H 2 S (Shewanella putrefaciens) Η µεταβολή του πληθυσµού των βακτηρίων που παράγουν H 2 S για τις δύο µεταχειρίσεις (0 o C και 5 o C) παρουσιάζονται στο Σχήµα 3.3. Σχήµα 3.3: Μεταβολή του πληθυσµού των βακτηρίων που παράγουν H 2 S κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασία 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση Παρουσιάζεται εµφανώς ταχύτερη ανάπτυξη των βακτηρίων που παράγουν H 2 S στους 5 o C συγκριτικά µε τους 0 o C. Αρχικά ο πληθυσµός του βακτηρίου Shewanella putrefaciens ήταν 1,63 log cfu/g και 2,3 log cfu/g για θερµοκρασία αποθήκευσης 0 o C και 5 o C αντίστοιχα. Στο τέλος του πειράµατος ο πληθυσµός είχε φτάσει 7,41 cfu/g για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο (16 η ηµέρα) και 8,04 cfu/g για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν σε θερµοκρασία ψύξης (8 η ηµέρα). Κατά την 34

αποθήκευση στον πάγο παρατηρείται µια µικρή φάση προσαρµογής δύο ηµερών, γεγονός που καθυστερεί την αύξηση του πληθυσµού, ενώ όταν η θερµοκρασία αποθήκευσης είναι 5 o C δεν παρατηρείται καθόλου φάση προσαρµογής και η ανάπτυξη είναι ταχεία. Μεταβολή του πληθυσµού των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae Η µεταβολή του πληθυσµού των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae φαίνεται στο Σχήµα 3.4. Σχήµα 3.4: Μεταβολή του πληθυσµού των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση Ο πληθυσµός των βακτηρίων της οικογένειας Enterobacteriaceae για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 0 o C ήταν ιδιαίτερα χαµηλός. Την τελευταία ηµέρα αποθήκευσης έφτασε τα 2,8 log cfu/g (16 η ηµέρα). Αντίθετα σε εκείνες που αποθηκεύτηκαν στους 5 o C ο πληθυσµός την 8 η ηµέρα έφτασε τα 4,35 logs cfu/g. 35

Γενικά παρατηρούµε ότι ο πληθυσµός των Enterobacteriaceae είναι ιδιαίτερα χαµηλός και στις δύο θερµοκρασίες. Μεταβολή των οξυγαλακτικών Σχήµα 3.5: Μεταβολή του πληθυσµού των οξυγαλακτικών κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. Κατά τη διάρκεια συντήρησης νωπών τσιπούρων σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C ουσιαστικά δεν αναπτύχθηκε καµία αποικία οξυγαλακτικών βακτηρίων. Ο πληθυσµός τους παρέµεινε κάτω από το όριο καταµέτρησης των 10 cfu/g και για τις δύο µεταχειρίσεις για όλες τις ηµέρες συντήρησης (Σχ. 3.5). Μεταβολή του Brochothrix thermosphacta Το Brochothrix thermosphacta κατά τη διάρκεια αποθήκευσης σε 0 o C δεν ξεπέρασε ποτέ το κατώτατο όριο καταµέτρησης των 10 2 cfu/g. Μεταβολή 36

παρατηρήθηκε στη θερµοκρασία αποθήκευσης των 5 o C, όπου ο πληθυσµός έφτασε τα 4,65 log cfu/g την 8 η ηµέρα αποθήκευσης (Σχ. 3.6). Σχήµα 3.6: Μεταβολή του Brochothrix thermosphacta κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. 3.2 Χηµικοί δείκτες αλλοίωσης Τριµεθυλαµίνη (ΤΜΑ) Οι µεταβολές της ΤΜΑ παρουσιάζονται στο σχήµα 3.7. Τις πρώτες ηµέρες αποθήκευσης και για τις δύο θερµοκρασίες συντήρησης παρατηρούµε αύξηση της τριµεθυλαµίνης (2 η ηµέρα για θερµοκρασία αποθήκευσης 5 o C και 4 η ηµέρα για θερµοκρασία αποθήκευσης 0 o C), όπου υπολογίστηκε 20,5 mg/100 g σάρκας και 23,80 mg/100 g, για θερµοκρασίες αποθήκευσης 0 o C και 5 o C αντίστοιχα. Γενικά η ΤΜΑ έχει αυξητική τάση κατά τη διάρκεια συντήρησεις και στις δύο θερµοκρασίες. Την 16 η 37

ηµέρα αποθήκευσης στους 0 o C η τιµή της ΤΜΑ ήταν 37,79 mg/100 g και την 8 η ηµέρα αποθήκευσης στους 5 o C ήταν 28,14 mg/100 g. Σχήµα 3.7: Μεταβολή της τριµεθυλαµίνης (ΤΜΑ) κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. Ολικό πτητικό βασικό άζωτο (TVB-N) Η µεταβολή του ολικού πτητικού βασικού αζώτου για νωπές τσιπούρες σε θερµοκρασία αποθήκευσης 0 o C και 5 o C φαίνεται στο Σχήµα 3.8. Όταν η θερµοκρασία αποθήκευσης είναι 0 o C παρατηρούµε ότι αρχικά το TVB-N δεν αυξάνεται, αντίθετα υπάρχει µία µικρή µείωση (4 η ηµέρα). Η αρχική τιµή του TVB-Ν είναι 19,94 mg/100 g. Μετά την 4 η ηµέρα υπάρχει σταδιακή αύξηση µέχρι το τέλος του πειράµατος. Τις τελευταίες ηµέρες αποθήκευσης η τιµή του TVB-N υπολογίστηκε 24,32 mg/100 g. Παρόµοια µεταβολή παρουσιάζει το TVB-N και όταν η θερµοκρασία αποθήκευσης είναι 5 o C. Αρχικά τις δύο πρώτες ηµέρες η συγκέντρωση παραµένει σχεδόν σταθερή, ενώ την 4 η ηµέρα παρουσιάζεται µικρή µείωση. Από την 4 η ηµέρα 38

µέχρι την 8 η παρουσιάζεται συνεχή αύξηση. Η τιµή του TVB-N την 4 η ηµέρα υπολογίστηκε 19,75 mg/100 g ενώ την 8 η 26,64 mg/100 g. Σχήµα 3.8: Μεταβολή του ολικού πτητικού βασικού αζώτου κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή τριών επαναλήψεων. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. 39

Μεταβολή ph Σχήµα 3.9: Μεταβολή του ph κατά τη διάρκεια συντήρησης σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Γενικά δεν παρατηρούνται µεγάλες αλλαγές στην τιµή του ph κατά τη διάρκεια αποθήκευσης των τσιπούρων σε θερµοκρασίες 0 o C και 5 o C. Η τιµή του ph στην αρχή του πειράµατος ήταν 6,35 ενώ στο τέλος ήταν 6,2 και 6,3 για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 0 o C (16 η ηµέρα) και 5 o C (8 η ηµέρα) αντίστοιχα (Σχ. 3.9). 3.3 Οργανοληπτικά χαρακτηριστικά Κατά τη διάρκεια συντήρησης των νωπών τσιπούρων στον πάγο έγινε οργανοληπτική εκτίµηση από πάνελ 5 ατόµων. Τα αποτελέσµατα από την οργανοληπτική αξιολόγηση για την ολική εκτίµηση της ποιότητας των τσιπούρων φαίνεται στο γράφηµα 3.10. 40

Ολική Αξιολόγηση Οργανοληπτικό σκορ 6 5 4 3 2 1 0 y = -0,2515x + 4,6778 R² = 0,9495 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο Σχήµα 3.10: Οργανοληπτική αξιολόγηση νωπών τσιπούρων αποθηκευµένων στον πάγο (0 o C). Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή των επιµέρους χαρακτηριστικών. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. Τα βέλη υποδεικνύουν το οργανοληπτικό σκορ την ηµέρα της απόρριψης. Το οργανοληπτικό σκορ µειώνεται γραµµικά (R² = 0,9495) σε σχέση µε τον χρόνο παραµονής στον πάγο. Ο χρόνος ζωής του προϊόντος προσδιορίσθηκε οργανοληπτικά στις 11 περίπου ηµέρες αποθήκευσης στους 0 o C (Σχ. 3.10). Τη χρονική στιγµή της οργανοληπτικής απόρριψης, η ΟΜΧ αλλά και ο πληθυσµός των ψευδοµονάδων, που θεωρούνται ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί της τσιπούρας που συντηρείται σε χαµηλές θερµοκρασίες, είχαν φτάσει το επίπεδο των 10 6,5 cfu/g το οποίο και καταγράφηκε ως επίπεδο αλλοίωσης (Σχ. 3.1 και 3.2). Τα αποτελέσµατα για κάθε ποιοτικό χαρακτηριστικό των νωπών τσιπούρων, όπως προσδιορίστηκαν από το πάνελ, φαίνονται στα παρακάτω σχήµατα. 41

Χρώμα Δέρματος Βλέννα 6 6 Τίτλος άξονα 5 4 3 2 y = -0,2625x + 4,9333 R² = 0,8704 Τίτλος άξονα 5 4 3 2 y = -0,2633x + 4,7071 R² = 0,9409 1 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο (α) (β) Οσμή Υφή 6 6 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 y = -0,2112x + 4,8738 R² = 0,8569 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 y = -0,2479x + 4,4556 R² = 0,9333 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο (γ) (δ) 42

Διάυγεια ματιού Κόρη Ματιού 6 6 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 y = -0,2431x + 4,4258 R² = 0,8938 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 y = -0,2591x + 4,5627 R² = 0,933 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο (ε) (στ) Μορφή Χρώμα Βραγχίων 6 6 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 y = -0,2528x + 4,7071 R² = 0,9215 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 y = -0,2389x + 4,448 R² = 0,8778 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο Ημέρες αποθήκευσης στον πάγο (ζ) (η) Σχήµα 3.11: Μεταβολή των ποιοτικών χαρακτηριστικών τσιπούρων που αποθηκεύτηκαν στον πάγο ((α), µεταβολή της οσµής, (β) µεταβολή της παραγωγής βλέννας, (γ) µεταβολή της οσµής, (δ) µεταβολή της υφής, (ε) µεταβολή της διαύγειας των µατιών, (στ) µεταβολή της κόρης των µατιών, (ζ) µεταβολή της µορφής των 43

µατιών, (η) µεταβολή του χρώµατος των βραγχίων) Τα σηµεία αποτελούν τη µέση τιµή βαθµολογίας των 5 κριτών. Οι ράβδοι δείχνουν την τυπική απόκλιση. Είναι φανερό ότι το οργανοληπτικό σκορ µειώνεται γραµµικά για όλες τις παραµέτρους ποιότητας που εξετάστηκαν. Εικόνα 3.1: Τσιπούρα αποθηκευµένη στον πάγο τη 2 η ηµέρα Εικόνα 3.2: Τσιπούρα αποθηκευµένη στον πάγο τη 12 η ηµέρα 44

Σύµφωνα µε τα παραπάνω διαγράµµατα υπολογίστηκε ο εµπορικός χρόνος ζωής λαµβάνοντας υπόψη κάθε ποιοτικό χαρακτηριστικό ξεχωριστά, για τσιπούρες που συντηρήθηκαν σε πάγο. Τα αποτελέσµατα δίνονται στον Πίνακα 3.1. Πίνακας 3.1: Εµπορικός χρόνος ζωής νωπής τσιπούρας έπειτα από οργανοληπτική αξιολόγηση διαφόρων ποιοτικών παραµέτρων. Οργανοληπτική παράµετρος Εµπορικός χρόνος ζωής (ηµέρες) Χρώµα δέρµατος 11 Βλέννα 10 Οσµή 14 Υφή 9 ιαύγεια Ματιού 10 Μορφή Ματιού 11 Χρώµα Βραγχίων 10 Από τον παραπάνω πίνακα παρατηρούµε ότι η υφή είναι το ποιοτικό χαρακτηριστικό το οποίο αν ληφθεί υπόψη µόνο αυτό το προϊόν θεωρείται µη αποδεκτό την 9 ηµέρα ενώ λαµβάνοντας µόνο την οσµή η διάρκεια ζωής υπολογίζεται σε 14 ηµέρες. Από τα χαρακτηριστικά που υποδηλώνουν γρήγορα την αλλοίωση είναι εκτός από την υφή, η διαύγεια του µατιού και το χρώµα των βραγχίων. Αρχικά τα µάτια ήταν λαµπερά-διαυγή ενώ µετά τη 10 η 11 η ηµέρα είχαν χάσει αυτή τη φωτεινότητα και ήταν κυρτά προς τα µέσα. Όσον αφορά τα βράγχια, αρχικά είχαν έντονο κόκκινο χρώµα ενώ µετά τη 10 η ηµέρα είχαν σχεδόν αποχρωµατιστεί. Τις πρώτες ηµέρες της αποθήκευσης η παραγωγή βλέννας ήταν περιορισµένη, αυξανόταν όµως όσο 45

περνούσαν οι µέρες συντήρησης. Με βάση την παραγωγή βλέννας, το προϊόν χαρακτηρίστηκε ως µη αποδεκτό την 10 η ηµέρα. 3.4 Συσχέτιση αποτελεσµάτων Η συσχέτιση της παραγωγής ΤΜΑ µε τα επίπεδα των πληθυσµών των δύο κυρίαρχων µικροβιακών πληθυσµών της τσιπούρας, για θερµοκρασία αποθήκευσης 0 o C δίνεται στο Σχήµα 3.12: log cfu/g 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 mg TMA / 100 g σάρκας y S.putrefaciens= 0,2103x - 0,1798 R² = 0,943 ypseudomonas = 0,165x + 1,4004 R² = 0,973 S. putrefacines Pseudomonas sp. Σχήµα 3.12: Συσχέτιση συγκέντρωσης τριµεθυλαµίνης και πληθυσµών S. putrefaciens, Pseudomonas sp., για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο. Η συσχέτιση της τριµεθυλαµίνης µε τους δύο κυρίαρχους µικροβιακούς πληθυσµούς της τσιπούρας είναι υψηλή. Πιο συγκεκριµένα, η συσχέτιση της τριµεθυλαµίνης µε το βακτήριο S. putrfaciens είναι R 2 =0,943 και R 2 =0,973 για το γένος Pseudomonas. 46

Στο Σχήµα 3.13 παρουσιάζεται η συσχέτιση της συγκέντρωσης τριµεθυλαµίνης µε τον πληθυσµού της ΟΜΧ. log cfu/g 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 0,2031x + 1,0841 R² = 0,9718 0 5 10 15 20 25 30 35 40 mg ΤΜΑ/100g σάρκας Σχήµα 3.13: Συσχέτιση τριµεθυλαµίνης και ολικής µεσόφιλης χλωρίδας για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο. Η συσχέτιση του TVB-N µε την ΟΜΧ για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο δίνεται στο Σχήµα 3.14. Log cfu/g 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 0,5111x - 4,05 R² = 0,680 10 12 14 16 18 20 22 24 26 mg TVB-N / 100g σάρκας Σχήµα 3.14: Συσχέτιση ΤVB-N και ΟΜΧ για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο. 47

Από το Σχήµα 3.14 παρατηρούµε ότι η συσχέτιση µεταξύ TVB-N και ΟΜΧ για τις τσιπούρες που συντηρήθηκαν στον πάγο είναι µέση (R 2 =0,68). Η συσχέτιση του TVB-N µε τα επίπεδα των πληθυσµών Pseudomonas sp. και S. putrefaciens για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο δίνεται στο Σχήµα 3.15. 8 7 Log cfu/g 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 mg TVB-N/100g σάρκας Pseudomonas sp. y = 0,323x - 0,953 R² = 0,530 S. putrefaciens y = 0,336x - 1,684 R² = 0,419 Σχήµα 3.15: Συσχέτιση ΤVB-N µε Pseudomonas sp. και S. putrefaciens για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο. Από τα Σχήµατα 3.14 και 3.15 συµπεραίνουµε ότι το TVB-N δεν έχει καλή συσχέτιση µε κανέναν µικροβιακό πληθυσµό. Η συσχέτιση του οργανοληπτικού σκορ µε την ΟΜΧ, Pseudomonas sp, και S. putrefaciens, για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 0 o C, δίνεται στο Σχήµα 3.16. 48

6 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 ΟΜΧ Pseudomonas sp. S. putrefaciens 0 0 2 4 6 8 10 log cfu/g Σχήµατα 3.16: Συσχέτιση οργανοληπτικού σκορ µε ΟΜΧ, Pseudomonas sp. και S. putrefaciens για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο. Το οργανοληπτικό σκορ έχει ισχυρή συσχέτιση µε την ΟΜΧ (R 2 =-0,927), την S. putrefaciens (R 2 =-0,92), και Pseudomonas sp. (R 2 =-0,976), όπως επίσης και µε την ΤΜΑ (R 2 =-0,913) (Σχ. 3.17). 6 Οργανοληπτικό σκορ 5 4 3 2 1 0 y = -0,146x + 6,240 R² = -0,913 0 5 10 15 20 25 30 35 40 mg TMA/100g σάρκας Σχήµα 3.17: Συσχέτιση οργανοληπτικού σκορ µε TMA για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο. 49

Η συσχέτιση του TVB-N µε την ΟΜΧ και τους πληθυσµούς των Pseudomonas sp. και S. putrefaciens για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 5 ο C δίνεται στα Σχήµατα 3.18 και 3.19. log cfu/g 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 0,4918x - 4,2988 R² =0,706 15 17 19 21 23 25 27 29 mg TVB-N/100 g σάρκας Σχήµα 3.18: Συσχέτιση του ολικού πτητικού βασικού αζώτου (ΤVB-N) µε την ολική µεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ) για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 5 o C. log cfu/g 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 15 17 19 21 23 25 27 29 mg ΤVB-N/100g σάρκας Pseudomonas S. putrefaciens ypseudomonas = 0,6343x - 7,8872 R² = 0,6595 ys.putrefaciens = 0,6415x - 8,787 R² = 0,845 Σχήµα 3.19: Συσχέτιση του ολικού πτητικού βασικού αζώτου (ΤVB-N) µε Pseudomonas sp. και S. putrefaciens για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 5 o C. 50

Η συσχέτιση της ΤΜΑ µε την ΟΜΧ και τους πληθυσµούς των S. putrefaciens και Pseudomonas sp. για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 5 o C δίνεται στα γραφήµατα 3.20 και 3.21. Log cfu/g 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 0,3238x - 0,2989 R² = 0,900 0 5 10 15 20 25 30 mg TMA/100g σάρκας Σχήµα 3.20: Συσχέτιση ΤΜΑ µε ΟΜΧ για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 5 o C Log cfu/g 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 0,3542x - 1,3879 R² = 0,877 0 5 10 15 20 25 30 mg TMA/100g σάρκας y = 0,3044x - 1,0768 R² = 0,776 Pseudomonas sp S. putrefaciens Σχήµα 3.21: Συσχέτιση ΤΜΑ µε S. putrefaciens και Pseudomonas sp. για τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στους 5 o C 51

Γενικά παρατηρούµε ότι η ΤΜΑ έχει καλύτερη συσχέτιση µε τους µικροβιακούς πληθυσµούς και για τις δύο θερµοκρασίες, ενώ το TVB-N δεν παρουσιάζει ισχυρή συσχέτιση. Επίσης η ΤΜΑ έχει ισχυρή συσχέτιση µε το οργανοληπτικό σκορ για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο (Σχ. 3.17). Στο Σχήµα 3.22 παρουσιάζεται ο εναποµείναντας χρόνος ζωής για τσιπούρες που συντηρήθηκαν στον πάγο σύµφωνα µε τους πληθυσµούς των Pseudomonas sp., του S. putrefaciens και της ΟΜΧ. 7 6 5 Log cfu/g 4 3 2 1 OMX Pseudomonas sp. S. putrefaciens 0 0 2 4 6 8 10 12 Εναπομείνασες ημέρες Σχήµα 3.22: Εναποµείναντας χρόνος ζωής για τσιπούρες που συντηρήθηκαν στον πάγο σύµφωνα µε τον πληθυσµό των Pseudomonas sp., του βακτηρίου Shewanella putrefaciens και της ΟΜΧ. 52

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Υπάρχουν διάφοροι µέθοδοι για τον προσδιορισµό του εµπορικού χρόνου ζωής ενός προϊόντος. Η νωπότητα καθορίζει την ποιότητα των ιχθύων ως τρόφιµα, τόσο για αυτά που προορίζονται για οικιακή κατανάλωση, όσο και για αυτά που προορίζονται για εµπορική επεξεργασία. Μικροβιολογικοί, βιοχηµικοί και οργανοληπτικοί µέθοδοι έχουν χρησιµοποιηθεί για την εκτίµηση της νωπότητας και της ποιότητας κατά τη διάρκεια της µεταχείρισης και της αποθήκευσης των ιχθύων (Papadopoulos et al., 2003). Οι οργανοληπτικές µέθοδοι είναι απλές, γρήγορες και παρέχουν άµεσα πληροφορίες σχετικά µε την ποιότητα. Ο εµπορικός χρόνος ζωής για τις τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο ήταν εµφανώς µεγαλύτερος σε σχέση µε αυτές που αποθηκεύτηκαν σε θερµοκρασία 5 o C. Καταλαβαίνουµε λοιπόν ότι η θερµοκρασία έχει καταλυτικό ρόλο στον χρόνο ζωής των τσιπούρων. Πιο συγκεκριµένα, οι τσιπούρες που συντηρήθηκαν σε πάγο είχαν έντονα τα χαρακτηριστικά των νωπών τις πρώτες 7 ηµέρες αποθήκευσης. Μετά την 7 η ηµέρα τα έντονα χαρακτηριστικά της νωπότητας µειώθηκαν αρκετά. Παρόµοια αποτελέσµατα είχαν και οι Cakli et al., (2006a). Μεγάλη σηµασία έχει ότι αξιολογώντας µόνο την οσµή το προϊόν έχει εµπορική διάρκεια ζωής 14 ηµέρες. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στην καθυστερηµένη αύξηση του TVB-N. Η οσµή είναι ένας από τους πιο σηµαντικούς παράγοντες στην εκτίµηση της ποιότητας (Selli and Cayhan, 2009). Αντίθετα η υφή βρέθηκε να είναι η ποιοτική παράµετρος που υποβαθµίζεται γρηγορότερα από τις υπόλοιπες. Έτσι σύµφωνα µε την υφή η διάρκεια ζωής είναι 9 ηµέρες. Στην παρούσα µελέτη οι τσιπούρες που αποθηκεύτηκαν στον πάγο, χαρακτηρίστηκαν ως µη αποδεκτές 53

από µη εκπαιδευµένο πάνελ, λαµβάνοντας υπόψη το µέσο όρο όλων των ποιοτικών χαρακτηριστικών, την 11 η ηµέρα Στους 0 o C επιµηκύνεται η φάση προσαρµογής για τα περισσότερα βακτήρια (Lougovois et al., 2003), έτσι η λογαριθµική φάση της καµπύλης ανάπτυξης των µικροοργανισµών ξεκινάει αργότερα, εποµένως ο πληθυσµός τους γενικά να αυξάνεται µε χαµηλούς ρυθµούς, και παρατείνεται ο εµπορικός χρόνος ζωής. Αντίθετα, στους 5 o C, δεν παρατηρήθηκε φάση προσαρµογής. Αυτό σηµαίνει ότι οι µικροοργανισµοί δεν χρειάστηκαν καθόλου χρόνο για να προσαρµοστούν και έτσι ξεκίνησαν άµεσα να πολλαπλασιάζονται. Έτσι, ο πληθυσµός τους έφτασε σε υψηλά επίπεδα πολύ πιο γρήγορα σε σχέση µε αυτούς που αναπτύχθηκαν σε θερµοκρασία πάγου. Ψυχρότροφα βακτήρια όπως Shewanella, Brochothrix, Pseudomonas αναπτύσσονται γρήγορα σε θερµοκρασία ψύξης και στους ιχθύς προκαλούν αλλοίωση σε θερµοκρασία 5-7 o C (Jay et al., 2005). Υπάρχει σταδιακή αύξηση στη µικροβιολογική χλωρίδα των εκτρεφόµενων τσιπούρων που αποθηκεύτηκαν στον πάγο και στους 5 o C. Αρχικά η ΟΜΧ ήταν 3,64 log cfu/g και 3,02 log cfu/g για θερµοκρασία αποθήκευσης 0 o C και 5 o C αντίστοιχα. Οι Cakli et al, (2006a), βρήκαν ότι ο αρχικός πληθυσµός των µεσόφιλων βακτηρίων για τσιπούρες αποθηκευµένες στον πάγο ήταν 2,78 log cfu/g, ενώ οι Papadopoulos et al., (2003), έδειξαν ότι ο αρχικός πληθυσµός των µεσόφιλων βακτηρίων για λαβράκια που αποθηκεύτηκαν στον πάγο ήταν 4 log cfu/g. Οι κυρίαρχοι µικροοργανισµοί αλλοίωσης και για τις δύο θερµοκρασίες ήταν οι ψευδοµονάδες και το Shewanella putrefaciens. Στους ιχθύς από την Μεσόγειο, οι ψευδοµονάδες είναι ειδικοί αλλοιογόνοι µικροοργανισµοί ενώ στα ψάρια των ψυχρότερων κλιµάτων είναι κυρίως το Shewanella putrefaciens. Επίσης δεν βρέθηκαν 54