1- ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ

PLATELIA ASPERGILLUS Ag 1 Πλακέτα 96 62794 Η Platelia Aspergillus Ag είναι μια ανοσοενζυμική δοκιμή σάντουιτς σε μικροκυψέλες για την ανίχνευση αντιγόνου Aspergillus galactomannan σε δείγματα ορού και υγρού βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης (BAL) ενήλικων και παιδιατρικών ασθενών. 881115 2013/10 1- ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Η Platelia Aspergillus Ag είναι μια ανοσοενζυμική δοκιμή σάντουιτς σε μικροκυψέλες για την ανίχνευση αντιγόνου Aspergillus galactomannan σε δείγματα ορού και υγρού βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης (BAL) ενήλικων και παιδιατρικών ασθενών. Η δοκιμή Platelia Aspergillus Ag όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές μεθόδους, όπως μικροβιολογική καλλιέργεια, ιστολογική αξιολόγηση δειγμάτων βιοψίας και ακτινολογικά ευρήματα, μπορεί να συντελέσει στη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. 2- ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΧΡΗΣΗ Η Platelia Aspergillus Ag είναι μια ανοσοενζυμική δοκιμή σάντουιτς σε μικροκυψέλες για την ανίχνευση αντιγόνου Aspergillus galactomannan σε δείγματα ορού και υγρού βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης (BAL) ενήλικων και παιδιατρικών ασθενών. Η δοκιμή Platelia Aspergillus Ag όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές μεθόδους, όπως μικροβιολογική καλλιέργεια, ιστολογική αξιολόγηση δειγμάτων βιοψίας και ακτινολογικά ευρήματα, μπορεί να συντελέσει στη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. 3- ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Οι λοιμώξεις από Aspergillus ξεκινούν συνήθως στον πνεύμονα κατόπιν εισπνοής σπορίων Aspergillus που είναι παρόντα στο περιβάλλον. Οι διηθητικές μορφές, οι οποίες έχουν παρουσιάσει αυξητική τάση την τελευταία δεκαετία, αποτελούν τις σοβαρότερες περιπτώσεις. Αναπτύσσονται ως επί το πλείστον σε ουδετεροπενικούς ασθενείς (έπειτα από αντικαρκινική θεραπεία) και σε ασθενείς που λαμβάνουν αγωγή με ανοσοκατασταλτικά (σε μεταμοσχεύσεις οργάνων, ιδίως μυελού των οστών) και κορτικοστεροειδή 10. Τα στελέχη Aspergillus απομονώνονται σπανίως από καλλιέργεια αίματος. Η διάγνωση βασίζεται συχνά σε μη ειδικά διαγνωστικά ή ακτινολογικά ευρήματα (κλινικά συμπτώματα, αξονική τομογραφία, ακτινογραφία θώρακος κτλ). Η δοκιμασία για διαλυτό αντιγόνο galactomannan στον ορό φαίνεται ότι αποτελεί μια ορολογική μέθοδο που συντελεί στη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης 9, 12, 23, 54, 62. Περαιτέρω, για λήπτες Μεταμόσχευσης Συμπαγούς Οργάνου, η ανίχνευση αντιγόνου galactomannan στο υγρό βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης (BAL) έχει αποδειχθεί επωφελής στη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης στον συγκεκριμένο πληθυσμό 8,17,18. 4- ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 45 Η Platelia Aspergillus Ag είναι μια ανοσοενζυμική δοκιμή σάντουιτς ενός σταδίου σε μικροκυψέλες, μέσω της οποίας ανιχνεύεται αντιγόνο galactomannan σε ανθρώπινο ορό και υγρό BAL. Στη δοκιμή χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα επίμυος EBA-2, τα οποία κατευθύνονται κατά του Aspergillus galactomannan και έχουν χαρακτηριστεί σε προηγούμενες μελέτες 26, 46. Τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται (1) για την επικάλυψη των βοθρίων της μικροκυψέλης και τη σύνδεση του αντιγόνου και (2) για την ανίχνευση του αντιγόνου που συνδέεται στην ευαισθητοποιημένη μικροκυψέλη (αντιδραστήριο συζεύγματος: μονοκλωνικά αντισώματα συνδεδεμένα με υπεροξειδάση). Τα δείγματα ορού ή υγρού BAL υφίστανται θερμική επεξεργασία παρουσία EDTA ώστε να διαχωριστούν ανοσοσύμπλοκα και να καθιζάνουν πρωτεΐνες που θα μπορούσαν ενδεχομένως να επηρεάσουν τη δοκιμασία 24. Τα επεξεργασμένα δείγματα και το σύζευγμα προστίθενται στα επικαλυμμένα με μονοκλωνικά αντισώματα βοθρία και επωάζονται. Σχηματίζεται ένα σύμπλοκο μονοκλωνικού αντισώματος - galactomannan - μονοκλωνικού αντισώματος / υπεροξειδάσης εφόσον υπάρχει αντιγόνο galactomannan. Οι λωρίδες πλένονται για να απομακρυνθεί το ελεύθερο υλικό. Στη συνέχεια, προστίθεται το διάλυμα υποστρώματος, το οποίο θα αντιδράσει με τα σύμπλοκα που έχουν δεσμευτεί στο βοθρίο για να προκληθεί μια αντίδραση μπλε χρώματος. Η ενζυμική αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη οξέος, το οποίο αλλάζει το χρώμα από μπλε σε κίτρινο. Η απορρόφηση (οπτική πυκνότητα) δειγμάτων ασθενών και δειγμάτων ελέγχου προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο ρυθμισμένο σε μήκος κύματος 450 και 620/630 nm. 1

5- ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Platelia Aspergillus Ag: Αριθ. προϊόντος 62794 (96 δοκιμασίες) Φυλάσσετε το kit σε θερμοκρασία 2-8 C. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αφήνονται να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος (18-25 C) πριν τη χρήση. Τα αντιδραστήρια πρέπει να επιστρέφουν σε θερμοκρασία 2-8 C αμέσως μετά τη χρήση. Τοποθετείτε τις μη χρησιμοποιημένες λωρίδες/πλάκες πίσω στη σακούλα και επανασφραγίζετε. Μην αφαιρείτε το αποξηραντικό μέσο. Μετά την αραίωση, το Διάλυμα Πλύσης Εργασίας μπορεί να φυλαχθεί επί 14 ημέρες σε θερμοκρασία 2-30 C. Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 8 εβδομάδων από το άνοιγμα. Παρέχεται επαρκής ποσότητα αντιδραστηρίων για την εκτέλεση 96 δοκιμασιών σε μέγιστο αριθμό 9 παρτίδων. R1 R2 R3 R4 R5 Στοιχείο Περιεχόμενα Ποσότητα Microwell Strip Plate Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Μικροκυψέλη: - 96 βοθρία (12 λωρίδες των 8 βοθρίων έκαστη) επικαλυμμένα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι galactomannan - Καρτελάκι λωρίδας με επισήμανση 85 Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (20X): - Ρυθμιστικό διάλυμα Tris NaCl (ph 7.4) - 2% Tween 20 - Συντηρητικό: 0,04% ProClin TM 300 Αρνητικό Δείγμα Ορού Ελέγχου: - Αρνητικό ανθρώπινο δείγμα ορού - Αρνητικό για αντισώματα anti-hiv-1, anti-h IV-2, anti- HCV και HBs Ag - Συντηρητικό: 0,3% ProClin TM 300 Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: - Ανθρώπινο δείγμα ορού που περιέχει galactomannan - Αρνητικό για αντισώματα anti-hiv-1, anti-h IV-2, anti- HCV και HBs Ag - Συντηρητικό: 0,3% ProClin TM 300 Θετικό Δείγμα Ορού Ελέγχου: - Ανθρώπινο δείγμα ορού που περιέχει galactomannan - Αρνητικό για αντισώματα anti-hiv-1, anti-h IV-2, anti- HCV και HBs Ag - Συντηρητικό: 0,3% ProClin TM 300 1 Πλάκα / 12 x 8 Βοθρία 1 x 70 ml 2 x 1.7 ml 2 x 1.7mL 2 x 1.7 ml Σύζευγμα (έτοιμο προς χρήση): - Μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι galactomannan R6 Conjugate 1 x 8 ml /σημασμένο με υπεροξειδάση - Συντηρητικό: 0,3% ProClin TM 300 Διάλυμα Επεξεργασίας Δείγματος (έτοιμο προς R7 Sample Treatment Solution χρήση): 1 x 13 ml - Όξινο διάλυμα EDTA R9 Chromogen:TMB Solution Χρωμογόνο Διάλυμα ΤΜΒ (έτοιμο προς χρήση): - 3,3,5,5 -τετραμεθυλβενζιδίνη (<0.1%) 1 x 28 ml - H 2 O 2 (<1.0 %) R10 Stopping Solution Διάλυμα Διακοπής Αντίδρασης (έτοιμο προς χρήση): 1 x 28 ml - Διάλυμα θειικού οξέος 1 N (H 2 SO 4 ) Σημείωση: Η TMB (3,3,5,5 -τετραμεθυλβενζιδίνη) είναι ένα μη καρκινογόνο και μη μεταλλαξιογόνο χρωμογόνο για την υπεροξειδάση. 6- ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Η χρήση αυτού του kit δοκιμασίας με άλλα δείγματα εκτός από ανθρώπινο ορό και υγρό BAL δεν συνιστάται. 4. Το Θετικό Δείγμα Ορού Ελέγχου, το Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών και το Αρνητικό Δείγμα Ορού Ελέγχου παρασκευάζονται από ανθρώπινο ορό που έχει δοκιμαστεί και έχει διαπιστωθεί ότι δεν αντιδρά με HBsAg και αντισώματα έναντι HIV-1, HIV-2 και HCV βάσει ελέγχων πιστοποιημένων με σήμανση CE. Ωστόσο, θα πρέπει να χειρίζεστε όλα τα αντιδραστήρια ωσάν να υπήρχε πιθανότητα μετάδοσης λοίμωξης. Όλες οι δοκιμασίες θα πρέπει να διεξάγονται σύμφωνα με το Πρότυπο OSHA περί Παθογόνων Αίματος, σύμφωνα με το Επίπεδο Βιοασφάλειας 2 ή σύμφωνα με άλλες κατάλληλες πρακτικές βιοασφάλειας. 5. Να φοράτε προστατευτική ενδυμασία, περιλαμβανομένης ρόμπας εργαστηρίου, μέσα ατομικής προστασίας για τα μάτια/το πρόσωπο και γάντια μιας χρήσης (συνιστώνται συνθετικά, όχι λατέξ γάντια) και να χειρίζεστε τα αντιδραστήρια του kit και τα δείγματα των ασθενών σύμφωνα με την απαιτούμενη Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. Να πλένετε καλά τα χέρια μετά την εκτέλεση της δοκιμασίας. 6. Μην αναρροφάτε το προϊόν με το στόμα. 7. Μην καπνίζετε, μην πίνετε και μην τρώτε σε χώρους στους οποίους γίνεται χειρισμός δειγμάτων ή αντιδραστηρίων kit. 2

8. Αποφεύγετε το πιτσίλισμα με δείγματα ή διαλύματα. 9. Οι εκροές βιολογικών υλικών που δεν περιέχουν οξύ θα πρέπει να καθαρίζονται καλά με αποτελεσματικό απολυμαντικό. Τα απολυμαντικά που δύναται να χρησιμοποιηθούν είναι (αλλά χωρίς περιορισμό) διάλυμα χλωρίνης 10% (διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0.5%), διάλυμα αιθανόλης 70% ή διάλυμα Wescodyne Plus 0.5%. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό εκροών θα πρέπει ενδεχομένως να απορρίπτονται ως επικίνδυνα βιολογικά απόβλητα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μην τοποθετείτε διαλύματα που περιέχουν χλωρίνη στο αυτόκλειστο. 10. Εκροές που περιέχουν οξύ θα πρέπει να απορροφώνται (σφουγγίζονται) ή να ουδετεροποιούνται με διττανθρακικό νάτριο και η περιοχή θα πρέπει να ξεπλένεται και να στεγνώνεται. Αν οι εκροές περιείχαν επικίνδυνο βιολογικό υλικό, καθαρίζετε την περιοχή με ένα χημικό απολυμαντικό. 11. Απορρίπτετε όλα τα δείγματα και τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση της δοκιμασίας ωσάν να περιέχουν μολυσματικό παράγοντα. Πρέπει να χειρίζεστε και να απορρίπτετε τα εργαστηριακά χημικά και επικίνδυνα βιολογικά απόβλητα σύμφωνα με όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισμούς. 12. Για συστάσεις αναφορικά με τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται με κάποια χημικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήματα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση www.bio-rad.com. 13. Το Δελτίο Δεδομένων περί Ασφάλειας των Υλικών διατίθεται κατόπιν αιτήσεως. 7- ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. ΚΑΤΕΨΥΓΜΕΝΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ Ή ΥΓΡΟΥ BAL ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΦΥΛΑΧΘΕΙ ΣΕ ΑΓΝΩΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΔΩΣΟΥΝ ΨΕΥΔΩΣ ΘΕΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΛΟΓΩ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗΣ ΜΕ ΜΥΚΗΤΕΣ ΚΑΙ/Ή ΒΑΚΤΗΡΙΑ. 2. Μην χρησιμοποιείτε το kit ή οποιοδήποτε αντιδραστήριο του kit μετά την αναφερόμενη ημερομηνία λήξης. 3. Μην αναμιγνύετε αντιδραστήρια από άλλα kit που έχουν διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας, με την εξαίρεση του Διαλύματος Πλύσης (R2, αναγνωριστικό*: 20x πράσινο χρώμα), του Χρωμογόνου (R9, αναγνωριστικό*: TMB τιρκουάζ χρώμα) και του Διαλύματος Διακοπής Αντίδρασης (R10, αναγνωριστικό*:1n κόκκινο χρώμα), υπό την προϋπόθεση ότι αυτά τα αντιδραστήρια είναι αυστηρώς ισοδύναμα και χρησιμοποιείται ο ίδιος αριθμός παρτίδας σε ένα δεδομένο κύκλο δοκιμασίας. *στην ετικέτα του φιαλιδίου ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το Διάλυμα Πλύσης (R2, αναγνωρίζεται* με πράσινο χρώμα ως 20x) δεν δύναται να αναμειχθεί με το Διάλυμα Πλύσης (R2, αναγνωρίζεται* με μπλε χρώμα ως 10X) που παρέχεται στα kit αντιδραστηρίων της Bio-Rad. *στην ετικέτα του φιαλιδίου 4. Αφήνετε όλα τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία δωματίου για 30 τουλάχιστον λεπτά πριν τη χρήση. 5. Αναμιγνύετε καλά κάθε αντιδραστήριο πριν τη χρήση. 6. Αναμιγνύετε καλά το Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (R2) πριν την προετοιμασία του Διαλύματος Πλύσης Εργασίας, φροντίζοντας να αποφεύγεται η μικροβιακή επιμόλυνση. 7. Μην διεξάγετε τη δοκιμασία αν υπάρχουν αντιδραστικοί ατμοί (οξέα, αλκάλια, αλδεΰδες) ή σκόνη, που μπορεί να επηρεάσουν την ενζυμική δραστηριότητα του Συζεύγματος. 8. Για χειροκίνητη άντληση των δειγμάτων ελέγχου και των δειγμάτων ασθενών, χρησιμοποιείτε ξεχωριστά άκρα πιπέτας ώστε να αποτραπεί η μεταφορά δειγμάτων. 9. Για να εξασφαλιστεί η επαρκής πλύση των βοθρίων, να συμμορφώνεστε με το συνιστώμενο αριθμό κύκλων πλύσης και να βεβαιώνεστε ότι όλα τα βοθρία γεμίζουν εντελώς και στη συνέχεια αδειάζουν εντελώς. Η πλύση δεν θα πρέπει να πραγματοποιείται χειροκίνητα με την χρήση υδροβολέα. 10. Μην αφήνετε τη μικροκυψέλη να στεγνώνει ανάμεσα στο τέλος του κύκλου πλύσης και στην προσθήκη αντιδραστηρίων. 11. Μην χρησιμοποιείτε τον ίδιο περιέκτη για τα διαλύματα συζεύγματος και υποστρώματος. 12. Μην αφήνετε το Διάλυμα Συζεύγματος ή το Χρωμογόνο Διάλυμα TMB να έλθει σε επαφή με μέταλλο ή μεταλλικά ιόντα. 13. Αποφεύγετε την έκθεση του Χρωμογόνου Διαλύματος TMB σε έντονο φως κατά τη διάρκεια της φύλαξης ή της επώασης. Μην αφήνετε το χρωμογόνο διάλυμα να έλθει σε επαφή με οξειδωτικό μέσο. 14. Αποφεύγετε την επαφή του Διαλύματος Διακοπής Αντίδρασης με οξειδωτικό μέσο. Μην αφήνετε το Διάλυμα Διακοπής Αντίδρασης να έλθει σε επαφή με μέταλλο ή μεταλλικά ιόντα. 15. Χρησιμοποιείτε καθαρά, χωρίς σκόνη υλικά (σωλήνες, άκρα πιπέτας, δοχεία κτλ) για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης με σπόρια Aspergillus από το περιβάλλον. Επειδή το galactomannan δεν επηρεάζεται από τη θερμότητα, η αποστείρωση του χρησιμοποιούμενου υλικού δεν εγγυάται την απουσία μολυσματικού αντιγόνου. Τα απυρετογόνα υλικά είναι άριστα, αλλά μπορείτε να χρησιμοποιήσετε και συνήθη εξοπλισμό λαμβάνοντας επαρκείς προφυλάξεις. 16. Περιορίζετε την έκθεση των διαλυμάτων (οροί, υγρό BAL, Διάλυμα Επεξεργασίας Δείγματος, Σύζευγμα) ή ανοικτών δοχείων (πλάκες, σωλήνες, πιπέτες) στον ατμοσφαιρικό αέρα. 17. Μην χύνετε μη χρησιμοποιημένο Σύζευγμα πίσω στον αρχικό περιέκτη. 18. Το Χρωμογόνο Διάλυμα TMB πρέπει να είναι άχρωμο. Η εμφάνιση μπλε χρώματος μετά την αραίωση σημαίνει ότι το αντιδραστήριο είναι επιμολυσμένο και δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί. Απορρίψτε το και ετοιμάστε ένα νέο αντιδραστήριο. 3

8- ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Πλάκα Λωρίδων Μικροβοθρίων (R1) Κάθε πλαίσιο που περιέχει 1 2 λωρίδες είναι συσκευασμένο σε σακούλα. Κόψτε τη σακούλα με ψαλίδι ακριβώς κάτω από τη συναρμογή. Ανοίξτε τη σακούλα και βγάλτε έξω το πλαίσιο. Τοποθετήστε το πλαίσιο που περιέχει τις μη χρησιμοποιημένες λωρίδες στην αρχική σακούλα. Επανασφραγίστε προσεκτικά τη σακούλα και αποθηκεύστε σε θερμοκρασία +2-8 C. Μετά το άνοιγμα της αεροστεγούς σακούλας, οι λωρίδες που φυλάσσονται σε θερμοκρασία +2-8 C στην αρχική σακούλα που έχει επανασφραγιστεί προσεκτικά είναι σταθερές για 8 εβδομάδες. Ελέγξτε αν βρίσκεται ακόμη μέσα το αποξηραντικό μέσο. Διάλυμα Πλύσης (R2) Ετοιμάστε το Διάλυμα Πλύσης Εργασίας όπως απαιτείται προσθέτοντας ένα μέρος Συμπυκνωμένου Διαλύματος Πλύσης (R2) σε 19 μέρη απιοντισμένου ή απεσταγμένου νερού. Το Διάλυμα Πλύσης Εργασίας μπορεί να φυλαχθεί για 14 ημέρες σε θερμοκρασία 2-30 C. Ετοιμάστε επαρκή ποσότητα Διαλύματος Πλύσης Εργασίας για την ολοκλήρωση του κύκλου δοκιμασίας (80 ml για μία λωρίδα: 4 ml R2 + 76 ml απεσταγμένο νερό). Μετά το άνοιγμα, το Συμπυκνωμένο Διάλυμα Εργασίας που φυλάσσεται σε θερμοκρασία +2-30 C o C, αν δεν έχει επιμολυνθεί, είναι σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην επισήμανση. Αρνητικό Δείγμα Ορού Ελέγχου (R3), Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4) και Θετικό Δείγμα Ορού Ελέγχου (R5) Τα δείγματα ελέγχου πρέπει να υφίστανται θερμική επεξεργασία με όξινο διάλυμα EDTA (R7) όπως και τα δείγματα των ασθενών, ώστε να αποτελούν επίσης και δείκτη ελέγχου της επεξεργασίας. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά φυλασσόμενα σε θερμοκρασία +2-8 C είναι σταθερά για διάστημα 8 εβδομάδων, αν δεν υπάρχει επιμόλυνση. Σύζευγμα (R6), Διάλυμα Επεξεργασίας Δείγματος (R7), Χρωμογόνο Διάλυμα TMB (R9) Τα αντιδραστήρια αυτά είναι έτοιμα προς χρήση. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά φυλασσόμενα σε θερμοκρασία +2-8 C είναι σταθερά για διάστημα 8 εβδομάδων, αν δεν υπάρχει επιμόλυνση. Διάλυμα Διακοπής Αντίδρασης (R10) Το αντιδραστήριο αυτό είναι έτοιμο προς χρήση. Μετά το άνοιγμα, το αντιδραστήριο αυτό φυλασσόμενο σε θερμοκρασία +2-8 C είναι σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην επισήμανση, αν δεν υπάρχει επιμόλυνση. 9- ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Η δοκιμασία αυτή πραγματοποιείται σε δείγμα ορού ή υγρού BAL. I. ΟΡΟΣ Συλλέγετε δείγματα αίματος σύμφωνα με τις καθιερωμένες εργαστηριακές διαδικασίες. Τα δείγματα ορού πρέπει να μην είναι επιμολυσμένα με σπόρια μυκήτων και/ή βακτήρια. Μεταφέρετε και αποθηκεύετε τα δείγματα σε σφραγισμένους σωλήνες, χωρίς να έρχονται σε επαφή με τον αέρα. Τα μη ανοιγμένα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2-8 C για διάστημα έως και 5 ημέρες πριν τη δοκιμασία. Μετά το πρώτο άνοιγμα, τα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2-8 C για διάστημα 48 ωρών πριν τη δοκιμασία. Για πιο μακρόχρονη αποθήκευση, φυλάσσετε τα δείγματα ορού στους -70 C. Τα δείγματα ορού μπορούν να υποβληθούν σε μέγιστο αριθμό 4 κύκλων κατάψυξης/απόψυξης. Προηγουμένως κατεψυγμένα δείγματα θα πρέπει να αναμειγνύονται καλά αφού αποψυχθούν πριν τη δοκιμασία. Τα αποτελέσματα δεν επηρεάζονται από δείγματα που περιέχουν 20 mg/l χολερυθρίνη, λιπαιμικά δείγματα που περιέχουν το ισοδύναμο 2 g/l τριολεΐνης (τριγλυκερίδιο) ή αιμολυμένα δείγματα που περιέχουν 165 mg/l αιμοσφαιρίνη. Οι παρεμβολές από περίσσεια λευκωματίνης δεν έχουν εξεταστεί. Μην αφαιρείτε το συμπλήρωμα των ορών. II. ΥΓΡΟ BAL Συλλέγετε δείγματα υγρού BAL σύμφωνα με τις καθιερωμένες εργαστηριακές διαδικασίες. Τα δείγματα υγρού BAL πρέπει να συλλέγονται σε στείρο φυσιολογικό ορό και μπορούν να εξετάζονται ως καθαρά δείγματα (ως είναι) ή υπερκείμενα φυγοκεντρισμένων δειγμάτων (10.000 rpm επί 10 λεπτά) προτού προβείτε στην επεξεργασία του δείγματος σύμφωνα με την Ενότητα 10. Τα δείγματα υγρού BAL πρέπει να μην είναι επιμολυσμένα με σπόρια μυκήτων και/ή βακτήρια. Μεταφέρετε και αποθηκεύετε τα δείγματα σε σφραγισμένους σωλήνες, χωρίς να έρχονται σε επαφή με τον αέρα. Μετά το πρώτο άνοιγμα, τα δείγματα μπορούν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 2-8 o C για διάστημα έως και 24 ώρες. Για πιο μακρόχρονη αποθήκευση, φυλάσσετε τα δείγματα υγρού BAL σε βαθιά ψύξη (θερμοκρασία -20 C ή χαμηλότερη) για διάστημα έως και 5 μήνες. Τα δείγματα υγρού BAL μπορούν να υποβληθούν σε μέγιστο αριθμό 4 κύκλων κατάψυξης/απόψυξης. Προηγουμένως κατεψυγμένα δείγματα θα πρέπει να αναμειγνύονται καλά αφού αποψυχθούν πριν τη δοκιμασία. 4

10- ΜΕΘΟΔΟΣ Παρεχόμενα υλικά Βλ. ενότητα ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ. Απαιτούμενα αλλά μη παρεχόμενα υλικά 1. Απεσταγμένο ή απιοντισμένο νερό, για αραίωση του Συμπυκνωμένου Διαλύματος Πλύσης. 2. Απορροφητικό χαρτί. 3. Γάντια μιας χρήσης. 4. Προστατευτικά γυαλιά. 5. Υποχλωριώδες νάτριο (χλωρίνη) και διττανθρακικό νάτριο. 6. Πιπέτες ή πολυπιπέτες, ρυθμιζόμενες ή σταθερές, για τη μέτρηση και διανομή 50 µl, 100 µl, 300 µl και 1000 µl. 7. Σωλήνες μικροφυγοκέντρησης των 1.5 ml από πολυπροπυλένιο με αεροστεγή πώματα, ανθεκτικοί σε θέρμανση έως τους 120 C (θερμαντήρας) ή τους 100 C (λουτρό ζέοντος ύδατος). - Βιδωτά καπάκια και σωλήνες: Κωνικοί Σωλήνες 1.5 ml, Ή - Σωλήνες με κουμπωτό καπάκι: EZ Δοκιμαστικοί Μικροσωλήνες 1.5 ml, - Κλείστρα καπακιού μικροσωλήνα. Τα κλείστρα αυτά ασφαλίζουν ερμητικά τα κουμπωτά καπάκια των σωλήνων, αποτρέποντας το άνοιγμα κατά τη διάρκεια μεταβολών της θερμοκρασίας και της πίεσης, ενώ επιτρέπουν επίσης την εύκολη ανύψωση και απομάκρυνση των σωλήνων από τον θερμαντήρα ή το λουτρό ζέοντος ύδατος. 8. Φυγοκεντρητής εργαστηριακού πάγκου για σωλήνες πολυπροπυλενίου των 1.5 ml με ικανότητα επίτευξης 10.000g (Brinkman Αρ. Κατ. 22-36-280-1 ή VWR Scientific Αρ. Κατ. 20901-9480 ή ισοδύναμος). 9. Αν χρησιμοποιείται θερμαντήρας για την επεξεργασία των δειγμάτων ορού/υγρού BAL: - Θερμαντήρας. Συνιστώνται τα ακόλουθα μοντέλα θερμαντήρα: - Μοντέλο μονής πλάκας: Grant Αρ. Κατ. QBD-1L - εκτός Η.Π.Α.: Grant Αρ. Κατ. QBD1 που διανέμεται από την VWR με Αρ. Κατ. # 460-0074) - Μοντέλο με δύο πλάκες: Grant Αρ. Κατ. QBD-2L εκτός Η.Π.Α.: Grant Αρ. Κατ. QBD2 που διανέμεται από την VWR με Αρ. Κατ. # 460-0076) - Πλάκα για θερμαντήρες: και οι δύο θερμαντήρες (QBD-1 L, QBD1 and QBD-2L, QBD2) πρέπει να χρησιμοποιούνται με πλάκα Grant Αρ. Κατ. QB-E1 που διανέμεται εκτός Η.Π.Α. από την VWR με Αρ. Κατ. # 460-8517 - Αν χρησιμοποιείται υδατόλουτρο για την επεξεργασία των δειγμάτων ορού/υγρού BAL: - Στρογγυλή, πλωτή βάση μικρο-φυγοκέντρησης για ποτήρι ζέσεως 1 L (στις Η.Π.Α.: VWR Scientific Αρ. Κατ. 60986- - 100 ή Nalgene Αρ. Κατ. 5974-1015 ή ισοδύναμη). - Λουτρό ζέοντος ύδατος στους 100 C. 10. Φυγοκεντρικός αναδευτήρας. 11. Επωαστήρας μικροκυψέλης στους 37 ± 1 C. 12. Ημι-αυτόματη ή αυτόματη συσκευή πλύσης μικροκυψέλης. 13. Συσκευή ανάγνωσης μικροκυψέλης εξοπλισμένη με φίλτρα 450 nm και 620/630 nm. Σχόλια για τη μέθοδο Το Αρνητικό Δείγμα Ορού Ελέγχου, το Θετικό Δείγμα Ορού Ελέγχου και το Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών πρέπει να εξετάζονται σε κάθε κύκλο για την επικύρωση των αποτελεσμάτων της δοκιμασίας. Επεξεργασία των δειγμάτων ορού/υγρού BAL Όλα τα δείγματα ορού ελέγχου: αρνητικό (R3), οριακών τιμών (R4) και θετικό (R5) πρέπει να υφίστανται επεξεργασία ταυτόχρονα με τα δείγματα ορού/υγρού BAL: 1. Βάλτε με πιπέτα 300 µl από κάθε δείγμα ορού/υγρού BAL προς εξέταση και από κάθε δείγμα ελέγχου σε ξεχωριστό σωλήνα πολυπροπυλενίου των 1,5 ml. 2. Προσθέστε 100 µl Διαλύματος Επεξεργασίας Δείγματος (R7) σε κάθε σωλήνα. 3. Αναμείξτε καλά το περιεχόμενο των σωλήνων με έντονη ανάδευση ή φυγοκέντρηση. Κλείστε ερμητικά τον σωλήνα προς αποφυγή ανοίγματος κατά τη διάρκεια της θέρμανσης. 4. Επιλογή θερμαντήρα Θερμάνετε τους σωλήνες επί 6 λεπτά σε θερμαντήρα στους 120 C. Οι σωλήνες πρέπει να τοποθετούνται στο θερμαντήρα μόνο όταν έχει επιτευχθεί η καθορισμένη θερμοκρασία (*). Ή Επιλογή λουτρού ύδατος Αν χρησιμοποιείτε λουτρό ζέοντος ύδατος: θερμάνετε τους σωλήνες επί 3 λεπτά στους 100 C (*). Οι σωλήνες πρέπει να τοποθετούνται στο λουτρό ύδατος μόνο όταν έχει επιτευχθεί η καθορισμένη θερμοκρασία. 5. Απομακρύνετε προσεκτικά τους ζεστούς σωλήνες από τον θερμαντήρα ή το λουτρό ζέοντος ύδατος και τοποθετήστε τους σε φυγοκεντρητή. Φυγοκεντρήστε τους σωλήνες σε 10.000 x g επί 10 λεπτά. Το υπερκείμενο χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του αντιγόνου galactomannan. 6. Εξετάστε τα υπερκείμενα με την εξής διαδικασία. Μετά τον διαχωρισμό, το υπερκείμενο μπορεί να αφαιρεθεί και να φυλαχθεί στους 2-8 C για διάστημα έως και 48 ώρες πριν τη δοκιμασία. Αν η ανάλυση των αποτελεσμάτων υποδεικνύει ότι απαιτείται εκ νέου εξέταση, μια άλλη ποσότητα του δείγματος πρέπει να υποστεί επεξεργασία πριν τη δοκιμασία. (*) Απαιτείται αυστηρή τήρηση της καθορισμένης θερμοκρασίας και του καθορισμένου χρόνου ολοκλήρωσης, καθώς και χρήση των συνιστώμενων υλικών για την αίσια εκτέλεση της δοκιμασίας. 5

Μην βασίζεστε στη θερμοκρασία που εμφανίζεται στη συσκευή, παρακαλείσθε να ελέγχετε ότι η θερμοκρασία συμφωνεί με τις προδιαγραφές χρησιμοποιώντας ένα βαθμονομημένο θερμόμετρο το οποίο θα προσαρμόζεται σε σωλήνα με ορυκτέλαιο: η θερμοκρασία πρέπει να φτάσει στους 120 C εντός του σωλήνα σε θερμαντήρα και στους 100 C σε λουτρό ζέοντος ύδατος. Μέθοδος EIA Να τηρείτε αυστηρά το προτεινόμενο πρωτόκολλο. Να τηρείτε την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. 1. Αφήνετε τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία δωματίου (+18-25 C) για 30 τουλάχιστον λεπτά πριν τη χρήση. 2. Ετοιμάστε το Διάλυμα Πλύσης Εργασίας. 3. Καταρτίστε ένα διάγραμμα για την αναγνώριση των υπό εξέταση δειγμάτων ορού/υγρού BAL και των δειγμάτων ελέγχου στη μικροκυψέλη. Χρησιμοποιείτε ένα βοθρίο για το Αρνητικό Δείγμα Ορού Ελέγχου (R3), δύο βοθρία για το Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4) και ένα βοθρίο για το Θετικό Δείγμα Ορού Ελέγχου (R5). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R5 S5 S13 B R4 S6 Γ R4 S7 Δ R3 S8 Ε S1 S9 ΣΤ S2 S10 Ζ S3 S11 Η S4 S12 4. Αφαιρέστε τη βάση της πλάκας και τις λωρίδες μικροβοθρίων (R1) από τη σακούλα της πλάκας. Βάλτε όλες τις λωρίδες που δεν θα χρησιμοποιηθούν πίσω στη σακούλα, μαζί με το αποξηραντικό μέσο και επανασφραγίστε τη σακούλα. 5. Αναμείξτε τα περιεχόμενα της φιάλης Συζεύγματος (R6) αναποδογυρίζοντάς την πριν τη χρήση. Προσθέστε 50 µl Συζεύγματος (R6) σε κάθε βοθρίο. Στη συνέχεια, προσθέστε 50 µl υπερκειμένου επεξεργασμένου ορού/υγρού BAL σε κάθε βοθρίο, όπως καθορίζεται παραπάνω. Μην προσθέτετε δείγματα ορού/υγρού BAL στα βοθρία πριν το σύζευγμα. 6. Καλύψτε την πλάκα με τον σφραγιστήρα ή με άλλο μέσο, προς αποφυγή εξάτμισης, εξασφαλίζοντας ότι όλη η επιφάνεια είναι καλυμμένη και υδατοστεγής. 7. Επωάστε τη μικροκυψέλη σε έναν ξηρό επωαστήρα μικροκυψελών επί 90 ± 5 λεπτά στους 37 C (± 1 C). 8. Αφαιρέστε τον σφραγιστήρα πλάκας. Αναρροφήστε τα περιεχόμενα όλων των βοθρίων σε ένα δοχείο αποβλήτων (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε την πλάκα 5 φορές σε συσκευή πλύσης μικροκυψελών (χρησιμοποιώντας 800 µl Διαλύματος Πλύσης Εργασίας). Μετά την τελευταία πλύση, αναποδογυρίστε τη μικροκυψέλη και κτυπήστε την απαλά πάνω σε απορροφητικό χαρτί για να απομακρυνθεί η εναπομένουσα ποσότητα υγρού. 9. Προσθέστε γρήγορα 200 µl Χρωμογόνου Διαλύματος TMB (R9) σε κάθε βοθρίο, αποφεύγοντας την έκθεση σε έντονο φως. 10. Επωάστε τη μικροκυψέλη στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (+18-25 C) επί 30 ± 5 λεπτά. Μην χρησιμοποιείτε αυτοκόλλητη μεμβράνη στη διάρκεια αυτού του βήματος επώασης. 11. Προσθέστε 100 µl Διαλύματος Διακοπής Αντίδρασης (R10) σε κάθε βοθρίο, χρησιμοποιώντας την ίδια σειρά με την οποία είχατε προσθέσει το Χρωμογόνο Διάλυμα TMB. Αναμείξτε καλά. 12. Σκουπίστε καλά τον πυθμένα κάθε πλάκας. 13. Διαβάστε την οπτική πυκνότητα κάθε βοθρίου στα 450 nm (φίλτρο αναφοράς 620/630 nm). Οι μικροκυψέλες πρέπει να διαβάζονται μέσα σε 30 λεπτά από την προσθήκη του Διαλύματος Διακοπής Αντίδρασης. 11- ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑΣ) Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: Η Ο.Π. κάθε Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών πρέπει να είναι 0.300 και 0.800. Θετικό Δείγμα Ορού Ελέγχου: Ο δείκτης του Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου πρέπει να είναι μεγαλύτερος από 1.50. Ο.Π. Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου I = (R5) Μέση Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου > 1.50 Οριακών Τιμών Αρνητικό Δείγμα Ορού Ελέγχου: Ο δείκτης του Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου πρέπει να είναι μικρότερος από 0.40. Ο.Π. Αρνητικού Δείγματος Ορού I = Ελέγχου (R3) Μέση Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου < 0.40 Οριακών Τιμών Αν οποιοδήποτε δείγμα ελέγχου δεν πληροί τα κριτήρια εγκυρότητας που περιγράφονται παραπάνω, η δοκιμή καθίσταται μη έγκυρη και τα αποτελέσματα για το δείγμα του ασθενούς δεν θα πρέπει να αναφέρονται. Ο χειριστής δύναται να αποφασίσει να επαναλάβει τη δοκιμή αφού αναθεωρήσει τη διαδικασία ή να επικοινωνήσει με τον κατασκευαστή για βοήθεια. Αν επαναληφθεί η δοκιμή, τότε θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί νέα ποσότητα από το ίδιο δείγμα. 6

Παράδειγμα Υπολογισμού: Δείγμα Απορρόφηση (Ο.Π.) Ο.Π. Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου (R3) 0.116 Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4) 0.513 0.533 Ο.Π. Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου (R5) 1.834 Υπολογισμοί Μέση Τιμή Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών Για να υπολογίσετε τη μέση Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4), προσθέστε τις τιμές Ο.Π. από κάθε Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών και διαιρέστε το αποτέλεσμα με 2: (0.513 + 0.533) 2 = 0.523 Δείκτης Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου Για να υπολογίσετε τον δείκτη του Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου, διαιρέστε την Ο.Π. του Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου με τη μέση Ο.Π. του Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: 0.116 I = = 0.22 0.523 Δείκτης Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου Για να υπολογίσετε τον δείκτη του Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου, διαιρέστε την Ο.Π. του Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου με τη μέση Ο.Π. του Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: 1.834 I = = 3.51 0.523 Εγκυρότητα Στο ανωτέρω παράδειγμα: Η Ο.Π. κάθε Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών είναι 0.300 και 0.800, που σημαίνει ότι ο Έλεγχος Οριακών Τιμών είναι έγκυρος. Ο δείκτης του Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου είναι < 0.40, που σημαίνει ότι ο Αρνητικός Έλεγχος είναι έγκυρος. Ο δείκτης του Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου είναι > 1.50, που σημαίνει ότι ο Θετικός Έλεγχος είναι έγκυρος. Ο κύκλος δοκιμασίας σε αυτό το παράδειγμα θεωρείται έγκυρος καθώς τα αποτελέσματα ικανοποιούν τα κριτήρια εγκυρότητας για κάθε δείγμα ελέγχου. 12- ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η ύπαρξη ή μη αντιγόνου galactomannan στο υπό δοκιμή δείγμα καθορίζεται με υπολογισμό ενός δείκτη για κάθε δείγμα ασθενούς. Ο Δείκτης (I) είναι η τιμή Ο.Π. του δείγματος διαιρεμένη με τη μέση οπτική πυκνότητα των βοθρίων που περιέχουν Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών. Υπολογισμός της μέσης οπτικής πυκνότητας του Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: Προσθέστε τις οπτικές πυκνότητες των δύο βοθρίων που περιέχουν Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4) και διαιρέστε το σύνολο με 2. Υπολογισμός ενός δείκτη (I) για κάθε υπό δοκιμή δείγμα: Υπολογίστε τον ακόλουθο λόγο για κάθε υπό δοκιμή δείγμα: Ο.Π. Δείγματος I = Μέση Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών Ερμηνεία αποτελεσμάτων δειγμάτων ορού/υγρού BAL με δείκτη < 0.50: Τα δείγματα ορού/υγρού BAL με δείκτη < 0.50 θεωρείται ότι είναι αρνητικά για αντιγόνο galactomannan. Σημείωση: Ένα αρνητικό αποτέλεσμα μπορεί να σημαίνει ότι το αποτέλεσμα του ασθενούς βρίσκεται κάτω από το ανιχνεύσιμο κατά τη δοκιμή επίπεδο. Τα αρνητικά αποτελέσματα δεν αποκλείουν τη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. Συνιστάται επανάληψη της δοκιμασίας εάν το αποτέλεσμα είναι αρνητικό αλλά υπάρχει υποψία για τη νόσο. Ερμηνεία αποτελεσμάτων δειγμάτων ορού/υγρού BAL με δείκτη 0.50 Τα δείγματα ορού/υγρού BAL με δείκτη 0.50 θεωρείται ότι είναι θετικά για αντιγόνο galactomannan. Για όλους τους θετικούς ασθενείς, συνιστάται επανάληψη της δοκιμασίας με νέα ποσότητα από το ίδιο δείγμα (ορού/υγρού BAL). Σημείωση: Μια τιμή απορρόφησης κάτω από 0.000 μπορεί να σημαίνει σφάλμα της μεθόδου ή του οργάνου, που θα πρέπει να αξιολογείται. Το αποτέλεσμα δεν είναι έγκυρο και το δείγμα πρέπει να εξεταστεί εκ νέου. Συνιστάται τακτικός έλεγχος (δύο φορές την εβδομάδα) δειγμάτων ορού ασθενών υψηλού κινδύνου ώστε να επαυξηθεί η ευαισθησία και η πρώιμη θετικότητα της δοκιμασίας. 7

Σημείωση: Η μέθοδος Platelia Aspergillus Ag προορίζεται για την υποβοήθηση της διάγνωσης Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. Τα θετικά αποτελέσματα που προκύπτουν με τη μέθοδο Platelia Aspergillus Ag θα πρέπει να εκτιμώνται σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές μεθόδους, όπως μικροβιολογική καλλιέργεια, ιστολογική αξιολόγηση δειγμάτων βιοψίας και ακτινολογικά ευρήματα. Παράδειγμα Υπολογισμού: Δείγμα Απορρόφηση (Ο.Π.) Ο.Π. Αρνητικού Δείγματος Ορού Ελέγχου (R3) 0.116 Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4) 0.513 0.533 Ο.Π. Θετικού Δείγματος Ορού Ελέγχου (R5) 1.834 Δείγμα Ασθενούς #1 0.134 Δείγμα Ασθενούς #2 0.436 Δείγμα Ασθενούς #3 1.196 Υπολογισμοί Ανατρέξτε στην ενότητα Ποιοτικός Έλεγχος (Κριτήρια Εγκυρότητας) για παράδειγμα των υπολογισμών που προσδιορίζουν την εγκυρότητα των δειγμάτων ελέγχου της δοκιμής. Μέση Τιμή Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών Για να υπολογίσετε τη μέση Ο.Π. Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών (R4), προσθέστε τις τιμές Ο.Π. από κάθε Δείγμα Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών και διαιρέστε το αποτέλεσμα με 2: (0.513 + 0.533) 2 = 0.523 Δείγμα Ασθενούς #1 Για να υπολογίσετε τον δείκτη του Δείγματος Ασθενούς #1, διαιρέστε την Ο.Π. του Δείγματος Ασθενούς #1 με τη μέση Ο.Π. του Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: 0.134 I = = 0.26 0.523 Σε αυτό το παράδειγμα, το Δείγμα Ασθενούς #1 είναι αρνητικό, εφόσον η τιμή Δείκτη 0.26 είναι < 0.50. Δείγμα Ασθενούς #2 Για να υπολογίσετε τον δείκτη του Δείγματος Ασθενούς #2, διαιρέστε την Ο.Π. του Δείγματος Ασθενούς #2 με τη μέση Ο.Π. του Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: 0.436 I = = 0.83 0.523 Σε αυτό το παράδειγμα, το Δείγμα Ασθενούς #2 είναι θετικό, εφόσον η τιμή Δείκτη 0.83 είναι 0.50. Δείγμα Ασθενούς #3 Για να υπολογίσετε τον δείκτη του Δείγματος Ασθενούς #3, διαιρέστε την Ο.Π. του Δείγματος Ασθενούς #3 με τη μέση Ο.Π. του Δείγματος Ορού Ελέγχου Οριακών Τιμών: 1.196 I = = 2.29 0.523 Σε αυτό το παράδειγμα, το Δείγμα Ασθενούς #3 είναι θετικό, εφόσον η τιμή Δείκτη 2.29 είναι 0.50. Παρακαλούμε ανατρέξτε στην Ερμηνεία Θετικών Αποτελεσμάτων στην Ενότητα 12. 13- ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 1. Μια αρνητική δοκιμασία από δείγματα ορού και/ή υγρού BAL δεν μπορεί να αποκλείσει τη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. Δείγματα ορού από ασθενείς που βρίσκονται σε κίνδυνο για Διηθητική Ασπεργίλλωση θα πρέπει να εξετάζονται δύο φορές την εβδομάδα. 2. Η μέθοδος Platelia Aspergillus Ag και ο τρόπος ερμηνείας των αποτελεσμάτων πρέπει να ακολουθούνται κατά την εξέταση δειγμάτων για την παρουσία αντιγόνου galactomannan. Ο χρήστης του kit συμβουλεύεται να διαβάσει προσεκτικά το εσώκλειστο φύλλο οδηγιών πριν από τη διεξαγωγή της δοκιμασίας. Συγκεκριμένα, η δοκιμαστική μέθοδος πρέπει να ακολουθείται προσεκτικά όσον αφορά τη μεταφορά δειγμάτων και αντιδραστηρίων με πιπέτα, την πλύση των πλακών και το χρόνο των βημάτων επώασης. 3. Η μη προσθήκη δείγματος ή αντιδραστηρίου σύμφωνα με τις υποδείξεις της μεθόδου μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητική δοκιμασία. Η επανάληψη της δοκιμασίας σε πρόσθετα δείγματα θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη όταν υπάρχει κλινική υποψία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ή διαδικαστικό σφάλμα. 4. Η πρόσμειξη βοθρίων αρνητικού δείγματος ασθενούς με βοθρία θετικού δείγματος ελέγχου/ασθενούς είναι πιθανή εάν το περιεχόμενο ενός βοθρίου χυθεί πάνω σε άλλο βοθρίο λόγω χονδροειδούς χειρισμού της μικροκυψέλης ή πλημμελούς τεχνικής κατά την προσθήκη αντιδραστηρίων με πιπέτα. 5. Η απόδοση της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag δεν έχει αξιολογηθεί με δείγματα νεογνών. Στην ευρωπαϊκή βιβλιογραφία αναφέρεται μεγαλύτερος αριθμός ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων για galactomannan σε δείγματα από πληθυσμό 13, 15, 33, 44. νεογνών 8

6. Η μέθοδος Platelia Aspergillus Ag ενδέχεται να επιδείξει μειωμένη ανίχνευση galactomannan σε ασθενείς με χρόνια κοκκιωμάτωση (CGD) και σύνδρομο του Ιώβ 56, 58. 7. Η ταυτόχρονη χρήση αντιμυκητιακής θεραπείας με ενεργούς μύκητες σε ορισμένους ασθενείς που πάσχουν από Διηθητική Ασπεργίλλωση συνεπάγεται πιθανώς μειωμένη ευαισθησία της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag 30,31. 8. Η μέθοδος Platelia Aspergillus Ag δεν έχει αξιολογηθεί για χρήση με πλάσμα ή άλλους τύπους δειγμάτων, π.χ. ούρα ή ΕΝΥ. 9. Η απόδοση της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag δεν έχει στοιχειοθετηθεί για μη αυτόματη ανάγνωση και/ή οπτικό προσδιορισμό των αποτελεσμάτων. 10. Άλλα είδη μυκήτων, όπως τα Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum και Histoplasma έχουν δείξει αντιδραστικότητα με μονοκλωνικά αντισώματα επίμυος EBA-2 τα οποία χρησιμοποιούνται στη δοκιμή για την ανίχνευση Aspergillus galactomannan. Η ιστοπλάσμωση θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σε ενδημικές περιοχές, περιλαμβανομένων τμημάτων των Ηνωμένων Πολιτειών 36, 50, 59. 11. Δεν έχει αξιολογηθεί η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα δειγμάτων υγρού BAL με Mycoplasma pneumoniae ή με αναισθητικά φάρμακα/λιπαντικά τα οποία χρησιμοποιούνται για την πρόκληση αιμωδίας στην περιοχή του αυχένα/λαιμού κατά τη διαδικασία αναρρόφησης. 12. Θετικές αντιδράσεις χωρίς κλινικά σημεία: Τα ακόλουθα θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη όσον αφορά την πρώιμη ανίχνευση αντιγόνου galactomannan στον ορό ή σε υγρό BAL πριν από την εμφάνιση κλινικών και/ή ακτινολογικών σημείων. Θετικά αποτελέσματα χωρίς κλινικά σημεία παρατηρούνται συνήθως και έχει αποδειχθεί ότι αντιστοιχούν σε "ορθώς θετικές" δοκιμασίες σε ασθενείς για τους οποίους η διάγνωση Επιβεβαιωμένης ή Πιθανολογούμενης Διηθητικής Ασπεργίλλωσης εδραιώνεται αργότερα 30. Ωστόσο, σε ορισμένες συγκεκριμένες περιπτώσεις, θα πρέπει να συνεκτιμώνται ειδικοί παράγοντες κατά την ερμηνεία της δοκιμασίας: α. Θετικά αποτελέσματα της δοκιμασίας χωρίς κλινικά σημεία έχουν αναφερθεί, ιδίως σε μικρά παιδιά 44. Αν και κάποια από αυτά τα περιστατικά σχετίζονται πιθανώς με μια πραγματική κυκλοφορία των αντιγόνων Aspergillus, τα περισσότερα μπορούν να θεωρηθούν ψευδώς θετικά 7. β. Φουρανόζες της γαλακτόζης έχουν τεκμηριωθεί σε διάφορες τροφές, κυρίως τα δημητριακά, προϊόντα από δημητριακά και κρεμώδη επιδόρπια 1, 27. Σε αντίθεση με το ανθρώπινο γάλα, τα ανθρωποποιημένα γάλατα περιέχουν συχνά υψηλές συγκεντρώσεις galactomannan 13. Ως εκ τούτου, διατροφικοί παράγοντες πρέπει να λαμβάνονται υπόψη στην ερμηνεία της πορείας της αντιγοναιμίας σε μικρά παιδιά και, γενικότερα, σε όλους τους ασθενείς με τροποποιημένο εντερικό φραγμό 6, 13. Οποιοδήποτε περιστατικό θετικής αντιγοναιμίας που δεν συνοδεύεται από κλινικά σημεία θα πρέπει να ερμηνεύεται ακόμη πιο προσεκτικά στον συγκεκριμένο πληθυσμό ασθενών. γ. Έχουν υπάρξει αναφορές θετικών αποτελεσμάτων δοκιμασίας για galactomannan σε ασθενείς που λαμβάνουν πιπερακιλλίνη/ταζοβακτάμη. Έχουν επίσης αναφερθεί ορισμένες παρτίδες πιπερακιλλίνης/ ταζοβακτάμης που βρέθηκαν θετικές για αντιγόνο galactomannan. Επομένως, τα θετικά αποτελέσματα της δοκιμασίας σε ασθενείς που λαμβάνουν πιπερακιλλίνη / ταζοβακτάμη θα πρέπει να ερμηνεύονται προσεκτικά και να επιβεβαιώνονται με άλλες διαγνωστικές μεθόδους. Ανίχνευση galactomannan έχει επίσης αναφερθεί σε κάποιες παρτίδες αμοξικιλλίνης που συνδέονταν με παρεντρικά παρασκευάσματα κλαβουλανικού οξέος. Επομένως, οι αγωγές με ημι-συνθετική β-λακτάμη θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμασίας 1, 3, 32. Εντούτοις, καθώς η μέθοδος Platelia Aspergillus Ag μπορεί να ανιχνεύσει αντιγόνο galactomannan πολύ πριν από την εμφάνιση κλινικών ή ακτινολογικών σημείων, το ενδεχόμενο εκδήλωσης Διηθητικής Ασπεργίλλωσης δεν μπορεί να αποκλειστεί. Ως εκ τούτου, οι ασθενείς που λαμβάνουν πιπερακιλλίνη/ταζοβακτάμη και έχουν θετικά αποτελέσματα στη δοκιμασία θα πρέπει να παρακολουθούνται προσεκτικά. δ. Θετικές αντιδράσεις χωρίς κλινικά σημεία είναι πιθανό να παρατηρηθούν σε ασθενείς που λαμβάνουν προϊόντα τα οποία περιέχουν galactomannan, είτε παρεντερικώς είτε από στόματος (στην περίπτωση τροποποίησης του εντερικού φραγμού). Η παρουσία galactomannan σε αυτά τα προϊόντα εξηγείται πολλές φορές από τη χρήση μιας διαδικασίας ζύμωσης που βασίζεται σε μυκητιακούς μικροοργανισμούς. Όμως, ένα θετικό αποτέλεσμα θα παρατηρηθεί σε έναν ασθενή μόνο εάν η συγκέντρωση του εξωγενούς galactomannan στον ορό φθάσει ή υπερβεί τον ουδό ανίχνευσης της δοκιμασίας. Επομένως, αν υπάρχει ύποπτο θετικό αποτέλεσμα χωρίς άλλα κλινικά σημεία, συνιστούμε τη διερεύνηση των προϊόντων που λαμβάνει ο ασθενής και κυρίως των διαδικασιών παραγωγής τους και της προέλευσης των χρησιμοποιηθέντων πρώτων υλών 14, 41, 49. 13. Έχουν υπάρξει αναφορές θετικών αντιδράσεων για galactomannan στον ορό και στο υγρό βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης οι οποίες συσχετίστηκαν με PLASMA-LYTE σε αρκετές μελέτες 14, 41. Συνεπώς, η χορήγηση PLASMA-LYTE θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά την ερμηνεία των αποτελεσμάτων αυτής της δοκιμασίας. 14. Τα αποτελέσματα της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag σε δείγματα υγρού Βρογχοκυψελιδικής Έκπλυσης (BAL) από μη ανοσοκατασταλμένους ασθενείς θα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. 37 15. Αποτελέσματα που προσεγγίζουν την οριακή τιμή δείκτη (0.5), θα πρέπει να ερμηνεύονται προσεκτικά και να υποστηρίζονται από άλλες κλινικές, ακτινολογικές ή εργαστηριακές ενδείξεις διηθητικής ασπεργίλλωσης, καθώς δεν συμπεριλαμβάνεται γκρι ζώνη στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής. 16. Περαιτέρω, τα αποτελέσματα της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag σε δείγματα υγρού Βρογχοκυψελιδικής Έκπλυσης (BAL) με δείκτη 0.5-1.0 έχουν χαμηλότερη προγνωστική αξία σε σύγκριση με αποτελέσματα δείγματος υγρού BAL με τιμές δείκτη > 1.0 και, επομένως, τα αποτελέσματα με τιμές δείκτη 0.5-1.0 θα πρέπει να ελέγχονται και να υποστηρίζονται από άλλες κλινικές, ακτινολογικές ή εργαστηριακές ενδείξεις διηθητικής ασπεργίλλωσης 8,17. 9

14-ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ I. ΟΡΟΣ Ο αναμενόμενος επιπολασμός Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό ασθενών. Έχουν αναφερθεί ποσοστά 5-20% 10, 16. Τα ακόλουθα αποτελέσματα έχουν προκύψει από κλινικές μελέτες που διεξήχθησαν σε παιδιατρικούς (ηλικία 21 έτη) ασθενείς στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε ενήλικες ασθενείς στη Βόρειο Αμερική. A-Παιδιατρικοί ασθενείς Μια κλινική μελέτη διεξήχθη σε σύνολο 1954 δειγμάτων ορού από 129 ανοσοκατασταλμένους παιδιατρικούς (ηλικία 21 έτη) ασθενείς που βρίσκονταν σε υψηλό κίνδυνο για Διηθητική Ασπεργίλλωση (IA) και σε ασθενείς με διάγνωση Επιβεβαιωμένης και Πιθανολογούμενης Διηθητικής Ασπεργίλλωσης σε τρία ερευνητικά κέντρα στις Ηνωμένες Πολιτείες, προκειμένου να εκτιμηθούν τα χαρακτηριστικά απόδοσης της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag. Η κατανομή των τιμών δείκτη για αυτούς τους πληθυσμούς φαίνεται στα ακόλουθα διαγράμματα: Παιδιατρικοί ασθενείς χωρίς διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (πληθυσμός ελέγχου) Ελήφθησαν συνολικά 1625* δείγματα ορού από 108 ανοσοκατασταλμένους παιδιατρικούς ασθενείς σε τρία ερευνητικά κέντρα στις Ηνωμένες Πολιτείες και εξετάστηκαν για να εκτιμηθούν τα χαρακτηριστικά απόδοσης της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag. Η κατανομή των τιμών δείκτη για τα δείγματα φαίνεται στο ακόλουθο διάγραμμα: Εικόνα 1 Number Αριθμός of Ορών Sera 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 584 805 0-0.1 0.1-0.2 Κατανομή των Distribution Τιμών Δείκτη of the Ορού Serum από Index τον Value Παιδιατρικό from the Πληθυσμό Pediatric Ελέγχου Control Population (N=1625) (N=1625) 145 50 16 0.2-0.3 0.3-0.4 0.4-0.5 6 2 2 0.5-0.6 0.6-0.7 0.7-0.8 2 Δείκτης Index 1 2 0.8-0.9 0.9-1.0 1.0-1.1 0 1 1 1.1-1.2 1.2-1.3 1.3-1.4 0 8 1.4-1.5 >1.5 *Σημείωση: Εξαιρέθηκαν 80 δείγματα από 4 ασθενείς ελέγχου με θετικά αποτελέσματα για αντιγόνο galactomannan που συνέπεσαν με λήψη πιπερακιλλίνης/ταζοβακτάμης (Zosyn ). Παιδιατρικοί Ασθενείς με διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης Το διάγραμμα διασποράς απεικονίζει τα αποτελέσματα της δοκιμής για 249 δείγματα ορού από 17 ασθενείς αυτής της μελέτης, οι οποίοι διαγνώσθηκαν με Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση σύμφωνα με τους ορισμούς EORTC/NIAID. Δεν αναμένεται να είναι κάθε δείγμα ορού από κάθε ασθενή θετικό. Ο αναμενόμενος επιπολασμός Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό ασθενών. Έχουν αναφερθεί ποσοστά 5-20% 10, 24. Το ποσοστό επιπολασμού σε αυτή τη μελέτη ήταν 13.6%. 10

Εικόνα 2 Δείκτης Index > 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Pediatric Παιδιατρικοί Proven/ Ασθενείς Probable με Επιβεβαιωμένη/Πιθανολογούμενη Aspergillosis: Distribution of Ασπεργίλλωση: Index/ Κατανομή Pediatric Τιμών Patient Δείκτη/Παιδιατρικό (N=17) Ασθενή (N=17) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Αριθμός Patient Ασθενούς Number B. Ενήλικες ασθενείς Μια κλινική μελέτη διεξήχθη σε σύνολο 1724 δειγμάτων ορού από 172 ασθενείς με μεταμόσχευση μυελού των οστών (BMT) και λευχαιμία, οι οποίοι διαγνώσθηκαν με και χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση σε τρία ερευνητικά κέντρα στη Βόρειο Αμερική, προκειμένου να εκτιμηθούν τα χαρακτηριστικά απόδοσης της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag. Η κατανομή των τιμών δείκτη για αυτούς τους πληθυσμούς παρουσιάζεται στα ακόλουθα διαγράμματα. Ενήλικες Ασθενείς χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση (πληθυσμός ελέγχου) Ελήφθησαν συνολικά 1262 δείγματα ορού από 143 ασθενείς με μεταμόσχευση μυελού των οστών (BMT) και λευχαιμία σε τρία ερευνητικά κέντρα στη Βόρειο Αμερική και εξετάστηκαν με τη μέθοδο Platelia Aspergillus Ag. Η κατανομή των τιμών δείκτη φαίνεται στο ακόλουθο διάγραμμα. Εικόνα 3 Αριθμός Ορών Number of Sera 800 700 600 500 400 300 200 100 0 420 0-0.1 0.1-0.2 662 Κατανομή των Distribution Τιμών Δείκτη of the Ορού Serum από Index τον Value Ενήλικο from Πληθυσμό the Adult Ελέγχου Control (N=1625) Population (N=1262) 107 40 14 0.2-0.3 0.3-0.4 0.4-0.5 5 4 4 0.5-0.6 0.6-0.7 0.7-0.8 0 Δείκτης Index 1 0 0.8-0.9 0.9-1.0 1.0-1.1 0 1 0 1.1-1.2 1.2-1.3 1.3-1.4 0 4 1.4-1.5 >1.5 11

Ενήλικες Ασθενείς με διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης Αυτό το διάγραμμα διασποράς απεικονίζει τα αποτελέσματα της δοκιμής για galactomannan για 462 δείγματα ορού από 29 ασθενείς αυτής της μελέτης, οι οποίοι διαγνώσθηκαν με Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση σύμφωνα με τους ορισμούς EORTC/NIAID. Δεν αναμένεται να είναι κάθε δείγμα ορού από κάθε ασθενή θετικό. Ο αναμενόμενος επιπολασμός Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό ασθενών. Έχουν αναφερθεί ποσοστά 5-20% 10, 24. Το ποσοστό επιπολασμού σε αυτή τη μελέτη ήταν 16.9%. Εικόνα 4 Index Δείκτης > 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Adult Ενήλικες Proven/ Ασθενείς Probable με Aspergillosis: Επιβεβαιωμένη/Πιθανολογούμενη Distribution of Ασπεργίλλωση: Index/ Κατανομή Adult Τιμών Patient Δείκτη/Ενήλικο (N=29) Ασθενή (N=29) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Αριθμός Patient Ασθενούς Number Στα ακόλουθα διαγράμματα παρουσιάζονται παραδείγματα ενός ασθενούς χωρίς κλινικά σημεία ή συμπτώματα Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (αρνητικός για Aspergillus) και ενός ασθενούς με Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση (θετικός για Aspergillus), αντίστοιχα. Εικόνα 5 Αρνητικός ασθενής Δείκτης Index 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 CONTROL Ασθενής PATIENT Ελέγχου 0 0 10 20 30 40 50 60 Ημέρες Days 12

Εικόνα 6 Θετικός ασθενής Δείκτης Index 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 PROVEN Ασθενής με INVASIVE Επιβεβαιωμένη ASPERGILLOSIS Διηθητική PATIENT Ασπεργίλλωση 0 10 20 30 40 50 60 Ημέρες Days II. ΥΓΡΟ BAL Διεξήχθησαν δύο μελέτες σε σύνολο 449 δειγμάτων υγρού BAL από 178 λήπτες Μεταμόσχευσης Συμπαγούς Οργάνου (SOT) και λήπτες μεταμόσχευσης πνεύμονος με και χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση στις Ηνωμένες Πολιτείες, προκειμένου να εκτιμηθούν τα χαρακτηριστικά απόδοσης της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag με δείγματα υγρού Βρογχοκυψελιδικής Έκπλυσης. Από αυτά, 403 δείγματα υγρού BAL προέρχονταν από 167 λήπτες μεταμόσχευσης συμπαγούς οργάνου και πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση. Επιπλέον, μια αναδρομική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε δείγματα υγρού BAL από 99 ασθενείς υψηλόυ κινδύνου, σε μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε εκτός των Ηνωμένων Πολιτειών, και στην οποία περιλαμβάνονται 58 ασθενέις με αποδεδειγμένη ή πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση. Οι αναμενόμενες τιμές σε δείγματα υγρού BAL από τον συνδυασμό ληπτών SOT και ληπτών μεταμόσχευσης πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση παρουσιάζονται στον πίνακα παρακάτω. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται κατά δείγματα από λήπτες μεταμόσχευσης με και χωρίς αποικισμό με στελέχη μυκήτων. Πίνακας 1 Αναμενόμενες Τιμές κατά Δείγμα Λήπτες SOT και Λήπτες Μεταμόσχευσης Πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση N =403 δείγματα υγρού BAL Διάγνωση N Θετικοί (%) Αρνητικοί (%) Ασθενείς ελέγχου χωρίς αποικισμό 341 11/341 (3.2%) 330/341 (96.8%) Ασθενείς ελέγχου με αποικισμό 62 12/62 (19.4%) 50/62 (80.6%) Σύνολο Ασθενών Ελέγχου 403 23/403 (5.7%) 380/403 (94.3%) Οι αναμενόμενες τιμές σε δείγματα υγρού BAL από τον συνδυασμό ληπτών SOT και ληπτών μεταμόσχευσης πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση παρουσιάζονται κατά τύπο μεταμόσχευσης στον πίνακα παρακάτω. Πίνακας 2 Αναμενόμενες Τιμές κατά Δείγμα Λήπτες SOT και Λήπτες Μεταμόσχευσης Πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση κατά Τύπο Μεταμόσχευσης N =403 δείγματα υγρού BAL Τύπος Μεταμόσχευσης N Θετικοί (%) Αρνητικοί (%) Καρδιάς 28 3/28 (10.7%) 25/28 (89.3%) Νεφρού 25 3/25 (12.0%) 22/25 (88.0%) Ήπατος 23 1/23 (4.3%) 22/23 (95.7%) Πνεύμονος 327 16/327 (4.9%) 311/327 (95.1%) Σύνολο Ασθενών Ελέγχου 403 23/403 (5.7%) 380/403 (94.3%) Επιπλέον, οι αναμενόμενες τιμές οι οποίες εκτιμήθηκαν, από ένα σύνολο 41 δειγμάτων υγρού BAL, προερχόμενα από 41 ασθενείς με αιματολογικές νόσους, χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση, παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: 13

Πίνακας 3 Εκτιμώμενες τιμές ανα δείγμα Ασθενείς με αιματολογικές νόσους χωρίς Διηθητική Ασπεργίλωση Ν=41 δείγματα υγρού BAL Διάγνωση N Θετικοί (%) Αρνητικοί (%) αθενείς ελέγχου 41 8/41 (19.5%) 33/41 (80.5%) 15- ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ A- ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΜΟΤΗΤΑ α) Μελέτες Αναπαραγωγιμότητας σε Ορό Η διακύμανση των αποτελεσμάτων της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag μεταξύ δοκιμών και εντός κάθε δοκιμής εκτιμήθηκε σε μια μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε ένα πάνελ 6 συγκεντρωτικών δειγμάτων ορού ασθενών (ένα αρνητικό, ένα χαμηλό θετικό, δύο θετικά και δύο υψηλά θετικά) που ελήφθησαν σε τρία κλινικά ερευνητικά κέντρα στη Βόρειο Αμερική. Καθένα από τα 6 μέλη του πάνελ εξετάστηκαν εις τριπλούν (x3) σε 3 διαφορετικές ημέρες, σε μια παρτίδα, σε δύο κέντρα (συνολικός αριθμός επαναλήψεων σε κάθε κέντρο = 9). Καθένα από τα 6 μέλη του πάνελ εξετάστηκαν εις διπλούν (x2) σε 3 διαφορετικές ημέρες, σε 1 παρτίδα, σε ένα τρίτο κέντρο (συνολικός αριθμός επαναλήψεων στο τρίτο κέντρο = 6). Ένας (1) χειριστής εκτέλεσε όλες τις δοκιμασίες ακριβείας σε κάθε κέντρο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τα πρότυπα του Ινστιτούτου Προτύπων Κλινικών Εργαστηρίων (Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI, πρώην Εθνική Επιτροπή Προτύπων Κλινικών Εργαστηρίων- National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Η μέση οπτική πυκνότητα (OD) και η μέση τιμή δείκτη, η τυπική απόκλιση (SD), ο επί τοις εκατό συντελεστής διακύμανσης (%CV), η ακρίβεια σε κάθε κύκλο (εντός της ίδιας δοκιμής) και σε κάθε κέντρο (μεταξύ δοκιμών) για κάθε μέλος του πάνελ σε κάθε κέντρο απεικονίζονται στους πίνακες παρακάτω. Πίνακας 4 Κέντρο 1 Μέλος Πάνελ Αρν Χαμ Θετ Θετ #1 Θετ #2 Υψ Θετ #1 Υψ Θετ #2 Αρν Έλεγχος Έλεγχος ΟΤ Θετ Έλεγχος OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Μέση τιμή 0.052 0.09 0.445 0.74 0.702 1.17 0.931 1.563 1.227 2.06 2.887 4.83 0.046 0.08 0.606 1.00 2.216 3.67 Εντός του κύκλου (στην ίδια 0.002 0.00 0.022 0.03 0.059 0.09 0.044 0.08 0.051 0.09 0.089 0.17 Μ/Ε Μ/Ε 0.02 0.03 Μ/Ε Μ/Ε δοκιμή) 1 SD %CV Μ/Ε Μ/Ε 4.8% 4.4% 8.4% 7.6% 4.7% 5.1% 4.2% 4.4% 3.1% 3.6% Μ/Ε Μ/Ε 3.7% 3.4% Μ/Ε Μ/Ε Συνολική (μεταξύ δοκιμών) 2 0.036 0.04 0.051 0.08 0.070 0.14 0.044 0.25 0.058 0.29 0.169 0.58 Μ/Ε Μ/Ε 0.102 0.03 0.317 0.12 SD %CV Μ/Ε Μ/Ε 11.5% 10.4% 10.0% 11.6% 4.7% 15.7% 4.7% 14.3% 5.9% 11.9% Μ/Ε Μ/Ε 16.9% 2.8% 14.3% 3.3% Κέντρο 2 Μέλος Πάνελ Αρν Χαμ Θετ Θετ #1 Θετ #2 Υψ Θετ #1 Υψ Θετ #2 Αρν Έλεγχος Έλεγχος ΟΤ Θετ Έλεγχος OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης N 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 3 3 6 6 3 3 Μέση τιμή 0.040 0.10 0.280 0.70 0.364 0.89 0.602 1.49 0.801 2.01 1.361 3.43 0.074 0.18 0.415 1.00 1.197 2.97 Εντός του κύκλου (στην ίδια 0.006 0.01 0.041 0.09 0.023 0.07 0.045 0.11 0.046 0.10 0.047 0.11 Μ/Ε Μ/Ε 0.00 0.01 Μ/Ε Μ/Ε δοκιμή) 1 SD %CV Μ/Ε Μ/Ε 14.5% 13.0% 6.4% 7.6% 7.5% 7.1% 5.7% 4.8% 3.5% 3.2% Μ/Ε Μ/Ε 1.1% 1.1% Μ/Ε Μ/Ε Συνολική (μεταξύ δοκιμών) 2 0.006 0.03 0.058 0.19 0.083 0.18 0.057 0.28 0.042 0.53 0.079 1.00 Μ/Ε Μ/Ε 0.094 0.01 0.068 0.54 SD %CV Μ/Ε Μ/Ε 20.8% 27.0% 22.7% 19.8% 9.5% 18.7% 5.3% 26.5% 5.8% 29.2% Μ/Ε Μ/Ε 22.7% 0.9% 5.7% 18.2% 14

Κέντρο 3 Μέλος Πάνελ Αρν Χαμ Θετ Θετ #1 Θετ #2 Υψ Θετ #1 Υψ Θετ #2 Αρν Έλεγχος Έλεγχος ΟΤ Θετ Έλεγχος OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης N 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 3 3 6 6 3 3 Μέση τιμή 0.049 0.10 0.388 0.81 0.652 1.36 0.830 1.73 1.158 2.41 2.378 4.96 0.059 0.12 0.480 1.00 1.652 3.45 Εντός του κύκλου (στην ίδια 0.003 0.01 0.009 0.02 0.082 0.17 0.068 0.14 0.094 0.20 0.126 0.25 Μ/Ε Μ/Ε 0.028 0.06 Μ/Ε Μ/Ε δοκιμή) 1 SD %CV Μ/Ε Μ/Ε 2.4% 2.4% 12.5% 12.2% 8.2% 8.2% 8.1% 8.2% 5.3% 5.1% Μ/Ε Μ/Ε 5.8% 5.8% Μ/Ε Μ/Ε Συνολική (μεταξύ δοκιμών) 2 0.012 0.03 0.078 0.13 0.068 0.15 0.104 0.25 0.082 0.15 0.111 0.34 Μ/Ε Μ/Ε 0.028 0.04 0.056 0.23 SD %CV Μ/Ε Μ/Ε 20.0% 15.8% 10.5% 11.1% 12.5% 14.3% 7.1% 6.2% 4.7% 6.8% Μ/Ε Μ/Ε 5.8% 4.1% 3.4% 6.6% Μ/Ε = μη εφαρμοζόμενο 1 NCCLS EP5-A, Τόμος 19, Αρ. 2, Σελίδα 24, Εξίσωση (C2) 2 NCCLS EP5-A, Τόμος 19, Αρ. 2, Σελίδα 25, Εξίσωση (C3) και Εξίσωση (C4) β) Αναπαραγωγιμότητα στο υγρό BAL Η διακύμανση των αποτελεσμάτων της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag μεταξύ δοκιμών και εντός κάθε δοκιμής εκτιμήθηκε σε μια μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε πάνελ 4 συγκεντρωτικών δειγμάτων υγρού BAL ασθενών εμβολιασμένων με κεκαθαρμένο galactomannan (ένα αρνητικό, ένα υψηλό αρνητικό, δύο χαμηλά θετικά και ένα μεσαίο θετικό) σε 3 ερευνητικά κέντρα (δύο κλινικά ερευνητικά κέντρα στις Η.Π.Α. και ένα εσωτερικό κέντρο). Καθένα από τα 4 μέλη του πάνελ και τα δείγματα ελέγχου εξετάστηκαν εις διπλούν (x2) σε 2 κύκλους την ημέρα, σε 5 διαφορετικές ημέρες, σε μία παρτίδα (συνολικός αριθμός αποτελεσμάτων σε κάθε κέντρο = 120). Δύο (2) χειριστές εκτέλεσαν όλες τις δοκιμασίες ακριβείας σε κάθε κέντρο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τα πρότυπα του Ινστιτούτου Προτύπων Κλινικών Εργαστηρίων (Clinical Standards Institute (CLSI) (πρώην Εθνική Επιτροπή Προτύπων Κλινικών Εργαστηρίων- National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). Η μέση οπτική πυκνότητα (OD) και η μέση τιμή δείκτη, η τυπική απόκλιση (SD), ο επί τοις εκατό συντελεστής διακύμανσης (%CV), η ακρίβεια σε κάθε κύκλο (εντός της ίδιας δοκιμής) και σε κάθε κέντρο (μεταξύ δοκιμών) για κάθε μέλος του πάνελ απεικονίζονται στον πίνακα παρακάτω: Πίνακας 5 Σύνοψη Συνδυασμού Κέντρων Σύνοψη Αρνητικό Υψηλό Αρνητικό Χαμηλό Θετικό Μεσαίο Θετικό Θετικό Δείγμα Ελέγχου Αρνητικό Δείγμα Ελέγχου N = 60 N=60 N=60 N=60 N=60 N=60 OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης Μέση τιμή 0.121 0.29 0.214 0.50 0.375 0.88 0.575 1.35 1.580 3.72 0.047 0.11 Εντός του κύκλου (στην ίδια δοκιμή) Σύνολο (μεταξύ δοκιμών). SD Μ/Ε Μ/Ε 0.037 0.103 0.035 0.078 0.029 0.067 0.111 0.265 Μ/Ε Μ/Ε %CV Μ/Ε Μ/Ε 17.4% 20.5% 9.3% 8.9% 5.0% 5.0% 7.0% 7.1% Μ/Ε Μ/Ε SD Μ/Ε Μ/Ε 0.042 0.095 0.061 0.122 0.070 0.138 0.190 0.438 Μ/Ε Μ/Ε %CV Μ/Ε Μ/Ε 19.6% 18.9% 16.2% 13.9% 12.2% 10.2% 12.0% 11.8% Μ/Ε Μ/Ε 15

B- ΔΙΑΣΤΑΥΡΟΥΜΕΝΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ Μια μελέτη για την εκτίμηση της επίδρασης ιατρικών παθήσεων εκτός της Διηθητικής Ασπεργίλλωσης που επηρεάζουν πιθανώς τα αποτελέσματα πραγματοποιήθηκε με μία παρτίδα kit Platelia Aspergillus Ag. Τα ακόλουθα δείγματα ορού εξετάστηκαν για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τη μέθοδο Platelia Aspergillus Ag. Συνολικά εξετάστηκαν 151 δείγματα ορού. Πίνακας 6 Παθολογία # Εξετασθέντων Δειγμάτων # Θετικών Ρευματοειδής παράγοντας 10 0 Θετικότητα για ANA 10 0 IgG Υπεργαμασφαιριναιμία 10 0 IgM Υπεργαμασφαιριναιμία 10 0 Καρκίνος* 11 0 Μη ιική κίρρωση (κυρίως χολική, επαγόμενη από αλκοόλ, επαγόμενη από ουσίες) 10 0 Πολλαπλές μεταγγίσεις 10 0 Πολύτοκες γυναίκες 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Ιλαρά 10 0 CMV 10 0 Σύφιλη (RPR+) 10 0 Τοξοπλάσμωση 10 0 Μυκόπλασμα 10 0 * Κύστης, μαστού (2), παχέος εντέρου, ενδομητρίου, πνεύμονος, προστάτη, νεφρού και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (3). Γ- ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΤΗ ΒΟΡΕΙΟ ΑΜΕΡΙΚΗ I. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ Κλινικές δοκιμές για την εκτίμηση της ευαισθησίας, της ειδικότητας και της προγνωστικής αξίας της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag διεξήχθησαν σε παιδιατρικούς (ηλικία 21 έτη) ασθενείς σε τρία κέντρα στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε ενήλικες ασθενείς σε τρία κέντρα στη Βόρειο Αμερική. Στις μελέτες χρησιμοποιήθηκαν 1954 δείγματα ορού συνολικά που συλλέχθηκαν από 129 παιδιατρικούς ασθενείς και 1724 δείγματα ορού συνολικά που συλλέχθηκαν από 172 ενήλικες ασθενείς από τους εξής πληθυσμούς*: Ασθενείς χωρίς σημεία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου) Ασθενείς με Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση Ασθενείς με Επιβεβαιωμένη Διηθητική Ασπεργίλλωση * Η Ομάδα Συνεργασίας για Διηθητικές Μυκητιακές Λοιμώξεις (Invasive Fungal Infection Cooperative Group, IFICG) της Ευρωπαϊκής Οργάνωσης για την Έρευνα και τη Θεραπεία του Καρκίνου (European Organization for Research and Treatment of Cancer, EORTC) και η Ομάδα Μελέτης Μυκητιάσεων (Mycosis Study Group, MSG) του Εθνικού Ινστιτούτου Αλλεργιών και Λοιμωδών Νόσων (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID) όρισαν το 2002 κριτήρια για τη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (IA) σε ασθενείς με αιματολογική κακοήθεια ή μεταμόσχευση αιμοποιητικών αρχέγονων κυττάρων. 2, ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ A. Παιδιατρικοί ασθενείς Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν ως προς την ευαισθησία των ασθενών. Η ευαισθησία εκτιμήθηκε με χρήση της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag σε τρία κέντρα σε σύνολο 17 ανοσοκατασταλμένων παιδιατρικών ασθενών με διάγνωση για Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση. Πίνακας 7 Διάγνωση Αριθμός ασθενών Ευαισθησία 95% διάστημα εμπιστοσύνης Επιβεβαιωμένη Ασπεργίλλωση 9 44.4% (4/9) 18.9-73.3% Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 8 62.5% (5/8) 30.6-86.3% Επιβεβαιωμένη και Πιθανολογούμενη 17* 52.9% (9/17) 31.0-73.8% Ασπεργίλλωση *Σημείωση: 8 από τους 17 ασθενείς είχαν αρνητικά αποτελέσματα για το αντιγόνο Aspergillus galactomannan. Και οι 8 ασθενείς με αρνητικά αποτελέσματα για αντιγόνο Aspergillus galactomannan έλαβαν θεραπεία με πολλαπλούς αντιμυκητιακούς παράγοντες. Η ταυτόχρονη χρήση αντιμυκητιακής θεραπείας με ενεργούς μύκητες σε ορισμένους ασθενείς που πάσχουν από Διηθητική Ασπεργίλλωση συνεπάγεται πιθανώς μειωμένη ευαισθησία 31. 16

B. Ενήλικες ασθενείς Η ευαισθησία εκτιμήθηκε με χρήση της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag σε τρία κέντρα σε σύνολο 29 ενηλίκων ασθενών με Μεταμόσχευση Μυελού των Οστών (BMT) και λευχαιμία και διάγνωση για Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση. Πίνακας 8 ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ A. Παιδιατρικοί ασθενείς Ειδικότητα σε παιδιατρικούς ασθενείς Η ειδικότητα εκτιμήθηκε με χρήση της μεθόδου Platelia Aspergilllus Ag σε τρία κέντρα σε σύνολο 108* ανοσοκατασταλμένων παιδιατρικών ασθενών που δεν εμφάνιζαν σημεία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου). Πίνακας 9 *Σημείωση: Εξαιρέθηκαν 4 ασθενείς με θετικά αποτελέσματα για αντιγόνο galactomannan που συνέπεσαν με λήψη πιπερακιλλίνης/ταζοβακτάμης. Ειδικότητα σε δείγματα παιδιατρικών ασθενών Η ειδικότητα εκτιμήθηκε με χρήση της μεθόδου Platelia Aspergilllus Ag σε τρία κέντρα σε σύνολο 1625* δειγμάτων που ελήφθησαν από 108 ανοσοκατασταλμένους παιδιατρικούς ασθενείς που δεν εμφάνιζαν σημεία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου). Πίνακας 10 Κέντρο Αριθμός δειγμάτων Ειδικότητα 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1 794 98.9% (785/794) 97.9-99.4% 2 731 97.8% (715/731) 96.5-98.6% 3 100 100% (100/100) 96.3-100% Συνδυασμός Κέντρων 1625 98.5% (1600/1625) 97.7-99.0% *Σημείωση: Εξαιρέθηκαν 80 δείγματα από 4 ασθενείς με θετικά αποτελέσματα για αντιγόνο galactomannan που συνέπεσαν με λήψη πιπερακιλλίνης/ταζοβακτάμης. B. Ενήλικες ασθενείς Ειδικότητα σε ενήλικες ασθενείς Η ειδικότητα εκτιμήθηκε με χρήση της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag σε τρία κέντρα σε σύνολο 143 ενήλικων ασθενών με Μεταμόσχευση Μυελού των Οστών (BMT) και λευχαιμία οι οποίοι δεν εμφάνιζαν σημεία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου). Πίνακας 11 Διάγνωση Αριθμός ασθενών Ευαισθησία 95% διάστημα εμπιστοσύνης Επιβεβαιωμένη Ασπεργίλλωση 11 81.8% (9/11) 52.3-94.9% Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση Επιβεβαιωμένη και Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση Κέντρο Αριθμός ασθενών Ειδικότητα 18 77.8% (14/18) 54.8-91.0% 29 79.3% (23/29) 61.6-90.2% 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1 44 86.4 % (38/44) 73.3-93.6% 2 59 86.4 % (51/59) 75.5-93.0% 3 5 100% (5/5) 56.6-100% Συνδυασμός Κέντρων 108 87.0% (94/108) 79.4-92.1% Κέντρο Αριθμός ασθενών Ειδικότητα 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1 28 78.6% (22/28) 60.5-89.8% 2 77 93.4% (71/77) 84.0-96.4% 3 38 89.5% (34/38) 75.9-95.8% Συνδυασμός Κέντρων 143 88.8% (127/143) 82.6-93.0% 17

Ειδικότητα σε δείγματα ενήλικων ασθενών Η ειδικότητα εκτιμήθηκε με χρήση της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag σε τρία κέντρα σε σύνολο 1262 δειγμάτων που ελήφθησαν από 143 ενήλικες ασθενείς με Μεταμόσχευση Μυελού των Οστών (BMT) και λευχαιμία οι οποίοι δεν εμφάνιζαν σημεία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου). Πίνακας 12 Κέντρο Αριθμός δειγμάτων Ειδικότητα 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1 349 98.0% (342/349) 95.9-99.0% 2 560 98.6% (552/560) 97.2-99.3% 3 353 98.9% (349/353) 97.1-99.6% Συνδυασμός Κέντρων 1262 98.5% (1243/1262) 97.7-99.0% ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΞΙΑ Η θετική και αρνητική προγνωστική αξία αναλύθηκαν για τον πληθυσμό ασθενών σε αυτή τη μελέτη. Βάσει του πραγματικού μέσου ποσοστού επιπολασμού της τάξεως του 13,6% σε παιδιατρικούς ασθενείς και 16,9% σε ενήλικες ασθενείς που παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη, η θετική και η αρνητική προγνωστική αξία υπολογίστηκαν ως εξής: A. Παιδιατρικοί ασθενείς Επιπολασμός Μελέτης 13.6% PPV: 39.1% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 22.2-59.2% NPV: 92.2% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 85.3-96.0% B. Ενήλικες ασθενείς Επιπολασμός Μελέτης 16,9% PPV: 59.0% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 43.4-72.9% NPV: 95.5% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 90.5-97.9% Ο αναμενόμενος επιπολασμός Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό ασθενών. Έχουν αναφερθεί ποσοστά 5-20% 10, 24. Για πληθυσμούς ασθενών στο κατώτερο άκρο του δημοσιευμένου επιπολασμού, ο θετικός και αρνητικός επιπολασμός υπολογίστηκαν εκ νέου χρησιμοποιώντας ποσοστό επιπολασμού 5%. A. Παιδιατρικοί ασθενείς Υπολογισμένος Επιπολασμός 5% PPV: 17.6% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 6.5-39.8% NPV: 97.2% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 92.1-99.1% B. Ενήλικες ασθενείς Υπολογισμένος Επιπολασμός 5% PPV: 27.2% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 13.7-46.7% NPV: 98.8% 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης: 95.4-99.7% II. ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΥΓΡΟΥ BAL- ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου Platelia Aspergillus Ag με δείγματα υγρού BAL εκτιμήθηκαν σε δύο μελέτες στις Ηνωμένες Πολιτείες, σε 116 δείγματα από 62 λήπτες μεταμόσχευσης συμπαγούς οργάνου και 333 δείγματα από 116 λήπτες μεταμόσχευσης πνεύμονος, καθώς και σε μια μελέτη εκτός Ηνωμένων Πολιτειών σε 99 δείγματα από 99 υψηλού κινδύνου ασθενείς αιματολογικού με ή χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση. A.ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Η ευαισθησία εκτιμήθηκε σε λήπτες μεταμόσχευσης συμπαγούς οργάνου και σε λήπτες μεταμόσχευσης πνεύμονος οι οποίοι είχαν διαγνωσθεί με Διηθητική Ασπεργίλλωση σύμφωνα με τα κριτήρια EORTC/MSG. I. Λήπτες μεταμόσχευσης συμπαγούς οργάνου με Διηθητική Ασπεργίλλωση Από σύνολο 116 δειγμάτων από 62 λήπτες μεταμόσχευσης συμπαγούς οργάνου σε μία μελέτη, η ευαισθησία εκτιμήθηκε σε 5 λήπτες που είχαν διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης, όπως φαίνεται στον πίνακα παρακάτω. 18

Πίνακας 13 Ευαισθησία με Bio-Rad Platelia Aspergillus Ag Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση σε Λήπτες Μεταμόσχευσης Συμπαγούς Οργάνου κατά Ασθενή Διάγνωση N Δείκτης 0.5 Ευαισθησία 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Επιβεβαιωμένη Ασπεργίλλωση 2 2 2/2 (100%) 34.2-100% Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 3 3 3/3 (100%) 43.8-100% Επιβεβαιωμένη και Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 5 5 5/5 (100%) 56.5-100% Πίνακας 14 Ευαισθησία με Bio-Rad Platelia Aspergillus Ag Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση σε Λήπτες Μεταμόσχευσης Συμπαγούς Οργάνου κατά Τύπο Μεταμόσχευσης 95% Διάστημα Τύπος Μεταμόσχευσης N Δείκτης 0.5 Ευαισθησία Εμπιστοσύνης II. Λήπτες μεταμόσχευσης πνεύμονος με Διηθητική Ασπεργίλλωση Από σύνολο 333 δειγμάτων από 116 λήπτες μεταμόσχευσης πνεύμονος σε μια άλλη μελέτη, η ευαισθησία εκτιμήθηκε σε 6 λήπτες που διαγνώσθηκαν με Διηθητική Ασπεργίλλωση, όπως φαίνεται στον πίνακα παρακάτω. Πίνακας 15 Ευαισθησία με Bio-Rad Platelia Aspergillus Ag Επιβεβαιωμένη ή Πιθανολογούμενη Διηθητική Ασπεργίλλωση σε Λήπτες Μεταμόσχευσης Πνεύμονος κατά Ασθενή ΙΙΙ. Ασθενείς με αιματολογικές νόσους και Διηθητική Ασπεργίλλωση Η ευαισθησία επιπλέον αξιολογήθηκε από μια τρίτη μελέτη 58 δειγμάτων από 58 ασθενείς με αιματολογικές νόσους διαγνοσμένους με Διηθητική Ασπεργίλλωση όπως φαίνεται και στον παρακάτω πίνακα. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε μια αναδρομική ανάλυση σε δείγματα υγρού BAL από αιματολογικούς ασθενείς υψηλού κινδύνου, με το αντιδραστήριο Platelia TM Aspergillus EIA, σε υγρό BAL. 29. Table 16 Καρδιάς 1 1 1/1 (100%) 20.6-100% Νεφρού 3 3 3/3 (100%) 43.8-100% Ήπατος 1 1 1/1 (100%) 20.6-100% Σύνολο 5 5 5/5 (100%) 56.5-100% Διάγνωση N Δείκτης 0.5 Ευαισθησία 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Επιβεβαιωμένη Ασπεργίλλωση 2 1 1/2 (50.0%) 9.4-90.6% Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 4 3 3/4 (75.0%) 30.0-96.4% Επιβεβαιωμένη και Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 6 4 4/6 (66.7%) 30.0-90.3% Διάγνωση N Δείκτης 0.5 Ευαισθησία 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Επιβεβαιωμένη Ασπεργίλλωση 31 31 31/31 (100%) 89.0-100% Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 27 26 26/27 (96.3%) 81.7-99.3% Επιβεβαιωμένη και Πιθανολογούμενη Ασπεργίλλωση 58 57 57/58 (98.3%) 90.8-99.7% B. ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Η ειδικότητα εκτιμήθηκε σε σύνολο 98 δειγμάτων υγρού BAL από 57 λήπτες SOT και 305 δείγματα υγρού BAL από 110 λήπτες μεταμόσχευσης πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση και παρατίθεται στον πίνακα παρακάτω. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται κατά δείγματα από λήπτες μεταμόσχευσης με και χωρίς αποικισμό με στελέχη μυκήτων. 19

Πίνακας 17 Ειδικότητα κατά Δείγμα Λήπτες SOT και Λήπτες Μεταμόσχευσης Πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση N =403 δείγματα υγρού BAL Δείκτης 95% Διάστημα Διάγνωση N Αρνητικοί (%) < 0.5 Εμπιστοσύνης Ασθενείς ελέγχου χωρίς αποικισμό 341 330 330/341 (96.8%) 94.3-98.2% Ασθενείς ελέγχου με αποικισμό 62 50 50/62 (80.6%) 69.1-88.6% Σύνολο Ασθενών Ελέγχου 403 380 380/403 (94.3%) 91.6-96.2% Η ειδικότητα σε δείγματα υγρού BAL από τον συνδυασμό ληπτών SOT και ληπτών μεταμόσχευσης πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση παρουσιάζεται κατά τύπο μεταμόσχευσης στον πίνακα 18 παρακάτω. Πίνακας 18 Ειδικότητα κατά Δείγμα Λήπτες SOT και Λήπτες Μεταμόσχευσης Πνεύμονος χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση κατά Τύπο Μεταμόσχευσης N =403 δείγματα υγρού BAL Τύπος Μεταμόσχευσης Η ειδικότητα υπολογίστηκε από ένα σύνολο 41 δειγμάτων υγρού BAL από ασθενείς με αιματολογικές νόσους, χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση και παρουσιιάζεται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 19 Ειδικότητα ανα Δείγμα Ασθενείς Αιματολογικών Νόσων χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση. Ν=41 N Δείκτης < 0.5 Αρνητικοί (%) 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης Καρδιάς 28 25 25/28 (89.3%) 72.8-96.3% Νεφρού 25 22 22/25 (88.0%) 70.0-95.8% Ήπατος 23 22 22/23 (95.7%) 79.0-99.2% Πνεύμονος 327 311 311/327 (95.1%) 92.2-97.0% Σύνολο Ασθενών Ελέγχου 403 380 380/403 (94.3%) 91.6-96.2% Δείκτης 95% Διάστημα Διάγνωση N Αρνητικοί (%) < 0.5 Εμπιστοσύνης αθενείς ελέγχου 41 33 33/41 (80.5%) 66.0 89.8% 16- ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath. 1997. Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40 : p. 353-7. 2. Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin.Infect.Dis. 34 : p. 7-14. 3. Aubry, A., R. Porcher. J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian 2006. Occurrence and Kinetics of False-Positive Aspergillus GalactomannanTest Results following Treatment with β-lactam Antibiotics in Patients with Hematological Disorders. J. Clin. Microbiol. 44: p. 389-394. 4. Barnes P. D. and K. A. Marr. 2007 Risks, diagnosis and outcomes of invasive fungal infections in haemotopoeitic stem cell transplant recipients. Brit. Journ. Haemotol. 139: p. 519-531. 5. Becker M. J., E. J. Lugtenburg. J. J. Cornelissen, C. V.D. Schee, H. C. Hoogsteden and S. D. Marie. 2003 Galactomannan detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haemotological patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br. J. Haemotol. 121(3): p. 448-457. 6. Blijevens, N. M., J. P. Donelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 2002 Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haemotopoietic stem cell transplant receipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p. 64-65. 7. Chambon-Pautas, C.,J. M. Costa, M.T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 2001 Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p. 213-214. 8. Clancy C., R. A. Jaber, H. L. Leather, J. R. Wingard, B. Staley, J. L. Wheat, C. Cline, K. H. Rand, D. Schain, M. Baz and M. H. Nyugen. 2007 Bronchoalveolar Lavage Galactomannan in Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis among Solid-Organ Transplant Recipients. J. Clin. Microbiol. 45(6): p. 1759-1765. 9. de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews. 1994. Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J Med Vet Mycol 32: p. 239-252. 20