Γενετική και μορφομετρική περιγραφή της ποικιλότητας της οξιάς στην ανατολική Ροδόπη.

1

Γενετική και μορφομετρική περιγραφή της ποικιλότητας της οξιάς στην ανατολική Ροδόπη. Μανώλης Α. 1, Χατζησκάκης Σ. 1, Βιδάλη Α. 2, Μυρωνίδου Ε. 1, Παπαγεωργίου Α.Χ 1. 1 Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης, Τμήμα Δασολογίας και Διαχείρισης Περιβάλλοντος και Φυσικών Πόρων, Εργαστήριο Δασικής Γενετικής, Αθ.Πανταζίδου 193, 68200 Ορεστιάδα (apapage@fmenr.duth.gr) 2 Georg August Univerität Göttingen, Abteilung Forstgenetik und Forstpflanzenzüchtung, Büsgenweg 2, D-37077 Göttingen, Γερμανία Περίληψη Οι πληθυσμοί οξιάς (Fagus sylvatica) στη ΝΑ Ροδόπη παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα ποικιλότητας στους μικροδορυφόρους χλωροπλαστικού DNA (cpdna SSRs). Η ποικιλότητα αυτή είναι αποτέλεσμα της συνδυασμένης δράσης των καταφυγίων που έχουν επισημανθεί στην περιοχή και της παρουσίας μιας ζώνης αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο υποειδών, Fagus sylvatica ssp. sylvatica και Fagus sylvatica ssp. orientalis. Διερευνήθηκε η γενετική ποικιλότητα δύο πληθυσμών οξιάς της ΝΑ Ροδόπης με τη χρήση cpdna SSRs, RAPDs και AFLPs. Για τη διερεύνηση της μορφολογικής ποικιλότητας των φύλλων μετρήθηκαν εκείνα χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται στη διάκριση των υποειδών. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τη μείξη των δύο υποειδών και δίνουν ενδείξεις για τις μεσοπαγετώδεις κινήσεις τους. Genetic and morphological description of diversity of beech in Eastern Rodopi Μανώλης Α. 1, Χατζησκάκης Σ. 1, Βιδάλη Α. 2, Μυρωνίδου Ε. 1, Παπαγεωργίου Α.Χ 1. 1 Democritus University of Thrace, Department of Forestry and Management of Environment and Natural Resources, Forest Genetics Laboratory, Ath.Pantazidou 193, 68200 Orestiada (apapage@fmenr.duth.gr) 2 Georg August Univerität Göttingen, Abteilung Forstgenetik und Forstpflanzenzüchtung, Büsgenweg 2, D-37077 Göttingen, Germany Abstract Beech (Fagus sylvatica) populations in northeastern Rodopi show high levels of cpdna SSRs diversity. This diversity is the outcome of the joint effect of refugial areas spotted in the study area and an introgression zone of the two beech subspecies, Fagus sylvatica ssp. sylvatica and Fagus sylvatica ssp. orientalis. Genetic diversity was investigated in terms of cpdna SSRs, RAPDs and AFLPs. The leaf morphological characters that are evaluated for beech taxonomy were measured, in order to investigate morphological diversity. The results confirm the introgression of the two beech subspecies in the study area and give indications of post-glacial migration of the species. 2

Εισαγωγή Η οξιά (Fαgus sylvatica) αποτελεί ένα από τα πιο αντιπροσωπευτικά δασικά είδη στην Ευρώπη, με ευρεία εξάπλωση και σημαντική ποικιλότητα. Η πιο πρόσφατη ταξινομική θεώρηση αποδέχεται την ύπαρξη ενός είδους (Fagus sylvatica) με δύο υποείδη, Fagus sylvatica ssp sylvatica και Fagus sylvatica ssp orientalis (Denk, 2003; Denk et al., 2002; Strid and Tan, 1997; Tutin et al., 1993; Greuter et al. 1984). Η βαθμιδωτή ποικιλότητα των μορφολογικών χαρακτήρων ανάμεσα στα δύο υποείδη είδη και η χαμηλή ανάλυση των γενετικών ομάδων, στηρίζουν την υπόθεση ότι αποτελούν ένα είδος (Denk, 2003). Διαφορετικές θεωρίες έχουν διατυπωθεί για την παρουσία και τη διάκριση ειδών ή υποειδών και στην Ελλάδα. Ιδιαίτερη αναφορά έχει γίνει στην οροσειρά της Ροδόπης, η οποία θεωρείται σημείο συνάντησης των δύο υποειδών (Papageorgiou et al., 2008). Η ποικιλότητα των μορφολογικών χαρακτήρων παρουσιάζεται ιδιαίτερα υψηλή, δημιουργώντας δυσκολίες στην ταξινόμηση των μορφών σε ένα μόνο είδος (Eleftheriadou and Raus, 1996; Gamisans and Hebrard, 1980; Μουλόπουλος, 1965). Παρόλα αυτά, η γενικότερη διαπίστωση για την οροσειρά της Ροδόπης είναι ότι στα ανατολικά και σε χαμηλότερα υψόμετρα κυριαρχούν μορφές που προσεγγίζουν εκείνες του υποείδους orientalis, ενώ στα δυτικά και σε υψηλότερα υψόμετρα εκείνες του υποείδους sylvatica (Papageorgiou et al., 2008; Χατζησκάκης κ.ά., 2005; Μπούτσιος, 2004; Tsiripidis and Athanasiadis, 2003). Η γενετική ποικιλότητα της οξιάς στην Ελλάδα παρουσιάζεται ιδιαίτερα υψηλή στο χλωροπλαστικό DNA σε πανευωπαϊκή έρευνα των Magri et al. (2006). Σε πανελλάδική έρευνα από τους Hatziskakis et al. (2009) επιβεβαιώθηκαν τα υψηλά επίπεδα ποικιλότητας με την παρουσία μεγάλου αριθμού απλοτύπων, ιδιαίτερα στη βορειοανατολική Ελλάδα, στην οροσειρά της Ροδόπης, όπου οι Papageorgiou et al. (2008) διαπίστωσαν υψηλά επίπεδα ποικιλότητας και στα AFLPs. Μεγάλο ποσοστό της βρέθηκε να κατανέμεται μέσα στους πληθυσμούς, με παράλληλη αύξηση από τα δυτικά στα ανατολικά. Η αυξητκή αυτή τάση και η διαβάθμιση τόσο των απλότυπων όσο και των μορφολογικών χαρακτήρων (Papageorgiou et al., 2008) μπορούν να ερμηνευτούν ως αποτέλεσμα της επαφής των δύο υποειδών (Myking and Yakovlev, 2006). Η υψηλή γενετική και μορφολογική ποικιλότητα των ελληνικών πληθυσμών οξιάς αποτελούν ενδείξεις παρουσίας καταφυγίων στην περιοχή. Ο Pott (1997) αναφέρει την παρουσία δύο καταφυγίων στον ελλαδικό χώρο, ενώ νεότερες έρευνες αναφέρουν την παρουσία τριών καταφυγίων, στη δυτική Ελλάδα, την ανατολική Μακεδονία και τη Ροδόπη (Magri et al., 2006). Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη και η περιγραφή της μορφολογικής και της γενετικής ποικιλότητας δύο πληθυσμών οξιάς στην ανατολική Ροδόπη και η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης στην κατανομή τους. Ακόμη, αναζητούνται ενδείξεις για την επιβεβαίωση της παρουσίας καταφυγίου και ζώνης επαφής των δύο υποειδών στην περιοχή. Υλικά και μέθοδοι Οι πληθυσμοί που επιλέχθηκαν για τη συλλογή υλικού βρίσκονται στο ανατολικό τμήμα της οροσειράς της Ροδόπης (Χάρτης 1, Πίνακας 1). Από κάθε πληθυσμό επιλέχθηκαν 25 δέντρα, με απόσταση τουλάχιστον 100 μέτρων μεταξύ τους, ώστε να αποφευχθούν οι οικογενειακές δομές. 3

Πίνακας 1: Γεωγραφική θέση και υψόμετρο των πληθυσμών Table 1: Geographic position and altitude of populations Πληθυσμός Γεωγραφικό πλάτος Γεωγραφικό μήκος Υψόμετρο Δαδιά 41 ο 17 26 ο 01 700 Χίλια 41 ο 31 25 ο 96 1000 Συλλέχθηκαν υγειή φύλλα από μη καρποφόρους κλαδίσκους από την εξωτερική πλευρά κόμης. Τα φύλλα μετά τη συλλογή τους ξηράνθηκαν, σαρώθηκαν και οι εικόνες τους αποθηκεύθηκαν ηλεκτρονικά. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις των παραμέτρων τους με τα λογισμικά μορφομετρίας ImagePro Plus 6.0 (Media Cybernetics Inc.) και tpsdig2 (Rohlf, 2004). Σε κάθε φύλλο μετρήθηκαν δώδεκα χαρακτηριστικά: μήκος μίσχου (Μίσχος), μήκος ελάσματος (ΜΕ), πλάτος ελάσματος (ΠΕ), μήκος μέγιστου πλάτους (ΜΜΠ), εμβαδόν ελάσματος (Εμβαδόν), περίμετρος ελάσματος (ΠΕ), αριθμός νεύρων (Ν), γωνία μεταξύ του κεντρικού και του πλευρικού νεύρου στο ύψος του μέγιστου πλάτους (ΓΝ), Leaf Index (LI: μήκος / πλάτος Χ 100), Maximum Width Index (MWI: μήκος μέγιστου πλάτους / μήκος Χ 100), Petiole Index (PI: μήκος μίσχου / μήκος Χ 100) και Radius Coefficient (RC: ακτίνα κύκλου με βάση το εμβαδόν / ακτίνα κύκλου με βάση την περίμετρο). Για κάθε χαρακτηριστικό και για κάθε πληθυσμό και δέντρο υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι, οι τυπικές αποκλίσεις και ο συντελεστής κύμανσης (CV). Έγινε τεστ Kruskal-Wallis για την εκτίμηση της σημαντικότητας των διαφορών και μείωση των μεταβλητών με PCA όπου με βάση τις νέες ανεξάρτητες μεταβλητές υπολογίστηκαν οι αποστάσεις μεταξύ των δέντρων. Με τον τρόπο αυτό έγινε κατηγοριοποίηση (UPGMA) των δέντρων σε πέντε μορφολογικές ομάδες, που εδώ αναφέρονται ως «φυλλότυποι» ή ΦΤ (Πίνακας 2) και υπολογίστηκαν οι συχνότητές τους σε κάθε πληθυσμό (Πίνακας 3). Πίνακας 2: Φυλλότυποι Table 2: Phyllotypes Φυλλότυπος Μέγεθο Σχήμα Μίσχος ς ΦΤ1 Μικρό Στρόγγυλο Μικρό LI Μεγάλος ΦΤ2 Μεγάλο Ελλειψοειδές Μεσαίο LI Μικρός ΦΤ3 Μεσαίο Αντίστροφα ωοειδές Μεγάλο LI Μικρός ΦΤ4 Μεγάλο Αντίστροφα ωοειδές Μεσαίο LI Μεγάλος ΦΤ5 Μεγάλο Έντονα αντίστροφα ωοειδές Πολύ μεγάλο LI Μεγάλος Για τις αναλύσεις του DNA συλλέχθηκαν οφθαλμοί και φύλλα από τα επιλεγμένα δέντρα. Η εκχύλιση DNA από αυτούς πραγματοποιήθηκε με βάση το πρωτόκολλο Dneasy TM 96 Plant Protocol For Isolation of DNA For Plant Tissue ενώ η εξέταση της ποιότητας και της ποσότητας του DNA πραγματοποιήθηκε σε 0,8% gel αγαρόζης χρωματισμένου με βρωμιούχο αιθίδιο. Στα δείγματα έγιναν αναλύσεις για δύο δείκτες: τους πολυμορφισμούς στο μήκος πολλαπλασιασμένων τμημάτων DNA (AFLPs) και στον αριθμό επαναλήψεων μικρών αλληλουχιών (SSR) στους μικροδορυφόρους του χλωροπλαστικού DNA (cpdna). Για τους AFLPs ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο των Vos et al. (1995), με μικρές μετατροπές. Ο προεπιλεκτικός πολλαπλασιασμός 4

πραγματοποιήθηκε με το συνδυασμό εκκινητών E01/M03, ενώ για την επιλεκτική αντίδραση χρησιμοποιήθηκε ο συνδυασμός εκκινητών E38/M64. Η ανάγνωση των αποτελεσμάτων έγινε στο ABI 3100 Genetic Analyzer με Hi Di Formamid και δείκτη Gene Scan standard 500 ROX. Για τους μικροδορυφόρους του cpdna δοκιμάστηκαν 3 ζεύγη εκκινητών και επιλέχθηκε το ζεύγος εκκινητών ccmp7 (Weising and Gardner, 1999) που έχει χρησιμοποιηθεί και σε παλαιότερες έρευνες σε πληθυσμούς οξιάς στην Ευρώπη (Vettori et al., 2004; Gailing and von Wühlisch, 2004). Ο έλεγχος μεγέθους των πολλαπλασιασμένων τμημάτων πραγματοποιήθηκε στο ABI 3100 Genetic Analyzer με Hi Di Formamid και δείκτη Gene Scan standard 500 ROX. Υπολογίστηκαν οι συχνότητες των απλοτύπων του cpdna και το ποσοστό πολυμορφικών γονιδιακών θέσεων και η αναμενόμενη ετεροζυγωτία για τους AFLPs. Για τα RAPDs έγινε ενίσχυση με τους εκκινητές OPA4 και OPAP20 και στη συνέχεια έγινε εκτίμηση της παρουσίας ή απουσίας ζωνών σε gel αγαρόζης μετά από ηλεκτροφόρηση. Με βάση την παραδοχή της ισορροπίας Hardy Weinberg έγινε εκτίμηση της ποικιλότητας. Αποτελέσματα Από τη μελέτη των μέσων όρων των μετρούμενων παραμέτρων προκύπτει στατιστικά σημαντική ποικιλότητα σε επίπεδο πληθυσμών και δέντρων για όλα τα χαρακτηριστικά. Από την PCA προκύπτουν τρεις βασικές παράμετροι διαφοροποίησης: το μέγεθος τους ελάσματος που εξηγεί και το μεγαλύτερο μέρος της ποικιλότητας, το σχήμα του ελάσματος και ο μίσχος. Το μέγεθος και το σχήμα των φύλλων δεν διαφοροποιείται σημαντικά ανάμεσα στους δύο πληθυσμούς. Στον πληθυσμό της Δαδιάς παρατηρούνται γενικά υψηλότερες τιμές στο συντελεστή κύμανσης, με εξαίρεση το MWI, υποδεικνύοντας αυξημένη διαφοροποίηση σε σχέση με τον πληθυσμό του Χίλια. Από τη μελέτη των φυλλότυπων προκύπτει ότι και οι δύο πληθυσμοί παρουσιάζουν τις ίδιες περίπου συχνότητες για τους ΦΤ2, ΦΤ3 και ΦΤ4 που εκφράζουν ενδιάμεσα χαρακτηριστικά ανάμεσα στους ακραίους φυλλότυπους ΦΤ1 (sylvatica) και ΦΤ5 (orientalis). Στον πληθυσμό του Χίλια απουσιάζει εντελώς ο ΦΤ1, ενώ εμφανίζει τριπλάσια συχνότητα ο ΦΤ5. 5

Πίνακας 3: Συχνότητες φυλλοτύπων Table 3: Phyllotype frequencies ΦΤ1 ΦΤ2 ΦΤ3 ΦΤ4 ΦΤ5 Δαδιά 0,05 0,45 0,40 0,05 0,05 Χίλια 0,00 0,41 0,37 0,07 0,15 Στους μικροδορυφόρους του cpdna εμφανίζονται μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στους δύο πληθυσμούς σε σύγκριση με τα μορφολογικά δεδομένα. Ο πληθυσμός της Δαδιάς, εμφανίζει μεν απλότυπους που χαρακτηρίζονται ανατολικοί (Gailing and von Wühlisch, 2004), αλλά και άλλους που έχουν επισημανθεί και σε άλλες περιοχές στην Ελλάδα, πέρα από τη Ροδόπη (Hatziskakis et al., 2009). Αντίθετα, ο πληθυσμός του Χίλια εμφανίζει απλότυπους που χαρακτηρίζονται ανατολικοί και η παρουσία τους στον ελλαδικό χώρο περιορίζεται κυρίως στη βορειοανατολική Ελλάδα (Hatziskakis et al., 2009). Αντίστοιχα είναι και τα αποτελέσματα των AFLPs, με τον πληθυσμό της Δαδιάς να εμφανίζει σαφώς μεγαλύτερη ποικιλότητα (Σχήμα 1). Η συγκριτικά υψηλότερη ποικιλότητα του πληθυσμού της Δαδιάς επιβεβαιώνεται και από τα RAPDs, παρόλο που δεν διαπιστώθηκε ιδιαίτερα σημαντική ποικιλότητα σε απόλυτες τιμές. Συζήτηση - Συμπεράσματα Οι δύο πληθυσμοί εμφανίζουν σημαντικές ομοιότητες στους μορφολογικούς χαρακτήρες, ενώ ομοιάζουν και στους τυχαίους γενωμικούς δείκτες. Η βασική τους διαφορά έγκειται στην αυξημένη ποικιλότητα που παρουσιάζει ο πληθυσμός της Δαδιάς σε όλους τους δείκτες. Με καθαρά μορφολογικά κριτήρια και συγκρίνοντας τους δύο πληθυσμούς με τα δεδομένα του Denk (1999a, 1999b, 2003), διαπιστώνουμε ότι τα φύλλα παρουσιάζουν ενδιάμεσες μορφές σε σχέση με τα δύο υποείδη. Στο μέγεθος των φύλλων φαίνεται να πλησιάζουν περισσότερο τους πληθυσμούς της Τουρκίας, ενώ στο σχήμα εκείνους της Βουλγαρίας. Η παρουσία σε σημαντικά ποσοστά απλότυπων cpdna που εμφανίζονται στις ανατολικές περιοχές και έχουν χαρακτηριστεί ανατολικοί ενισχύει το σενάριο της επίδρασης του υποείδους orientalis. Έτσι φαίνεται ότι ο πληυθσμός του Χίλια επηρεάζεται στο σύνολό του από από το υποείδος orientalis, εκείνος της Δαδιάς φαίνεται να επηρεάζεται και από το υποείδος sylvatica. Η αυξημένη ποικιλότητα της Δαδιάς σε σύγκριση με το Χίλια βρίσκεται σε συμφωνία με το μοτίβο της αυξημένης προς τα ανατολικά ποικιλότητας που παρατήρησαν οι Papageorgiou et al. (2008) στη Ροδόπη. Με βάση τα παραπάνω αλλά και την υπόθεση ότι η περιοχή της Ροδόπης αποτελεί ζώνη συνάντησης και αλληλεπίδρασης ανάμεσα στα δύο υποείδη (Papageorgiou et al., 2008), συμπεραίνουμε ότι η ανατολική Ροδόπη αποτελεί σημείο συνάντησης των δύο υποειδών και ότι το σύνολο των χαρακτήρων που παρουσιάζουν οι πληθυσμοί είναι αποτέλεσμα αυτής της μείξης. Βιβλιογραφία Denk, T. 1999a. The taxonomy of Fagus in western Eurasia, 1: Fagus sylvatica ssp. orientalis (=F. orientalis). Feddes Repert 110: 117 200. Denk, T. 1999b. The taxonomy of Fagus in western Eurasia, 2: Fagus sylvatica ssp. sylvatica. Feddes Repert 110: 381 412. 6

Denk, T., Grimm, G., Stoegerer, K., Langer, M. and Hambelen, V. 2002. The evolutionary history of Fagus in western Eurasia: Evidence from genes, morphology and the fossil record. Plant Sys. Evol 232: 213-236. Denk, T. 2003. Phylogeny of Fagus L. (Fagaceae) based on morphological data. Plant Syst Evol 240:55 81. Eleftheriadou, E., Raus, T. 1996. The vascular flora of the nature reserve Frakto Virgin Forest of Nomos Dramas (E.Makedonia, Greece). Willdenowia 25: 455-485. Gailing, O., von Wuehlisch, G. 2004. Nuclear markers (AFLPs) and chloroplast microsatellites differ between Fagus sylvatica and Fagus orientalis. Silvae Genetica 53: 105-110. Gamisans, J., Hebrard J-P. 1980. A Propos de la Végétation des Forêts en Grèce du Nord-est (Macédoine Orientale et Thrace Occidentale). Doc Phytosociol 5: 243 289. Greuter, W., Burdet, H.M. and Long, G. 1984. Med-Checklist, A critical inventory of vascular plants of the circum-mediterranean countries, 1. Pteridophyta, Gymnospermae, Dicotyledones (Acanthaceae Cneoraceae), 2nd edn. BGBM/Conservatoire Botanique de la Ville de Genéve, Berlin/Geneve. Hatziskakis, S., Papageorgiou, A.C., Gailing, O, and Finkeldey, R. 2009. High chloroplast haplotype diversity in Greek populations of beech (Fagus sylvatica L.). Plant Biology 11: 425 433. Magri, D., Vendramin, G.G., Comps, B., Dupanloup, I., Geburek, T., Gömöry, D., Latalowa, M., Litt, T., Paule, L., Roure, J.M., Tantau, I., Knaap, W.O., Petit, R.J. and Beaulieu, J.L. 2006. A new scenario for the Quaternary history of European beech populations: paleobotanical evidence and genetic consequences. New Phytologist 171, 199-221. Myking, T., Yakovlev, I. 2006. Variation in leaf morphology and chloroplast DNA in Ulmus glabra in the northern suture zone: Effects of distinct glacial refugia. Scandinavian Journal of Forest Research 21: 99-107. Papageorgiou, A.C., Vidalis, A., Gailing, O., Tsiripidis, I., Hatziskakis, S., Boutsios, S., Galatsidas, S. and Finkeldey, R. 2008. Genetic variation of beech (Fagus sylvatica L.) in Rodopi (N.E. Greece) European Journal of Forest Research. Pott, R. 1997. Invasion of beech and establishment of beech forests in Europe. Annali di Botanica LV:27 58. Rohlf F.J. 2004 TpsDig, digitize landmarks and outlines, Version 2.0. Department of Ecology and Evolution, State University of NewYork, Stony Brook, New York. Strid, A. and Tan, K. 1997. Flora Hellenica 1. Koeltz, Königstein. Tsiripidis, I., Athanasiadis, N. 2003. Contribution to the knowledge of the vascular flora of NE Greece: floristic composition of the beech (Fagus sylvatica L.) forests in the Greek Rodopi. Willdenowia 33: 273-298. Tutin, T.G., Burges, N.A., Chater, A.O., Edmondson, J.R., Heywood, V.H., Moore, D.M., Valentine, D.H., Walters, S.M. and Webb, D.A. 1993. Flora Europaea, vol 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge. Vettori, C., Vendramin, G.G., Anzidei, M., Pastorelli, R., Paffetti, D., Giannini, R. 2004. Geographic distribution of chloroplast variation in Italian populations of beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical and Applied Genetics 109: 1-9. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 23:4407 4414. 7

Weising K., Gardner R.C. 1999. A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of decotyledonous angiosperms. Genome 42:9 19. Μουλόπουλος, Χ. 1965. Τα δάση οξυάς της Ελλάδος Ά Μέρος: Τα είδη της οξυάς και η εξάπλωσης αυτών εν Ελλάδι. Α.Π.Θ. Επετηρίς της Γεωπονικής και Δασολογικής Σχολής. Θεσσαλονίκη. Μπούτσιος, Σ., Τσιριπίδης, Ι., Παπαγεωργίου, Α.Χ., Γαλατσίδας, Σ. 2004. Ποικιλότητα μορφολογικών χαρακτήρων των φύλλων οξιάς (Fagus sylvatica L.) της Ροδόπης. Πρακτικά 1ου Πανελλήνιου Περιβαλλοντικού Συνεδρίου, 7-9 Μαϊου, Ορεστιάδα, Γεωτεχνικό Επιμελητήριο Ελλάδας, Θεσσαλονίκη, 756-762. Χατζησκάκης, Σ., Παπαγεωργίου, Α., Μπούτσιος, Σ., Γαλατσίδας, Σ. και Τσιριπίδης, Ι. Ποικιλότητα δέκα πληθυσμών οξιάς στην Ελλάδα σε μορφολογικούς χαρακτήρες φύλλων. Ιωάννινα. 5-8/5/2005.. Πρακτικά 10 ου Πανελλήνιου Συνεδρίου της Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας. 8