ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΚΟΥΡΤΙΔΗΣ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ-ΓΕΝΕΤΙΣΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΣΥΝΘΑΣΩΝ ΤΟΥ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ CD44 ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΟΓΚΩΝ ΟΡΧΕΩΝ ΠΑΤΡΑ 2011 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΕΟΧΑΡΗΣ ΑΧΙΛΛΕΑΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ 1

2

Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών του Τμήματος Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών με τίτλο Εφαρμοσμένη Βιοχημεία-Βιοτεχνολογία. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΘΕΟΧΑΡΗΣ ΑΧΙΛΛΕΑΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) 2. ΒΥΝΙΟΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ 3. ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ 3

4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 9 ABSTRACT 13 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 17 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 27 1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ 29 1.1. ΔΙΗΘΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ 31 1.2. ΚΑΛΟΗΘΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΕΙΣ ΟΓΚΟΙ 32 2. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ 32 3. ΝΕΟΠΛΑΣΙΑ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ 35 3.1. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ 36 3.2. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ ΚΑΤΑ WHO 36 3.2.1. ΑΙΤΙΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ- ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ 39 3.4. ΙΣΤΟΓΕΝΕΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩN ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ- ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ 40 3.5. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ 42 3.6. ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ 47 3.7. ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΑ 49 3.7.1.ΟΓΚΟΙ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 50 3.7.2.ΟΓΚΟΙ ΤΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΓΟΝΑΔΩΝ 52 3.8. ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ-ΕΞΕΛΙΞΗ 53 3.9. ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ-ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 54 4. ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΣ ΧΩΡΟΣ 55 4.1. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΥ ΧΩΡΟΥ 56 4.2. ΤΟ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ. 57 4.3. ΣΥΝΘΑΣΕΣ ΤΟΥ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΔΑΣΕΣ 58 4.4. CD44: ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΟΥ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ 60 4.4.1 ΔΟΜΗ ΤΟΥ CD44 61 4.4.2 ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ CD44. 62 4.4.3 ΠΡΟΣΔΕΤΕΣ ΤΟΥ CD44 63 5

4.5. ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΚΑΙ ΤΟΥ CD44 ΣΤΗΝ ΟΓΚΟΓΕΝΕΣΗ 64 4.5.1 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΗΑ 64 4.5.2 ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΗΑ ΣΤΗΝ ΟΓΚΟΓΕΝΕΣΗ 66 4.5.3 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΗΑ ΣΤΗΝ ΟΓΚΟΓΕΝΕΣΗ 70 ΣΚΟΠΟΣ 73 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 77 1. ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ 79 1.2. ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ 79 2. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ 80 2.1 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ 80 3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ RNA ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ CD44 ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΥΝΘΑΣΩΝ ΤΟΥ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΜΕ RT-PCR 80 3.1 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ RNA 80 3.2. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ cdna. 82 3.3. ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ 82 3.4. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ 84 3.5. ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ 85 3.6. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ PCR ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ 85 4. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 86 4.1ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ SDS (SDS-PAGE) 87 5. ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 88 5.1ΑΝΑΣΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ CD44 ME WESTERN BLOTTING 88 6. ΑΝΟΣOΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΧΡΩΣΗ ΤΟΥ CD44 89 6.1 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 90 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. 93 1.ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ CD44 ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕIΡΕΣ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ ΟΡΧΕΩΝ ΜΕ RT-PCR 95 1.1ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ CD44s ΙΣΟΜΟΡΦΗΣ 95 1.2 AΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΤΗΣ CDs 96 6

1.3ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΟΥ CD44 97 1.4ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ CD44 ΜΕ ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ 105 1.5ΑΝΟΣΟΙΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ CD44 ΣΕ ΟΓΚΟΥΣ ΟΡΧΕΩΝ 106 2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΣΥΝΘΑΣΩΝ ΤΟΥ ΗΑ 106 ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 109 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 115 7

8

ΠΕΡΙΛΗΨΗ 9

10

Η νεοπλασία των όρχεων, αν και σχετικά αποτελεί μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1-2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα), είναι ο πιο συχνός όγκος στις ηλικίες 20-40 ετών, αποτελώντας την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Η αλληλεπίδραση των κυττάρων με άλλα κύτταρα ή με συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, καθώς και η μετακίνηση στο ενδοθήλιο των αρτηριών και στο εξωφλεβικό ιστό, είναι εξαρτημένη από την ενεργότητα των μορίων προσκόλλησης όπως οι ιντεγκρίνες, οι σελεκτίνες και μέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, καντχερίνες και ο CD44. Ο CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Η ισομορφή που δεν περιέχει ενδιάμεσα εξώνια ονομάζεται CD44s, ενώ όλες οι υπόλοιπες ισομορφές προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δέκα διαφορετικών εξωνίων, παράγοντας πληθώρα διαφορετικών μορίων του CD44. Πληθώρα μελετών υποστηρίζει ότι ο μεμβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισομορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει με το ΗΑ, ενώ κάποιες ισομορφές όπως η CD44v5, CD44v6, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιθετικότητα μερικών τύπων καρκίνου. Η έκφραση του CD44 έχει μελετηθεί μερικώς στους όγκους όρχεων και έχουν δημοσιευθεί αντικρουόμενα ευρήματα, ενώ δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για την έκφραση των ενζύμων που συνθέτουν το ΗΑ. Στόχος της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν να διερευνηθεί η έκφραση των ισομορφών του CD44 και των συνθασών του ΗΑ σε τρεις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων (Σεμίνωμα, Εμβρυϊκό καρκίνωμα, Τερατοκαρκίνωμα). Η μελέτη του υποδοχέα CD44 πραγματοποιήθηκε με RT-PCR και ανοσοαποτύπωση. Σε επίπεδο mrna βρέθηκε πως η κύρια ισομορφή του CD44 που εκφράζεται στο σεμίνωμα καθώς και σε μησεμινωματώδεις όγκους είναι η ισομορφή CD44s. Ακόμη στην κυτταρική σειρά σεμινώματος όρχεων εκφράζονται και άλλες ισομορφές, κυρίως όμως εκφράζονται οι ισομορφές CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και CD44v10. Στις κυτταρικές σειρές μη σεμινωματωδών όγκων (εμβρυϊκό καρκίνωμα και τερατοκαρκίνωμα) εκτός της CD44s ισομορφής που είναι η κυρίαρχη ισομορφή εκφράζονται και κάποιες άλλες ισομορφές του CD44. Στο εμβρυϊκό καρκίνωμα εκφράζονται οι ισομορφές CD44v5,v8, CD44v9-v10 και 11

CD44v10, ενώ στο τερατοκαρκίνωμα παρατηρείται η έκφραση κυρίως της CD44v5,v8, ενώ εκφράζονται και οι CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και η CD44v10. Η μελέτη του CD44 σε επίπεδο πρωτεΐνης με το αντίσωμα Hermes-3 κατέδειξε πως η κύρια ισομορφή που εκφράζεται στην κυτταρική σειρά σεμινώματος είναι η CD44s με μοριακό βάρος~90kda. Ακόμα φάνηκε πως υπάρχει έκφραση και κάποιων ισομορφών και θραυσμάτων του CD44 με μικρότερο μοριακό μέγεθος. Αντίθετα στις κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκίνωματος και τερατοκαρκινώματος παρατηρήθηκε η έκφραση μόνο της CD44s ισομορφής. Αντίθετα με την υψηλή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά σεμινώματος, παρατηρήθηκε μικρή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά εμβρυϊκού καρκινώματος και μια ελάχιστη έκφραση στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος. Η μελέτη του υποδοχέα CD44 σε επίπεδο ιστού έδειξε ότι η πρωτεΐνη του CD44 εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου. Η σηματοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήμα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυμα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισομορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α, και HAS-3β. Στα πλαίσια της μεταπτυχιακής διατριβής βρέθηκε πως η κυτταρική σειρά σεμινώματος εκφράζει μόνο την ισομορφή HAS-3α, ενώ οι κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκινώματος και τερατοκαρκινώματος εμφανίζουν ισχυρή έκφραση της ισομορφής HAS-3α και μικρή έκφραση της HAS-2. 12

ABSTRACT 13

14

Testicular tumors are present in men aged 15-35 years with increasing incidence in the last 40 years. Approximately 95% of these tumors arise from germ cells. The interaction of cells with other cells or with components of the extracellular matrix (ECM), as well as their locomotion on blood vessel endothelium and extravascular tissue, are substantially dependent on the activity of adhesion molecules such as integrins, selectins, members of the immunoglobulin superfamily, addressins, cadherins, and CD44. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The isoform with no variant exons is named CD44s, whereas the other isoforms arise from alternative splicing of the 10 variant exons of the CD44 mrna, producing a huge variety of diverse CD44 molecules. A lot of studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger fuctions in tumour cells, which conduce to the disease progression. The major isoform is the CD44s which is expressed widely in tissues, whereas is overexpressed in several types of tumours,coexisting with HA. The expression of CD44 has been partly studied in testicular tumours but controversial findings have been published, whereas no data about the enzymes which synthesize HA are available. The aim of this thesis was to examine the expression of CD44 isoforms and HA synthases in three cell lines (seminoma, embryonic carcinoma, teratocarcinoma). The study of CD44 was conducted by RT-PCR analysis and western blotting. It was found that in mrna level, the major isoform that is expressed in seminoma and nonseminomas is the CD44s isoform. Moreover, in seminoma cell line, other isoforms are also expressed, namely CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. In nonseminomas cell lines CD44s is expressed as the major isoform, but also other isoforms are expressed. CD44v5,v8, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms are expressed in embryonic carcinoma, whereas in teratocarcinoma the expression mainly of the CD44v5,v8 isoform is observed, together with CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. The study of CD44 in protein level conducted by western blotting using the monoclonal antibody Hermes-3. It was shown that the major isoform expressed in seminoma cell line is CD44s with a molecular mass approximately 90kDa. Moreover it was shown that other CD44 isoforms and CD44 fragments with smaller molecular mass are expressed. On the other hand, in embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines, the 15

expression only of CD44s isoform was observed. The study of CD44 in tissue level revealed that CD44protein is expressed in tumour cells. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and represent three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. The findings of this study revealed that seminoma cell line express only HAS-3a isoform, whereas embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines showed high expression of HAS-3a isoform and low expression of HAS-2 isoform. 16

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΕΠΕΞΗΓΗΣΕΙΣ 17

18

A ABC ABP AFP ΑΚΤ AMH Asn bfgf β-hcg C CaMKII cdna CEA CS CS/DSPGs DAB D-ClcA DNA dntps DS ECM EDTA EGF EGFR EMA ΕΜΤ ERK FAK FBS FGF FSH G GAG Αδενίνη Κασέττα δέσμευσης με ATP Πρωτεΐνη ενωμένη με ανδρογόνα Άλφα εμβρυϊκή πρωτεΐνη Πρωτεϊνική κινάση Β Ορμόνη κατά των πόρων του Muller Ασπαραγίνη Βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών Βήτα υπομονάδα της χοριακής γοναδοτροπίνης Κυτοσίνη Aσβέστιο / καλμοντουλίνη εξαρτώμενη κινάση ΙΙ Συμπληρωματικό δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο Θειϊκή χονδροϊτίνη Πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης / θειϊκής δερματάνης Διαμινοβενζιδίνη D-Γλυκουρονικό οξύ Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια Θειϊκή δερματάνη Εξωκυττάριος χώρος Αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό οξύ Επιδερμικός αυξητικός παράγοντας Υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα Επιθηλιακό μεμβρανικό αντιγόνο Μετάπτωση από τον επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο Κινάση ρυθμιζόμενη από εξωκυττάριο σήμα Κινάση εστιακής προσκόλλησης Βόειος εμβρυϊκός ορός Αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών Θυλακιότροπος ορμόνη Γουανίνη Γλυκοζαμινογλυκάνη 19

Gal Γαλακτόζη GalNAc Ν-ακετυλο-γαλακτοζαμίνη GAPDH Αφυδρογονάση της 3 φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης GdnHCl Υδροχλωρική γουανιδίνη GlcNAc Ν-ακετυλο-γλυκοζαμίνη Gly Γλυκίνη GPI Γλυκοζυλφωσφατιδυλοϊνοσιτόλη GTP Τριφωσφορική γουανιδίνη HA Υαλουρονικό οξύ HAS Συνθάσες του υαλουρονικού οξέος HGF Ηπατοκυτταρικός αυξητικός παράγοντας hnrna Ετεροπυρηνικό ριβονουκλεϊκό οξύ HP Ηπαρίνη HS Θειϊκή ηπαράνη HSPGs Πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης HYAL Υαλουρονιδάση IGCNU Αταξινόμητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία εκ βλαστικών κυττάρων IGF Αυξητικός παράγοντας ινσουλίνης IL-5, Ιντερλευκίνη -5 IFN- Iντερφερόνη-γ kda 10 3 x 1/12 της μάζας του ατόμου του ισοτόπου 12 C KS Θειϊκή κερατάνη KSPGs Πρωτεογλυκάνες θειϊκής κερατάνης LDH Γαλακτική αφυδρογονάση LDL Λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας LH Ωχρινότροπος ορμόνη L-IdoA L-Ιδουρονικό οξύ MAPKs Πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνα mirna Μικροριβονουκλεϊκό οξύ MMPs Μεταλλοπρωτεάσες του εξωκυττάριου χώρου MMP-2 Μεταλλοπρωτεάση-2 του εξωκυττάριου χώρου MMP-9 Μεταλλοπρωτεάση-9 του εξωκυττάριου χώρου mrna Αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊκό οξύ 20

ΜΤ1-ΜΜΡ Μεμβρανικού τύπου-1 μεταλλοπρωτεάση του εξωκυττάριου χώρου NEM Ν-αιθυλο-μηλεϊνιμίδιο NF-κB Πυρηνικός παράγοντας κb PAPS 3 φωσφοαδενοσινο-5 -φωσφοθειΐκό PBS 80 mm Na2HPO4-20 mm NaH2PO4-0.15 M NaCl, ph 7.4 PDGF Αυξητικός παράγοντας αιμοπεταλίων PDGFR Υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα αιμοπεταλίων PG Πρωτεογλυκάνη PI3K Κινάση της φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης-3 PKCα Πρωτεϊνική κινάση Cα PKCδ Πρωτεϊνική κινάση Cδ PLAP Πλακουντιακή αλκαλική φωσφατάση PMSF Φαινυλο-μεθανο-σουλφονυλο-φθορίδιο PVDF Φθοριούχο πολυβινυλιδένιο RGD Αλληλουχία αργινίνης-γλυκίνης-ασπαραγίνης RNA Ριβονουκλεϊκό οξύ RΝases Ριβονουκλεάσες rrna Ριβοσωμικό ριβονουκλεϊκό οξύ RT-PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - αντίστροφης μεταγραφάσης Ser Σερίνη SDS Θειϊκό δωδεκυλικό νάτριο SDS-PAGE Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS T Θυμίνη Τ1/2 Ημιπερίοδος ζωής TBE Διάλυμα Tris 0.22M-Βορικό O.22M-EDTA 5mM ph 8.0 TGCTs Όγκοι όρχεων προερχόμενοι από βλαστικά κύτταρα TGF-β Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β Thr Θρεονίνη TIMPs Αναστολείς των μεταλλοπρωτεασών TNF-a Παράγοντας νέκρωσης όγκου Tris-HCl Υδροχλωρικό τρις-υδροξυ-μεθυλο-αμινο-μεθάνιο Triton X-100 Ισοοκτυλ-φαινοξυ-πολυαιθοξυ-αιθανόλη 21

trna Tween-20 VEGF VEGFR-2 WHO Μεταφορικό ριβονουκλεϊκό οξύ Πολυοξυαιθυλενο-σορβιταν-μονολεϊκός αιθέρας Αυξητικός παράγοντας αγγειακού ενδοθηλίου Υποδοχέας τύπου-2 του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας 22

ΠΡΟΛΟΓΟΣ 23

24

Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσοι βοήθησαν στην εκπόνηση της μεταπτυχιακής μου διατριβής και στην απονομή του τίτλου ειδίκευσης στο μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών του τμήματος Χημείας με τίτλο Εφαρμοσμένη Βιοχημεία-Βιοτεχνολογία. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα Καθηγητή μου κ. Θεοχάρη Αχιλλέα, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημείας Πατρών, για την επιστημονική καθοδήγηση και την πολύτιμη βοήθειά του στην πειραματική όσο και συγγραφική περαίωση της μεταπτυχιακής διατριβής. Ακόμη θα ήθελα να τονίσω την αμέριστη συμπαράσταση του, τόσο σε επιστημονικό, όσο και σε διαπροσωπικό επίπεδο. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Καθηγητές Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας κ. Ν. Καραμάνο και κ. Δ. Βύνιο, μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής, για την πολύτιμη βοήθεια τους, τόσο με τις διαλέξεις τους στα μεταπτυχιακά μαθήματα όσο και για τις πολύτιμες συμβουλές τους σε οποιοδήποτε πρόβλημα παρουσιάστηκε κατά την διάρκεια του μεταπτυχιακού κύκλου σπουδών. Ιδιαίτερες ευχαριστίες σε όλους τους συναδέρφους του εργαστηρίου, για την ζεστή επικοινωνία και συνεργασία που είχαμε κατά την διάρκεια της παραμονής μου στο εργαστήριο. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα του τμήματος Χημείας κ. Μήλια Ελένη για την ουσιώδη προσφορά της, χωρίς την οποία θα ήταν αδύνατη η εκπόνηση της μεταπτυχιακής διατριβής. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω τις υποψήφιες διδάκτορες του τμήματος Χημείας κ. Κορπεντίνου Αγγελική και κ. Μπούγα Ελένη καθώς και τον διδάκτορα του Τμήματος κ. Σκλήρη Αντώνη για την πολύτιμη βοήθειά τους. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου και ιδιαίτερα τον πατέρα μου, Δημήτρη για την στήριξη που μου έχει προσφέρει όλα αυτά τα χρόνια της πανεπιστημιακής και επιστημονικής περιπλάνισης, ελπίζοντας αυτή η περιπλάνιση να είναι κύριο εφόδιο τόσο στην επαγγελματική όσο και στην προσωπική πορεία μου. 25

26

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 27

28

1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Οι κακοήθεις νόσοι συμπεριλαμβάνονται στις κυριότερες αιτίες νοσηρότητας και θνητότητας στις ανεπτυγμένες χώρες και για το λόγο αυτό, η έρευνα για την παθογένεια και τη θεραπεία τους ελκύει παγκοσμίως το ενδιαφέρον των ερευνητών. Η κυτταρική διαίρεση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι φυσιολογικές λειτουργίες που λαμβάνουν χώρα σε όλους σχεδόν τους ιστούς. Προκειμένου να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα των οργάνων και των ιστών απαιτείται αυστηρή ρύθμιση μεταξύ πολλαπλασιασμού και προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση). Ο όρος καρκίνος συμπεριλαμβάνει μεγάλη ποικιλία κακοηθών νόσων που προκύπτουν, εξαιτίας της απώλειας στην ικανότητα ρύθμισης της ανάπτυξης και διαίρεσης των κυττάρων ενός ιστού και έχουν ως αποτέλεσμα τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων. Η παθογένεια του καρκίνου αποδίδεται σε γενετικές αλλαγές στο DNA των σωματικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ζωής του ατόμου που προκαλούνται, υπό την επίδραση ποικίλων παραγόντων (περιβαλλοντικών, διατροφικών, χημικών, φαρμακευτικών). Στην περίπτωση που οι βλάβες αφορούν το γονδίωμα των γενετικών κυττάρων, το γενετικό σφάλμα μεταβιβάζεται στους απογόνους. Οι γενετικές αλλαγές θα προκαλέσουν ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, με αποτέλεσμα αρχικά τη δημιουργία μορφώματος και αργότερα ενός συμπαγούς όγκου ή νεοπλάσματος. Η καρκινογένεση είναι μια διαδικασία κατά την οποία ο ρυθμός κυτταρικής διαίρεσης έχει διαταραχθεί λόγω βλάβης του DNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ταχεία κυτταρική ανάπτυξη δεν είναι συνώνυμη της κακοήθειας και παρατηρείται σε φυσιολογικές καταστάσεις, όπως η επούλωση τραύματος ή κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης ή. Όταν μια φυσιολογική ταχεία κυτταρική ανάπτυξη ολοκληρωθεί, μια ομάδα γονιδίων δίνει εντολή στο κύτταρο να σταματήσει την διαδικασία πολλαπλασιασμού. Το καρκινικό κύτταρο όμως δεν υπακούει σε αυτή την εντολή εξαιτίας αλλαγών στο γενετικό του υλικό, με αποτέλεσμα ο πολλαπλασιασμός να συνεχίζεται και τα καρκινικά κύτταρα να εξακολουθούν να διαιρούνται ανεξέλεγκτα. Τρεις κατηγορίες γονιδίων συμμετέχουν στην καρκινογένεση, σε περίπτωση που μεταλλαχθούν. Οι κατηγορίες αυτές είναι: τα ογκογονίδια ή πρωτο-ογκογονίδια, τα ογκοκατασταλτικά γονίδια και τα επιδιορθωτικά γονίδια. Α. Τα πρωτο-ογκογονίδια είναι γονίδια που προάγουν την κυτταρική ανάπτυξη με ποικίλους τρόπους. Ένας τρόπος είναι μέσω της παραγωγής ορμονών ή μιτογόνων μεταξύ των κυττάρων, οι οποίες επάγουν τη μίτωση. Ένας άλλος τρόπος είναι μέσω της εμπλοκής 29

τους στην πρωτεϊνοσύνθεση και στη μεταγραφή του DNΑ ρυθμίζοντας μονοπάτια μεταγωγής σήματος και τους υποδοχείς τους στα κύτταρα. Σε περίπτωση μετάλλαξης σε κάποιο πρωτο-ογκογονίδιο, μπορεί να προκληθεί τροποποίηση στην έκφραση και στη λειτουργία αυτής της πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα την αύξηση της δραστικότητάς της ή του ποσού της. Τα ογκογονίδια συμμετέχουν στην ανεξέλεγκτη κυτταρική αύξηση και στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Σε περίπτωση που μεταλλαχθούν, ενισχυθούν ή υπερεκφραστούν είναι δυνατόν να δημιουργηθεί νεόπλασμα. Τα ογκογονίδια ανάλογα με τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης που κωδικοποιούν και τη θέση τους στο κύτταρο, χωρίζονται σε έξι κατηγορίες, οι οποίες είναι οι εξής: Αυξητικοί παράγοντες (ογκογονίδιο sis), οι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων (erbb, c-erbb2), οι υποδοχείς κινάσης τυροσίνης (abl, src), τα κυττα-ροπλασματικά ογκογονίδια (raf), τα πυρηνικά ογκογονίδια (fos, jun, erba) και τα αποπτωτικά ογκογονίδια (bcl-2). Η μετατροπή των πρωτο-ογκογονιδίων σε ογκογονίδια μπορεί να γίνει είτε μέσω της παρουσία τους σε υψηλά μεταγραφικό περιβάλλον (μεταλλάξεις promoter), είτε εξαιτίας της απώλειας μέρους της αλληλουχίας τους, με αποτέλεσμα την απορρύθμιση της λειτουργίας τους, είτε τέλος εξαιτίας μιας σημειακής ή άλλης μετάλλαξης. Β. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι γονίδια που αναστέλλουν προσωρινά την κυτταρική διαίρεση προκειμένου να επιτευχθεί η επιδιόρθωση του DNA. Συνήθως είναι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από το κυτταρικό στρες ή από βλάβες του DNA. Κωδικοποιούν αντι-πολλαπλασιαστικά σήματα και πρωτεΐνες που καταστέλλουν τη μίτωση και την κυτταρική ανάπτυξη. Απενεργοποίηση των γονιδίων αυτών προκαλείται λόγω έλλειψης τμήματος ή και ολόκληρου χρωμοσώματος. Σε περίπτωση που τα χρωμοσώματα που βρίσκονται τα συγκεκριμένα γονίδια παρουσιάζουν κάποιο έλλειμμα, με αποτέλεσμα τη μη φυσιολογική έκφραση αυτών, μπορεί να πυροδοτηθεί ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Γ. Τέλος, τα επιδιορθωτικά γονίδια είναι γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα τα οποία ελέγχουν το DNA για τυχόν λάθη που έγιναν κατά τη διάρκεια της αντιγραφής ή για βλάβες από περιβαλλοντολογικούς παράγοντες. Η απενεργοποίηση τους οδηγεί σε συσσώρευση γενετικών βλαβών και αστάθεια του γονιδιώματος με αποτέλεσμα την αύξηση του κινδύνου κακοήθους εξαλλαγής του κυττάρου. Διαφαίνεται ότι η καρκινογένεση είναι συνήθως αθροιστικό αποτέλεσμα πολλαπλών παραγόντων που έχουν 30

ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ογκογονιδίων, την απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και την ελλειμματική επιδιόρθωση του DNA. 1.1. ΔΙΗΘΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ Το καρκινικό κύτταρο έχει ιδιαίτερες βιολογικές ιδιότητες που του επιτρέπουν την τοπική διήθηση καθώς και την απομακρυσμένη μετάσταση. Ως διήθηση ορίζεται η απευθείας διείσδυση των καρκινικών κυττάρων σε γειτονικούς ιστούς, ενώ ως μετάσταση η διαδικασία κατά την οποία κύτταρα αποσπώνται από τον όγκο και μεταφέρονται μέσω της κυκλοφορίας του αίματος ή και της λέμφου, σε άλλους ιστούς και όργανα, όπου συνεχίζουν την ανεξέλεγκτη διαίρεσή τους, σχηματίζοντας θυγατρικούς όγκους. Η μετάσταση χαρακτηρίζει αποκλειστικά τους κακοήθεις όγκους. Προκειμένου να μεταναστεύσουν τα νεοπλασματικά κύτταρα πρέπει να είναι ικανά να επιτύχουν μια σειρά διαδικασιών που θα τους επιτρέψει να επιβιώσουν και να κυκλοφορήσουν μέσα στον ανθρώπινο οργανισμό, με σκοπό να εγκατασταθούν και να πολλαπλασιαστούν σε άλλο σημείο του σώματος. Πρώτο βήμα είναι η αποκόλληση του καρκινικού κυττάρου από τον πρωτογενή όγκο και η διήθηση παρακείμενου ιστού. Ακολουθεί η εισχώρηση σε αγγεία ή λεμφαγγεία όπου το κύτταρο πρέπει να επιβιώσει, να προσκολληθεί σε νέα απομακρυσμένη θέση και εν συνεχεία να εισχωρήσει από τα αγγεία ή τα λεμφαγγεία στον παρακείμενο ιστό και να γίνει η ανάπτυξη του σε νέα ιστική θέση. Όσα κύτταρα καταφέρουν να προσαρμοστούν στο νέο περιβάλλον και να ενεργοποιήσουν το στρώμα, θα ενεργοποιήσουν τη διαδικασία της μετάστασης (σχήμα 1). Σχήμα 1. Σημαντικά βήματα κατά τη διαδικασία της μετάστασης. Τα κύτταρα αποκολλώνται από τον πρωτογενή όγκο και διηθούν παρακείμενους ιστούς ενώ μέσω της εισόδου τους στην κυκλοφορία δημιουργούν μεταστάσεις σε άλλους ιστούς και όργανα. 31

1.2. ΚΑΛΟΗΘΕΙΣ ΚΑΙ ΚΑΚΟΗΘΕΙΣ ΟΓΚΟΙ Οι όγκοι διακρίνονται ανάλογα με την ικανότητα τους για διήθηση ή μετάσταση, σε καλοήθεις και κακοήθεις. Οι καλοήθεις όγκοι μπορούν να εμφανιστούν οπουδήποτε στο σώμα, παραμένουν εντοπισμένοι στην περιοχή από την οποία προέρχονται χωρίς να διαθέτουν την ικανότητα διήθησης ή να μεταναστεύουν σε άλλα όργανα. Ως κύρια χαρακτηριστικά έχουν την αργή ανάπτυξη, την σαφή οριοθέτηση και διαφοροποίηση από παρακείμενους ιστούς μέσω του ινώδους περιβλήματος ενώ μπορούν να αφαιρεθούν με χειρουργική επέμβαση. Οι κακοήθεις όγκοι χαρακτηρίζονται συνήθως από ραγδαία ανάπτυξη με υψηλό ρυθμό κυτταρικής διαίρεσης και είναι συνήθως θανατηφόροι αν δε γίνει έγκαιρα η διάγνωση και η θεραπεία. Η ανάπτυξη των κακοηθών όγκων συνοδεύεται από προοδευτική διήθηση και αποδιοργάνωση του περιβάλλοντος ιστού. Κύρια χαρακτηριστικά τους είναι τα ατελώς καθορισμένα ανατομικά όρια, η ταχεία ανάπτυξη και η ικανότητα εξάπλωσης με διήθηση ή μετάσταση. Για τα περισσότερα είδη καρκίνων δεν υπάρχουν σαφώς καθορισμένα αίτια. Στους φυσιολογικούς ιστούς ο ρυθμός κυτταρικής ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου βρίσκονται σε ισορροπία, ενώ στον καρκίνο η ισορροπία αυτή έχει διαταραχθεί. Αιτία της διατάραξης αυτής μπορεί να είναι είτε η ανεξέλεγκτη κυτταρική αύξηση είτε η απώλεια ικανότητας του κυττάρου για απόπτωση. Συνεπώς τα κύτταρα γίνονται μη φυσιολογικά, αρχίζουν να διαιρούνται χωρίς έλεγχο και χάνουν το διακριτό τους σχήμα. 2. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ Οι όρχεις είναι δύο σύνθετοι σωληνοειδείς αδένες περιβαλλόμενοι από πτυχή του δέρματος που ονομάζεται όσχεον, όπου και διατηρούνται σε θερμοκρασία 1 ο έως 2 ο C κάτω από την θερμοκρασία του εσωτερικού του σώματος, γεγονός που διευκολύνει την παραγωγή σπερματοζωαρίων. Ο κάθε όρχις του ενήλικου ατόμου έχει βάρος 40 gr, μήκος 4-5 cm, πάχος 2-3 cm και όγκο 15-25 ml. Αποτελούν μέρος του αναπαραγωγικού συστήματος αφού παράγουν τα σπερματοζωάρια καθώς και του ενδοκρινικού συστήματος παράγοντας ανδρικές ορμόνες, όπως η τεστοστερόνη. Και οι δύο λειτουργίες τους, βρίσκονται υπό τον έλεγχο των γοναδοτρόπων ορμονών που εκκρίνονται από το πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Εξωτερικά περιβάλλονται από ινώδη χιτώνα, που αποτελείται από πυκνό συνδετικό ιστό ο οποίος συνήθως προς τα βαθύτερα στρώματα, αντικαθίσταται από χαλαρό συνδετικό ιστό (σχήμα 2). Οι όρχεις αποτελούνται 32

κατά 80% από τα σπερματικά σωληνάρια και το υπόλοιπο 20% αποτελείται από συνδετικό ιστό που περιέχει κύτταρα Leydig. Από την εσωτερική επιφάνεια του ινώδους χιτώνα ξεκινούν λεπτά ορχικά διαφράγματα που διαχωρίζουν τον όρχι σε 250-300 ορχικά λοβία. Σε κάθε ορχικό λόβιο υπάρχουν 3-4 σπερματικά σωληνάρια τα οποία σχηματίζουν μια εσπειραμένη μάζα από αγκύλες, μήκους 60-70 cm, που εκβάλουν σε ένα σύστημα πόρων το οποίο τελικά αποχετεύει στην επιδιδυμίδα, όπου ωριμάζουν και αποθηκεύονται τα σπερματοζωάρια. Από εκεί, τα σπερματοζωάρια μεταφέρονται μέσω του σπερματικού και του εκσπερματικού πόρου στο πέος, προκειμένου να εκπεμφθούν (σχήμα 2). Σχήμα 2. Κάθετη τομή του όρχεος. Ο όρχις εξωτερικά περιβάλλεται από τον ινώδη χιτώνα, ενώ εσωτερικά βρίσκονται τα σπερματοφόρα σωληνάρια και η επιδιδυμίδα. Τα σπερματικά σωληνάρια φαίνονται στο μικροσκόπιο ως κυκλικές ή ελλειψοειδείς τομές Κάθε σωληνάριο αφορίζεται από ένα βασικό υμένα που το διαχωρίζει από τα παρακείμενα τριχοειδή αγγεία, από τα περισωληναριακά (μυοειδή) κύτταρα και από τα κύτταρα Leydig. Τα κύτταρα Leydig είναι σωματικά κύτταρα που βρίσκονται μεταξύ των σπερματοφόρων σωληνίσκων, παράγουν τη βασική ανδρογόνο ορμόνη, την τεστοστερόνη, η οποία διοχετεύεται μέσα στους σπερματοφόρους σωληνίσκους και προάγει την σπερματογένεση. Η παραγωγή της τεστοστερόνης ρυθμίζεται από την ωχρινοτρόπο ορμόνη (LH) που εκκρίνεται από την υπόφυση και δρα στα κύτταρα Leydig. Στο εσωτερικό του υμένα βρίσκονται τα κύτταρα Sertoli και τα άωρα γεννητικά κύτταρα, τα σπερματογόνια. Καθώς τα σπερματογόνια διαιρούνται και αναπτύσσονται γύρω από 33

την περιφέρεια των σωληναρίων, σχηματίζουν κάτω από αυτά στήλες από ωριμάζοντα σπερματικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης τα σπερματικά κύτταρα διέρχονται από 4 διαφορετικά στάδια ωρίμανσης. Αρχικά αναγνωρίζονται τα σπερματογόνια, με υποστρόγγυλο σχήμα και σφαιρικό πυρήνα, που βρίσκονται πολύ κοντά ή σχεδόν σε επαφή με το βασικό υμένα, που εντοπίζεται ακριβώς μέσα από τον ινώδη χιτώνα. Ενώ μερικά σπερματογόνια παραμένουν προγονικά, άλλα μετά από μιτωτικές διαιρέσεις γίνονται πρωτογενή σπερματοκύτταρα ή σπερμα-τοκύτταρα α τάξης, τα οποία είναι ογκωδέστερα των σπερματογονίων και βρίσκονται σε μεγαλύτερο βάθος στο σπερματικό τοίχωμα. Με την πρώτη διαίρεση της μείωσης, τα σπερματοκύτταρα α τάξης παράγουν δευτερογενή σπερματοκύτταρα ή σπερματοκύτταρα β τάξης που είναι πολύ μικρότερα των πρωτογενών, η χρονική διάρκεια της ζωής τους είναι πολύ περιορισμένη και τα οποία με τη δεύτερη διαίρεση της μείωσης παράγουν τις σπερματίδες. Οι σπερματίδες είναι μικρά στρογγυλά κύτταρα με στρογγυλό πυρήνα, που διατάσσονται σε 3-4 σειρές κοντά στον αυλό του σωληναρίου και μέσω δεσμοσωμάτων βρίσκονται σε επαφή με τα κύτταρα Sertoli. Τέλος, με μια διεργασία μεταμόρφωσης των απλοειδών σπερματίδων που ονομάζεται σπερμιογένεση ή σπερμιοτελείωση παράγονται τα σπερματοζωάρια. Τα σπερματοζωάρια εντοπίζονται πολύ κοντά στον αυλό ή μέσα σε αυτόν ως πολύ επιμηκυμένα κύτταρα στα οποία αρχίζει να διακρίνεται η ουρά. Οι στήλες αυτές με τα ωριμάζοντα σπερματικά κύτταρα βρίσκονται μεταξύ δύο παρακείμενων κυττάρων Sertoli, καθένα από τα οποία εκτείνεται από τον βασικό υμένα μέχρι τον αυλό. Τα κύτταρα Sertoli είναι σωματικά κύτταρα που εκτείνονται από τα τοιχώματα προς το κέντρο των σπερματοφόρων σωληνίσκων (σχήμα 3). Προσδιορίζουν το ρυθμό της σπερματογένεσης ελέγχοντας το ρυθμό μετατόπισης των σπερματοκυττάρων από τη βασική μεμβράνη προς το κέντρο του σπερματοφόρου σωληνίσκου. Τα σπερματοκύτταρα είναι βυθισμένα μέσα στις κοιλότητες που σχηματίζονται από τις αναδιπλώσεις της κυτταρικής μεμβράνης των κυττάρων Sertoli σε καθορισμένη αλληλουχία και μετατοπίζονται κατά μήκος των κυττάρων Sertoli με αποικοδόμηση και ανοικοδόμηση των συνδέσεών τους με αυτά τα κύτταρα και με αλλαγή της μορφολογίας των κυττάρων Sertoli. Τα κύτταρα Sertoli παράγουν την ορμόνη κατά των πόρων του Muller (AMH) έχοντας έτσι σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό του αναπαραγωγικού συστήματος του άρρενος. Επίσης, τα κύτταρα Sertoli απελευθερώνουν την πρωτεΐνη ενωμένη με ανδρογόνα (ABP) υπό την επίδραση της θυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH). Λόγω της ΑΒP τα 34

κύτταρα Sertoli δεσμεύουν την τεστοστερόνη και εν συνεχεία η δεσμευμένη τεστοστερόνη συντηρεί την σπερματογένεση (Ζάγκρης, 2005). Σχήμα 3. Α) Κάθετη τομή του όρχεος, όπου διακρίνονται τα σπερματικά σωληνάρια, κύτταρα Sertoli και τα κύτταρα Leydig. Β) Πορεία ωρίμανσης των σπερματικών κυττάρων. 3. ΝΕΟΠΛΑΣΙΑ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ Η νεοπλασία των όρχεων, αν και σχετικά αποτελεί μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1-2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα), είναι ο πιο συχνός όγκος στις ηλικίες 20-40 ετών, αποτελώντας την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Τα τελευταία 30 χρόνια, η αντιμετώπιση του καρκίνου των όρχεων έχει σημειώσει θεαματική πρόοδο λόγω της εισαγωγής αποτελεσματικών χημειοθεραπευτικών σχημάτων με βάση τον λευκόχρυσο, της βελτίωσης των μεθόδων σταδιοποίησης και των χειρουργικών τεχνικών, καθώς επίσης και της καλύτερης κατανόησης της φυσικής ιστορίας της νόσου. Σήμερα θεωρείται η πλέον θεραπεύσιμη μορφή ουρολογικού καρκίνου και η συνολική επιβίωση στα πρώιμα στάδια πλησιάζει το 100%, ενώ σε προχωρημένη νόσο ξεπερνά το 80%. Επιδημιολογία: Στις Η.Π.Α και το Ηνωμένο Βασίλειο υπολογίζονται 7.000 και 1.600 νέα περιστατικά κάθε χρόνο, αντίστοιχα. Η πιθανότητα νόσησης είναι 1:500 άνδρες (0,2%) με αυξανόμενη τάση. Τα τελευταία 100 χρόνια, για άγνωστους λόγους, η επίπτωση της νόσου αυξάνεται κατά 15-20%, ανά 5ετία ή κατά 2% ανά έτος. 35

Ηλικία: Στο 78% των περιπτώσεων ο καρκίνος εμφανίζεται σε άνδρες 20-40 ετών, στο 20% σε άνδρες > 40 ετών, ενώ στο 2% των περιπτώσεων εμφανίζεται σε αγόρια < 15 ετών. Φυλή: Οι λευκοί νέοι άνδρες προσβάλλονται σε τετραπλάσια συχνότητα σε σύγκριση με τους έγχρωμους. Γεωγραφική κατανομή: Υπάρχει σημαντική διακύμανση στη συχνότητα εμφάνισης στις διάφορες χώρες με υψηλότερη εκείνη των Σκανδιναβικών χωρών και χαμηλότερη στις χώρες της Αφρικής και της Ασίας. Εντόπιση: Ο καρκίνος εντοπίζεται, για άγνωστους λόγους, συχνότερα στο δεξιό όρχι (όπως και η κρυψορχία) ενώ αμφοτερόπλευρη εντόπιση παρατηρείται στο 1-2% των περιπτώσεων. 3.1. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Οι περισσότεροι από αυτούς του όγκους είναι αρκετά επιθετικοί και ικανοί για γρήγορη και ευρεία διασπορά. Παρόλα αυτά, η θνησιμότητα των ασθενών με κακοήθεις όγκους όρχεων έχει μειωθεί εντυπωσιακά λόγω της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας που περιλαμβάνει cisplatin. Αντίθετα, οι όγκοι που δεν προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα είναι σε γενικές γραμμές καλοήθεις. Η ταξινόμηση των όγκων των όρχεων δυστυχώς ποικίλει σε μεγάλο βαθμό λόγω της διαφορετικής αντίληψης σχετικά με την ιστογένεση των όγκων, της ποικιλίας στη μορφολογία ενός ιστολογικού τύπου καθώς και της παρουσίας περισσοτέρων του ενός ιστολογικών τύπων εντός ενός όγκου. Η ταξινόμηση των όγκων όρχεων με βάση τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) αναγράφεται παρακάτω: 3.2 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ ΚΑΤΑ WHO ΟΓΚΟΙ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΟΙ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Όγκοι αποτελούμενοι από ένα ιστολογικό τύπο (αμιγείς μορφές) Σεμίνωμα Σεμίνωμα με συγκυτιοτροφοβλαστικά κύτταρα Σπερματοκυτταρικό σεμίνωμα Σπερματοκυτταρικό σεμίνωμα με σάρκωμα 36

Εμβρυϊκό Καρκίνωμα Όγκος του λεκιθικού ασκού Τροφοβλαστικοί όγκοι Χοριοκαρκίνωμα Τροφοβλαστικά νεοπλάσματα εκτός χοριοκαρκινώματος Μονοφασικό χοριοκαρκίνωμα Πλακουντιακός τύπος τροφοβλαστικού όγκου Τεράτωμα Δερμοειδής κύστη Μονοδερμικό τεράτωμα Τεράτωμα με σωματικού τύπου κακοήθειες Όγκοι αποτελούμενοι από πολλούς ιστολογικούς τύπους (μικτοί όγκοι) Μικτό εμβρυϊκό καρκίνωμα με τεράτωμα (τερατοκαρκίνωμα) Μικτό τεράτωμα με σεμίνωμα Χοριοκαρκίνωμα με τεράτωμα / εμβρυϊκό καρκίνωμα Άλλοι συνδυασμοί ΟΓΚΟΙ ΤΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΤΩΝ ΓΟΝΑΔΩΝ/ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΟΥ ΤΟΝΟΥ Αμιγείς μορφές Όγκος των κυττάρων Leydig Κακοήθης όγκος των κυττάρων Leydig Όγκος των κυττάρων Sertoli Όγκος των κυττάρων Sertoli πλούσιος σε λιπίδια Σκληρυντικός όγκος των κυττάρων Sertoli Αποτιτανωμένος όγκος από μεγάλα κύτταρα Sertoli Κακοήθης όγκος των κυττάρων Sertoli Κοκκιωματώδης όγκος Κοκκιωματώδης όγκος ενηλίκων Νεανικός κοκκιωματώδης όγκος Όγκοι που κατατάσσονται στην κατηγορία θήκωμα / ίνωμα Θήκωμα Ίνωμα 37

Ατελώς διαφοροποιημένοι όγκοι Μικτοί όγκοι του στρώματος των γονάδων / σπερματικού τόνου Κακοήθεις όγκοι του στρώματος των γονάδων / σπερματικού τόνου Μικτοί όγκοι που περιλαμβάνουν στοιχεία εκ βλαστικών κυττάρων, του στρώματος των γονάδων και του σπερματικού τόνου Γοναδοβλάστωμα Αταξινόμητος όγκος εκ βλαστικών κυττάρων-σπερματικού τόνου / στρώματος των γονάδων ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΤΩΝ ΕΚΦΟΡΗΤΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ ΚΑΙ ΟΡΧΙΚΟΥ ΔΙΚΤΥΟΥ Αδένωμα Καρκίνωμα ΟΓΚΟΙ ΤΩΝ ΠΑΡΑΟΡΧΙΚΩΝ ΔΟΜΩΝ Αδενωματώδης όγκος Κακόηθες μεσοθηλίωμα Καλόηθες μεσοθηλίωμα Θηλώδες μεσοθηλίωμα καλά διαφοροποιημένο Κυστικό μεσοθηλίωμα Αδενοκαρκίνωμα της επιδιδυμίδος Θηλώδες κυσταδένωμα της επιδιδυμίδος Μελανωματώδης νευρο-εξωδερματικός όγκος Δεσμοπλαστικός όγκος από μικρά στρογγυλά κύτταρα ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΙΚΟΥ ΤΟΝΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΕΞΑΡΤΗΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ ΔΕΥΤΕΡΟΠΑΘΕΙΣ ΟΓΚΟΙ ΤΩΝ ΟΡΧΕΩΝ 38

3.3. ΑΙΤΙΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ- ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Μολονότι για την αιτιοπαθογένεια της νόσου έχουν εκφραστεί πολλές απόψεις αυτή ουσιαστικά παραμένει άγνωστη. Ωστόσο κατά καιρούς έχουν ενοχοποιηθεί διάφοροι παράγοντες, συγγενείς και επίκτητοι όπως: Κρυψορχία: Αποτελεί τον μοναδικό ίσως παράγοντα για τον οποίο έχει αποδειχθεί σαφής συσχέτιση με όγκους των όρχεων και ο σχετικός κίνδυνος είναι 3-14 φορές μεγαλύτερος από την φυσιολογική συχνότητα. Περίπου το 10% των ασθενών με νεοπλασίες των όρχεων έχουν ιστορικό κρυψορχίας. Αν και δεν υπάρχει απόδειξη ότι η ορχεοπηξία μειώνει τον κίνδυνο, η εκτέλεση της διευκολύνει την πρωιμότερη ανακάλυψη του όγκου μέσω της αυτοεξέτασης των όρχεων. Οι πιθανοί παράγοντες που έχουν αναφερθεί ότι οδηγούν στην ανάπτυξη του όγκου στον κρυψοόρχι είναι: α) Aνωμαλία στη μορφολογία των κυττάρων της γεννητικής σειράς, β) Αυξημένη θερμοκρασία, γ) Οι ενδοκρινείς διαταραχές και δ) Δυσγενεσία των γονάδων. Τέλος η πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου στην κοιλιακή κρυψορχία είναι μεγαλύτερη από ότι στη βουβωνική. Επίδραση ουσιών με οιστρογονική ή αντιανδρογονική δράση: Η χορήγηση συνθετικών οιστρογόνων στο πρώτο τρίμηνο της κύησης έχει ενοχοποιηθεί στο παρελθόν για την ανάπτυξη όγκου των όρχεων. Η σχέση μεταξύ οιστρογονικής έκθεσης στη ενδομήτρια ζωή και ανάπτυξης όγκου υποστηρίζεται από πρόσφατα δεδομένα που δείχνουν ότι η επίπτωση του όγκου των όρχεων είναι υψηλότερη σε διωογενείς δίδυμους (υψηλότερα επίπεδα οιστρογόνων στη μητέρα) σε σύγκριση με τους μονοωογενείς. Επιπλέον έχει παρατηρηθεί ότι πολλές βιομηχανικές τοξίνες έχουν παρόμοια χημική δομή και κατά συνέπεια δράση και επίδραση με τα οιστρογόνα, γεγονός που σημαίνει πως όταν οι γυναίκες εκτίθενται σε αυτές κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, υπάρχει δυνητικός κίνδυνος για τα έμβρυα. Τα τελευταία χρόνια, σύμφωνα με επιδημιολογικές μελέτες, υπάρχει μείωση της ποιότητας του σπέρματος σε συνδυασμό με συνυπάρχουσα αύξηση της επίπτωσης ουροποιογεννητικών ανωμαλιών, όπως η κρυψορχία, ο υποσπαδίας και οι διαταραχές διαφοροποίησης του φύλου. Η αύξηση της συχνότητας εμφάνισης όγκου των όρχεων σε ασθενείς με υπογονιμότητα, κρυψορχία και γοναδική δυσγενεσία υποδηλώνει κοινή αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ των γεννητικών αυτών διαταραχών και των ορχικών νεοπλασιών. Θεωρείται ότι η επίδραση παραγόντων με οιστρογονική δράση στην ενδομήτρια ζωή, ιδιαίτερα σε άτομα με γενετική προδιάθεση, προκαλεί ενδοκρινική δυσλειτουργία των όρχεων και προαγωγή της καρκινογένεσης. 39

Ενδοσωληναριακή νεοπλασία από βλαστικά κύτταρα (νεοπλασία in situ): H παρουσία της πρόδρομης αυτής αλλοίωσης στα βλαστικά κύτταρα ανευρίσκεται στο 5% των ασθενών με όγκο στον αντίπλευρο όρχι. Η συχνότητα του καρκινώματος in situ είναι υψηλότερη σε άτομα με υπογονιμότητα, κρυψορχία, διαταραχές της διαφοροποίησης του φύλου και εξωγοναδικούς όγκους από βλαστικά κύτταρα. Περίπου το 50% των ασθενών με νεοπλασία in situ θα εμφανίσουν όγκο μέσα σε 5 χρόνια από την διάγνωση. Οικογενειακό ιστορικό όγκου των όρχεων: Η γενετική βάση της παθογένεσης των νεοπλασιών του όρχεος παραμένει άγνωστη. Κληρονομική προδιάθεση ανευρίσκεται μόνο στο 2% των ασθενών και σχετίζεται με μια μετάλλαξη στο χρωμόσωμα Χq27. Ιστορικό νεοπλασιών του όρχεως: Ασθενείς με ιστορικό νεοπλασίας του όρχι έχουν πιθανότητα 1-2% να εμφανίσουν ένα δεύτερο πρωτοπαθή όγκο στον αντίπλευρο όρχι. Μικρολιθίαση του όρχεος: Η συσχέτιση της νεοπλασίας του όρχεως με την μικρολιθίαση του αδένα παρουσιάζει σημαντική διακύμανση (συχνότητα συνύπαρξης: 0.05%-9%). Οι περισσότεροι ερευνητές συστήνουν παρακολούθηση με υπερηχογράφημα οσχέου, ενώ μερικοί συστήνουν βιοψία του όρχεως, θεωρώντας τη μικρολιθίαση ως προκαρκινωματώδη κατάσταση. Άλλοι παράγοντες κινδύνου: Μεταξύ άλλων πιθανών παραγόντων κινδύνου έχουν μελετηθεί η βουβωνοκήλη, η ναυτία κατά τη διάρκεια της κύησης (από την εξωγενή χορήγηση οιστρογόνων), τα τραύματα, οι επανειλημμένες φλεγμονές και η συνεχής έκθεση σε διάφορες ουσίες (όπως οι φαινόλες, τα λιπάσματα, την άσβεστοκαι τον καπνό). 3.4. ΙΣΤΟΓΕΝΕΣΗ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ-ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Η ενδοσωληναριακή νεοπλασία θεωρείται η πρόδρομος αλλοίωση όλων των όγκων του σπερματοκυτταρικού σεμινώματος. Η αλλοίωση αυτή στα πρώιμα στάδια συνίσταται στην εμφάνιση άτυπων κυττάρων που μoιάζουν με τα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα και τα κύτταρα του σεμινώματος. Τα κύτταρα αυτά βρίσκονται μέσα στα σπερματικά σωληνάρια, συνήθως σε μια σειρά κατά μήκος της βασικής μεμβράνης. Αργότερα τα άτυπα αυτά κύτταρα αντικαθιστούν τα φυσιολογικά κύτταρα των σωληναρίων, ενώ στα προχωρημένα στάδια (διηθητικός όγκος) παρατηρείται διήθηση της βασικής μεμβράνης και επέκταση στον ενδιάμεσο ιστό. Πρέπει να σημειωθεί, ότι οι γενετικές τροποποιήσεις των κυττάρων της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας είναι όμοιες με αυτές των διηθητικών όγκων και αφορούν κυρίως τον διπλασιασμό του μικρού βραχίονα του χρωμοσώματος 12 υπό τη μορφή ισοχρωμόσωματος των μικρών βραχιόνων i(12p). Η γενετική αυτή 40

τροποποίηση ανευρίσκεται στο 89% και 81% των σεμινωμάτων και μη σεμινωματωδών όγκων, αντίστοιχα. Ο δείκτης i(12p) παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα σε όγκους από βλαστικά κύτταρα και αποτελεί χρήσιμη διαγνωστική μέθοδο σε όγκους άγνωστης προέλευσης. Πρόσφατες μελέτες του γενετικού υλικού των νεοπλασματικών κυττάρων οδήγησαν στην κατάργηση της κλασικής θεωρίας ότι οι όγκοι των όρχεων προέρχονται από ένα πολυδύναμο κύτταρο, το οποίο υφίσταται νεοπλασματική εξαλλαγή προς σεμίνωμα ή εμβρυϊκό καρκίνωμα. Τα κύτταρα του σεμινώματος ομοιάζουν με αυτά της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας και πολλαπλασιάζονται ως ομοιογενής όγκος που διατηρεί τα χαρακτηριστικά του βλαστικού επιθηλίου. Έτσι προτάθηκε η άποψη ότι το σεμίνωμα αποτελεί τη διηθητική μορφή της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας, το οποίο στη συνέχεια υφίσταται εξαλλαγή προς εμβρυϊκό καρκίνωμα ή σπανιότερα προς άλλους τύπους όπως το χοριοκαρκίνωμα και τον όγκο του λεκιθικού ασκού. Το εμβρυϊκό καρκίνωμα μπορεί επίσης να υποστεί εξαλλαγή σε χοριοκαρκίνωμα ή σε όγκο του λεκιθικού ασκού. Σύμφωνα με τις παραπάνω παρατηρήσεις ιστογένεση των όγκων από βλαστικά κύτταρα αρχίζει ως ενδοσωληναριακή νεοπλασία, η οποία μπορεί να ακολουθήσει την παρακάτω εξέλιξη: A) Έξωσωληναριακή διήθηση (αναγνωρίζεται ως σεμίνωμα, η οποία παραμένει σταθερή ή εξαλλάσσεται σε μη σεμινωματώδεις όγκους και B) Ενδοσωληναριακή εξαλλαγή σε μη σεμινωματώδεις όγκους, οι οποίοι στη συνέχεια διηθούν το διάμεσο ιστό. Έχουν προταθεί δύο θεωρίες για την προέλευση των κυττάρων της ενδοσωληναριακής νεοπλασίας. Α) Τα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα, τα οποία δεν ακολουθούν την φυσιολογική ανάπτυξη, υφίστανται ανώμαλη κυτταρική διαίρεση και πολλαπλασιασμό. Τα κύτταρα αυτά μπορεί να έχουν την ικανότατα διηθητικής ανάπτυξης, η οποία επάγεται από τις γοναδοτροπίνες (LH, FSH) στη νεογνική περίοδο και στην ήβη σε άτομα με γενετική προδιάθεση. Β) Προαγωγή της καρκινογένεσης μέσω της αυξημένης έκφρασης του ισοχρωμόσωματος 12p, της κυκλίνης D2 και της φυσικής μορφής του ογκογονιδίου p53. Όταν τα κύτταρα έχουν υποστεί βλάβη στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA, η υπερέκφραση της κυκλίνης (ρυθμιστική πρωτεΐνη του κυτταρικού κύκλου) μπορεί να αναστείλει την εξαρτώμενη από το p53 απόπτωση και να οδηγήσει σε επανέναρξη του 41

κυτταρικού κύκλου και γενετική αστάθεια. Το p53 ογκογονίδιο υπάρχει στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 17 και ρυθμίζει τη μεταγραφή του DNA, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. 3.5. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ Η επιδημιολογία, η κλινική συμπεριφορά, η ιστολογία και οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες οδηγούν στη διάκριση τριών ομάδων όγκων των όρχεων από βλαστικά κύτταρα (Looijenga LH & Oosterhuis JW 1999, Looijenga LH & Oosterhuis JW 2002, Oosterhuis JW et al. 1997). Στην πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται τα τερατώματα και οι όγκοι του λεκιθικού ασκού των νεογέννητων και των παιδιών, στη δεύτερη τα σεμινώματα και οι μη σεμινωματώδεις όγκοι στους έφηβους και τους ενήλικες (TGCTs) και στην τρίτη το σπερματοκυτταρικό σεμίνωμα των ηλικιωμένων. Γενετική προδιάθεση (οικογενείς όγκοι): Οι οικογενείς όγκοι των όρχεων από βλαστικά κύτταρα στους ενήλικες αποτελούν το 1.5-2% του συνόλου των όγκων αυτής της κατηγορίας. Η συνήθως πρώιμη εμφάνιση της νόσου, η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης της νόσου και στους δύο όρχεις και η αυξημένη βαρύτητά της αποδίδεται σε γενετικούς λόγους που είναι υπεύθυνοι για την εμφάνιση της νόσου σε ζευγάρια πατέρωνυιών (Han S & Peschel RE 2000). Περιβαλλοντικοί και κληρονομικοί παράγοντες έχουν αναλυθεί και το εκτιμούμενο ποσοστό εμφάνισης κακοήθειας λόγω γενετικών βλαβών ανέρχεται στο 25% των TGCTs στους ενήλικες ενώ εξίσου σημαντική κρίνεται η επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων κατά τη παιδική ηλικία στην εμφάνιση όγκου στους όρχεις (17%). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στις χρωμοσωμικές ανωμαλίες μεταξύ των σποραδικών όγκων και των οικογενών όγκων που εμφανίζονται και στους δύο όρχεις (Skotheim RI et al. 2001). Ωστόσο, βρέθηκε ένα γονίδιο στο χρωμόσωμα Χq27 το οποίο εμπλέκεται στην ανάπτυξη όγκων των όρχεων από βλαστικά κύτταρα και το οποίο εμπλέκεται επίσης και στη μη φυσιολογική κάθοδο του όρχι στο όσχεο (Rapley EA et al. 2000). Αν και ο ρόλος των γενετικών παραγόντων στην αιτιολογία των όγκων των όρχεων φαίνεται ότι είναι σημαντικός, η παρουσία ενός μόνο γονιδίου που εμπλέκεται στην εμφάνιση της νόσου είναι αμφισβητήσιμη θεωρία. Είναι πιο πιθανό ότι η γενετική προδιάθεση σε συνδυασμό με την ενδομήτρια έκθεση και την επίδραση περιβαλλοντικών 42

παραγόντων κατά την παιδική ηλικία συνεισφέρουν στον μηχανισμό μοριακής παθογένεσης των όγκων. Ανωμαλίες γονάδων: Άτομα με 46,ΧΥ ή 45,Χ/46,ΧΥ δυσγενεσίες γονάδων εμφανίζουν ιδιαίτερα αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης όγκων των βλαστικών κυττάρων. Ο απόλυτος κίνδυνος κυμαίνεται μεταξύ 10-50% (Rutgers JL & Scully RE 1987, Mostofi FK & Sesterhenn IA 2004). Γενωμική αποτύπωση: Η γενωμική αποτύπωση αναφέρεται σε ένα μοναδικό φαινόμενο στα θηλαστικά που σχετίζεται με διαφορετική λειτουργία ενός αριθμού γονιδίων αναλόγως από ποιο γονέα προέρχεται. Αυτή η διαφορά γεννάται και διεισδύει στους απογόνους μέσω των βλαστικών κυττάρων. Ο τύπος της γενωμικής αποτύπωσης έχει σημαντική επίδραση στο δυναμικό ανάπτυξης των κυττάρων (Solter D 1988). Οι όγκοι των όρχεων εμφανίζουν σταθερή έκφραση αποτυπωμένων γονιδίων και στα δύο αλληλόμορφα (Gillis AJ et al. 1997, Looijenga LH et al. 1999, Looijenga LH et al. 1997, Mishina M et al. 1996, Nonomura N et al. 1997, Rachmilewitz J et al. 1996, van Gurp RJ et al. 1994). Υποστηρίζεται ότι στους TGCTs η έκφραση των αποτυπωμένων γονιδίων και στα δύο αλληλόμορφα δεν είναι αποτέλεσμα της απώλειας της αποτύπωσης αλλά είναι χαρακτηριστικό των κυττάρων από όπου προέρχονται οι όγκοι. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγεί την παρουσία δραστικότητας τελομεράσης στους όγκους των όρχεων εκτός των ωρίμων τερατωμάτων (Albanell J et al. 1999). Τα τερατώματα και οι όγκοι του λεκιθικού ασκού των ανηλίκων εμφανίζουν μια ελαφρώς διαφορετική εικόνα γενωμικής αποτύπωσης που υποστηρίζει την άποψη της διαφορετικής προέλευσης αυτών των νεοπλασμάτων από ένα πιο πρώιμο στάδιο ανάπτυξης των βλαστικών κυττάρων (Ross JA et al. 1999, Schneider DT et al. 2001). Αν και λίγα είναι γνωστά για την γενωμική αποτύπωση στο σπερματοκυτταρικό σεμίνωμα, τα δεδομένα δείχνουν ότι αυτοί οι όγκοι έχουν ήδη υποστεί πατρική αποτύπωση (Verkerk AJ et al. 1997). Χρωμοσωμικές ανωμαλίες: Όλοι οι όγκοι των όρχεων από βλαστικά κύτταρα συμπεριλαμβανομένων και των προδρόμων μορφών (αταξινόμητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία) είναι ανευπλοειδείς (Oosterhuis JW et al. 1989). Τα σεμινώματα και η αταξινόμητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία είναι υπερτριπλοειδείς, ενώ τα κύτταρα των μη σεμινωματωδών όγκων ανεξάρτητα του ιστολογικού τύπου είναι υποτριπλοειδή. Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι ο πολυπλοειδισμός είναι το αρχικό γεγονός που οδηγεί στην τετραπλοειδή αταξινόμητη ενδοσωληναριακή νεοπλασία, η οποία στη συνέχεια 43

ακολουθείται από χρωμοσωμική ελάττωση (Oosterhuis JW et al. 1989). Η ανευπλοειδία στους όγκους των όρχεων έχει σχετιστεί με την ενίσχυση των κεντροσωμάτων (Mayer F et al. 2003). Με διάφορες τεχνικές έχει δειχθεί ένα σύνθετο αλλά παρόμοιο πρότυπο υπερέκφρασης ή μείωσης της έκφρασης μέρους διαφόρων χρωμοσωμάτων στους σεμινωματώδεις και μη-σεμινωματώδεις όγκους. Μέρος των χρωμοσωμάτων 4, 5, 11, 13, 18 και Υ εμφανίζουν ελάττωση, ενώ μέρη των χρωμοσωμάτων 7, 8, 12, και Χ εμφανίζουν αύξηση της έκφρασής τους. Τα σεμινώματα εμφανίζουν αύξηση του αριθμού των χρωμοσωμάτων 7, 15, 17, 19, και 22 αιτιολογώντας την πολυπλοειδική δομή τους (Rosenberg C et al. 1999, van Echten J et al. 1995). Αυτό υποστηρίζει μια κοινή αρχή όλων των ιστολογικών μορφών αυτών των TGCTs γεγονός που υποστηρίζεται από την συνύπαρξη τόσο σεμινωματωδών όσο και μη-σεμινωματωδών όγκων σε κάποιες περιπτώσεις (Castedo SM et al. 1988, Gillis AJ et al. 1994, Rothe M et al. 1999). Αύξηση του χρωμοσώματος 12p: Η μόνη σταθερή χρωμοσωμική ενίσχυση που παρατηρείται στους διηθητικούς όγκους των όρχεων είναι η ενίσχυση μέρους του χρωμοσώματος 12p το οποίο αναφέρεται συχνά ως ισοχρωμόσωμα 12p [i(12p)] (Sandberg AA et al. 1996). Η μοριακή ανάλυση έχει δείξει ότι αυτό το ισοχρωμόσωμα προέρχεται από ένα πατρικό χρωμόσωμα και δημιουργείται από τον διπλασιασμό του p- μέρους ενός χρωμοσώματος και την απώλεια του q-μέρους. Η πλειονότητα των TGCTs (περίπου το 80%) εμφανίζουν το i(12p) (van Echten J et al. 1995), ενώ στις υπόλοιπες περιπτώσεις εμφανίζονται επιπλέον αντίγραφα μέρους ή ολόκληρου του χρωμοσώματος 12p (Rodriguez E et al. 1993, Suijkerbuijk RF et al. 1993). Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η ενίσχυση μέρους του χρωμοσώματος 12p είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη αυτής της κακοήθειας και σχετίζεται ιδιαίτερα με την ικανότητα πολλαπλασιασμού και διήθησης (Rosenberg C et al. 2000). Διάφορα γονίδια του χρωμοσώματος 12p έχει προταθεί ότι εμπλέκονται στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων. Μεταξύ αυτών είναι το γονίδιο K-ras, το οποίο εμφανίζει σπάνια μεταλλάξεις και μερικές φορές υπερεκφράζεται στους όγκους των όρχεων (Moul JW et al. 1992, Mulder MP et al. 1989, Olie RA et al. 1995, Ridanpää M et al. 1993, Skotheim RI et al. 2002) και η κυκλίνη D2 (Houldsworth J et al. 1997, Schmidt BA et al. 2001, Sicinski P et al. 1996, Skotheim RI et al. 2002). Η κυκλίνη αυτή πιθανόν να εμπλέκεται προκαλώντας απορρύθμιση του σημείου ελέγχου μεταξύ των φάσεων G1-S. Μια πιο εντοπισμένη προσέγγιση στην ταυτοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων ξεκίνησε έπειτα από την εύρεση ενός μεταστατικού σεμινώματος με ενίσχυση ενός περιορισμένου τμήματος 44

του χρωμοσώματος 12p που ταυτοποιήθηκε κυτταρογενετικά ότι ήταν η περιοχή 12p11.2-p12.1 (Suijkerbuijk RF et al. 1994). Ακολούθως, πρωτογενείς όγκοι των όρχεων βρέθηκαν να περιέχουν τέτοιες ενισχύσεις (Zafarana G et al. 2002, Korn WM et al. 1996, Mostert MC et al. 1998, Mostert MM et al. 1996). Η ενίσχυση του 12p απαντάται στο 8-10% των περιπτώσεων του σεμινώματος ιδιαίτερα σε εκείνα όπου δεν παρατηρείται το ισοχρωμόσωμα 12p και είναι σπανιότερα στους μη σεμινωματώδεις όγκους (Zafarana G et al. 2002). Αυτό προτείνει την παρουσία δύο μονοπατιών που οδηγούν στην υπερέκφραση των γονιδίων στο τμήμα 12p, είτε μέσω της δημιουργίας του ισοχρωμοσώματος 12p ή μέσω εναλλακτικού μηχανισμού που οδηγεί σε υψηλή ενίσχυση της περιοχής αυτής του χρωμοσώματος. Τα σεμινώματα με ενίσχυση της περιοχής αυτής του χρωμοσώματος 12p εμφανίζουν ελαττωμένη ευαισθησία στην απόπτωση και ένα γονίδιο που πιθανόν να εμπλέκεται είναι το γονίδιο DAD-R (Zafarana G et al. 2002). Είναι επίσης πιθανό ότι περισσότερα γονίδια σε αυτή την περιοχή ενίσχυσης βοηθούν τα κύτταρα του όγκου να υπερισχύσουν της απόπτωσης και να πολλαπλασιαστούν (Frisch SM & Francis H 1994). Μοριακές γενετικές μεταβολές: Αρκετές μελέτες έχουν δημοσιευτεί σχετικά με το ρόλο της αδρανοποίησης ογκο-κατασταλτικών γονιδίων και την ενεργοποίηση πρωτοογκογονιδίων στην ανάπτυξη των όγκων των όρχεων. Μια σημαντική διαφορά μεταξύ των σεμινωμάτων είναι η υπομεθυλίωσή τους, σε σχέση με τους μη-σεμινωματώδεις όγκους, όπου παρατηρείται υπερμεθυλίωση (Gillis AJ et al. 1997, Smiraglia DJ et al. 2002). Αυτό μπορεί να αντικατοπτρίζει την διαφορετική εμβρυϊκή τους προέλευση και την ικανότητα των μη-σεμινωματωδών όγκων να μιμούνται την εμβρυϊκή και την εξωεμβρυϊκή ανάπτυξη, γεγονός που υποστηρίζεται από το μοντέλο έκφρασης του γονιδίου OCT3/4 καθώς και την δραστικότητα τελομεράσης που εμφανίζουν (Palumbo C et al. 2002, Looijenga LH et al. 1997a). Διάφορες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για την ταυτοποίηση γενωμικών απωλειών ιδιαίτερα την ταυτοποίηση της απώλειας ετεροζυγωτίας με σκοπό να αναγνωριστούν ογκο-κατασταλτικοί γονιδιακοί τόποι. Όμως λόγω της ανευπλοειδίας του DNA στους όγκους των όρχεων καθώς και της εμβρυϊκής τους φύσης αυτά τα στοιχεία πρέπει να αναλύονται με προσοχή (Looijenga LH et al. 1994). Πράγματι, τα ανευπλοειδή κύτταρα πιστεύεται ότι χάνουν γενωμικές αλληλουχίες που οδηγούν σε απώλεια της ετεροζυγωτίας και επηρεάζουν περίπου 200.000 περιοχές του γονιδιώματος, οι οποίες μπορεί να μην εμπλέκονται στην έναρξη της κακοήθειας (Loeb LA 2001). Επιπροσθέτως, τα πολυδύναμα εμβρυϊκά προγονικά κύτταρα εμφανίζουν διαφορετική συχνότητα και 45