ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Γκαντέρης Γεώργιος Βιοπαθολόγος Αναπληρωτής Διευθυντής ΓΝΑ «Γ. ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ»
GRAM ΘΕΤΙΚΑ ΑΝΑΕΡΟΒΙA Gram θετικά βακτηρίδια σπορογόνα (Clostridium sp) Gram θετικοί αναερόβιοι κόκκοι Peptostreptococcus sp P. anaerobius Parvimonas sp P. micra Finegoldia sp Peptoniphillus sp Anaerococcus sp F. magna Peptocoocus sp P. niger Atopobium sp A. parvula Coprococcus sp, Rominococcus sp Sarcina sp,gallicola, sp Pn. asaccharolyticus, Pn. indolicus, Pn. harei, Pn. lacrimalis, Pn. ivorii An. prevotii,, An. Tetradius,, An. hydrogenalis, An. octavius An. lactolyticus,, An. vaginalis Gallicilo bamesae Gram Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα (Actimomyces sp, Propionibacterium sp, Lactobacillus sp, Bifidobacterium sp, Eubacterium sp )
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Α. Κλινικές πληροφορίες Β. Μακροσκοπική εξέταση Γ. Άμεση μικροσκοπική εξέταση Δ. Ταυτοποίηση (προκαταρκτική & τελική)
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ (συνέχεια) Α. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ 1. Θέση λοίμωξης 2. Προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών 3. Παραγωγή αερίου 4. Δυσοσμία
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ B. Μακροσκοπική εξέταση Μαύρα πυώδη ή αιματηρά εξιδρώματα Πιθανόν φθορισμός Κοκκία θείου
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ (συνέχεια) Γ. ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Νωπό: Μικροσκόπηση σε σκοτεινό πεδίο για παρατήρηση των σπόρων και της κινητικότητας Χρώση Gram: Θέτει την αρχική υποψία της παρουσίας αναεροβίων βακτηρίων Προσφέρει σημαντική βοήθεια στην αρχική εμπειρική θεραπεία
Χλωρίδα εντέρου
Lactobacillus sp
Θρεπτικά υλικά για αναερόβια Brucella blood agar εμπλουτισμένο με αιμίνη και βιταμίνη Κ1 Phenyl ethyl alcohol blood agar (PEA) kanamycin-vancomycin laked blood agar (KVLB) Bacteroides bile-esculin esculin agar (BBE) Thioglycolate broth εμπλουτισμένο με βιταμίνη K 1 και αιμίνη
Δ. Προκαταρκτική ταυτοποίηση αναεροβίων Mορφολογία των αποικιών Xρώση Gram Aπλέςπλές δοκιμασίες Πλήρης ταυτοποίηση Βιοχημικές δοκιμασίες Συστήματα ταυτοποίησης ταυτοποίησης (Rapid ID 32A, BBL Crystal ANR, RapID ANA II ) Δισκία ενζυματικών αντιδράσεων Υγρή-αέρια χρωματογραφία
Εξέταση των καλλιεργημάτων Συνήθως πολυμικροβιακή ανάπτυξη με άλλα αναερόβια και αερόβια Ενδείξεις αναεροβίων: 1. Δυσοσμία 2. Περισσότεροι τύποι αποικιών στο αιματούχο αναερόβιο από το σοκολατόχρωμο 3. Ανάπτυξη στο υλικό ΒΒΕ ή στο KVLB 4. Κεραμιδί φθορισμός (μετά έκθεση σε UV φως 366 nm) ή μαύρες αποικίες στο KVLB ή στο αιματούχο αναερόβιο 5. Από κάθε διαφορετικό μορφότυπο αποικίας εκτελείται χρώση Gram, έλεγχος αεροβιώσεως σε σοκολατόχρωμο άγαρ (24-48 48 h CO 2 5-10%) και απομόνωση σε αιματούχο ανερόβιο με δισκίο metronodazole 6. Ανάπτυξη μόνο στο αιματούχο αναερόβιο σημαίνει αναερόβιο βακτήριο 7. Μερικά αναερόβια αναπτύσσονται σε περιβάλλον CO 2 5-10%
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΓΡΗΓΟΡΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ Clostridium sp (από καθαρό καλλιέργημα) Χρώση Gram Μορφολογία αποικιών Έλεγχος αεροβίωσης Δίσκοι ειδικής περιεκτικότητας (Vancomycin 5 μg, Kanamycin 1000 μg, Colistin 10 μg) Λιπάση Λεκιθινάση Παραγωγή ινδόλης Αναγωγή νιτρικών δισκία Καταλάση Φθορισμός Παραγωγή ουρεάσης Δοκιμασία παραγωγής σπόρων (alcohol shock) Ανάστροφη CAMP Nagler test
Χαρακτηριστικά αποικιών κλωστηριδίων Μεγάλες αποικίες με διπλή ζώνη αιμόλυσης (C. perfringens, C.novyi ) Μεγάλες ριζοειδείς ( Clostridium sp ) Ερπύζουσες αποικίες (C. septicum, C. tetani, C. sordellii, C. sporogenes) Οσμή (στάβλου αλόγων C. difficile) Χρώμα αποικιών
C. novyi
C. difficile
C. septicum
ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ C. difficile κιτρινοπράσινος C. innocuum κιτρινοπράσινος C. ramosum κόκκινος
Μικροσκοπική εικόνα C. perfringens: Gram (+) βακτηρίδια μεγάλα με τετραγωνισμένα άκρα, χωρίς σπόρους C. septicum: Μακρύ, λεπτό, πολύμορφο νηματοειδές με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. novyi : Mεσαίου μεγέθους με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους C. difficile: Μακρύ, λεπτό, με υποτελικούς ωοειδείς σπόρους
C. perfringens
C. difficile
C. difficile
C. sporogenes
C. novyi
C. tetani
C. septicum
Λεκιθινάση + C. perfringens
Λιπάση + C. sporogenes
ΒΑΚΤΗΡΙΟ C. perfringens 1 C. Sordellii 1 C. bifermentans C. barati 1 C. limosum C. novyi A C. sporogenes 1 Nagler θετικά ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗΣ ΛΙΠΑΣΗΣ 1 ΛΕΚΙΘΙΝΑΣΗ + + + + + + - ΛΙΠΑΣΗ - - - - - + +
C. perfringens Ανάστροφη δοκιμασία CAMP
Nagler test Αντιτοξίνη C. perfrringens
ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΣΤΗΡΙΔΙΩΝ Ινδόλη Νιτρικά Φθορισμός Λεκιθινάση Λιπάση Ουρεάση Τετράγωνα άκρα Διπλή β- αιμόλυση C. perfringens - - + - + - - + + C. bifermentans + - - + - - - - C. sordellii + - - + - + - - C. septicum - - + - - - - - - C. sporogenes - - - - + - - -
Προκαταρκτική ταυτοποίηση κλωστηριδίων + Λεκιθινάση - + Λιπάση - + Λιπάση - C. novyi C. bifermenntas C. sordelli C. sporogenes Closridium sp C. barati C. limosum C. perfringens + Ινδόλη - C. bifermenntas C. sordelli + Ουρεάση - C. sordelli C. bifermenntas C. barati C. limosum C. perfringens + C. limosum C. perfringens Ζελατίνη - C. barati
Ένζυμα Glutamic acid decarboxylase ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΕΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ Θετικό αποτέλεσμα Βακτήρια amine (μπλε χρώμα) C. sordelii (+) C. bifermentans (-) L-proline aminopeptedas e β-naphythylamine + cinnamaldehyde ( ροζ-πορφυρό χρώμα) C. difficile (+) C. innocuum (-) α-glucosidase μπλε φθορισμός (με UV 360 nm) 4-methylumbelliferone C. septicum (+) C. sporogenes (-) Αλκαλική φωσφατάση 4- nitrophenol Κίτρινο χρώμα An. hydrogenalis (+) An. accacharolyticus (-)
RapID ANA II Panel (remel)
Σακχαρολυτικά πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεθινά ση Λιπά ση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλί νη C. bifermentans + - + - - - + ΩΥ + C. Sordelii + - + - +- - + ΩΥ - C. perfringens + - - - - +- - Οχι - C. novyi + + - - - - + ΩΥ - C. sporogenes - + - - - - + ΩΥ + C. cadaveris - - + - - - + ΩΥ - C Septicum - - - - - Π + ΩΥ + C. difficile - - - - - - + ΩΤ + C. putrificum - - - - - - + Τ -+
Σακχαρολυτικά μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθι νάση Λιπ άση Ινδό λη Αερό βια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκου λίνη C. barati + - + - - - + Τελικός ΟΧΙ + C. tertium - - - + - - + AN + C. butyricum - - - - - - - ΩΤ + C. innocum - - - - - - ΩΤ + C. ramosum - - - - - - + Σ, ΩΤ Σπάνιος + C Clostridioform - - - - - +_ + ΩΥ, ΟΧΙ +
Μη σακχαρολυτικά μη πρωτεολυτικά κλωστηρίδια Λεκιθινά ση Λιπάση Ινδόλη Αερόβια ανάπτυξη Ουρία Νιτρικά Κινητικό τητα Θέση σπόρων Εσκουλίνη C. tetani - - Π - - - + Σ,Τ - C. hastiform - - - - - _+ + Υ - C. Subterminale -+ - - - - - + ΩΥ, ΟΧΙ -+ C. histoyticum - - - +- - - + ΩΥ - C. limosum + - - - - - + Υ -
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΚΟΚΚΩΝ E Δίσκοι SPS A Peptostreptococcus anaerobius Ινδόλη + - + An. prevotii An. terradius + α-γαλακτοσιδάση - Ουρεάση - Micromonas micros <0,6 μm Finegoldia magna > 0,6 μm + Pn. asaccharolyticus An. hydrogenalis Αλκαλική φωσφατάση ήζύμωσηγλυκόζης - - An. prevotii An. tetradius An. hydrogenalis Pn.αsaccharolyticus
P. anaerobius
Gram θετικά βακτηρίδια μη σπορογόνα A. israeli
A. israeli
A. odondolyticus
Propionibacterium acnes
ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ GRAM ΘΕΤΙΚΩΝ ΜΗ ΣΠΟΡΟΓΟΝΩΝ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ Βακτήρια Νιτρικά Καταλάση Ινδόλη Εσκουλίνη Ουρεάση Χρώμα αποικιών Ανάπτυξη Actinomyces sp + -+ - +- +- A. israelii +- - - + - - Α, Μ A. odontolyticus + - -- +- - +- Α, Μ A. naeslundii +- - - +- + - Α, Δ A. viscosus +- + - +- + - Α, Μ A. meyeri -+ - - -+ - - Α Propionibacterium sp +- +- -+ +- Α, Μ P. acnes +- +- +- - Α, Μ - + - - P. granulosum P. anidum - + - + Bifidobacterium sp - -+ - +- Α, Μ B. dentium - - - + Α Lactobacillus sp -+ - - +- Α, Μ Eubacterium sp +- - -+ +- Α + -+ - - E. lentum Α Α: αναερόβια Isenberg 2005 Δ: δυνητικά αναερόβια Μ: μικροαερόφιλα
Προκαταρκτική ταυτοποίηση Gram (+) Μη σπορογόνων βακτηριδίων Διφθεροειδή, πολύμορφα ή διακλαδιζό μενα Διφθεροειδή με διακλαδιζόμενα άκρα διφθεροειδή, Πολύμορφα Ήομαλά Κοντά ή μακρυά λεπτά βακτηρίδια Συχνά σε αλυσίδες Καταλάση(+) Καταλάση(-) Eubacterium sp Bifidobabacterium Lactobacillus Propionibacterium sp Actinomyces viscosus Νιτρικά (-) Νιτρικά(+) E. limosum E. lentum Iινδόλη (+) Iινδόλη (-) P. propionicum A Israelii, A.odontolyticus Α. naeslundii, A. meyeri P. acnes Α. Viscosus: Ουρία(+) Νιτρικά (+) Propioniba cteriun sp
Ερώτηση 1 η Gram θετικό, σπορογόνο αναερόβιο βακτηρίδιο, (απομονώθηκε από κ/α αποστήματος σε χρήστη ενδοφλεβίων ναρκωτικών ουσιών) με: διπλή ζώνη β- αιμόλυσης λεκιθινάση( ( +) λιπάση (+) είναι: 1. C. perfringens 2. C. sporogenes 3. C. novyi 4. Όλα τα ανωτέρω
Ερώτηση 2 η Gram (+) αναερόβιος κόκκος, ευαίσθητος στη Metronidazole με ζώνη αναστολής στο SPS >= 12 mm είναι: 1. Micromonas micros 2. Pertosrteptococcus anaerobius 3. Finegoldia magna 4. Όλα τα ανωτέρω