από είδη μυκήτων. Από ιας (AIDS). Επειδή η πρόγνωση ΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΩΝ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μ ι κροβιολογίας Δ.Π.Θ.

1 ΙΑΤΡΙΚΉ ΠΑΙΔΕΙΑ 1999. 7:2 ΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΩΝ Σοφία Κτεvίδου - Καρτάλη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μ ι κροβιολογίας Δ.Π.Θ. Οι μυκητιασικές λοιμώξεις απέκτησαν τελευταία ι δ ιαίτ ερο ενδιαφέρον, λόγω της συνεχώς αυξανόμενης συχνότητάς τους μεταξύ των λευχαιμικών, των μεταμοσχευθέντων και των άλλων ανοσοκατασταλμένων ασθενών όπως και των ασθενών που πάσχουν από το σύνδρομο της επίκτητη ς ανοσολογική ς ανεπάρκε ιας (AIDS). Επειδή η πρόγνωση των λο ιμώξεων αυτών είναι φτωχή, η ταχεία διάγνωση είναι ουσιώδης προκειμένου να αρχίσει έγκαιρα η κατάλληλη θεραπεία, η οποία βασίζεται στη συνεργασία μετ αξύ των εργαστηριακών και κλι νικών γιατρών. ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Το Εργαστήριο με τη μεθοδολογία του προσφέρει χρήσιμες πληροφορίες στους κλινικούς με τις οποίες θα μπο ρέσουν να επιβεβαιώσουν την κλιν ική δ ιάγνωση και θα αναγνωρίσουν τη μυκητιασική αιτία μιας λοίμωξης άγνωστης α ιτ ιολογίας ή θα την αποκλείσουν στην περίπτωση που υπάρχει διαγνωστ ικό πρόβλημα. Η εργαστηρ ιακή έρευνα αποσκοπεί στην ακρ ιβή και ταχεία κατάδειξη και απομόνωση του υπεύθυνου μύκητα από το κλινικό υλικό, στην ταυτοπ ο ίηση του στελέχους που απομονώθηκε και στη διάκριση των γνωστών ή δυνητικά παθογόνων μυκήτων από τις επ ιμολύνσεις ή τις απομονώσεις που στερούνται ιδιαίτερης σημασίας 1 Υπάρχουν περισσότερα από 50.000 είδη μυκήτων. Από αυτά μόνο 50-75 είδη έχουν αναγνωρισθεί ως παθογόνα γ ια τον άνθρωπο 2 Ο ι μύκητες που συνήθως συναντώνται στο κλινικό Εργαστήριο φαίνονται στον πίνακα 1. ΑΠΟΣΤΟΛΉ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Για την επιτυχία του σκοπού αυτού, το εργαστήριο θα πρέπει να παραλάβει το σωστό δείγμα. Το δείγμα δηλαδή το οποίο έχε ι κατάλληλα επ ιλεγεί και συλλεγεί και το οποίο θα συνοδεύ εται από επαρκή πληροφόρηση και ενημέρωση για την υποψία της μυκητιασικής λοίμωξης. Είναι ουσιαστικό, να αναφέρο νται, σε συντομία, πληροφορίες που έχου ν σχέση με το ι στορικό του ασθενούς, τη θεραπεία με αντιμικρο β ιακά, κυτταροτοξικά ή ανοσοκατασταλ τικά φαινόμενα, την υποκειμένη νόσο, το επάγγελμα, τα ταξίδια ή την παραμονή σε χώρες του εξωτερικού και την επαφή με ζώα. Θα πρέπει επίσης να αναφέρε-

1 ται η πηγή προέλευσης του δείγματος, ο χρόνος και ο τρόπος συλλογής και το υλικό μεταφοράς, αν χρησιμοποιήθηκε. Οι πληροφορίες αυτές βοηθούν το Εργαστήρ ιο να υποπτευθεί τον υπεύθυνο μύκητα και να επιλέξει τις πιο κατάλληλες μεθόδους για την κατ άδειξή του. ΕΙΔΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΣΥ ΛΛΟΓΗ Α ΥΤΩΝ 1 Τα είδη των δειγμάτων που αποστέλλονται, πο ικίλλουν από λοίμωξη σε λοίμωξη και εξαρτώνται από την ανατομική θέση, στην οποία εντοπίζεται η λοίμωξη. Έτσι, από τις επ ιφανειακές μυκητιάσεις θα σταλούν ξέσματα (λέπια) από το δέρμα του τριχωτού της κεφαλής, το λεπτ ό άτριχο δέρμα, τις παλάμες και τα πέλματα, τις μηρογεννητικές πτυχές, τις τρίχες και τα νύχια. Για τη λήψη ξεσμάτων από το δέρμα χρησιμοποιείται αμβλύ ξέ στρο ή το χείλος αντικειμενοφόρου πλάκας. Τα ξέσματα συλλέγονται από την περιφέρεια της βλάβη ς, περιοχή όπου υπάρχει ο μύκητας ζωντανός. Οι τρίχες αποσπώνται με λαβίδα. Συγκεκριμένα συλλέγεται το κο λόβωμα της σπασμένης τρίχας, που απομένει στην επιφάνε ια του τριχωτού της κεφαλής. Κομμένες τρίχες δεν αποτελούν ικανοπο ιητικό υλικό. Δείγματα θα πρέπει να ληφθούν από αρκετά σημεία των βλαβών. Επίσης συλλέγεται το βύσμα από το θύλακο της τρίχας, αν υπάρχει. Για την επιλογή των μολυσμένων τριχών χρησιμοποιείται η λάμπα του Wood, η οποία εκπέμπε ι υπεριώδη ακτινοβολία προκαλώντας χαρακτηρι- στικό φθορισμό της μολυσμένης τρίχας από ορισμένα είδη δερματοφύτων. Τα νύχια ψαλιδίζονται και συλλέγονται τα κομμάτια ή τα ρινίσματά του ς. Αν υπάρχει πάχυνση του νυχιού μπορεί να συλλεγούν και ξέσματα. Επιλέγεται κάθε αποχρωματισμένη, χωρίς στιλπνότητα, δυστροφική και εύθρυπτη περιοχή του νυχιού. Το δείγμα κόβεται, όσο είναι δυνατόν, π ι ο βαθειά από το ελεύθερο χείλος και περιλαμβάνει όλες τις στ ιβάδες του νυχιού. Δεδομένου ότι μερικοί κατώτερες. μύκητες περιορίζονται μόνο στις Συχνά ο μύκητας δεν είναι ζωντανός στο ελεύθερο χείλος του νυχιού και έτσι ε ίναι δυνατόν, ενώ είναι ορατός κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση, σ' ένα ποσοστό 40-50% των περιπτώσεων, να μην αναπτύσσεται στην καλλιέργεια. Μερικές φορές η αλλοίωση στο δέρμα μπορεί να είναι ελάχιστη και να μην υπάρχει αρκετό υλ ικό για λήψη, όπως αυτό συμβαίνει π.χ. με τις βλάβες στο άτριχο δέρμα. Τότε ακολουθείται η λήψη του δείγματος με την μέθοδο της δ ιαφανούς κολλητικής ταινία ς (Sellotape). Κατά τη μέθοδο αυτή, εφαρμόζεται η ταινία με την κολλητική επ ι φάν ειά της πάνω στη βλάβη, όπου π ιέζεται και στη συνέχεια αποσπάται και τοποθετ είται με την επιφάνεια αυτή πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα για μικροσκοπική παρατήρηση. Σε λοιμώξεις των βλεννογόνων της στοματικής κο ιλ ότ ητας ή του κόλπου είναι προ τιμότερο να ληφθούν ξέσματα με αμβλύ ξέστρο ή σπάτουλα από την επιφάνεια του επιθηλίου και από τα ση-

1 μεία στα οποία υπάρχει ερυθρότητα και /ή λευκές πλάκες. Όμως χρησιμοποιούνται συχνότερα στυλεοί και λαμβάνεται επίχρισμα ή έκκριμα και αυτό γιατί είναι ευκολώτερη η λήψη και η μεταφορά του δείγματος στο εργαστήριο. Ιδιαίτερα σε κολπίτιδα, είναι προτιμότερη η συλλογή εκκρίματος από το αιδοίο ή τον κόλπο. Επειδή οι ζυμομύκητες χάνουν γρήγορα τη βιωσιμότητά τους σε αποξηραμένους στυλεούς, θα πρέπει αυτοί να υγραίνονται με απεσταγμένο νερό ή φυσιολογικό ορό, πριν τη λήψη του δείγματος ή να τοποθετούνται σε υλικό μεταφοράς. Στις υποδόριες λοιμώξεις συλλέγονται ξέσματα, εφελκίδες από τις επιφανειακές εκδηλώσεις της βλάβης. Όταν υπάρχει διαπύηση, συλλέγεται πύον με αποστειρωμένη βελόνη και σύριγγα και κοκκία, αν υπάρχουν, καθώς και βιοψίες των ιστιί:>ν που έχουν προσβληθεί. Τέλος από τις συστηματικές μυκητιάσεις αποστέλλονται δείγματα αίματος για καλλιέργεια, πύον αποστημάτων, υλικό εξελκώσεων (πρωτοπαθών, δευτεροπαθών), μυελός των οστών, εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ), ούρα, ξέσματα από τον οφθαλμό, διάφορα υγρά (πλευρικό, περιτοναϊκό αρθρικό), πτύελα (προκλητή απόχρεμψη) βρογχικό και βρογχοκυψελιδικό έκκριμα, υλικό αναρρόφησης από την τραχεία ή βιοψία από τον πνεύμονα. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΩΝ ΔΕΙ ΓΜΑΤΩΝ Τα δείγματα μετά τη συλλογή τους σε αποστειρωμένα δοχεία, μεταφέρονται στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο. Δείγματα όπως πτύελα, ούρα, βιοψίες θα πρέπει να μεταφερθούν, όσο είναι δυνατόν, ταχύτερα. Σε αντίθετη περίπτωση, τα δείγματα διατηρούνται σε ψυγείο στους 4oC. Έτσι αποφεύγεται η υπερανάπτυξη βακτηρίων ή άλλων μυκήτων, που τυχόν συνυπάρχουν στο δείγμα και ελαχιστοποιείται ο κίνδυνος απώλειας παθογόνων μυκήτων, όπως π.χ. Histoplasma, Cryptococcus, Blastomyces, των οποίων ο αριθμός στο δείγμα είναι μικρός. Ακόμη δίνεται η δυνατότητα της ακριβούς εκτίμησης της υπάρχουσας ποσότητας του μύκητα στο δείγμα. Τα παραπάνω δεν ισχύουν για δείγματα όπως λέπια δέρματος, τρίχες και νύχια στα οποία η αποξήρανση, λόγω παραμονής του δείγματος, προκαλεί μείωση της βακτηριακής επιμόλυνσης και μπορεί το δείγμα να διατηρηθεί επί μήνες. ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Όταν τα δείγματα φθάσουν στο Εργαστήριο ελέγχεται η καταλληλότητά τους. Ακατάλληλα θεωρούνται τα δείγ ματα που έχουν αποξ ηρανθεί ή έχουν τοποθετηθεί σε μονιμοποιητικό υγρό. Τα δείγματα που περιέχουν σάλιο αντί πτύελα. Τα 24ωρα δείγματα πτυ έλων ή ούρων καθετηριασμένων ασθενών. Δείγματα που χύθηκαν κατά τη μεταφο ρά και μολύνθηκαν ή είναι επικίνδυνα για το προσωπικό, που θα ασχοληθεί με αυτά. Ανεπαρκή δείγματα ή δείγματα που καθυστέρησαν κατά τη μεταφορά (εκτός λεπίων, τριχών και νυχιών). Σ '

1 όλες τις περιπτώσεις αυτές θα ζητηθούν νέα δείγματα. Ωστόσο θα πρέπει να τονιστεί ότι, θα χρησιμοποιηθεί το όποιο δείγμα υπάρχει, όταν το πρόβλημα του ασθενούς είναι επείγον ή είναι δύσκολη ή και επικίνδυνη η λήψη άλλου δείγματος. Όταν η ποσότητα του δείγματος που στάλθηκε είναι ανεπαρκής, τότε αυτή θα χρησιμοποιηθεί μόνο για καλλιέργεια. Αρχικά τα δείγματα εξετάζονται μακροσκοπικά και επιλέγεται αντιπροσωπευτικό τμήμα για περαιτέρω έρευνα. Έτσι για παράδειγμα, από τα πτύελα ή τους ιστούς θα επιλεγεί το τμήμα που παρουσιάζει διαπύηση, αίμα ή νέκρωση. Η μελέτη των δειγμάτων περιλαμβάνει την άμεση μικροσκοπική εξέταση, την καλλιέργεια, την ταυτοποίηση του μύκητα και την ιστολογική εξέταση. ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Α.ΑΜΕΣΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Αμέσως μετά την επισκόπιση αρχίζει η χωρίς καθυστέρηση επεξεργασία των δειγμάτων για λόγους που αναφέρθηκαν παραπάνω. Η διαδικασία επεξεργασίας περιλαμβάνει προετοιμασία των δειγμάτων για εξέταση και τις μεθόδους μελέτης αυτών. α. Προετοιμασία των δειγμάτων Η προετοιμασία των δειγμάτων έχει σκοπό την κατάδειξη μικρού αριθμού μυκήτων, που υπάρχουν στο δείγμα. Όταν η ποσότητα του δείγματος είναι μεγάλη όπως π.χ. τα ούρα, το ΕΝΥ, η προετοιμασία περιλαμβάνει τη φυγοκέντρηση και τη λήψη του ιζή ματος ενώ όταν αυτή είναι μικρή όπως π.χ. το βρογχικό έκπλυμα, ακολουθεί διήθηση μέσω φίλτρων, με πόρους μεγέθους 0,45 μm, ενσωματωμένων σε αποστειρωμένη σύριγγα. Επί παρουσίας βλέννης στο δείγμα π.χ. πτύελα ακολουθεί ρευστοποίηση. Όταν πρόκειται για κόπρανα ή βιοψίες ιστών χρειάζεται ομογ εν οποίηση. β. Μέθοδοι μελέτης των δειγμάτων Η άμεση μικροσκοπική εξέταση του κλινικού υλικού είναι μια σημαντική προκαταρκτική μέθοδος, η οποία προσφέρει την πρώτη συνάντηση με το παθογόνο αίτιο. Είναι μέθοδος γρήγορη, εύκολη και συχνά δίνει τη δυνατότητα μιας πιθανής διάγνωσης. Σε μερικές περιπτώσεις μάλιστα, μπορεί να αρχίσει η θεραπεία με βάση τα αποτελέσματα της άμεσης μικροσκοπικής εξέτ ασης. Γεγονός, ιδιαίτερα σημαντικό στις περιπτώσεις των ευκα ιριακών λοιμώξεων στους ανοσοκατασταλμένους. Ορισμένες φορές, η τελική διάγνωση της μυκητιασικής λοίμωξης εξαρτάται από τη μικροσκοπική παρατήρηση καθόσον, ενώ καταδεικνύεται ο μύκητας στο άμεσο πα ρασκεύασμα, δεν επ ιτυγχάνεται η απομόνωσή του στην καλλιέργεια, όπως αυτό συμβαίνει π.χ. στα νύχια 4 Η ευαισθησία και η ε ιδικότητα της άμε σης μικροσκοπικής εξέτασης εξαρτάται από την εμπειρία του παρατηρητή. Εφαρμόζετα ι σε παρασκευάσματα, που ετοιμάζονται απ ' ευθείας από το κλινι-

1 κό υλικό. Τα περισσότερα δείγματα μπορούν να εξεταστούν σε, α. νωπό παρασκεύασμα. Το δείγμα χρειάζεται μερική πέψη με σκοπό τη λέπτυνση και διαύγαση των κυττάρων των ιστών και. επιτυγχάνεται i. με την επίδραση διαλύματος υδροξειδίου του καλίου (ΚΟΗ) πυκνότητας 10-30% και παραμονή επί Ι 0-20 ' σε θερμοκρασία δωματίου ή μετά από ήπια θέρμανση πάνω από τη φλόγα Bunsen. Υπερβολική θέρμανση του παρασκευάσματος θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί προκαλεί σχηματισμό κρυστάλλων ΚΟΗ, οι οποίοι μπορούν να καλύψουν λεπτομέρειες του παρασκευάσματος ii. Ενσωμάτωση διαλύματος διμεθυλ-σουλφοξειδίου (DMSO) 4% στο ΚΟΗ με συνέπεια την αποφυγή θέρμανσης του παρασκευάσματος και iii. κατεργασία με παγκρεατικά ένζυμα στην περίπτωση που το δείγμα πρόκειται αρχικά να μικροσκοπηθεί και στη συνέχεια να καλλιεργηθεί. Η παρατήρηση γίνεται με το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. Ιδιαίτερα ικανοποιητική όμως είναι, η παρατήρηση με το μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου ή "αντίθεσης φάσης" κατά την οποία παρατηρούνται λεπτομέρειες, που δεν είναι ορατές με το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου, λόγω μικρών διαφορών στο δείκτη διάθλασης μεταξύ των δομών του μύκητα και του περιβάλλοντος. Μερικές φορές η παρατήρηση νωπού παρασκευάσματος δεν είναι ικανοποι ητική για την κατάδειξη μυκήτων, όπως αυτό συμβαίνει π.χ. με τα μικρού μεγέθους βλαστοκύτταρα του μύκητα Histoplasma στις ύποπτες περιπτώσεις Ιστοπλάσμωσης. Στην περίπτωση αυτή θα προτιμηθεί η παρατήρηση σε β. χρωματισμένο παρασκεύασμα. Για την χρώση των παρασκευασμάτων από το αίμα, τα πτύελα ή το πύον προτιμάται η χρώση Giemsa. Εμφάνιση των μυκήτων στους ιστούς κατά την άμεση μικροσκοπική παρατήρηση. 1. ΙΣΤΟΙ ΚΕΡΑΤΙΝΗΣ Κατά την άμεση μικροσκοπική παρατήρηση μετά την κατεργασία με KOH/DMSO στα λέπια του δέρματος, τις τρίχες και τα νύχια εμφανίζονται οι υφές των μυκήτων ως διακλαδιζόμενα διαφανή (υάλινα) νημάτια με το αυτό πλάτος, που διαπερνούν τα τοιχώματα των κυττάρων των ιστών του ξενιστή. Οι υφές των δερματοφύτων συχνά διασπώνται σε αρθροκονίδια ( αρθροπόρια). Στην ποικιλόχρουν πιτυρίαση, η διάγνωση γίνεται εύκολα από τις μορφές "μπανάνας και τσαμπιού σταφυλιού", που χαρακτηρίζουν τον μύκητα στα δείγματα, που συλλέγονται με την μέθοδο κολλητικής ταινίας (Sellotape) και τις κοντές, ελαφρώς καμπυλωτές υφές σε ξέσματα του δέρματος. Οι τρίχες εξετάζονται πολύ προσεκτικά καθώς μπορεί να υπάρχει μικρός αριθμός υφών στο μολυσμένο υλικό. Εν τούτοις, παράγονται άφθονα αρθροκονίδια μέσα στο στέλεχος της τρίχας (ενδοτριχικά) ή κατά μήκος της εξωτερικής επιφάνειάς της (εξωτριχικά) με μικρό ή μεγάλο μέγεθος. Ο τύπος προσβολής της τρίχας είναι χαρακτηριστικός

1 για τα διάφορα είδη δερματοφύτων. Οι μέθοδοι χρώσης δεν χρησιμοποιούνται για τα δείγματα των ιστών κερα τίνης, γ ιατί είναι χρονοβόρες αλλά και γ ιατί δεν βοηθούν στη διάκριση των μυ~ κήτων. Η μόνη εξαίρεση είναι η χρώση με calcofluor white, κατά την οποίαν ο ι υφές των μυκήτων δίνουν έναν έντονο πράσινο, σαν του μήλου, φθορισμό. 2. ΠΤΥΕΛΑ ΚΑΙ ΒΡΟΓΧΙΚΑ ΕΚΠΛΥΜΑΤΑ Βλεννώδη δείγματα μπορούν να εξεταστούν απ' ευθείας, χωρίς να προ ηγηθ εί η συμπύκνωσή τ ους. Εξετάζονται κατό πιν προσθήκης διαλύματος ΚΟΗ/ DMSO. Επί αρνητικού αποτελέσματος θα εξετασθεί δείγμα μετά από συμπύκνωση. Συνήθως, από όλα τα δείγματα της αναπνευστικής οδού μόνον τα ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ βρογχ ικά εκπλ ύματα μπορούν να φυγο Η παρατήρηση στοιχείων του μύκητα στους ιστούς κερατίνης μπορεί να θεωρηθεί ως πιθανή ένδειξη μυκητιασικής λοίμωξης, η οποία επ ιβεβαιώνει την κλινική διάγνωση και επιτρέπ ε ι την έναρξη της αντιμυκητιασικής θεραπ ε ί ας. Κατά την μικροσκοπική παρατήρηση όλα τα δερματόφυτα εμφανίζοντα ι με την ίδια μορφολογία. Εξαίρεση αποτελεί ο μύκητας Malassezia furfur στα λέπ ια του δέρματος, του οπο ίου έχε ι αναφερθ εί προηγούμενα η χαρακτηριστική μορφολογία και ο μύκητας Scopulariopsis brevicaulis στα νύχια, ο οποίος εμφανίζει χαρακτηριστικούς σπόρους με ανώμαλο τοίχωμα. Η ταυτοποίηση του παθ ογόνου αιτίου μπορεί να γίνε ι με την απομόνωσή του στην καλλιέργεια. Γενικά ό μως η παρουσία υάλινων υφών, που δ ιασπώνται σε αλυσίδες αρθροκονιδίων, είναι ενδε ικτική λοίμωξης με δερματόφυτα ενώ εκβλάστανα βλαστοκύτταρα και ψευδοϋφές είναι ενδε ικτικά λοίμωξης με ζυμομύκητα. κεντρηθούν χωρίς να προηγηθεί ρευστοποίηση. Τα πτύελα και τα άλλα βλεννώδη δείγματα χρειάζεται να ρευ στοπο ιηθούν με ένα βλεννολυτικό μέσον όπως, παγκρεατίνη 0.5%, Ν -ακετυλο-κυστείνη 0.5 %, sputolysin η οποία περιέχε ι διθειοθρεϊτόλη και παγκρεατικά ένζυμα. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Η μορφολογία με την οποίαν εμφανίζεται ο μύκητας στα δείγματα των κατώτερων αναπνευστικών οδών, μπορεί να καθορίσε ι τη σημασία του μύκητα και να βοηθήσει σiην ταυτοποίησή του. Με βάση τη μορφολογία μπορεί να ανα γνωριστούν οι παρακάτω ομάδες. i. Εκβλαστάνοντα κύτταρα σε συνδυασμό με ψευδοϋφές ή αληθείς υφές Με το συνδυασμό των μορφών αυτών εμφανίζονται κυρίως τα είδη Candida και συνήθως η C. albicans. Τα περισσότερα δείγματα πτυέλων περιέχουν υφές Candida, που ουσιαστικά δεν έχουν σημασία. Πρόκειται για επιμόλυνση από f

1 το στοματοφάρυγγα ασθενών και ειδικά αυτών που παίρνουν αντιβιοτικά ευρέος φάσματος. ίί. Αληθείς υφές απουσία βλαστοκύττα-. ρων Σε πρόσφατα δείγματα η παρουσία αληθών υφών χωρίς ψευδοϋφές και βλαστοκύτταρα έχει, σχεδόν πάντα, παθολογική σημασία και αντιπροσωπεύει ευκαιριακή λοίμωξη. Στην αναπνευστική οδό ο Aspergillus fumigratus κυριαρχεί μεταξύ των μυκήτων που προκαλούν ευκαιριακές λοιμώξεις σ ' όλον τον κόσμο. Κατά την άμεση μικροσκόπιση μπορούν να αναγνωρισθούν λοιμώξεις από τα είδη Asperigillus αλλά και από διάφορα άλλα είδη όπως οι Ζυγομύκητες. Οι υφές των Ασπεργίλλων είναι σχετικά στενές, διαφανείς (υάλινες), άχρωμες, διηρημένες. Διαθέτουν διακλαδώσεις διχοτομικές, που συμβαίνουν υπό οξεία γωνία 45. Οι υφές των Ζυγομυκήτων είναι επίσης υάλινες, αλλά συνεχείς καθότι στερούνται διαφραγμάτων ή διαθέτουν σπάνια. Διαθέτουν διακλαδώσεις που σχηματίζονται υπό ορθή γωνία. Είναι πλατειές, με ποικίλλο πλάτος που φθάνει τα 50 μm. Εμφανίζονται σαν κορδέλλες με τάση να σχηματίζουν πτυχές. Μερικές φορές μπορεί να βρεθούν τυχαία σε παρασκευάσματα των πτυέλων ασθενών με αλλεργική βρογχοπνευμονική Ασπεργίλλωση, υφές ειδών Penicillium. Είναι υάλινες, διηρημένες αλλά διαθέτουν πολύ λιγότερες διακλαδώσεις από ότι οι Ασπέργιλλοι. Η ταυτοποίηση τους είναι εύκολη, ιδιαίτερα όταν συμβαίνει σπορογένεση in situ. Συχνότερα οι υφές των ειδών Penicillium διογκώνονται και παίρνουν τη μορφή μπαλονιού. Είναι παροδικές και η σημασία τους άγνωστη. Η διάγνωση της λοίμωξης από τον Ασπέργιλλο μπορεί να γίνει και μόνο από τις χαρακτηριστικές υφές κατά την άμεση μικροσκόπηση. Κατά την ανάπτυξη του μύκητα στην κατώτερη αναπνευστική οδό είναι δυνατόν να συμβεί απόχρεμψη τμημάτων του, που είναι χαρακτηριστικά του τύπου της λοίμωξης. Μάλιστα ένας έμπειρος εργαστηριακός θα μπορούσε να εκτιμήσει τον τύπο της λοίμωξης -αλλεργική βρογχοπνευμονική Ασπεργίλλωση, διηθητική ή νεκρωτική Ασπεργίλλωση και το Ασπεργίλλωμα- από την ποικιλομορφία των υφών. Όσον αφορά τις κεφαλές ασπεργίλλων, αυτές βρίσκονται σπάνια στο άμεσο παρασκεύασμα και συνήθως όταν ο μύκητας αναπτύσσεται, κατά τον αρχικό αποικισμό, σε αεριζόμενο χώρο όπως ο αυλός των βρόγχων ή κοιλότητα στον πνεύμονα. Σε μια αναλογία περιπτώσεων Ασπεργιλλώματος οι υφές που παράγονται, δεν αναπτύσσονται στην καλλιέργεια. Στις περιπτώσεις αυτές η άμεση μικροσκόπηση αποτελεί το μόνο μέσο για τη διάγνωση της λοίμωξης. Γι' αυτό και η διαφορο ποίηση της χαρακτηριστικής μορφολογ ίας των υφών βοηθάει σημαντικά. iii. Σφαιρίδια Με τη μορφή αυτή εμφανίζεται ο μύκητας Coccidioides immitis στα πτύελα συμπτωματικών ασθενών, οι οποίοι επισκ έφθηκαν πρόσφατα ορισμένες περιο-

1 χές της Αμερικής, όπου ενδημεί ο μύκητας. Πρόκειται για άφθονους σφαιρικούς σχηματισμούς μεγάλου μεγέθους (30-60 μm). iv. Βλαστοκύτταρα μόνον Με τη μορφή αυτή εμφανίζονται οι μύκητες, α. Cryptococcus neof ormans, που εμφανίζει παγκόσμια κατανομή. Ο Cr. neoformans είναι ένας μεγάλος (5-20 μm) στρογγυλός ζυμομύκη τας με εκβλάστηση. Περιβάλλεται από παχύ διαθλαστικό έλυτρο, που εμφανίζεται σαν διαφανής ζώνη στο νωπό παρασκεύασμα με KOH/DMSO. β. Οι δίμορφοι μύκητες Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum και Parracoccidioides brasiliensis, που συνδέονται με ορισμένες γεωγραφ ικ ές περιοχές και περιβάλλον έτσι, που το ιστορικό πιθανής έκθεσης θέτει σε επιφυλακή το εργαστήριο. 3. ΕΓΚΕΦΑΛΟΝΩΤΙΑΙΟ ΥΓΡΟ (ΕΝΥ) Οι ζυμομύκητες που προκαλούν μηνιγγίτιδα, βρίσκονται συνήθως σε πολύ μικρούς αριθμούς στο ΕΝΥ, εκτός των περιπτώσεων των ασθενών με AIDS, το ΕΝΥ των οποίων περιέχει μεγάλο αριθμό ζυμομυκήτων παρά την ύπαρξη σχετικά ήπιων συμπτωμάτων. Γι αυτό είναι απαραίτητη η συλλογή τουλάχιστον 5 ml ΕΝΥ. Το ΕΝΥ φυγοκεντρείται (=1.500 g επί 10') και από το ίζημα ετοιμάζεται παρασκεύασμα, που χρωματίζεται αρχικά με χρώση Gram, προκειμέ- νου να αναζητηθούν βλαστοκύτταρα με εκβλάστηση. Εάν φανούν βλαστοκύτταρα, τότε από το ίζημα ετοιμάζεται νέο παρασκεύασμα, στο οποίο προστίθεται ίση ποσότητα σινικής μελάνης ή νιγροσί νης. Επί παρουσίας Cryptococcus εμφανίζεται το έλυτρο σαν διαυγής άλως γύρω από τα στρογγυλά βλαστοκύτταρα. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Η παρατήρηση βλαστοκυττάρων με έλ υ τρο είναι χαρακτηριστική του Cr. neoformans, αν και παρατηρούνται χα ρακτηριστικά σε ασθενείς με AIDS στην Αμερική μορφές χωρίς έλυτρο. Γενικά όμως η παρουσία βλαστοκυττάρων χωρίς έλυτρο δεν είναι ενδεικτικη Cr. neoformans, ενώ είναι πολύ πιθανόν να πρόκειται για είδη Candida και ειδικότερα C. albicans. Όπως και με τα άλλα φυσιολογικά στείρα υγρά που έχουν συλλεγεί με άσηπτες συνθήκες, η παρουσία μυκήτων στο ΕΝΥ απαιτεί άμεση αναφορά, προκειμένου να αρχίσει έγκαιρα η αντιμυκητιασική θεραπεία. Θα πρέπει να δοθεί προσοχή στη σύγχυση που μπορεί να συμβεί με διαυγείς ζώνες, που είναι δυνατόν να εμφανισθούν γύρω από ερυθρά αιμοσφαίρια ή με άλλα σφάλμα τα τεχνικής, που μπορούν εύκολα να εκληφθούν ως έλυτρο. Γι αυτό είναι προτιμότερο η εξέταση του παρασκευάσματος με σινική μελάνη να ακολουθεί την εμφάνιση βλαστοκυττάρων σε χρωματισμένο με χρώση Gram παρασκεύασμα.

4. ΠΥΟΝ ΚΑΙ ΑΛΛΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΕΞΙΔΡΩΜΑΤΑ Στα περισσότερα εργαστήρια, Ετοιμάζεται ένα νωπό παρασκεύασμα με προσθήκη KOH/DMSO για άμεση στα επιχρίσματα από τον κόλπο εφαρμόζεται η άμεση μικροσκόπηση. Η διάγνωση παρατήρηση και δύο χρωματισμένα, το όμως δεν είναι αξιόπιστη. ένα με χρώση Gram και το άλλο με methenamine-silver (GMS). Εξιδρώματα από εν τω βάθει συριγγώδεις πόρους ειδικά των ποδιών και των χεριών ύποπτους για μυκητώματα, θα τοποθετηθούν σε φυσιολογικό ορό και θα παρατηρηθούν με γυμνό μάτι ή με στερεοσκοπικό μικροσκόπιο για την παρουσία κοκκίων. Τα κοκκία θα απομακρυνθούν από το φυσιολογικό ορό, θα ετοιμα Σε μια μελέτη με δείγματα από 257 γυναίκες με βε βαιωμένη κολπίτιδα από Candida, καταδείχθηκαν ζυμομύκητες σε παρασκευάσματα χρωματισμένα με Gram μόνον στα 130 (50.6%) δείγματα. Γι αυτό η απουσία ζυμομυκήτων δεν αποτελεί κριτήριο για τον αποκλεισμό της λοί μωξης4. Σε περιπτώσεις εξωτερικής ωτίτιδας, παρά του ότι στέλνονται συχνά στο ερ στούν παρασκευάσματα, που θα χρω γαστήριο στυλεοί, αυτοί δεν θα πρέπει ματιστούν το ένα με χρώση Gram και το άλλο με GMS. να θεωρούνται σαν αξιόπιστη πηγή υλικού για άμεση μικροσκόπηση καθώς η ποσότητα του 5. ΥΛΙΚΟ ΠΟΥ ΛΑΜΒΑΝΕΤΑΙ ΜΕΣΤΥΛΕΟ μύκητα ποικίλλει σημαντικά και είναι πιθανόν να είναι μικρή. Η λήψη ξεσμάτων είναι περισσότερο ικανοποιητική. Παρόμοια, η λήψη υλικού με στυλεό από τον οφθαλμό δεν Για την λήψη υλικού και την προετοιμασία νωπών παρασκευασμάτων, κυρίως από τους βλεννογόνους, μπορούν έχει αξία στη διάγνωση της μυκητιασικής κερατίτιδας. να χρησιμοποιηθούν στυλεοί μέσα σε υλικό μεταφοράς (υγροί στυλεοί). Το Θα πρέπει να λαμβάνονται, από τον οφθαλμίατρο, ξέσματα από τον κερατοειδή και να εξετάζονται σε KOH/DMSO. παρασκεύασμα εξετάζεται σε μικροσκόπιο φωτεινού ή σκοτεινού πεδίου ή " αντίθεσης φάσης". Η άμεση τοποθέτηση καλ υπτρίδας στο 6. ΟΥΡ Α ΚΑΙ ΑΑΛΑ ΣΩΜΑΤΙΚΑ ΥΓΡΑ παρασκεύασμα το προστατεύει από την ξήρανση. Επίσης ετοιμάζονται παρασκευάσματα που θα χρωματιστούν με χρώση Gram και GMS. Όλα τα σωματικά υγρά χρειάζεται να συμπυκνωθούν. Γι αυτό φυγοκεντρούνται στις 1.500 g Χ 10'. Από το ίζημα ετοιμάζεται παρασκεύασμα, που χρωματίζεται με τη χρώση Gram. Όταν

υπάρχει μεγάλη ποσότητα κυττάρων θα πρέπει να προστεθ εί στο υλικό και KOH/DMSO προκ ειμένου να διαυγαστούν τα κύτταρα και στη συνέχεια να μικροσκοπηθεί το παρασκεύασμα. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Η παρουσία βλαστοκυττάρων ή μυκη τυλλίων (νηματίων) στο ασκιτικό, περιτοναϊκό υγρό και στα άλλα στείρα υγρά, θεωρείται σημαντική. Τα ούρα όμως ε ίναι δυνατόν να μολυνθούν κατά τη συλλογή τους από την ουρήθρα, τον κόλπο ή την ακροπο σθία του ξεν ιστή και έτσι η παρουσία μυκήτων σ ' αυτά, δεν είναι απαραίτητα διαγνωστική αποικισμού των ουροφόρων οδών. Αντίθετα, θα πρέπε ι να αναγνωριστεί ότ ι, η μυκητουρία μπορεί να αποτελεί την πρώτη ένδειξη συστηματικής λοίμωξης. 7. ΙΣΤΟΙ Δείγματα ιστών μπορεί να προέρχονται από οπο ιοδήποτε όργανο. Λαμβάνονται με βιοψία ή αποτελούν δείγμα νεκροτομικό. Είναι σημαντικό, να επιλέγονται τα δείγματα από τις ύποπτες αλλοιώ σεις και περιοχές. Από τα δείγματα ετο ι μάζονται παρασκευάσματα με επανε ιλημμένη πίεση στην επιφάνεια της αντικειμενοφόρου πλακός. Από κάθε δείγμα χρειάζονται δυο τουλάχιστον παρασκευάσματα. Το ένα χρωματίζεται με χρώση Gram και το άλλο με methenamine silver-gms.to δε ίγμα του ιστού τεμαχίζεται σε μικρότερα κομμάτια δ ια- μέτρου 0.5-1 mm, που τοποθετούνται πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα με προσθήκη KOH/DMSO και παραμένουν 5-1 Ο,. Σε πολλές περιπτώσεις η ποσότητα του μύκητα μπο ρε ί να είναι μικρή, γ ι αυτό καλό θα ε ίναι μ ετά την προσθήκη ΚΟΗ 10% ή 20%, να ακολουθήσει χρώση με Calcofluor white και μικροσκόπηση στο μικροσκόπ ιο φθορ ισμού. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Η παρουσία υφών μυκήτων μέσα στο δείγμα είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη δ ιάγνωση της λοίμωξης. Β. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Ένας από του ς κύρ ιους σκοπούς του Εργ αστηρίου ε ίναι η απομόνωση από τα κλινικά υλικά και η ακριβής ταυτοποίηση του αιτίου της μυκητιασικής λοίμωξης. Σχεδόν όλα τα κλινικά υλικά χρειάζεται να καλλιεργηθούν ανεξάρτητα από τα ευρήματα τη ς άμεσης μικροσκοπικής παρατήρηση ς. Υπάρχουν ορ ισμένες προϋποθέσεις, που σχετίζονται μ ε το δείγμα κα ι τ ο ιστορικό του ασθενούς κα ι που μπορούν να επηρεάσουν τον τρόπο επεξεργα σίας του δείγματος γ ια την αρχική καλλ ιέργε ια κα ι την επ ιλογή των θρεπτικών υλικών. Γι αυτό είναι χρήσιμο να είναι γνωστές λεπτομέρειες, που αφορούν το δε ίγμα και ο ι ποίες έχου ν αναφερθεί σε προηγούμενα κεφάλαια. Οι μέθοδο ι γ ια τη διαχείριση και επεξεργα σία των κλινικών δειγμάτων για καλλ ιέργε ια σχεδιάστηκαν έτσι, ώστε 1

να διατηρούν ζωντανούς τους μύκητες και να αποδίδουν την μεγαλύτερη ποσότητα μικροοργανισμών από το δείγμα. Οι τεχνικές, που επιλέγονται, θα πρέπει να μην μεταβάλλουν τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα του μύκητα και να δυσκολεύουν την ταυτοποίησή του. Η απομόνωση των παθογόνων μυκήτων με καλλιέργεια δεν παρουσιάζει δυσκολίες. Θα πρέπει ωστόσο να δοθεί έμφα ση σε ορισμένα γενικά σημεία που είναι η. 1. ΑΡΙΘΜΗΣΗ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Μερικές φορές είναι απαραίτητο να καλλιεργηθεί ορισμένη ποσότητα του δείγ ματος. Ποσοτική αρίθμηση των ζωντανών κυττάρων του μύκητα στις καλλιέργ ειες, εκφραζόμενες ως CFU/ml, αποδείχθηκε χρήσιμη για την πρόγνωση και την ρύθμιση της πορε ίας ορισμένων νοσημάτων όπως, π.χ. αρίθμηση των κυττάρων στα πτύελα στην περίπτωση της πνευμονικής Ασπεργ ίλλωσης και Καντιντίασης και στο ΕΝΥ στην Κρυπτοκόκκωση. ίί. Επιλογή των θρεπτικών υλικών Η επιλογή κατάλληλων θρεπτικών υλικών γ ια βασίζεται κατ ' την απομόνωση των μιrι<ήτων αρχήν στο πιθανό είδος του μύκητα, που θα απομονωθεί από μια ιδιαίτερη θέση ή από μια γνωστή κλινική κατάσταση και τα είδη των μυκήτων που τυπικά απομονώνονται σε μια συγκεκριμένη γεωγ ραφική περιοχή. Είναι πολύ βοηθητικό, εάν οι κλινικοί μπορούν να ενημερώσουν το Εργαστήριο για τη διάγνωση, που υποπτεύονται, κι έτσι το εργαστήριο να μπορέσε ι να επιλέξει τις πιο κατάλληλες μεθόδους και υλικά που χρειάζονται, όπως επίσης και να αποφύγ ει το προσωπικ ό κάθε κίνδυνο, που σχετίζεται με την επεξεργασία των δειγμάτων και τους μύκητες που απομονώνονται στην καλλιέργεια. Ένας αριθμός θρεπτικών υλικών είναι ικανοποιητικός για την καλλιέ ργεια των παθογόνων μυκήτων. Τα υλικά που περιέχουν άγ αρ προτιμώνται από τα υγρά υλικά, εκτός από την καλλιέργεια αίματος. Στην καθημέραν πράξη χρησιμοποιούνται δύο τύποι υλικών που είναι, θρεπτικά υλικά γενικής χρήσης για την αρχική απομόνωση των παθογόνων μυκήτων και υλικά γ ια ανακαλλιέργ ε ια και ταυτοποίηση, στα οποία ενισχύ εται η ανάπτυξη των ιδιαιτέρων χαρακτηριστικών π.χ. αναφέρονται παρακάτω. σπορογένεση και τα οποία Για την απομόνωση των μυκήτων από τα κλινικά δε ίγματα απαιτούνται περισσότερα από ένα είδος θρεπτικά υλικά και από κάθ ε δείγμα πολλαπλά τρυβλία. Θρεπτικά υλικά γενικής χρήσης που χρησιμοποιούνται συνήθως ε ίναι, το Sabouraud άγαρ με γ λυκόζη και ph 5.5-5.6 για την απομόνωση των δ ερματόφυτων και Sabouraud με λιγότερη γ λυκόζη και ph 6.8-7 για γενικότερη χρήση. Το άγαρ με μαλτόζη 4% χρησιμοποιε ί ται εναλλακτικά με το Sabouraud άγαρ με γλυκόζη για την απομόνωση παθογόνων μυκήτων. Το άγαρ με μαλτό ζη 2% 1

είναι ικανοποιητικό για την απομόνω ση και την ανάπτυξη και ιδιαίτερα τη διατήρηση, μεγάλου φάσματος μυκήτων αλλά δεν συνιστάται στην καθημέραν πράξη για την απομόνωση παθογόνων μυκήτων. Το θρεπτικό άγαρ προτιμάται για την απομόνωση του Trichophyton veπucosum. Το brain heart infusion άγαρ είνα ι εμπλουτισμένο υλικό, που χρησιμοπο ιείται παράλληλα με το Sabouraud άγαρ και το άγαρ με μαλ τόζη 4%. Το υλικό αυτό βοηθάει την απομόνωση των δίμορφων παθογόνων μυκήτων με τη μορφή βλαστοκυττάρων (φάση ζυμομύκητα). Μπορεί να εμπλουτιστεί ακόμη περισσότερο με την προσθήκη 5 % αίματος προβάτου. Στα θρεπτικά υλικά για την αρχική απομόνωση προσθέτονται αντιμικροβιακές ουσίες, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η επιμόλυνση με βακτήρια και τους ταχέως αναπτυσσόμενους σαπροφυτικούς μύκητες. Αντιμικροβ ι ακές ουσίες που συνιστώνται είναι η χλωραμφενικόλη σε συγκέντρωση 0.05 g/l γ ια προστασία από τα βακτήρια και η κυκλοεξιμίδη (ακτιδιόνη) σε συγκέ ντρωση 0.5g/l για τους περισσότερους σαπροφυτικούς μυκήτες5. Η χρήση της τελευταίας συνιστάται για τ ην απομόνωση δερματοφύτων στις περιπτώσεις που συνυπάρχουν και σαπροφυτικοί μύκητες. Εν τούτοις, επειδή ορισμένοι ευκαιριακά παθογόνοι μύκητες όπως, τα είδη Candida, Cryptococcus neof oπnans και οι Ζυγομύκητες (Mucor, Rhizopus κλπ.) είναι ευαίσθητοι στην κυκλοεξιμίδη, θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή κατά τη χρησι- μοποίηση του υλικού αυτού. iii. Θερμοκρασία επώασης Τα όρια της θερμοκρασίας επώασης ποικίλλουν ανάλογα με το είδος του μύκητα. Για τα αίτια των επιφανειακών μυκητιάσεων απαιτείται θερμοκρασία 25-30 C. Για τα αίτια των υποδορίων και συστηματικών μυκητιάσεων χρειάζεται επώαση στους 25-30 C κα ι στους 37 C. Σε ορισμένους μύκητες π.χ. Histoplama capsulatum και Blastomyces deπnatitidis η μυκητηλιακή φάση συμβαίνει στη θερμοκρασία των 20-25oC στα συνήθη θρεπτικά υλικά, ενώ η φάση ζυμομύκητα χρειάζεται θερμοκρασία 37oC και εμπλουτισμένα θρεπτικά υλικά (π.χ. brain heart infusion). Η μεταβολή στη φάση ανάπτυξης του μύκητα εξαρτάται από τις συνθήκες καλλ ιέργειας, αποτελεί χρήσιμο χαρακτη(}ιuτικ6 για την ταυτοποίησή του. Για την καλλιέργεια των περισσοτέρων δειγμάτων συστήνεται να γίνονται δύο σειρές καλλιεργειών, από τις οποίες η μία να επωάζεται στους 25-30 C και η άλλη στους 37 C. Η ικανότητα του Aspergillus fumigatus να αναπτύσσεται στους 45 C τον διακρίνει από τις άλλες μούχλ ες. iν. Ανάγκη σε οξυγόνο. Οι μύκητες είναι αερόβιοι μικροοργαν ισμοί, που χρειάζονται οξυγόνο γ ια την ανάπτυξή τους. ν. Χρόνος επώασης. Πολλοί παθογό νοι μύκητες αναπτύσσονται αργά και γι αυτό οι καλλιέργειες πρέπει να επωάζονται για 3 εβδομάδες τουλάχιστον. Σε μερικές περιπτώσεις η επώαση παρατείνεται μέχρι και 6, γ ια να θεωρηθούν ως 1

μοποίηση του υλικού αυτού. είναι ικανοποιητικό για την απομόνωση και την ανάπτυξη και ιδιαίτερα τη διατήρηση, μεγάλου φάσματος μυκήτων αλλά δεν συνιστάται στην καθημέραν πράξη για την απομόνωση παθογόνων μυκήτων. Το θρεπτικό άγαρ προτιμάται για την απομόνωση του Tiichophyton veπucosum. Το brain heart ίnfusion άγαρ είναι εμπλουτισμένο υλικό, που χρησιμοποιείται παράλληλα με το ίiί. Θερμοκρασία επώασης Τα όρια της θ ερμοκρασίας επώασης ποικίλλουν ανάλογα με το είδος του μύκητα. Για τα αίτια των επιφανειακών μυκητιάσεων απαιτείται θερμοκρασία 25-30 C. Για τα αίτια των υποδορίων και συστηματικών μυκητιάσεων χρειάζεται επώαση στους 25-30 C και στους 37 C. Σε ορισμένους μύκητες π.χ. Histoplama capsulatum και Blastomyces dermatitidis η μυκητηλιακή φάση συμβαίνει στη θερμοκρασία των 20-25oC SabouΓaud άγαρ και το άγαρ με μαλ τόζη 4%. Το υλικό αυτό βοηθάει την απομόνωση των δίμορφων παθογόνων μυκήτων με τη μορφή βλαστοκυττάρων (φάση ζυμομύκητα). στα συνήθη θρεπτικά υλικά, ενώ η φάση Μπορεί να εμπλουτιστεί ακόμη περισσότερο με την προσθήκη 5% αίματος προβάτου. Στα θρεπτικά υλικά για την αρχική απομόνωση προσθέτονται αντιμικροβιακές ουσίες, προκειμένου να ελαχιστοποιηθcί η επιμόλυνση με βακτήρια ζυμομύκητα χρειάζεται θερμοκρασία 37oC και εμπλουτισμένα θρεπτικά υλικά (π.χ. brain heart infusion). Η μεταβολή στη φάση ανάπτυξης του μύκητα εξαρτάται από τις συνθήκες καλλιέργειας, αποτελεί χρήσιμο χαρακτηριστικό για την ταυτοποίησή του. και τους ταχέως αναπτυσσόμενους σαπροφυτικούς μύκητες. Αντιμικροβιακές ουσίες που συνιστώνται είναι η χλωραμφενικόλ η σε συγκέντρωση 0.05 g/l για προστασία από τα βακτήρια και η κυκλοεξιμίδη ( ακτιδιόνη) σε συγκέντρωση O.Sg/I για τους περισσότερους Για την καλλιέργεια των περισσοτέρων δειγμάτων συστήνεται να γίνονται δύο σειρές καλλιεργειών, από τις οποίες η μία να επωάζεται στους 25-30 C και η άλλη στους 37 C. Η ικανότητα του Aspergillus fumigatus να αναπτύσσεται στους 45 C σαπροφυτικούς μυκήτες5. Η χρήση της τον διακρίνει από τις άλλες μούχλες. τελευταίας συνιστάται για την απομόνωση δερματοφύτων στις περιπτώσεις iv. Ανάγκη σε οξυγόνο. Οι μύκητες είναι αερόβιοι μικροοργανισμοί, που που συνυπάρχουν και σαπροφυτικοί μύκητες. Εν τούτοις, επειδή ορισμένοι ευκαιριακά παθογόνοι μύκητες όπως, τα είδη Candίda, Cryptococcus neotόrmans και οι Ζυγομύκητες (Mucor, Rhizopus κλπ.) είναι ευαίσθητοι στην κυκλοεξιμίδη, θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή κατά τη χρησι- χρειάζονται οξυγόνο για την ανάπτυξή τους. ν. Χρόνος επώασης. Πολλοί παθογόνοι μύκητες αναπτύσσονται αργά και γι αυτό οι καλλιέργειες πρέπει να επωάζονται για 3 εβδομάδες τουλάχιστον. Σε μερικές περιπτώσεις η επώαση παρατείνεται μέχρι και 6, για να θεωρηθούν ως 1

1 αρνητικές και να απορριφθούν. Σε μερικούς παθογόνους μύκητες όπως το Histoplasma η επώαση παρατείνεται μέχρι και 12 εβδομάδες. Οι καλλιέργειες των περισσοτέρων μυκήτων γίνονται. θετικές μέσα σε 7-10 ημέρες. Συνήθως όμως οι ζυμομύκητες του γένους Candida και τα είδη Aspergillus αναπτύσσονται μέσα σε 1-3 ημέρες. Ο έλεγχος του αποτελέσματος των καλλιεργειών των περισσοτέρων δειγμάτων γίνεται καθημερινά, ενώ λέπια, τρίχες και νύχια εξετάζονται δύο φορές την εβδομάδα. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ευκαιριακά παθογόνων μυκήτων από στείρες περιοχές όπως, αίμα ή ΕΝΥ, σωματικά υγρά (περιτοναϊκό, πλευριτικό, αρθρικό) αποτελεί συχνά αξιόπιστη ένδειξη λοίμωξης. Όταν όμως απομονώνονται μύκητες από υλικά όπως πύον, πτύελα, κόπρανα και ούρα, τα αποτελέσματα θα πρέπει να αξιολογούνται με προσοχή. Προσοχή επίσης θα πρέπει να δίνεται και στον αριθμό των αποικιών που αναπτύσσονται. Επειδή πολλές φορές έχουν αναφερθεί σπάνιοι μύκητες ως αίτια εν τω βάθει μυκητιάσεων στους ανοσοκατασταλμένους, κανένα στέλεχος που απομονώνεται δεν θα πρέπει να χαρακτηρίζεται ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ σαν επιμόλυνση, χωρίς να λαμβάνεται υπόψην η κλινική κατάσταση του ασθενή, Η αξιολόγηση του μύκητα, που απομονώθηκε στην καλλιέργεια, ως παθογόνου ή δυνητικά παθογόνου εξαρτάται η προέλευση και η μέθοδος συλλογής του δείγματος καθώς και η ποσότητα των μικροοργανισμών που απομο από την πηγή προέλευσης του δείγμα νώθηκαν. Παρά το γεγονός ότι η καλ τος και την ταυτότητα του μύκητα. Σημασία έχε ι, αν το δείγμα προέρχεται από ανατομική θέση στην οποία σπάνια βρίσκονται μύκητες, αν ο μύκητας βρέθηκε σε φυσιολογικό άτομο ή αν προέρ λιέργεια προσφέρει την τελική διάγνωση της μυκητιασικής λοίμωξης, είναι δυνατόν να μην αποκαλυφθεί ο παθογόνος μικροοργανισμός. Η αποτυχία απομόνωσης του μύκητα στην καλλιέρ χεται από ανατομική θέση, που διαθέτει γεια μπορεί να οφείλεται σε ακατάλλη συμβιωτική μυκητολογική χλωρίδα. Η απομόνωση, από κάθε δείγμα, αναγνωρ ισμένων παθογόνων όπως το Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans ή τα δερματόφυτα θεωρείται γενικά ως ένδειξη λοίμωξης με το μύκητα αυτό. Εν τούτοις, η κατάσταση δεν είναι ξεκαθα ρισμένη με τους ευκαιρ ιακά παθογόνους μύκητες όπως ο Aspergillus fumigatus, η C. albicans. Η απομόνωση λο δείγμα (συλλογή, μεταφορά), ή σε λανθασμένη τεχνική απομόνωση, που σχετίζεται με την καταλληλότητα των θρεπτικών υλικών ή τις συνθήκες ανάπτυξης. Γ. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΉΤΩΝ Ο μύκητας που απομονώνεται στην καλλιέργεια, χρειάζεται να ταυτοποιη-

θεί. Η ταυτοποίηση βασίζεται σ' έναν αριθμό κριτηρίων. Οι περισσότεροι μύκητες μπορούν να ταυτοποιηθούν από την πρωτοκαλλιέργεια. Όταν η μικροσκοπική εξέταση παρασκευάσματος από την πρωτοκαλλιέργεια δεν δίνει επαρκείς πληροφορίες για το στ έλεχο ς που απομονώθηκε, τότε είναι απαραίτητη η ανακαλλιέργεια σε θρεπτικά υλι κά, που προάγουν τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του μύκητα όπως π.χ. η παραγωγή σπόρων, οι σποροφόρες δομές κλπ. Θρεπτικά υλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανακαλλιέργεια είναι το Sabouraud-άγαρ με γλυκόζη, το άγαρ με μαλτόζη 4% και 2% όπως και το Czapek Οοχ agar. Το τελευταίο είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στη διαφοροποίηση των δερματοφύτων από τα σαπρόφυτα, δεδομένου ότι αναστέλλεται η ανάπτυξη των πρώτων, ενώ αναπτύσσονται τα δεύτερα. Συνιστάται για την καλλιέργεια των πτυέλων και για την ανάπτυξη κυρίως των ειδών Aspergillus και Penicillium και όλων των σαπροφύτων με εξαίρεση τους Ζυγομύκητες (Mucor, Rhizopus κ.α.). Οι Ζυγομύκητες ανακαλλιεργούνται στο άγαρ με μαλ τόζη 2% όπως και τα είδη Fusarium και ο δίμορφος μύκητας Sporothrix schenckii. την καλλιέργεια διαταράσσονται οι χαρακτηριστικές δομές. Στην περίπτωση αυτή, η καλλιέργεια μεταξύ αντικειμενοφόρου πλάκας και καλυπτρίδας φαίνεται να είναι η πλέον κατάλληλη. Η τεχνική αυτή διευκολύνει την παρατήρηση αδιατάρακτης της ανάπτυξης του μύκητα, γιατί επιτρέπει την προσκόλληση των υφών και των σποροφόρων δομών στην καλυπτρίδα και η οποία στη συνέχεια μικροσκοπεί ται. Η παρατήρηση είνα ι ιδιαίτ ερα ικανοποιητική για μύκητες, που δεν διαθέτουν οργανωμένα σποροφόρα αλλά οι σπόροι τους παράγονται απ' ευθείας από τις υφές, π.χ. στα δερματόφυτα. Η μέθοδος παρά του ότι φαίνεται να είναι ιδανική, όχι γ ια όλους τους μύκητες, χρησιμοποιείται στη ρουτίνα μόνον όταν δεν μπορεί να γίνε ι η ταυτοποίηση με άλλες μεθόδους. Επίσης δεν θα πρέπει να πραγματοποιείται για την καλλιέργεια των βραδέως αναπτυσσομένων δίμορφων μυκήτων όπως το H.capsulatum, Β. dermatitidis, C. immitis, Ρ. brasiliensis, ή S. schenckii για την αποφυγή μόλυνσης του προσωπικού. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑ ΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ 6 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΕ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟΦΟΡΟ ΠΛΑΚΑ Μερικές φορές μπορεί να μην είναι δυνατή η αναγνώριση των χαρακτηριστικών γνωρισμάτων των μυκήτων γ ια την ταυτοποίηση κι αυτό γ ιατί, κατά την προετοιμασία παρασκευάσματος από _J α. Ο τύπος της μακροσκοπικής ανάπτυξης Το πιο απλό χαρακτηριστικό που εξετάζετα ι ε ίναι η φύση της αποικίας του μύκητα. Εξετάζεται αρχικά, αν πρόκειται για αποικία ζυμομύκητα ή νηματοειδή μύκητα. Οι ζυμομύκητ ες είναι μονοκυττάριοι μικροοργανισμοί, οι οποί-

1 οι συνήθως πολλαπλασιάζονται άνευ γενών, με εκβλάστηση θυγατρικού κυττάρου. Το αποτέλεσμα είναι η αποικία να αποτελείται από μικροοργανισμούς, οι οποίοι σχηματίζουν αποικίες πάνω. στο άγαρ, όμοιες με αυτές των βακτηρίων. Έχουν συνήθως ομαλή επιφάνεια κα ι περιφέρεια. Οι αποικίες των ελυτροφόρων ζυ μομυκήτων, όπως του Cryptococcus, μοιάζουν με αυτ ές των ελυτροφόρων βακτηρίων π. χ. pneumoniae. Συχνά οι Klebsiella ψευδοϋφές των ζυμομυκήτων φαίνονται μακροσκοπικά σαν νηματοειδείς προσεκβολές γνωστές σαν πόδια, που ξεκινούν από την περιφέρε ια της αποικίας. Οι νηματοειδείς μύκητες (μούχλες) είναι πολ υκυττάριοι. Η νηματοειδής φύση δίνει στην αποικία εμφάνιση θυσσάνου, βαμβακωτή, χνουδωτή ή βελούδινη. Μερικές φορές η σύσταση είναι κοκκιώδ ης ή σαν πούδρα, αποτέλεσμα παραγωγής των κονιδίων. 'λλες φορές πάλι η αποικία μπορεί να είναι λεία. β. Τα μικροσκοπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά του μύκητα Για την εξέταση των μικροσκοπικών μορφολογ ικών χαρακτηριστικών ετοιμάζονται από τις αποικίες παρασκευάσματα, στα οποία θα εξεταστούν οι χαρακτηριστικ ές δομές των μυκήτων. Το υλικό όσον αφορά τους ζυμομύκητες, αποσπάται εύκολα από τις αποικίες και δύσκολα όσον αφορά τους νηματοειδείς μύκητες. Στην δεύτερη περίπτωση αποσπάται μικρό τμήμα της αποικίας μαζί με το υποκείμενο θρεπτικό υλικό, με τη βοήθεια μικροβιολογικής σπάτουλας. Τοποθετείται πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, όπου έχουν προστεθεί σταγόν ες της χρωστικής π.χ. κυανούν της λακτοφαινόλης, η οποία χρωματίζει τις υφές των μυκήτων με βαθύ κυανούν χρώμα. Το παρασκεύασμα μ ικροσκο πεί ται καλύτερα στην περιφέρ εια, όπου το υλικό είναι αραιό. Τα τμήματα της αποικίας που έχουν διαφορετική σύσταση ή χρώμα θα πρέπει να εξετάζονται επίσης. Τα μικροσκοπικά μορφο λογικά χαρακτηριστικά που παρατη ρούνται είναι η, ί. Μορφολογία των υφών Σπουδαίο χαρακτηριστικό γνώρισμα γ ια την ταυτοποίηση των μυκήτων είναι η παρουσία υφών, μονοκυττάριων που χαρακτηρίζουν τους ζυμομύκητες, ή πολυκυττάριων που χαρακτηρίζουν τους νηματοειδείς μύκητες (μούχλες). Εξετάζεται επίσης, αν πρόκειται για αληθείς υφές ή ψευδοϋφές. Παρατηρείται το πλάτος και η μορφολογία τους. Αν οι υφές είναι συνεχείς ή διαιρούνται συχνά ή σπάνια, με διαφραγμάτια, η ύπαρξη διακλαδώσεων και η ύπαρξη διαφράγματος πριν τη διακλάδωση. Η γωνία υπό την οποία διακλαδίζεται η υφή οξεία στα είδη Aspergillus ή ορθή στα είδη Rhizopus. Εξετάζεται επίσης η διαφάνεια (υάλινες), το χρώμα των υφών, αν είναι αχρωμάτιστες ή ελαφρώς χρωματισμένες ή έχουν σκούρο καφέ ή βαθύ πράσινο ή μαύρ ο χρώμα (Dematiaceous fungi). Επίσης εξετάζο νται ειδικοί σχηματισμοί των υφών, κυρίως στα δερματόφυτα, που θυμίζουν κέρατα ελαφιού, κτένα, ρακέτα τένις ή

σπειροειδή ελατήρια. Ελέγχεται και η ύπαρξη ή όχι ριζιδίων στο θαλλό κυρίως στους Ζυγομύκητες. Όσον αφορά τους ζυμομύκητες που αναπαράγονται με εκβλάστηση, το θν γατρικό κύτταρο εμφανίζεται στο ένα άκρο του κυττάρου, μεγαλώνει και σχηματίζεται το νέο βλαστοκύτταρο. Όταν θυγατρικά κύτταρα, σε σειρά, δεν αποχωρίζονται πλήρως μεταξύ τους, αλλά παραμένουν σε επαφή, παράγονται ψευδοϋφές. Αυτές διακρίνονται από τις πραγματικές υφές, από την παρουσία συσφίξεων, στο σημείο επαφής γειτονικών κυττάρων, σε αντίθεση με τις αλη θείς υφές που έχουν παράλληλα τοιχώματα χωρίς συσφίξεις. Η έλλειψη διαφράγματος στο σημείο πριν τη διακλάδωση του μυκητηλίου και το περιορισμένο μέγεθος του θυγατρικού κυττάρου σ ' αυτό του μητρικού ή και μικρότερου είναι άλλες διαφορές. ii. Μορφολογία των, άνευ γενών, αναπαραγωγικών δομών (σπόροι, κονίδια). Εξετάζεται το σχήμα, το μέγεθος, το χρώμα, η διαίρεσή τους σε διαμερίσματα με διαφράγματα, ο αριθμός τους (μονοκύτταροι ή πολυκύτταροι). Παρατηρείται η μορφολογία της επιφάνειας του σπόρου, αν είναι ομαλή ή ανώμαλη. Ελέγχεται ο τρόπος παραγωγής π.χ. με κατάτμηση της υφής ή από εξειδικευμένα όργανα όπως κυστίδια, φιαλίδια, που φέρονται σε διαφοροποιημένες (κονιδιοφόρα) ή μη υφές ή απ' ευθείας από τις υφές. Παρατηρ είται επίσης η διάταξη των σπόρων αν φέρονται μεμονωμένοι σε αλυσίδες ή κατά ομάδες. Αν 11 είναι ελεύθεροι ή περιορίζονται σε σάκκο, το σποράγγειο (σποραγγε ιόσπορα). iii. Μορφολογία των, δια γενών, αναπαραγωγικών δομών. Χρήσιμη είναι και η κατάδειξη των δια γενών σπόρων, που σπάνια μπορούν να καταδειχθούν (ασκοσπόρια, κλειστοθή κια, περιθήκ ια). γ. Ρυθμός ανάπτυξης Μπορεί να είναι αργός (> 10 ημέρες), μέτριος (5-10 ημέρες) ή ταχύς(< 4 ημέρες). δ. Αναστολή ανάπτυξης παρουσία κυκλοεξιμίδης (ακτιδιόνης) Η ανάπτυξη παρουσία κυκλοεξιμίδης είναι ένδειξη παρουσίας παθογόνου μύκητα, ιδιαίτερα μεταξύ των δίμορφων και των δερματοφύτων. Εξαίρεση από τον κανόνα, αποτελούν οι Ζυγομύκητες και ο C. neofoπnans, των οποίων η ανάπτυξη αναστέλλεται εντελώς απ ό την κυκλοεξιμίδη. Είδη Ασπεργ ίλλων και μερικά ε ίδη Candida αναστέλλονται επίσης εντελώς ή μερικώς. ε. Αριστη θερμοκρασία ανάπτυξης Οι περισσότεροι μύκητες αναπτύσσονται καλύτερα σε θερμοκρασία μεταξύ 25 C με 30 C. Ορισμένοι μύκητες, όπως ο Cr. neofoπnans, αναπτύσσονται καλά στους 37 C. Ο Aspergίllus fumigatus αναπτύσσεται καλά σε θερμοκρασία 45 C και μερικοί σε ακόμη υψηλότερες θερμοκρασίες. Ειδικότερα η ταυτοποίηση των ζυ μομυκήτων σε επίπεδο είδους βασίζεται στο συνδυασμό των μορφολογικών και βιοχημικών κριτηρίων5. Κύρια μορφολογ ι κά κριτήρια αποτελούν i. η μορφολο-

1 γ ία, ti. το χρώμα των αποικιών, iii. το (Torulopsis) glabrata συνήθως σχήμα κα ι iv. το μέγεθος των βλαστοκυττάρων, ν. η παρουσία ελύτρου σε νωπό παρασκεύασμα με σινική μελάνη, vi. η παραγωγή υφών και / ή ψευδοϋ (PCB), corneal agar με Tween-80, ήce Tween 80 και Czapek Dox agar μετά επώαση στους 27-30oC επί 3 ημέρες. Τα είδη Candida με εξα ίρεση το είδος C. παράγουν άφθονες υφές. Ομάδες από ωοειδή ή στρογγυλά βλαστοσπόρια φαίνονται κατά μήκος της υφής. Η διάταξη των υφών και των βλαστοσπορίων συχνά είναι χαρακτηριστική για τα είδη φών, vii. η ικανότητα παραγωγής βλαστικών σωλήνων και viii. η ικανότητα παραγωγής χλαμυδοκονιδίων (χλαμυδοσπορίων) σε ειδικά υλικά. Τα κριτήρ ια i έως vii έχουν αναφερθεί σε προηγούμενα κεφάλαια. Τα δύο τελευταία κριτήρια αποτελούν ταχείες εξετάσεις γ ια την ταυτοποίηση της C. albicans. Παραγωγή βλαστικού σωλήνος7. Γίνεται μέσα σε ορό κατά την παραμονή επί 1.30-2 ώρες σε υδατόλουτρο στους 37 C ή 3 ώρες σε κλίβανο. Χαρακτηρίζει το 95-97% των κλινικών στελεχών της C. albicans. Ο βλαστικός σωλήνας εμφανίζεται ως κυλινδρική υφή με παράλληλα τοιχώματα που προέρχεται από Candida. Τα χλαμυδοσπόρια είναι τελικά ή υποτελικά κύτταρα πολύ διαθλαστικά, με παχύ κυτταρικό τοίχωμα κα ι πυκνό πρωτόπλασμα. Περίπου το 60%, των κλινικών στελεχών C. albicans παράγουν χλαμυδοσπόρια. Κυριότερα βιοχημικά κριτήρια, κυρίως για τους ζυμομύκητες, αποτελούν, ο έλεγχος της αφομοίωση ς i. των υδατανθράκων και ii. των νιτρικών καθώς και iii. η ζύμωση των υδατανθράκων, πίνακας 2. Ειδικές βιοχημικές εξετάσεις για την γρήγορη ταυτοποίηση του Cr. neofonηans αποτελούν η δράση φαινο ένα βλαστοσπόριο. λοξειδάσης, η οποία γίνεται ορατή από Δεν διακρίνεται σύσφ ιξη στο σημείο έκφυσης ούτε ορατή την ανάπτυξη αποικιών με βαθύ καφέ διόγκωση κατά μήκος του νηματίου. Το χρώμα, λόγω παραγωγής χρωστικών τύπου μελανίνης, από την οξείδωση πλάτος του σωλήνα είναι το Υ2 της διαμέτρου του βλαστοσπορίου και το μήκο ς του το διπλάσιο ή τριπλάσιο αυτού. μιας διφαινολικής ουσίας που περιέχεται στο θρεπτικό υλικό. ii. η παραγωγή ουρεάσης. Η υδρόλυση της ουρίας σε ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΥΦΩΝ ΚΑΙ ΧΛΑΜΥΔΟΣΠΟΡΙΩΝ. αμμωνία και η εμφάνιση ρόδινου χρώ ματος, σαν του γαρυφάλλου, του υλικού είναι ενδεικτική παραγωγής ουρεάσης. Ο έλεγχος παραγωγής υφών/ψευδοϋφών και χλαμυδοσπορίων γίνεται σε υλ ικά όπως, το άγαρ με πατάτα και δεξτρόζη, άγαρ με πατάτα-καρώτο -χολή Η τελευταία ιδιότητα χρησιμοποιείται ευρέως για τη διάκριση των ε ιδών Cryptococcus από τα είδη Candida. Διάκριση μεταξύ των ποικιλλιών του Cr. neofoπnans μπορεί να γίνει με βάση την αλλαγή του χρώματος στο υλικό Glycine Bromothymol Blue agara (C.G.B.). Ο Cr. n eofoπnans ποικ.

neof onnans δεν μεταβάλλε ι το κυανούν χρώμα του υλικού, αντίθετα προς τα στελ έχη του Cr. neofonnans ποικ. gatii που το μετατρέπουν σε βαθύ κυανούν. ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΟΥ ΕΜΠΟΡΙΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΩΝ ΖΥΜΟΜΥΚΗΤΩΝ. Τα συστήματα ταυτοποίησης του εμπορίου ενίσχυσαν τα εργαστήρια με τυποποιημένες μεθόδους. Οι μέθοδοι, κατά το μεγ αλύτερο μέ ρος τους, είναι ταχείες και τα αποτελέσματα δίνονται μέσα σε 72 ώρες. Το μεγάλο πλεονέκτημά τους είναι ότι, τα συστήματα αυτά προσφέρουν ταυτοποίηση, που βασίζεται σε πληροφορίες εκατοντάδων βιοτύπων ζυμομυκήτων, γεγονός που προϋποθέτει χρησιμοποίηση μεγάλου αριθμού εξετάσεων και υλικών. Ένα άλλο πλεονέκτημα είναι ότι δίνεται η δυνατότητα ταυτοποίηση στελεχών, που δεν μπορούν να ταυτοποιηθούν με τις κλασσικές μεθόδους. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Από τους ζυμομύκητ ες που απομονώνονται στο κλινικό εργαστήριο, το 70-80% ανήκουν στο είδος C. albicans, που χαρακτηρίζεται από την παραγωγή βλαστικού σωλήνα. Η παρουσία ελύτρου σε ένα μη χρωματισμένο ζυμομύκητα, είναι ενδεικτική του είδους Cr. neoformans. Από τους υπόλοιπους μύκητες θα πρέπει να ταυτοποιούνται σε 1 επίπεδο είδους στο εργαστήρ ιο ή να αποστέλλονται σε εργαστήρια αναφοράς, όλοι οι ζυ μομύκητε ς που απομονώνονται από φυσιολογικά στείρα υγρά όπως αίμα, ΕΝΥ, υγρά παρακεντήσεων (αρθρικό, πλευρικό κ.α.), όταν απομονώνονται από βαρειά πάσχοντ ες, εξασθενημένους, ανοσοκατασταλμένους ή ασθενείς που υπέστησαν μεγάλες εγχειρήσεις και όταν έχουν απομονωθεί σε μεγάλους αριθμούς. Δεν θα ταυτοποιούνται σε επίπεδο είδους οι ζυμομύκητες που προέρχονται από τις εκκρίσεις της αναπνευ στικής οδού εκτός από τον μύκητα Cr. neof ormans. Δ. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ Η ταυτοποίηση των μυκήτων σε τομές βιοψίας ιστών και ιδιαίτερα αυτών που προσβάλλουν τα εν τω βάθει όργανα, έχει μεγάλη σημασία στην εργα στηριακή διάγνωση των μυκητιασικών λοιμώξεων. Επε ιδή οι μύκητες έχουν σχετικά μεγάλο μέγεθος, λίγοι έχου ν διάμετρο μικρότερη των 2-3 μm και σαφή μορφολογία, είναι δυνατόν να γίνει μια ακριβής ταυτοποίηση πολλών από τους παθογόνους μύκητες με βάση την εμφάνισή τους στους ιστούς. Στις περιπτώσεις που αυτή δεν είνα ι δυνατή, τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των μυκήτων σε συνδυασμό με τα κλιν ικά σημεία και άλλα εργαστηριακά ευρήματα είνα ι δυνατόν, να οδηγήσουν στη σωστή διάγνωση και την καταλληλότερη θεραπεία. Από τις χρώσεις, εκείνη που χρησιμοποιείται περισσότερο στην ιστοπαθολο-

γία, είναι η χρώση με αιματοξυλίνη-εωσί νη (ΗΕ). Όμως παρά τη χρησιμότητά της είναι δύσκολο να αναγνωριστούν όλοι οι μύκητες στους ιστούς. Πολύ χρήσιμες για την ταυτοποίηση των μυκήτων στους ιστούς, είναι οι χρώσεις Periodic acid Schiff (Ρ AS) και methenamine silνer, (τροποποίηση Grocott's - GMS). Ο συνδυασμός των χρώσεων GMS και ΗΕ είναι προτιμότερος γ ιατί επιτρέπει να γίνουν σαφώς ορατοί οι μύκητες. Ε. ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Η διάγνωση της μυκητιασικής λοίμωξης δεν είναι πάντα εφ ικτή με τις εργαστηριακές μεθόδους, που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Στις περιπτώσεις αυτές οι ορολογικές εξετάσεις μπορούν να προσφέρου ν μια γρήγορη και πιθανή διάγνωσ η. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση κυκλοφορούντων αντισωμάτων, αντιγόνων και για την ταυτοποίηση των μυκήτων. Οι μύκητες έχουν σύνθετη οργάνωση κυτταροπλάσματος και αποτελούν μωσαϊκό αντιγόνων. Πολλά από τα κυτταρικά και εξωκυτταρ ικά προϊόντα τους είναι ανοσογόνα και προκαλούν εύκολα την παραγωγή αντισωμάτων σε άτομα, που διαθέτουν φυσιολογ ικό ανοσοποιητικό σύστημα. Η κατάδειξη των αντισωμάτων με τις ορολογικές εξετάσεις βοηθάει στη διάγνωση και στη ρύθμιση της πορείας της λοίμωξης. Όλες οι ορολογικές εξετάσε ις έχουν τους περιορισμούς τους και η αξιοπιστία κάθε μιας, ως δείκτη λοίμωξης, ποικίλλει. Αιτίες για την απόκλιση αυτή αποτελούν ο μεγάλος αριθμός αντιγόνων που παράγονται από το μύκητα, η εμφάνιση, σε μεγάλο βαθμό, διασταυρούμενων αντιδράσεων μεταξύ συγγενών αλλά και άσχετων μυκήτων, όπως κα ι η έλλειψη καθιερωμένων αντιδραστηρίων αναφοράς και τυποποιημένων τεχνικών. Επί πλέον σε άτομα με ανοσοκαταστολ ή η παραγωγή αντισωμάτων μπορεί να είναι καθυστερημένη, μειωμένη ή και να απουσιάζει. Η ορολογική διάγνωση εξαρτάται από την ανοσολογική απάντηση του ξενιστή. Μέχρις ότου δημιουργηθούν αντισώματα σε ικανό ποσόν, ώστε να μπορούν να υπολογιστούν, οι κλασσικές ορολογικές εξετάσεις συμβάλλουν ελάχιστα στη διάγνωση. Στην οξεία ή στα πρώιμα στάδια της λοίμωξης μπορεί να κυκλοφορούν στον ορό ή στα άλλα σωματικά υγρά διαλυτά αντιγόνα γι αυτό και ο προσδιορισμός και η τιτλοποίηση κυκλοφορούντων αντιγόνων προσφέρει αξιόπιστη ένδειξη της λοίμωξης στις περιπτώσεις των ευκαιριακών μυκητιάσεων και βρίσκουν ευρεία εφαρμογή. Οι ορολογικές εξετάσεις προσφέρουν έναν αξιόπιστο και αντικειμενικό τρ ό πο για την εκτίμηση των μεταβολών στις σχέσεις ξενιστή παρασίτου. Έτσι αύξηση στον τίτλο των αντισωμάτων ή των αντιγόνων, κατά τον ορολογικό έλεγχο διαδοχικών δειγμάτων αίματος ή άλλων σωματικών υγρών, δείχνει σε κάποιο βαθμό την εξέλιξη της λοίμωξη ς. Για όσο χρονικό διάστημα πολλαπλασιάζεται ο μύκητας, θα πρέπει να αναμένεται αύξηση του τίτλου των 1

αντισωμάτων ή και των αντιγόνων. Επίσης η απάντηση σε μια ειδική θεραπεία που εφαρμόστηκε, θα φανεί με αλλαγή στον τίτλο αυτών. Επειδή ο ενεργός χρόνος ζωής των αντιδραστηρίων ποικίλλει, θα πρέπει κατά την εκτέλεση των ορολογικών εξετάσεων, να συμπεριλαμβάνονται πάντα θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Οσον αφορά τη λήψη δειγμάτων για την εκτέλεση των ορολογικών αντιδράσεων, αυτή θα πρέπει να γίνεται στον κατάλληλο χρόνο. Κατά την παρακολούθηση της πορείας της λοίμωξης θα πρέπει να λαμβάνονται δείγματα αίματος στην αρχή, στην ακμή, κατά την ανάρρωση και αρκετές εβδομάδες μετά την θεραπεία. Τετραπλάσια ή μεγαλύτερη αύξηση στον τίτλο των αντισωμάτων σε εξετάσεις διαδοχικών δειγμάτων ορού αίματος είναι αξιόλογο διαγνωστικό κριτήριο. Σύγχυση μπορεί να προκαλέσουν διασταυρούμενες αντιδράσεις με ετερόλογα αντιγόνα.πολλές και διαφορετικές ορολογικές εξετάσεις έχουν αναπτυχθεί για τον καθορισμό αντισωμάτων και πιο πρόσφατα αντιγόνων στους ασθενείς με μυκητιασικέ ς λοιμώξεις. Θα πρέπει να αναφερθεί όμως ότι, το εκχύλισμα των κυττάρων των μυκήτων ή το διήθημα καλλιέργειας περιέχει άφθονα αντιγόνα και ότι η ακριβής ταυτότητα και λειτουργία των αντιγόνων, σε σχέση με την παθογενετικότητα του μύκητα είναι ουσιαστικά άγνωστη. Για το λόγο αυτό οι ορολογικές εξε τάσεις αναπτύχθηκαν εμπειρικά. Μερικές είναι καλύτερες από άλλες, με την έννοια, ότι τα αποτελέσματα συνδέονται καλύτερα με ενερ- γό νόσο. Οι βασικές ορολογικές μέθοδοι και η εφαρμογή τους στις σπουδαιότερες μυκητιασικές λοιμώξεις αναφέρονται στον πίνακα 3. Για την κατάδειξη των αντισωμάτων χρησιμοποιούνται ποικίλλες μέθοδοι όπως, η διπλή ανοσοδιάχυση, η ανοσοηλεκτροφόρηση αντιθέτου φοράς, η άμεση και έμμεση συγκολλητινοαντίδραση, η σύνδεση του συμπληρώματος, η ανοσοενζυμική (ELISA), η ραδιοανοσολογική και ο έμμεσος ο ανοσοφθορισμός. Τελευταία, οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται ευρέως για την κατάδειξη αντιγόνων είναι, η συγκόλληση αδρανών σωματιδίων πο (latex), ευαισθητοποιημέ λυστερίνης νων με ανοσοσφαιρίνη από πειραματικώς ανοσοποιηθέντα πειραματόζωα με είδη μυκήτων, παρουσία ελεύθερου αντιγόνου στον ορό και στα υγρά του ασθενούς. Διαθέσιμα στο εμπόριο είναι τα LPA-tests για την κατάδειξη των αντιγόνων στον ορό, α. μαννάνης και β. μαννοπρωτ εί νης της Candida, γ. γαλακτομαννάνης του Aspergillus και δ. το πολυσακχαριδικό αντιγόνο του ελύ τρου του Cr. neoformans στον ορό και σε άλλα σωματικά υγρά (ΕΝΥ, ούρα). Επίσης κυκλοφορούν και αντιδραστήρια που ανιχνεύουν τα παραπάνω αντι γόνα στον ορό, με την ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) κα ι τα οποία έχουν πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία. ΣΤ. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΜΕΘΟ ΔΟΥΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 9 Ο περιορισμένος αριθμός αναφορών σχετικά με τις μεθόδους ταυτοποίησης, 1

που βασίζονται στο DNA των μυκήτων για τη διάγνωση της Ασπεργίλλωσης και της Καντιτίασης, απέδειξαν ότι οι μέθοδοι αυτοί είναι προς το παρόν ανεπαρκείς είτε λόγω μειωμένης ευαισθησίας ή γιατί το DNA των μυκήτων βρίσκεται και σε άτομα χωρίς λοίμωξη, γι αυτό και δεν χρησιμοποιούνται ευρέως. Ζ. ΔΕΡΜΑΤΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ Οι δερματικές δοκιμασίες χρησιμοποιούνται στην επιδημιολογική μελέτη ορισμένων μυκητιασικών λοιμώξεων αλλά η χρησιμότητά τους για διαγνωστικούς σκοπούς είναι περιορισμένη. Η. ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣθΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Οι μέθοδοι με τις οποίες προσδιορίζεται η δραστικότητα των αντιμυκητιασικών φαρμάκων, διακρίνονται στις μεθόδους προσδιορισμού α. της ελάχιστης πυκνότητας του φαρμάκου (MIC) που θα αναστείλει την ανάπτυξη συγκεκριμένου μύκητα και β. σ' αυτές με τις οπ οίες υπολογίζονται οι συγκεντρώσε ις των φαρμάκων στα βιολογικά υγρά ασθενών, που δέχονται αντιμυκητιασική θεραπεία α. Προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC). Για τον προσδιορισμό της MIC των διαφόρων αντιμυκητιασικών φαρμάκων έχουν σχεδιασθεί πολλές μέθοδοι, που διαχωρίζονται σε τρεις κύριες ομάδες. Η πιο απλή μέθοδος είναι η διάχυση του φαρμάκου σε άγαρ, είναι η αραίωση του φαρμάκου σε ζωμό και η αραίωση σε άγαρ. Ο καθορισμός της MIC των αντιμυκητιασικών φαρμάκων συχνά παρουσιάζει δυσκολίες για να εκτελεστεί και να αξιολογηθεί. Οι παράγοντες, που μπορεί να επηρεάσουν την MIC, σχετίζονται με την πυκνότητα του ενοφθαλμίσματος, τη σύνθεση, το ph του υλικού και τη διάρκεια επώασης. Δεν είναι ασύνηθες να δίνονται αποτελέσματα με αποκλίσεις, όταν για τον προσδιορισμό της MIC χρησιμοποιούνται διαφορετικές μέθοδοι. Η απόφαση αν μια λοίμωξη από ένα συγκεκριμένο στέλεχος μύκητα, θα θεραπευθεί με ένα ιδιαίτερο φάρμακο ή εάν το στέλεχος αυτό θα θεωρηθεί ως ανθεκτικό στο φάρμακο, βασίζεται στην εκτίμηση της σχέσης της MIC του στελ έ χους προς αυτήν άλλων στελεχών, του ιδίου μύκητα, η οποία έχει ελεγχθεί κάτω από ιδεώδεις συνθήκες. Λιγότερο συχνά μπορεί να βασιστεί στη σχέση της MIC με τα επίπεδα του φαρμάκου, τα οποία επιτυγχάνονται στον ασθενή. Οπωσδήποτε οι MIC εξαρτώνται συχνά από τις συνθήκες της εξέτασης και δεν ε ίναι ασύνηθες να λαμβάνονται MIC, πολύ υψηλότερες από τα επίπεδα του φαρμάκου, που επιτυγχάνονται στον ασθενή. β. Η μέτρηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στα βιολογικά υγρά Η μέτρηση των συγκεντρώσεων των αντιμυκητιασικών φαρμάκων στα βιολογικά υγρά όπως, ο ορός και το ΕΝΥ εκτ ελε ίται γ ια δύο σκοπούς. Ο πρώτος, για να εξασφαλιστεί η προϋπόθεση ότι 1

έχουν επιτευχθεί οι θεραπευτικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου και ο δεύτερος, για να εξασφαλιστεί ότι έχουν αποφευχθεί οι υπερβολικές δόσεις, οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε ανεπιθύμητες και τοξικές παρενέργειες. Γεν ικά θα μπορούσε να λεχθεί ότι ο έλεγχος της MIC για την αμφοτερικίνη Β δεν είναι απαραίτητος γιατί σπάνια συναντώνται ανθεκτικά στελέχη. Αντίθετα θα πρέπει να ελέγχονται οι MIC για την φλουκυτοσίνη (5-φλουοροκυτοσίνη) δεδομένου ότι, απομονώνονται ανθεκτικά στελέχη και από ασθενείς στους οποίους δεν είχε χορηγηθεί στο παρελθόν το φάρμακο αλλά και μετά τη χορήγησή του. Έλεγχος θα πρέπει να γίνεται σ' όλα τα στελέχη, που προέρχονται από τους ασθενείς που πρόκειται να αρχίσουν τη θεραπεία και στα στελέχη που απομονώνονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού των MIC θα πρέπει να αξιολογούνται με προσοχή, επειδή δεν ανταποκρίνονται πάντα με το κλινικό αποτέλεσμα. Ο προσδιορισμός των MIC για τα παράγωγα των αζολών παρουσιάζει προβλήματα. Συχνά, αυξανόμενες δόσεις του φαρμάκου μειώνουν βαθμιαία την ανάπτυξη του μύκητα, γεγονός που κάνει δύσκολη την αξιολόγηση του τελικού σημείου. Οι MIC που λαμβάνονται, εξαρτώνται συχνά από τις συνθήκες της εξέτασης, την πυκνότητα του ενοφθαλμίσματος, τη σύνθεση και το ph του υλικού, τη θερμοκρασία και το χρόνο επώασης, παράγοντες που έχουν όλοι αξιοσημείωτη επίδραση στο αποτέλεσμα. Για την γκριζεοφουλβίνη που είναι το αντιμυκητιασικό αντιβιοτικό για την από του στόματος θεραπεία των Δερμομυκητιάσεων, σπάνια απαιτείται ο προσδιορισμός της MIC. Ελάχιστες φορές έχουν αναφερθεί στελέχη με πρωτογενή ανθεκτικότητα, όπως είναι ελάχιστες και οι αναφορές γ ια την ανάπτυξη αντοχής κατά τη διάρκεια της θεραπείας. SUMMARY Sophia Ktenidou-Kartali Assoc. Professor of Medical Biology National Alexandroupolis' Medical School Democritus' University of Thrace The present review includes the study of the following subjects; ( 1) Procedures conceming taking, transfert and elaboration of samples. (2) Methods and deductions of direct microscopic obervation, in function with each sample origin. (3) Cultivation conditions ot fungi. (4) Factors contήbuting to the identification of fungi. (5) Findings of histological examinations. (6) Findings of histological examinations. (6) Contήbution of serological examinations and molecular biology techniques. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΩΝ Στην παρούσα ανασκόπηση περιλαμβάνονται σε γενικ ές γραμμές τα εξής: ( 1) Οι διαδικασίες που αφορούν τη λήψη, τη μεταφορά και την επεξεργασία των δειγμάτων. (2) Οι μέθοδοι και τα πορί- 1