Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ο Σ

Immucor GTI Diagnostics, Inc. 20925 Crossroads Circle, Waukesha, WI 53186 Η.Π.Α. Τηλ.: +1 (855) 466-8267 WWW.IMMUCOR.COM Οι συνοδευτικές οδηγίες και οι αντίστοιχες μεταφράσεις για το προϊόν είναι διαθέσιμες στη διεύθυνση: www.immucor.com Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ο Σ ΚΙΤ ΕΞΑΚΡΙΒΩΣΗΣ LIFECODES HLA-SSO Για διαγνωστική χρήση In Vitro. ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Ορισμός συμβόλων... 1 Οδηγίες χρήσης... 6 Κιτ/Αντιδραστήρια κατά αρ. καταλόγου... 2 A. Καθαρίστε το γενωμικό DNA... 6 Προοριζόμενη χρήση... 4 B. Ενίσχυση... 6 Σύνοψη και περιγραφή... 4 Γ. Υβριδισμός... 7 Αρχές της διαδικασίας... 4 Δ. Αναλύστε με το όργανο Luminex... 8 Αντιδραστήρια... 5 Αποτελέσματα... 8 A. Ταυτοποίηση... 5 Έλεγχος ποιότητας... 9 B. Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις... 5 Περιορισμοί της διαδικασίας... 9 Γ. Οδηγίες φύλαξης... 5 Αντιμετώπιση προβλημάτων... 10 Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση... 5 Αναμενόμενες τιμές... 10 Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης... 10 E. Ενδείξεις αστάθειας... 5 Βιβλιογραφία... 11 Απαιτούμενα όργανα... 5 Περιορισμένες Άδειες... 11 Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία... 6 Πληροφορίες σχετικά με τον Κατασκευαστή... 11 Διαδικασία... 5 Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα A. Παρεχόμενα υλικά... 5 εμπορικά σήματα... 11 B. Υλικά, αντιδραστήρια και εξοπλισμός που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται... 6 Παράρτημα A... 12 Γ. Συμπληρωματικά υλικά που παρέχονται από το χρήστ... 6 Ηλεκτροφόρηση γέλης... 12 Ερμηνεία γέλης... 12 ΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΒΟΛΩΝ (Ετικέτες προϊόντων και συμπληρωματικά έγγραφα) Αριθμός παρτίδας Αριθμός καταλόγου Άνω όριο θερμοκρασίας Περιορισμοί θερμοκρασίας Ημερομηνία για χρήση από Να κρατηθεί μακριά από το Επαρκεί για N δοκιμές Να μην καταψυχθεί Προσοχή Βλ. Οδηγίες Χρήσης Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Κατασκευαστής Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Κίνδυνος Σελίδα 1 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

ΚΙΤ/ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΤΑ ΑΡ. ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ LCT-A Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-A SSO, Αρ. Καταλόγου 628911 LΜ-A Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-A για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 628410-50 MX-A LIFECODES HLA- A Κύριο Μείγμα 628405 870 µl BM-A LIFECODES HLA-A Μείγμα ιχνηλατών 628453 810 µl DS Διάλυμα αραίωσης 628515 9,9 ml 18 έως 30ºC LCT-AE Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-A eres SSO, Αρ. Καταλόγου 628913 LC-AE Κιτ Εξακρίβωσης HLA-A eres LIFECODES για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 628459-50 MX-A LIFECODES HLA- A Κύριο Μείγμα 628405 870 µl BM-A LIFECODES HLA-A Μείγμα ιχνηλατών 628453 810 µl BM-AeRES LIFECODES HLA-A eres Μείγμα ιχνηλατών 628455 810 µl LCT-B Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-B SSO, Αρ. Καταλόγου 628915 LM-B Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-B για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 628510-50 MX-B LIFECODES HLA-B Κύριο Μείγμα 628556 870 µl BM-B LIFECODES HLA-B Μείγμα ιχνηλατών 628553 810 µl DS Διάλυμα αραίωσης 628155 9,9 ml 18 έως 30ºC LCT-BE Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-B eres SSO, Αρ. Καταλόγου 628917 LC-BE Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-B eres για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 628559-50 MX-B LIFECODES HLA-B Κύριο Μείγμα 628556 870 µl BM-B LIFECODES HLA-B Μείγμα ιχνηλατών 628553 810 µl BM-BeRES LIFECODES HLA-B eres Μείγμα ιχνηλατών 628554 810 µl Τα μείγματα ιχνηλατών είναι φωτοευαίσθητα: διατηρήστε στο ελάχιστο την έκθεση στο. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη χρησιμοποιείτε συστατικά των οποίων η ημερομηνία λήξης έχει παρέλθει. ΠΡΟΣΟΧΗ: Δεν έχουν επικυρωθεί τυχόν αποκλίσεις από το συνιστώμενο πρωτόκολλο και τα απαιτούμενα υλικά, συμπεριλαμβανομένης και της LIFECODES Πολυμεράσης Taq. Σελίδα 2 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

ΚΙΤ/ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΤΑ ΑΡ. ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ LCT-CE Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-C eres SSO, Αρ. Καταλόγου 628921 LC-CE Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-C eres για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 628850-50 MX-C LIFECODES HLA-C Κύριο Μείγμα 628803 870 µl BM- LIFECODES HLA-C eres Μείγμα ιχνηλατών 628804 810 µl CeRES LCT-DR1 Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DRB1 SSO, Αρ. Καταλόγου 628923 LM-DR1 Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DRB1 για χρήση με το Luminex = Αρ. προϊόντος 628751-50 MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Κύριο Μείγμα 628753 870 µl BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Μείγμα ιχνηλατών 628752 810 µl DS Διάλυμα αραίωσης 628155 9,9 ml 18 έως 30ºC LCT-DR1E Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DRB1eRES SSO, Αρ. Καταλόγου 628925 LC-DR1E Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DRB1eRES για χρήση με το Luminex = Αρ. προϊόντος 628759-50 MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Κύριο Μείγμα 628753 870 µl BM-DR1 BM-DR1eRES LIFECODES HLA-DRB1 Μείγμα ιχνηλατών 628752 810 µl LIFECODES HLA-DRB1 eres Μείγμα ιχνηλατών 628755 810 µl LCT-DRB3,4,5 Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 SSO, Αρ. Καταλόγου 628927 LC-DRB3,4,5 Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 629200-50 MX-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Κύριο Μείγμα 629201 870 µl 2-8 C LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Μείγμα BM-DRB3,4,5 ιχνηλατών 629202 810 µl Να προστατεύεται από το Τα μείγματα ιχνηλατών είναι φωτοευαίσθητα: διατηρήστε στο ελάχιστο την έκθεση στο. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη χρησιμοποιείτε συστατικά των οποίων η ημερομηνία λήξης έχει παρέλθει. ΠΡΟΣΟΧΗ: Δεν έχουν επικυρωθεί τυχόν αποκλίσεις από το συνιστώμενο πρωτόκολλο και τα απαιτούμενα υλικά, συμπεριλαμβανομένης και της LIFECODES Πολυμεράσης Taq. Σελίδα 3 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

ΚΙΤ/ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΤΑ ΑΡ. ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ LCT-DQAB Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DQA1/B1 SSO, Αρ. Καταλόγου 628930 LC-DQAB Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DQA1/B1 για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 200210-50 Αριθμός Όγκος Αντιδραστήριο Φύλαξη προϊόντος πλήρωσης MX-DQAB BM-DQAB LIFECODES HLA DQA1/B1 Κύριο Μείγμα 200200 870 µl 2 έως 8 C 2 έως 8 C LIFECODES HLA DQA1/B1 Μείγμα ιχνηλατών 200201 810 µl Να προστατεύεται από το Επαρκεί για 50 TAQ LIFECODES Πολυμεράση Taq 628075 25 µl -10ºC έως -30ºC LCT-DPAB Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DPA1/B1 SSO, Αρ. καταλόγου 628936 LC-DPAB Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA-DPA1/B1 για χρήση με το Luminex Αρ. προϊόντος 200110-50 MX-DPAB BM-DPAB Αντιδραστήριο LIFECODES HLA DPA1/B1 Κύριο Μείγμα Αριθμός προϊόντος Όγκος πλήρωσης Φύλαξη 200100 870 µl 2 έως 8 C 2 έως 8 C LIFECODES HLA DPA1/B1 Μείγμα ιχνηλατών 200101 810 µl Να προστατεύεται από το Επαρκεί για 50 TAQ LIFECODES Πολυμεράση Taq 628075 25 µl -10ºC έως -30ºC Τα μείγματα ιχνηλατών είναι φωτοευαίσθητα: διατηρήστε στο ελάχιστο την έκθεση στο. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη χρησιμοποιείτε συστατικά των οποίων η ημερομηνία λήξης έχει παρέλθει. ΠΡΟΣΟΧΗ: Δεν έχουν επικυρωθεί τυχόν αποκλίσεις από το συνιστώμενο πρωτόκολλο και τα απαιτούμενα υλικά, συμπεριλαμβανομένης και της LIFECODES Πολυμεράσης Taq. ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Εξακρίβωση με DNA αλληλόμορφων HLA Τάξης Ι και Τάξης ΙΙ, με σκοπό τη βοήθεια σε δότες μετάγγισης και μεταμόσχευσης καθώς και τη συμβατότητα αποδέκτη ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Η εξακρίβωση HLA με βάση το DNA με χρήση DNA ενισχυμένου με PCR είναι μια συνηθισμένη εργαστηριακή διαδικασία. Η ενίσχυση του DNA με PCR χρησιμοποιείται ως μέθοδος εμπλουτισμού μιας επιλεγμένης περιοχής DNA. Για την εξακρίβωση HLA χρησιμοποιείται ένας επακόλουθος προσδιορισμός που προσδιορίζει τις ιδιότητες του ενισχυμένου DNA. Διάφοροι τύποι προσδιορισμών, όπως οι τεχνολογίες SSP (1), άμεσου SSOP (2), RFLP (3) και SSOP ανάστροφου στυπώματος κηλίδων (4), έχουν χρησιμοποιηθεί στην εξακρίβωση HLA. Όμοια με τις μεθόδους SSOP και ανάστροφου στυπώματος κηλίδων, τα Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO χρησιμοποιούν ολιγονουκλεοτίδια ειδικά της αλληλουχίας (SSO) για να εξακριβώνουν ποια αλληλόμορφα HLA είναι παρόντα σε ένα ενισχυμένο με δείγμα PCR. Το σετ των χρησιμοποιούμενων SSO, όχι οι μεθοδολογίες, είναι αυτό που καθορίζει την ικανότητα διάκρισης των διαφόρων αλληλόμορφων που είναι παρόντα στην ενίσχυση PCR. Ενώ οι μέθοδοι ανάστροφου στυπώματος κηλίδων και SSOP χρησιμοποιούν ενζυμική ιχνηθέτηση και χρωματομετρικά υποστρώματα που απαιτούν επακόλουθη ανάπτυξη, ο προσδιορισμός LIFECODES είναι ένα ομοιογενές πολυπλεκτικό σύστημα. Δηλαδή, όλα τα SSO αναλύονται ταυτόχρονα και ολόκληρος ο προσδιορισμός εκτελείται σε ένα μόνο δοχείο αντίδρασης με την προσθήκη ενός μόνο αντιδραστηρίου. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η διαδικασία εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO βασίζεται στον υβριδισμό ιχνηθετημένου μονόκλωνου προϊόντος PCR σε ιχνηλάτες SSO. Η ενίσχυση του DNA με χρήση PCR συνήθως χρησιμοποιεί ισομοριακές ποσότητες πρόσθιου και ανάστροφου εκκινητή για την παραγωγή δίκλωνου προϊόντος DNA. Ωστόσο, αν η ποσότητα του ενός εκκινητή είναι σε περίσσεια σε σχέση με τον άλλο, η αντίδραση παράγει, εκτός από το δίκλωνο DNA, μια ποσότητα μονόκλωνου DNA. Κατά τους αρχικούς κύκλους του βήματος ενίσχυσης LIFECODES παράγεται δίκλωνο DNA. Αφού εξαντληθεί ο περιοριστικός εκκινητής, ο υπόλοιπος εκκινητής χρησιμοποιεί το δίκλωνο προϊόν ως εκμαγείο για την παραγωγή μονόκλωνου DNA. Η μέθοδος αυτή παράγει δίκλωνο και μονόκλωνο προϊόν τα οποία, αφού μετουσιωθούν, θα συμμετάσχουν και τα δύο στην αντίδραση υβριδισμού. Καθένας από τους διαφορετικούς ιχνηλάτες μπορεί να είναι ομόλογος προς μια αλληλουχία στο ενισχυμένο DNA η οποία είναι μοναδική σε ένα αλληλόμορφο ή μια ομάδα αλληλόμορφων. Με άλλα λόγια, οι ιχνηλάτες είναι σχεδιασμένοι έτσι ώστε κάθε ιχνηλάτης να υβριδοποιεί κατά προτίμηση μια συμπληρωματική περιοχή που μπορεί να είναι ή να μην είναι παρούσα στο ενισχυμένο DNA. Επιπρόσθετα, το ενισχυμένο DNA επίσης υβριδοποιείται σε έναν ή περισσότερους συναινετικούς ιχνηλάτες ομόλογους προς αλληλουχίες παρούσες σε όλα τα αλληλόμορφα ενός γενετικού τόπου. Η εξακρίβωση SSO μπορεί να επηρεαστεί από τον τύπο του βιολογικού υλικού, τη μέθοδο καθαρισμού, την ποσότητα και την ακεραιότητα του γενωμικού DNA. Επομένως, το σήμα που λαμβάνεται για τον(ους) συναινετικό(ούς) ιχνηλάτη(ες) μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης της επιτυχίας των διαδικασιών ενίσχυσης και υβριδισμού. Επίσης, το σήμα που λαμβάνεται με τον συναινετικό ιχνηλάτη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ομαλοποίηση του σήματος των ειδικών για αλληλόμορφα ιχνηλατών και τη διόρθωση Σελίδα 4 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

των διακυμάνσεων στην ποσότητα του ενισχυμένου προϊόντος στην αντίδραση υβριδισμού. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων που παρήχθησαν από την εξακρίβωση SSO μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξακριβώσει την παρουσία ή απουσία συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA σε ενισχυμένο DNA και για να προσδιορίσει τα πιθανά αλληλόμορφα στο δείγμα. Για τη διαδικασία εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO, οι ιχνηλάτες προσαρτώνται σε μικροσφαίρες Luminex που έχουν σχεδιαστεί για χρήση με το όργανο Luminex. Έως 100 διαφορετικοί πληθυσμοί μικροσφαιρών Luminex μπορούν να αναμειχθούν και να αναλυθούν από το όργανο Luminex επειδή κάθε πληθυσμός μικροσφαιρών ξεχωρίζει από τη μοναδική φθορίζουσα υπογραφή του ή το χρώμα του. Σε κάθε έγχρωμη μικροσφαίρα μπορεί να προσαρτηθεί διαφορετικός ιχνηλάτης SSO. Επομένως, ένα μείγμα διαφόρων ιχνηλατών μπορεί να διαχωριστεί μέσω της προσάρτησής τους σε διαφορετικές έγχρωμες μικροσφαίρες. Το όργανο Luminex μπορεί επίσης να προσδιορίσει την ποσότητα στις σχετικές ποσότητες ιχνηθετημένου προϊόντος PCR με υβριδισμό σε κάθε μικροσφαίρα Luminex. Επομένως, το σχετικό σήμα που λαμβάνεται με τους ιχνηλάτες SSO στον προσδιορισμό LIFECODES, όπως και με άλλες μεθόδους SSOP, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το χαρακτηρισμό των ιχνηλατών σαν να έχουν θετική ή αρνητική αντιδραστικότητα με το δείγμα ενισχυμένου DNA (βλ. ενότητα Αποτελέσματα). Αυτό, με τη σειρά του, παρέχει τις πληροφορίες που απαιτούνται για τον προσδιορισμό του φαινοτύπου HLA του δείγματος. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ A. Ταυτοποίηση Δείτε τους πίνακες στην ενότητα Κιτ/Αντιδραστήρια κατά αρ. καταλόγου για τον πλήρη κατάλογο των προϊόντων και των αριθμών καταλόγου. B. Προειδοποιήσεις ή Προφυλάξεις 1. Για διαγνωστική χρήση in vitro. 2. Πρέπει να προβλέπονται χωριστές πιπέτες για τους χειρισμούς προ-pcr και για τους χειρισμούς μετα-pcr. 3. Βιολογικός κίνδυνος: Όλα τα βιολογικά και τα αίματος πρέπει να αντιμετωπίζονται σαν να είναι δυνητικά μολυσματικά. Να χρησιμοποιείτε τις Γενικές Προφυλάξεις κατά το χειρισμό. 4. Το Διάλυμα αραίωσης, τα μείγματα ιχνηλατών, η TAQ πολυμεράση και η PE-Στρεπταβιδίνη περιέχουν επικίνδυνα συστατικά. Αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα και απορρίψτε όλα τα υλικά μετά τη χρήση, σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά Φύλλα δεδομένων ασφαλείας υλικού. 5. Τα αποτελέσματα από αυτά τα κιτ δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ως μοναδική βάση για λήψη κλινικής απόφασης, η οποία επηρεάζει τον ασθενή. Γ. Οδηγίες φύλαξης 1. Για τις κατάλληλες θερμοκρασίες φύλαξης, ανατρέξτε στην ετικέτα συσκευασίας του συστατικού του κιτ. 2. Τα μείγματα ιχνηλατών και η PE-Στρεπταβιδίνη είναι φωτοευαίσθητα υλικά. ΚΡΑΤΗΣΤΕ ΤΑ ΜΑΚΡΙΑ ΑΠΟ ΦΩΣ, ΜΗΝ ΤΑ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. 3. Μη χρησιμοποιείτε συστατικά των οποίων η ημερομηνία λήξης έχει παρέλθει. Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση Βλ. «Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία». E. Ενδείξεις αστάθειας 1. Αν έχουν κατακρημνιστεί άλατα στο διάλυμα κατά την αποστολή ή τη φύλαξη, διαλύστε πάλι πλήρως πριν από τη χρήση με δονητική ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 30ºC). 2. Μη χρησιμοποιείτε στρεπταβιδίνη συζευγμένη με R-φυκοερυθρίνη, η οποία έχει καταψυχθεί κατά την αποστολή ή την αποθήκευση. 3. Τα κιτ είναι σταθερά για ένα ελάχιστο χρονικό διάστημα 6 μηνών από το άνοιγμα όταν φυλάσσονται σύμφωνα με τις συστάσεις. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΟΡΓΑΝΑ 1. Όργανο Luminex, XY PLATFORM (Αριθμός προϊόντος 888300, 888302) 2. Έχουν επικυρωθεί οι ακόλουθοι Θερμικoί Ανακυκλωτές: 96-Well GeneAmp PCR σύστημα 9700 ρυθμιζόμενο σε τρόπο MAX (Βασικός Αρ. Καταλ. N8050200, Gold Block Αρ. Καταλ. 4314878), Θερμικός Ανακυκλωτής Veriti 96-Well ρυθμιζόμενος σε τρόπο 9700 MAX (Αρ. Καταλ. 4375786). Αναφερθείτε στον Πίνακα Table 2 για τις μέγιστες ταχύτητες κλιμάκωσης. Προσοχή: Δεν έχουν επικυρωθεί άλλοι ανακυκλωτές και ταχύτητες κλιμάκωσης. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ α. Το ανθρώπινο DNA δύναται να εξαγνιστεί από ολικό αίμα, στιβάδα λευκοκυττάρων και παρειακή απόξεση με εγκεκριμένη μέθοδο που ανταποκρίνεται στα παρακάτω κριτήρια. β. Το DNA που βγαίνει από αίμα και έχει συντηρηθεί σε EDTA και ACD (Κιτρικιούχο Όξινη Δεξτρόζη) έχει τεθεί υπό δοκιμασία και έχει αποδειχθεί ότι δίνει την αναμενόμενη απόδοση σε αυτήν την ανάλυση. Το DNA που βγαίνει από αίμα που έχει συντηρηθεί σε ηπαρίνη δεν δύνανται να χρησιμοποιηθεί σε αυτήν την ανάλυση. Δεν έχουν τεθεί υπό δοκιμασία άλλα συντηρητικά. γ. Το απομονωμένο DNA πρέπει να βρίσκεται σε 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 ή σε νερό χωρίς νουκλεάση. Αν υπάρχει χηλωτής, όπως το EDTA, η τελική συγκέντρωση του χηλωτή δεν πρέπει να υπερβαίνει την τιμή 0,5 mm. δ. Η παρουσία αλκοόλης, απορρυπαντικών ή αλάτων μπορεί να έχει αρνητική επίδραση στην ενίσχυση του DNA. ε. Η τελική συγκέντρωση του DNA πρέπει να είναι 10 200 ng/µl. ζ. Οι μετρήσεις απορροφητικότητας του δείγματος DNA στα 260 και 280nm πρέπει να δώσουν μια αναλογία 1,65 έως 2,0. η. Το DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως μετά την απομόνωσή του ή να καταψυχθεί στους 20 ο C για έως 1 έτος. Η επανειλημμένη ψύξη/απόψυξη πρέπει να αποφεύγεται γιατί αυτή η διαδικασία μπορεί να προκαλέσει αλλοίωση του DNA. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Προσοχή: Δεν έχουν επικυρωθεί τυχόν αποκλίσεις από το συνιστώμενο πρωτόκολλο και τα απαιτούμενα υλικά. A. Παρεχόμενα υλικά (Βλ. πίνακες στην ενότητα Κιτ/Αντιδραστήρια κατά αρ. καταλόγου για ειδικές πληροφορίες) Κατάλληλο Κύριο Μείγμα (MX) Κατάλληλο μείγμα/μείγματα ιχνηλάτησης (ΒΜ) Διάλυμα αραίωσης (DS) Πίνακας κατωφλίων, Διαγράμματα ιχνηλάτησης LIFECODES Πολυμεράση Taq (LIFECODES Αρ. Καταλ. 628075) Σελίδα 5 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

B. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Τα παρακάτω υλικά χρησιμοποιήθηκαν για την εγκυρότητα του κιτ: Υγρό Ελύτρου Luminex (1x Lifecodes Αρ. Κατ. 628005) Διαφανής ταινία πολυαιθυλενίου Thermowell (Costar Αρ. 6524 Νερό χωρίς νουκλεάση (Lifecodes Αρ. Κατ. 757003, 20ml) (LIFECODES Αρ. Καταλ. 888635) Σωληνάρια και πώματα PCR Λωρίδες σωληναρίων (PE)-Στρεπταβιδίνη συζευγμένη με φυκοερυθρίνη (SA-PE), 1mg/mL Corning Thermowell φρέαρ (Costar Αρ. Καταλ. 6542, (LIFECODES Αρ. Κατ. 628511) LIFECODES Αρ. Καταλ. 888640) ή πλάκες φρεατίων Κιτ Βαθμονόμησης Luminex (Κιτ Βαθμονόμησης Luminex 100/200, Corning Thermowell PCR 96 (Αρ. Καταλ. CLS6551) ή Κιτ Επαλήθευσης Απόδοσης Luminex 100/200, LIFECODES Αρ. Thermo Scientific AB Gene SuperPlate 96-πλάκα Καταλ. 628018 και 628019 αντίστοιχα) φρεατίου PCR (Αρ. Καταλ. AB-2100) Πλάκα Costar (Costar Αρ. Καταλ. 6509, LIFECODES Αρ. Καταλ. 888630) Γ. Συμπληρωματικά υλικά που παρέχονται από το χρήστη Δονητικός αναδευτήρας Υλικ. συμπίεσης σιλικόνης Axygen Scientific αρ. CM-FLAT ή ισοδύναμο Συσκευή λουτρού υπερήχων Απολήξεις φίλτρων μικροφυγόκεντρου Συσκευές πιπεταρίσματος, Πολυκάναλες συσκευές πιπεταρίσματος και απολήξεις (1-20µL, 20-200µL, 1000µL) Λογισμικό ανάλυσης υπολογιστικού φύλλου Θερμαντική πλάκα 70% Ισοπροπανόλη ή 20% Λευκαντικό Δίσκος συγκράτησης - Applied Biosystems αρ. 403081 (για χρήση μόνο με τον ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: Τα μείγματα ιχνηλατών και η PE-Στρεπταβιδίνη είναι φωτοευαίσθητα υλικά: κρατήστε τα μακριά από το και μην τα καταψύχετε. Θερμάνετε τα σφαιρίδια στους 55-60ºC για τουλάχιστον 5-10 λεπτά για να υγροποιήσετε πλήρως τα συστατικά στο μείγμα ιχνηλατών. Χρησιμοποιήστε για λίγο (~15 δευτ.) τη συσκευή υπερήχων και μετά τοποθετήστε το μείγμα ιχνηλατών σε δονητικό αναδευτήρα για 15 δευτερόλεπτα περίπου για να εναιωρηθούν πλήρως τα σφαιρίδια. Να είστε ιδιαίτερα προσεκτικοί στη διαδικασία κλασμάτωσης, χρησιμοποιώντας βαθμονομημένες πιπέτες. Αν δεν το κάνετε, μπορεί να προκληθεί απώλεια του αντιδραστηρίου και αποτυχία του δείγματος. Όλες οι θερμοκρασίες πρέπει να διατηρούνται επακριβώς. Διακυμάνσεις της τάξης του +/- 0,5 C μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα. Στο στάδιο υβριδισμού, τα δεν πρέπει να παραμείνουν στην αραιωμένη κατάσταση στους 56 C για παραπάνω από 5 λεπτά (Βλ. ενότητα Αποτελέσματα). Συνιστάται να προσδιορίζετε τα ενισχυμένα όσο γίνεται πιο γρήγορα. Αν τα δεν μπορούν να μετρηθούν στο όργανο Luminex την ίδια ημέρα, το ενισχυμένο προϊόν μπορεί να φυλαχτεί για έως 3 ημέρες στους πριν από τη χρήση. Για μεγαλύτερη διάρκεια αποθήκευσης,αποθηκεύστε στους -20 ο C για μία βδομάδα το πολύ, μέχρι να είναι έτοιμο για προσδιορισμό. Το ενισχυμένο προϊόν μπορεί να ψυχθεί και να αποψυχθεί μόνο μία φορά. Οι επανειλημμένες ψύξεις και αποψύξεις προκαλούν αλλοίωση των ενισχυμένων δειγμάτων και παράγουν φτωχά αποτελέσματα κατά τον προσδιορισμό. A. Καθαρίστε το γενωμικό DNA, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο της επιλογής σας. Η τελική συγκέντρωση πρέπει να είναι 10 200 ng/µl. Προσαρμόστε, αν χρειάζεται, με νερό χωρίς νουκλεάση. Διατηρήστε όλα τα σε παρόμοιες συγκεντρώσεις. B. Ενίσχυση DNA (PCR) 1. Αφήστε το Κύριο Μείγμα να θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως30ºc). 2. Αναμείξτε απαλά με δονητικό αναδευτήρα τα αντιδραστήρια για 10 δευτερόλεπτα περίπου. Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίζεται ότι τα άλατα είναι στο διάλυμα. Περιστρέψτε για σύντομο χρονικό διάστημα (5 10 δευτερόλεπτα) σε μικροφυγόκεντρο για να τοποθετηθεί το περιεχόμενο στον πυθμένα του σωληναρίου. 3. Χρησιμοποιώντας τον Πίνακα 1 παρακάτω, παρασκευάστε τα συστατικά για ενίσχυση n+1 αντιδράσεων χρησιμοποιώντας την ενδεικνυόμενη ποσότητα καθενός συστατικού ανά αντίδραση (εκτός από το DNA). Δημιουργήστε τελικό όγκο 20µl ανά αντίδραση με νερό χωρίς νουκλεάση. Αναμείξτε απαλά με δονητικό αναδευτήρα. 4. Μεταφέρετε με πιπέτα την κατάλληλη ποσότητα γενωμικού DNA (40 έως 120ng) στα σωληνάρια PCR. 5. Χωρίστε σε κλάσματα το μείγμα ενίσχυσης στα σωληνάρια PCR που περιέχουν το γενωμικό DNA. (Ο συνολικός όγκος του κύριου μείγματος και του γενωμικού DNA πρέπει να είναι ίσος με 20µl για κάθε αντίδραση δείγματος.) 6. Σφίξτε καλά τα καπάκια στα σωληνάρια για να εμποδίσετε την εξάτμιση κατά τη διάρκεια του PCR. 7. Τοποθετήστε τα στο θερμικό ανακυκλωτή και εκτελέστε το πρόγραμμα, βλ. Πίνακα 2 και Πίνακα 3. Σελίδα 6 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

Πίνακας 1. Συστατικά αντίδρασης για ενίσχυση Συστατικό Πίνακας 2. Συνθήκες θερμικού ανακυκλωτή για ενίσχυση Ποσότητα ανά αντίδραση δείγματος PCR LIFECODES Κύριο Μείγμα 6µl Γενωμικό DNA 10-200ng/µl Συνολικά ~80ng LIFECODES TAQ πολυμεράση 0,2µl (1U) Νερό χωρίς νουκλεάση Τελικός όγκος 20µl Θερμικός ανακυκλωτής GeneAmp PCR Σύστημα 9700 Θερμικός ανακυκλωτής Veriti 96-Well Τρόπος λειτουργίας (Ταχύτητα κλιμάκωσης) Τρόπος λειτουργίας MAX (3,9 C/δευτ.) ΜΕΓΙΣΤΟΣ τρόπος λειτουργίας 9700 (3,9 C/δευτ.) Πίνακας 3. Συνθήκες θερμικού ανακυκλωτή για ενίσχυση Θερμοκρασία και χρόνος Βήμα επώασης Αρ. κύκλων 1 95º C για 3 λεπ. 1 2 3 95º C για 15 δευτ. 60º C για 30 δευτ. 72º C για 30 δευτ. 95º C για 10 δευτ. 63º C για 30 δευτ. 72º C για 30 δευτ. 4 72º C για 2 λεπ. 1 5 4º C πάντα 1 Σημείωση: Για να είστε βέβαιοι για την ενίσχυση δειγμάτων, ανατρέξτε στην Ηλεκτροφόρηση γέλης προϊόντων (Παράρτημα A). Γ. Υβριδισμός Βεβαιωθείτε ότι τα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού του μείγματος ιχνηλατών LIFECODES είναι υγροποιημένα και ότι τα σφαιρίδια εναιωρούνται πλήρως. Ξεκινήστε το όργανο Luminex και τη Βάση XY και αφήστε τα να προθερμανθούν για 30 λεπτά. 1. Θερμάνετε το μείγμα ιχνηλατών σε θερμαντική πλάκα 55-60 C για τουλάχιστον 5-10 λεπτά για να διαλυτοποιήσετε πλήρως τα συστατικά στο μείγμα ιχνηλατών. 2. Χρησιμοποιήστε για λίγο (~15 δευτ.) τη συσκευή υπερήχων και μετά τοποθετήστε το μείγμα ιχνηλατών σε δονητικό αναδευτήρα για 15 δευτερόλεπτα περίπου για να εναιωρηθούν πλήρως τα σφαιρίδια. 3. Συνδυάστε 15 µl από κατάλληλο μίγμα ιχνηλατών με 5 μl προϊόντος PCR για ειδικό γενετικό τόπο σε κάθε φρεάτιο θερμικού ανακυκλωτή με πλάκα 96 φρεατίων (Costar Αρ. 6509). Σημείωση: Τα Κιτ A eres, B eres και DRB1 eres Kits απαιτούν δύο φρεάτια για κάθε δείγμα, ένα για το μίγμα ιχνηλατών eres και ένα για το τυπικό μίγμα ιχνηλατών. Το μίγμα ιχνηλατών eres και το τυπικό μίγμα ιχνηλατών δεν είναι απαραίτητο να εκτελεστύν κατά την ίδια διαδικασία. Και τα δύο μίγματα είναι απαραίτητα για την επίτευξη αποτελεσμάτων eres για αυτά τα κιτ. Τα Κιτ C eres περιέχουν μόνο ένα τυπικό μίγμα ιχνηλατών. Όταν εκτελείται κλασμάτωση στο μίγμα ιχνηλατών για περισσότερα από 10 φρεάτια, κουνήστε απαλά το μίγμα ιχνηλατών μετά από κάθε σετ των δέκα. Σφραγίστε το πλακίδιο με ταινία από πολυαιθυλένιο (Costar No. 6524). 4. Τοποθετήστε πλακίδιο συμπίεσης της σιλικόνης στο επάνω μέρος της πλάκας πριν από τον υβριδισμό. 5. Υβριδοποιήστε τα υπό τις ακόλουθες συνθήκες επώασης: Πίνακας 4. Συνθήκες θερμικού ανακυκλωτή για υβριδισμό Βεβαιωθείτε ότι το λέιζερ ανίχνευσης στο όργανο Luminex έχει ενεργοποιηθεί τουλάχιστον 30 λεπτά πριν ολοκληρωθεί ο υβριδισμός. 6. Κατά τον υβριδισμό των δειγμάτων, παρασκευάστε ένα μείγμα 200:1 διαλύματος αραίωσης/pe-στρεπταβιδίνης. Συνδυάστε 170µl διαλύματος αραίωσης (DS) και 0,85 µl 1mg/mL PE-Στρεπταβιδίνης (SA-PE) ανά δείγμα. Συνιστάται να παρασκευάσετε αρκετό μείγμα διαλύματος αραίωσης για n+1 ώστε να αντισταθμιστούν οι απώλειες κατά τη μεταφορά με πιπέτα. (Βλ. Πίνακα 5) 7. Φυλάξτε το μείγμα διαλύματος αραίωσης / PE-Στρεπταβιδίνης σε σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου - η PE-Στρεπταβιδίνη είναι φωτοευαίσθητη! Το διάλυμα αραίωσης μπορεί να θερμανθεί στους 45º C για 5 λεπτά και να αναμειχθεί με δονητικό αναδευτήρα μόλις παραληφθεί για να διασφαλιστεί ότι όλα τα συστατικά είναι διαλυμένα. Το διάλυμα αραίωσης πρέπει να είναι σε θερμοκρασία δωματίου (18 30 C) πριν ετοιμαστεί το δείγμα. Παρασκευάστε πριν από τη χρήση και απορρίψτε το τμήμα που ενδεχομένως έχει απομείνει. 12 28 97º C για 2 λεπτά 47º C για 10 λεπτά 56º C για 8 λεπτά 56º C ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ Σελίδα 7 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

Πίνακας 5. Όγκοι παρασκευής διαλύματος αραίωσης Αριθμός δειγμάτων Διάλυμα αραίωσης (DS) PE-Στρεπταβιδίνη (SA-PE) 1 170µl 0,85µl 5 850µl 4,25µl 10 1700µl 8,5µl 20 3400µl 17µl 50 8500µl 42,5µl Σημείωση: ΜΗΝ ΑΚΥΡΩΣΕΤΕ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΥ ΠΡΙΝ ΑΦΑΙΡΕΣΕΤΕ ΤΟΝ ΔΙΣΚΟ ΑΠΟ ΤΟΝ ΘΕΡΜΙΚΟ ΑΝΑΚΥΚΛΩΤΗ! 8. Στους 56º C με διατήρηση (hold), με τον δίσκο στον θερμικό ανακυκλωτή, αραιώστε κάθε δείγμα με 170µl από το παρασκευασμένο μείγμα διαλύματος αραίωσης/pe- Στρεπταβιδίνης. Είναι ζωτικής σημασίας να αραιωθούν όλα τα μέσα σε 5 λεπτά (μετά το βήμα HOLD (Αναμονή) διάρκειας 8 λεπτών στους 56 C). 9. Αφαιρέστε τον δίσκο δειγμάτων από τον θερμικό ανακυκλωτή και τοποθετήστε τον στο όργανο Luminex. Δ. Αναλύστε το δείγμα χρησιμοποιώντας το όργανο Luminex* Για βέλτιστα αποτελέσματα, προσδιορίστε τα αμέσως χρησιμοποιώντας το όργανο Luminex. Τα μπορούν να μετρηθούν έως και 30 λεπτά μετά την αραίωση. Αν δεν μετρηθούν αμέσως, προστατέψτε τα από το. 1. Ενεργοποιήστε το όργανο Luminex 30 λεπτά έως 4 ώρες πριν από τον προσδιορισμό των δειγμάτων. 2. Πριν από την ανάλυση των δειγμάτων στο όργανο Luminex, ετοιμάστε μια ανάλυση παρτίδας (Batch Run) με την οποία θα αναλυθούν τα. α) Επιλέξτε Create a New Batch (Δημιουργία νέας παρτίδας) από το μενού File (Αρχείο). Για παράδειγμα, αν εκτελείτε ανάλυση για HLA-DRB1, προσθέστε παρτίδα για HLA-DRB1 Το Εκμαγείο παρτίδας (Batch Template) παρέχεται και ονομάζεται, στη συγκεκριμένη περίπτωση, HLA-DRB1. Σημειώστε ότι οι εκδόσεις των εκμαγείων είναι ειδικές του αριθμού παρτίδας και αντιστοιχούν στους αριθμούς παρτίδων του κιτ. Ακολουθήστε τα βήματα των οδηγιών δημιουργίας ομάδων που εμφανίζονται στην οθόνη. Όταν ονομάζετε την παρτίδα, μη συμπεριλάβετε κόμματα στο όνομα γιατί οι πληροφορίες μετά το κόμμα θα χαθούν κατά την εξαγωγή των δεδομένων. Για περισσότερες οδηγίες σχετικά με τη δημιουργία παρτίδων και πολλαπλών παρτίδων, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του Luminex. β) Κάντε κλικ στο κουμπί εκτίναξης για να εκτιναχτεί η βάση συγκράτησης της πλάκας. Τοποθετήστε την πλάκα του θερμικού ανακυκλωτή με τα 96 φρεάτια, η οποία περιέχει τα, στη θερμαντική πλάκα XYP που υπάρχει στη βάση συγκράτησης της πλάκας. γ) Κάντε κλικ στο εικονίδιο Retract (Απόσυρση). Τα είναι τώρα έτοιμα για ανάλυση. Θα πρέπει να εκτελεστεί ένα βήμα εκκινητή πριν ξεκινήσει η ανάλυση. δ) Μετά την ανάλυση των δειγμάτων από το όργανο, θα πρέπει να εκτελεστεί ένα βήμα καθαρισμού με 70% Ισοπροπανόλη ή 20% οικιακό λευκαντικό, και στη συνέχεια θα ακολουθήσουν δύο βήματα πλύσης. Στο σημείο αυτό μπορείτε να σβήσετε το όργανο, εφόσον δεν σκοπεύετε να το χρησιμοποιήσετε στο υπόλοιπο της ημέρας. 3. Αφού ολοκληρωθεί η ανάλυση μίας παρτίδας, τα δεδομένα εξάγονται ως αρχείο τιμών διαχωρισμένων με κόμμα (csv). Τα αρχεία αυτά ονομάζονται OUTPUT.CSV και είναι αποθηκευμένα σε έναν φάκελο με το Όνομα Παρτίδας καταχωρισμένο στο Luminex IS. Τα δεδομένα αυτά είναι κατόπιν διαθέσιμα για την εκτέλεση εξακριβώσεων όπως περιγράφεται παρακάτω. *Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του Luminex IS για τη λειτουργία του οργάνου, περιλαμβανομένης της καθημερινής εκκίνησης, της βαθμονόμησης, της συντήρησης και των διαδικασιών τερματισμού λειτουργίας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το λογισμικό εξακρίβωσης DNA MATCH IT! προορίζεται ως βοηθητικό μέσο για την ανάλυση των κιτ εξακρίβωσης LIFECODES SSO Η εξακρίβωση δειγμάτων μπορεί να εκτελεστεί ως εξής: Τα παραγόμενα αρχεία CSV μπορούν να ανοιχτούν και τα δεδομένα να υποστούν επεξεργασία με συνηθισμένα προγράμματα λογιστικών φύλλων όπως τα Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro ή παρόμοιο λογισμικό. Η ανάλυση περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα: 1) Επαληθεύστε ότι ισχύει ο ελάχιστος αριθμός συμβάντων για κάθε SSO σε κάθε δείγμα. Οι πληροφορίες αυτές βρίσκονται στην ενότητα DataType: Count (Τύπος δεδομένων: Καταμέτρηση) του αρχείου CSV. 2) Εξακριβώστε ότι οι τιμές για τους συναινετικούς ιχνηλάτες για κάθε δείγμα είναι μεγαλύτερες από τη μικρότερη διάμεση ένταση φθορισμού ή MFI. Τα ελάχιστα κατώφλια είναι ειδικά της παρτίδας και μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα κατωφλίων. Προσοχή: Για να πάρετε αξιόπιστα αποτελέσματα, πρέπει να έχουν συλλεχθεί επαρκή δεδομένα από το όργανο Luminex. Συλλέξτε τουλάχιστον 40 συμβάντα για HLA-DQA1/B1 (Αρ. προϊόντος 628930) και HLA-DPA1/B1 (Αρ. προϊόντος 628936). Συλλέξτε τουλάχιστον 60 συμβάντα για τα υπόλοιπα κιτ που αναγράφονται στην Ενότητα "ΚΙΤ/ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΤΑ ΑΡ. ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ" ή τον ελάχιστο αριθμό συμβπάντων που ορίζεται στα συγκεκριμένα έγγραφα των παρτίδων. 3) Αφαιρέστε την τιμή του Background Control (Μάρτυρα θορύβου) για κάθε ιχνηλάτη από τις τιμές των δειγμάτων για να πάρετε το διορθωμένο ως προς τον θόρυβο σετ δεδομένων. Οι τιμές των μαρτύρων θορύβου είναι ειδικές της παρτίδας και μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα κατωφλίων. Οι τιμές θορύβου είναι οι μέσες τιμές MFI για κάθε σφαιρίδιο με τις οποίες αντισταθμίζεται ο θόρυβος του υπόβαθρου που οφείλεται στις διακυμάνσεις των σφαιριδίων. 4) Για κάθε δείγμα, διαιρέστε τα διορθωμένα για θόρυβο δεδομένα για κάθε ιχνηλάτη με τη διορθωμένη για θόρυβο τιμή του αντίστοιχου συναινετικού ιχνηλάτη για να πάρετε το ομαλοποιημένο σετ δεδομένων. MFI (Ιχνηλάτης) MFI (Τυφλός μάρτυρας για ιχνηλάτη) Σελίδα 8 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

MFI (Συναινετικός) MFI (Τυφλός μάρτυρας για συναινετικό) 5) Για κάθε ιχνηλάτη, καταγράψτε την ομαλοποιημένη τιμή στο Φύλλο εργασίας με τον Πίνακα κατωφλίων. 6) Αφού αντιστοιχιστούν όλες οι τιμές, το μοτίβο δραστηριότητας των ιχνηλατών (δηλαδή, ο συνδυασμός όλων των θετικών και αρνητικών αντιστοιχίσεων για ένα συγκεκριμένο δείγμα) μπορεί να συγκριθεί με τους παρεχόμενους Τραπέζι/Πίνακες δραστηριότητας ιχνηλατών. Προσοχή: Υπάρχει χωριστός πίνακας κατωφλίων για κάθε γενετικό τόπο και για κάθε μείγμα ιχνηλατών, Οι πίνακες κατωφλίων είναι ειδικοί της παρτίδας. Βεβαιωθείτε ότι ο αριθμός παρτίδας στους πίνακες κατωφλίων ταιριάζει με τον αριθμό παρτίδας στο κιτ εξακρίβωσης. Αν μια ομαλοποιημένη τιμή για έναν συγκεκριμένο ιχνηλάτη βρίσκεται πάνω από το μέγιστο κατώφλι για μια αρνητική αντιστοίχιση και κάτω από την ελάχιστη τιμή για μια θετική αντιστοίχιση, το δείγμα θα πρέπει να θεωρηθεί απροσδιόριστο για το συγκεκριμένο ιχνηλάτη. Η εξακρίβωση του δείγματος μπορεί να γίνει, υποθέτοντας πρώτα ότι η τιμή είναι αρνητική και κατόπιν ότι η τιμή είναι θετική. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις τιμές κατωφλίων, ανατρέξτε στην ενότητα ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ. ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Συνιστάται η εκτέλεση ενός αρνητικού κι ενός θετικού ελέγχου σε κάθε δοκιμή, όπως ένα τυφλό διάλυμα ύδατος και ένα προηγουμένως αναγραφόμενο δείγμα αντίστοιχα. Οι ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας (SSO), που είναι καταχωρημένοι στον Πίνακα Εισόδου, υβριδοποιούνται στα συγκεκριμένα αλληλόμορφα της αντίστοιχης θέσης. Οι τιμές που λαμβάνονται με τους ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας (SSO) από τους θετικούς ελέγχους πρέπει να υπερβαίνουν την τιμή εισόδου για τα ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας (SSO) όπως έχει θεσπιστεί στο Φύλλο του Πίνακα Εισόδου. Οι τιμές που αποκτούνται με τους ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας (SSO) από κενά νερού πρέπει να είναι χαμηλότερες από τη βασική τιμή για το SSO που τίθεται στο Φύλλο Εργασίας του Πίνακα Βάσης. Το/τα μίγματα ανιχνευτή LIFECODES περιέχουν έναν ή περισσότερους ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας που προσδιορίζονται στα φύλλα εργασίας του κιτ εξακρίβωσης. Αυτοί οι ανιχνευτές συναίνεσης υβριδίζονται σε όλα τα αλληλόμορφα και δρουν ως εσωτερικοί μάρτυρες για την επαλήθευση ενίσχυσης και για την επιβεβαίωση υβριδισμών. Εάν η ελάχιστη τιμή δεν ληφθεί για αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας (SSO), το δείγμα ίσως να μην παράγει τον σωστό τύπο και πρέπει να γίνει επανάληψη της δοκιμής του δείγματος. Η δοκιμασία πρέπει να εκτελεστεί όπως συνιστάται στο εσωτερικό της συσκευασίας καθώς επίσης όπως εκτελείται με κάθε άλλη διαδικασία ποιοτικού ελέγχου που συμφωνεί με τις τοπικές απαιτήσεις και τις απαιτήσεις της πολιτείας, της ομοσπονδίας ή / και των υπηρεσιών διαπίστευσης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Οι συνθήκες PCR και προσδιορισμού που περιγράφονται απαιτούν επακριβώς ελεγχόμενες συνθήκες. Αποκλίσεις από αυτές τις παραμέτρους μπορεί να οδηγήσουν σε αποτυχία του προϊόντος. Όλα τα όργανα πρέπει να βαθμονομηθούν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και να χρησιμοποιηθούν εντός των παραμέτρων που ορίζει ο κατασκευαστής. 1) Τα σφαιρίδια πρέπει να προθερμανθούν και να εναιωρηθούν καλά πριν από τη χρήση. Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίζεται ότι είναι διαλυμένα τα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού. 2) Οι επωάσεις στους 47ºC και 56ºC απαιτούν υψηλό βαθμό ακρίβειας (+/- 0,5ºC). Πρέπει να χρησιμοποιηθεί θερμικός ανακυκλωτής. Η θερμοκρασία πρέπει να επαληθεύεται στα φρεάτια της πλάκας 96 φρεατίων του θερμικού ανακυκλωτή με ένα θερμόζευγος (π.χ., Bio-Rad, Αρ. μοντέλου VPT-0300 ή ισοδύναμο). Η θερμοκρασία μέσα στα φρεάτια και μεταξύ των φρεατίων δεν πρέπει να παρουσιάζει διακυμάνσεις μεγαλύτερες από +/- 0,5ºC. 3) Ο χρόνος στους 56ºC είναι κρίσιμης σημασίας και δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 13 λεπτά συνολικά. Σε αυτόν τον χρόνο περιλαμβάνεται η 8 λεπτά επώαση και χρόνος 5 λεπτών το πολύ για την αραίωση όλων των δειγμάτων με μείγμα διαλύματος αραίωσης/pe-στρεπταβιδίνης. 4) Μετά την αραίωση, τα είναι σταθερά σε θερμοκρασία δωματίου για έως 2 ώρες (πρέπει να προστατεύονται από το ). Εφόσον μία πλήρης πλάκα 96 φρεατίων μπορεί να χρειαστεί έως 1,5 ώρες για να μετρηθεί στο όργανο Luminex, η ανάλυση πρέπει να ξεκινήσει όχι αργότερα από 30 λεπτά μετά την αραίωση για να διασφαλιστεί ότι το τελευταίο δείγμα αναλύθηκε εντός του ορίου των 2 ωρών. 5) Μην αναμείξετε συστατικά από άλλα κιτ και παρτίδες. Λόγω της σύνθετης φύσης της εξακρίβωσης HLA, η ερμηνεία των δεδομένων και οι αντιστοιχίσεις των τύπων πρέπει να εκτελούνται από εξειδικευμένο προσωπικό. Σελίδα 9 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΠΙΘΑΝΗ ΑΙΤΙΑ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ Χαμηλός αριθμός Το μείγμα ιχνηλατών δεν έχει εναιωρηθεί καλά Προθερμάνετε, χρησιμοποιήστε τη συσκευή υπερήχων σφαιριδίων και τον δονητικό αναδευτήρα και επαναλάβετε τον Αποτυχία κατωφλίου CON Πολλαπλές αποτυχίες SSO ή το δείγμα δεν μπορεί να παράγει αποτέλεσμα εξακρίβωσης HLA Το όργανο δεν λειτουργεί καλά Το δείγμα δεν ενισχύθηκε ή ενισχύθηκε ανεπαρκώς* Εκτός βαθμονόμησης Η διαδρομή ροής του δείγματος είναι φραγμένη Χαμηλό DNA Άλατα στο Κύριο Μείγμα δεν έχουν διαλυθεί Ανεπαρκής πολυμεράση Taq πολυμεράση Οι συνθήκες ενίσχυσης δεν βρίσκονται εντός των καθορισμένων παραμέτρων προσδιορισμό. Βαθμονομήστε το όργανο. (Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του Luminex IS.) Αφαιρέστε και τοποθετήστε τη βελόνα στη συσκευή υπερήχων. Εκτελέστε αντίστροφη έκπλυση. Αν το πρόβλημα επιμένει, επικοινωνήστε με την Immucor GTI Diagnostics, Inc. +1 (855) 466-8267 Ελέγξτε τη συγκέντρωση και καθαρότητα του DNA. Θερμάνετε το Κύριο Μείγμα στους 37ºC για 5 λεπτά, χρησιμοποιήστε απαλά τον δονητικό αναδευτήρα και φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα. Χρησιμοποιήστε την επικυρωμένη LIFECODES Πολυμεράση Taq Αρ. Καταλ. 628075. Εκτελέστε το θερμικό προφίλ στον θερμικό ανακυκλωτή για να επαληθεύσετε ότι οι παράμετροι βρίσκονται εντός του καθορισμένου εύρους. Χαμηλή διάμεση τιμή έντασης φθορισμού (MFI) Θερμάνετε το διάλυμα αραίωσης στους 45 ο C για 5 λεπτά πριν από τη χρήση και χρησιμοποιήστε δονητικό αναδευτήρα. Φυλάξτε σε θερμοκρασία δωματίου. Αντικαταστήστε την PE-Στρεπταβιδίνη. Ενίσχυση ειδική των αλληλόμορφων Οι συνθήκες ενίσχυσης δεν βρίσκονται εντός των καθορισμένων παραμέτρων Το δείγμα DNA έχει μολυνθεί Το DNA έχει αλλοιωθεί μερικώς Εξάτμιση κατά τη διάρκεια του βήματος υβριδισμού * Η ενίσχυση PCR μπορεί να επαληθευτεί με ηλεκτροφόρηση γέλης (βλ. Παράρτημα A). Εκτελέστε το θερμικό προφίλ στον θερμικό ανακυκλωτή για να επαληθεύσετε ότι οι παράμετροι βρίσκονται εντός του καθορισμένου εύρους. Απομονώστε πάλι DNA από το δείγμα αίματος. Αν δεν χρησιμοποιείτε ολόκληρη την πλάκα, αφήστε μία σειρά άδεια σε κάθε πλευρά των δειγμάτων που θα προσδιοριστούν ώστε να σφραγιστεί καλά η πλάκα. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ Οι τιμές συνήθως μπορούν να διαχωριστούν ως θετικές και αρνητικές. Σε ορισμένες σπάνιες περιπτώσεις, οι τιμές μπορεί να είναι απροσδιόριστες. Μια»απροσδιόριστη τιμή» αντιπροσωπεύει ένα εύρος τιμών στο οποίο δεν έχουν παρατηρηθεί ούτε θετικές ούτε αρνητικές τιμές. Αν ένα δείγμα περιλαμβάνει απροσδιόριστες τιμές για συγκεκριμένο ιχνηλάτη SSO, η εξακρίβωση του δείγματος πρέπει να γίνει με την υπόθεση ότι ο ιχνηλάτης είναι αρνητικός και κατόπιν με την υπόθεση ότι ο ιχνηλάτης είναι θετικός. Μπορεί να προκύψουν τρεις περιπτώσεις: 1. Μία από τις επιλογές (δηλ.η Θετική ή η Αρνητική) θα εμφανίσει ταύτιση. 2. Και οι δύο επιλογές εμφανίζουν ταύτιση. Το δείγμα μπορεί να επαναπροσδιοριστεί ή μπορείτε να αναφέρετε τα αλληλόμορφα που λήφθηκαν και από τις δύο εξακριβώσεις. 3. Καμία επιλογή δεν εμφανίζει ταύτιση. Στην περίπτωση αυτή, είναι πιθανό να υπάρχει λανθασμένη αντιστοίχιση ιχνηλατών. Το δείγμα πρέπει να επαναπροσδιοριστεί και πιθανώς να ενισχυθεί πάλι. Αν υπάρχουν περισσότεροι από δύο ιχνηλάτες με απροσδιόριστη τιμή, το δείγμα πρέπει να επαναπροσδιοριστεί. Αν ένα σχέδιο δραστηριότητας ιχνηλατών δεν παράγει εξακρίβωση HLA, το δείγμα πρέπει να ενισχυθεί πάλι και να επαναπροσδιοριστεί. Μπορεί επίσης να χρειαστεί να απομονώσετε πάλι DNA από το δείγμα, να ενισχύσετε πάλι και να επαναπροσδιορίσετε. Όπως έχει αναφερθεί στην ενότητα Περιορισμοί της Διαδικασίας, η εφαρμογή του πρωτοκόλλου είναι κρίσιμης σημασίας. Οποιαδήποτε απόκλιση μπορεί να προκαλέσει αποτυχία εξακρίβωσης του δείγματος. ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Όταν τα κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA SSO χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο ένθετο του προϊόντος, μπορούν να καθοριστούν τα Κλάσης I και Κλάσης II HLA τύπου DNA.. Το κιτ HLA A eres δείχνει συμφωνία 98,46% (95,24% χαμηλότερο όριο του Διαστήματος Εμπιστοσύνης 95%), τα Κιτ HLA B eres, DRB1 eres και DRB 3, 4, 5 δείχνουν 100% συμφωνία (97,72% χαμηλότερο όριο 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης), και το κιτ HLA C eres δείχνει 99,23% συμφωνία (95,75% χαμηλότερο όριο 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) για 130 που αξιολογήθηκαν όταν συγκρίνονται με αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με αμφίδρομη αλληλουχία. Τα Κιτ HLA A και B δείχνουν συμφωνία 100% (92,9% χαμηλότερο όριο 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) για 50 που αξιολογήθηκαν όταν συγκρίνονται με αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με τη μέθοδο Pel-Freez SSP UniTray. Το κιτ HLA DRB1 δείχνει 98% συμφωνία (91,1% χαμηλότερο όριο 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) για 60 που αξιολογήθηκαν όταν συγκρίνονται με αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με το Κιτ LIFECODES HLA DRB. Το Κιτ HLA-DQA1/B1 (Αρ. καταλόγου 628930) δείχνει 99,2% συμφωνία για αλληλόμορφα DQA (96,2% χαμηλότερο όριο χρησιμοποιώντας τη μονόπλευρη μέθοδο ακριβείας σε 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) και 98,4% συμφωνία για αλληλόμορφα DQB (95,2% χαμηλότερο όριο χρησιμοποιώντας τη μονόπλευρη μέθοδο ακριβείας σε 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) κατά τη σύγκριση αποτελεσμάτων εξακρίβωσης HLA σε 2 πεδία καλών χαρακτηριζόμενων δειγμάτων, τα 123 και 130, αντίστοιχα. Το κιτ HLA-DPA1/B1 (Αρ. καταλόγου 628936) δείχνει 100% συμφωνία για αλληλόμορφα DPA (97,7% χαμηλότερο όριο χρησιμοποιώντας τη μονόπλευρη μέθοδο ακριβείας σε 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) και 98,5% συμφωνία για αλληλόμορφα DPB (95,4% χαμηλότερο όριο χρησιμοποιώντας τη μονόπλευρη μέθοδο ακριβείας σε 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης) κατά τη σύγκριση αποτελεσμάτων εξακρίβωσης HLA σε πεδία καλών χαρακτηριζόμενων δειγμάτων, τα 133 και 135, αντίστοιχα. Σε εργαστηριακές δοκιμές, οι ακόλουθες ουσίες έδειξαν περιορισμένη αναστολή κατά την αξιολόγηση με Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA- DQA1/B1 και LIFECODES HLA-DPA1/B1 SSO. Η υψηλότερη συγκέντρωση των παρεμβαλλόμενων ουσιών χωρίς αναστολή είναι Δεκυλο- Σελίδα 10 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

θειικό νάτριο (0,005% (w/v)), Αιθανόλη (500mM), Φαινόλη (0,125% (v/v)), Σακχαρόζη (0,1M), EDTA (500 µm), ACD, (0,1% (v/v)), Χολεστερόλη (3µg/mL), Χολερυθρίνη (16,4 µm), Αιμοσφαιρίνη (0,0156 mg/ml) και Αιμόλυση (0,1 % (v/v)). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163 3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΑΔΕΙΕΣ Η πολυμεράση Taq κατασκευάζεται για την Immucor GTI Diagnostics by Promega Corp. Εχει παρασχεθεί άδεια στην Promega υπό τα Διπλώματα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ 5.338.671 και 5.587.287 και των αντιστοίχων του σε άλλες χώρες. Η αγορά του παρόντος προϊόντος περιλαμβάνει μια περιορισμένη, μη μεταβιβαζόμενη άδεια σύμφωνα με το Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ 5.981.180 ή των αντιστοίχων του σε άλλες χώρες, τα οποία ανήκουν στην εταιρεία Luminex Corporation, για εκτέλεση πολυπλεκτικής ανάλυσης κλινικών δειγμάτων για εξακρίβωση HLA. ΕΞΟΥΣΙΟΔΟΤΗΜΕΝΟΣ ΑΝΤΙΠΡΟΣΩΠΟΣ Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32, 63303 Dreieich, ερμανία. Τεχνική Εξυπηρέτηση για την Ευρώπη: Τηλ: +32/3 385 4791 Τελευταία αναθεώρηση και έκδοση του εγγράφου: 2017-02-07 ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΤΑ ΑΚΟΛΟΥΘΑ ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ AB Gene AB Gene House Luminex Costar Corning Incorporated Gene Amp Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. Veriti IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. LIFECODES GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. Σελίδα 11 από 12 LC1436IVDEL Rev. G

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ A Ηλεκτροφόρηση γέλης Οι αντιδράσεις PCR που εκτελούνται στα Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO προορίζονται να παράγουν δίκλωνα και μονόκλωνα προϊόντα, τα οποία είναι τα κύρια προϊόντα που υβριδοποιούνται σε SSO. Για διασφάλιση της ποιότητας ή για να αντιμετωπιστούν τα προβλήματα σε ένα πείραμα μπορεί να χρειαστεί να εκτελέσετε ηλεκτροφόρηση γέλης για να εξετάσετε την αντίδραση PCR ως προς την παρουσία ενισχυμένου DNA. Απαιτούμενα υλικά (τα αναφερόμενα ή ισοδύναμα) Electrophoresis Grade Agarose (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose Αρ. 50170) Συσκευή ηλεκτροφόρησης/τροφοδοσία ρεύματος 1X Ρυθμιστικό διάλυμα γέλης (40xTAE, Promega Αρ. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. Αρ.50535) UV Transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Αρ. μοντέλου TM36) Σύστημα φωτογραφικής απεικόνισης Η σχετική μετανάστευση του μονόκλωνου προϊόντος εξαρτάται από τη συγκέντρωση της γέλης και το ρυθμιστικό σύστημα που θα χρησιμοποιηθεί. Οι κατά προσέγγιση μεταναστεύσεις για κάθε ενίσχυση αναφέρονται παρακάτω για που αναλύθηκαν σε γέλη αγαρόζης 2% σε 1X TAE ρυθμιστικό διάλυμα. Συνθήκες ηλεκτροφόρησης Σημείωση: Δεν εφαρμόζεται για HLA-DQA1/B1 (Αρ. προϊόντος 628930) και HLA-DPA1/B1 (Αρ. προϊόντος 628936) όπως as οι μεμονωμένες ζώνες δεν είναι δυνατό να διαχωριστούν σε πολυπλεκτικό συνδυασμό. 1. Αφαιρέστε το GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. Αρ. 50535) από τον καταψύκτη για να αποψυχθεί. Διατηρήστε το σε σκοτεινό μέρος. 2. Η γέλη που χρησιμοποιείται στη διαδικασία πρέπει να είναι 2%, δηλ. για ένα στρώμα γέλης 200ml χρησιμοποιήστε 4 grams αγαρόζης σε 200ml 1X TAE (Αραιώστε από 40X TAE). Προσθέστε 10µl GelStar Nucleic Acid Stain στην αποψυχθείσα αγαρόζη. Όταν ρίχνετε τη γέλη, βεβαιωθείτε ότι έχετε αφήσει αρκετό χώρο για να διατρέξει το DNA ικανοποιητική απόσταση (2,5 έως 5 cm). ΠΡΟΣΟΧΗ: Το GelStar είναι δυνητικά καρκινογόνο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μπορείτε να χρησιμοποιείτε γέλες με 20µl Βρωμιούχου Αιθιδίου 10mg/mL αντί για το GelStar Nucleic Acid Stain. Η ένταση ζώνης του προϊόντος θα είναι χαμηλότερη σε γέλες που περιέχουν Βρωμιούχο Αιθίδιο σε σχέση με τις γέλες που περιέχουν GelStar. ΠΡΟΣΟΧΗ: Το Βρωμιούχο Αιθίδιο είναι γνωστό καρκινογόνο. 3. Διατηρήστε τη γέλη σε σκοτεινό μέρος και αφήστε την να στερεοποιηθεί. 4. Φορτώστε ένα μείγμα 2,5µL του κάθε προϊόντος PCR και 2,5µL 2 X φόρτωσης buffer με ορατές χρωστική ουσία ανά δείγμα, ανά ενίσχυση. Αφήστε τη γέλη στο σκοτάδι στα 160 Volt περίπου για 45 λεπτά ή μέχρι να δείτε χωριστές ζώνες για το μονόκλωνο και το δίκλωνο προϊόν (η ζώνη του κυανού βρωμοφαινόλης ή άλλος ορατός δείκτης μεταναστεύει 2,5 έως 5 cm από τα φρεάτια). 5. Φωτογραφήστε χρησιμοποιώντας τη συσκευή υπεριώδους διαφανοσκόπησης (UV Transilluminator) με φωτογραφικό φίλτρο GelStar Yellow Photographic Filter (Lonza Group, Ltd. No 50536). ΠΡΟΣΟΧΗ: Να φοράτε προστατευτικό εξοπλισμό όταν χειρίζεστε το GelStar Nucleic Acid Stain ή Βρωμιούχο Αιθίδιο, καθώς και όταν φωτογραφίζετε τη γέλη χρησιμοποιώντας τη συσκευή UV Transilluminator. 6. Ανάλυση γέλης HLA-A HLA-B HLA-C HLA- HLA- DRB1 DRB3,4,5 Δίκλωνο(α) (bp) ~420 ~370, ~340 ~476, ~447 ~280 ~280 Μονόκλωνο (bp) ~240 ~200 ~250, ~200 ~180 ~180 Ερμηνεία γέλης Φρεάτιο Ενίσχυση Χωρίς ενίσχυση Δίκλωνο DNA Μονόκλωνο DNA Ζώνη εκκινητή ----(Έντονο) --------(λιγότερο έντονο) Σελίδα 12 από 12 LC1436IVDEL Rev. G