QUANTA Lite Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: Υψηλή dsdna SC ELISA 704650 Σκοπός χρήσης Αυτή η ανάλυση προορίζεται για in-vitro μέτρηση συγκεκριμένων αυτοαντισωμάτων IgG έναντι δίκλωνου δεοξυριβονουκλεϊνικού οξέως (dsdna) παρόντος στον ανθρώπινο ορό, ως βοήθημα στη διάγνωση του συστηματικού ερυθηματώδη λύκου (ΣΕΛ), σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα. Παρέχονται επαρκή υλικά για να επιτραπεί η δοκιμασία έως 40 δειγμάτων εις διπλούν ή 88 μεμονωμένων, με μια καμπύλη βαθμονόμησης, καθώς και θετικός και αρνητικός ορός ελέγχου και ορός ελέγχου μονόκλωνου DNA. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Τα αυτοαντισώματα έναντι του DNA αναγνωρίζουν μονόκλωνες (ssdna) ή δίκλωνες (dsdna) μορφές DNA. Τα αυτοαντισώματα αντι-ssdna δεν αφορούν σε κάποια συγκεκριμένη νόσο, αλλά σχετίζονται με ένα ευρύ φάσμα αυτοάνοσων νοσημάτων, στα οποία περιλαμβάνονται ο φαρμακογενής συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, η μικτή νόσος του συνδετικού ιστού, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η σκληροδερμία και το σύνδρομο Sjögren. Αντίθετα, τα αυτοαντισώματα αντι-dsdna σχετίζονται ιδιαιτέρως με το ΣΕΛ 1,2,3, όπου η δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων θεωρείται ότι παίζει σημαντικότατο ρόλο στην παρθενογένεση της νόσου. Η εναπόθεση των ανοσοσυμπλεγμάτων προξενεί φλεγμονές, καθώς και νεφρικά και αγγειακά χαρακτηριστικά της νόσου 4. Γενικά, μια αύξηση των επιπέδων αντι-dsdna, ακολουθούμενη από μια απότομη μείωση στο αποκορύφωμα της νόσου, προηγείται της ξαφνικής αύξησης της δραστηριότητας του ΣΕΛ 5. Από την παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνεται η ανάγκη τακτικής παρακολούθησης των επιπέδων των αυτοαντισωμάτων αντι-dsdna σε ασθενείς που πάσχουν από ΣΕΛ. Αρχές της διαδικασίας Οι μικροκοιλότητες έχουν προηγουμένως επαλειφθεί με αντιγόνο dsdna από θύμο μόσχου. Οι βαθμονομητές, οι οροί ελέγχου και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών προστίθενται στις κοιλότητες και τα αυτοαντισώματα που αναγνωρίζουν το αντιγόνο dsdna δεσμεύονται κατά την πρώτη επώαση. Έπειτα από την πλύση των κοιλοτήτων ώστε να απομακρυνθούν όλες οι αδέσμευτες πρωτεΐνες, προστίθεται κεκαθαρμένη υπεροξειδάση προσδιοριζόμενη ως σύζευγμα αντι-ανθρώπινης IgG αίγας. Το σύζευγμα δεσμεύεται με το ακινητοποιημένο ανθρώπινο αυτοαντίσωμα και το περίσσιο αδέσμευτο σύζευγμα απομακρύνεται με ένα επιπλέον βήμα πλύσης. Το δεσμευμένο σύζευγμα οπτικοποιείται με ένα υπόστρωμα 3,3,5,5 τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB) που δίνει ένα προϊόν αντίδρασης χρώματος μπλε, η ένταση του οποίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αυτοαντισώματος στο δείγμα. Προστίθεται θειικό οξύ σε κάθε κοιλότητα για να σταματήσει η αντίδραση. Αυτό παράγει ένα τελικό κίτρινο χρώμα, το οποίο διαβάζεται στα 450nm. Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο dsdna από θύμο μόσχου (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Αρνητικός Έλεγχος, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς ανθρώπινα αντισώματα έναντι του dsdna, προαραιωμένο 1,2ml 3. dsdna SC ELISA Βαθμονομητής A, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 4. dsdna SC ELISA Βαθμονομητής B, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 5. dsdna SC ELISA Βαθμονομητής C, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 6. dsdna SC ELISA Βαθμονομητής D, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 7. dsdna SC ELISA Βαθμονομητής E, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 8. dsdna SC ELISA Θετικός ορός ελέγχου, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και 9. Τύπου III Αραιωτικό δείγματος, 2 φιαλίδια χρώματος κίτρινου, που περιέχει Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 10. HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 11. dsdna SC ELISA Μονόκλωνος ορός ελέγχου, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα αραιωμένου ανθρώπινου ορού έναντι του ssdna, προαραιωμένο, 1,2ml 12. HRP dsdna SC IgG Σύζευγμα, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 13. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 14. HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προειδοποιήσεις 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% χλωραμφαινικόλης) στους ορούς ελέγχου, Αραιωτικό δείγματος και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. Το αραιωτικό δείγματος περιέχει Proclin 150. Για την πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 1
2. Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην προετοιμασία των πρότυπων ορών για αυτό το προϊόν έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικά για αντισώματα HIV, HBsAg και HCV από εγκεκριμένες μεθόδους FDA. Ωστόσο, καμία μέθοδος ελέγχου δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση για την απουσία των HIV, HBV, HCV ή άλλων μολυσματικών παραγόντων. Επομένως, ο dsdna SC Θετικός ορός ελέγχου, ο dsdna SC Μονόκλωνος ορός ελέγχου, οι dsdna SC Βαθμονομητές A έως E και ο ELISA 8 Αρνητικός ορός ελέγχου θα πρέπει να αντιμετωπίζονται με τον ίδιο τρόπο ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και δύναται να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης ή απορρόφησης μέσω του δέρματος ή των ματιών. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Ξεπλύνετε τις λεκάνες απόπλυσης εάν χρησιμοποιούνται για την απόρριψη του αντιδραστηρίου, με άφθονο νερό ώστε να αποφευχθεί η συγκέντρωση των αζιδίων. 4. Το σύζευγμα HRP περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για την πρόληψη πιθανών εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μια ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν εισπνευσθεί, καταποθεί ή απορροφηθεί από το δέρμα. Για την πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το HRP διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) αποτελείται από ένα αραιωμένο διάλυμα θειικού οξέως. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή άλλα μείγματα που δύνανται να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και επομένως μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για την πρόληψη εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια που παρέχονται. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Προφυλάξεις 1. Αυτό το προϊόν είναι για In Vitro διαγνωστική χρήση. 2. Αυτό το προϊόν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνον από κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό. 3. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. Οποιαδήποτε παρέκκλιση μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της ανάλυσης και τα αποτελέσματα που αποκομίζονται. Πρέπει να δίνεται προσοχή στις συγκεκριμένες "Σημειώσεις" και προειδοποιήσεις σε κάθε σημείο αυτών των Οδηγιών Χρήσεως. 4. Αντιδραστήρια από κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας ΔΕΝ είναι εναλλάξιμα. Αν πραγματοποιείται μεγάλος αριθμός δοκιμών, θα πρέπει να ληφθεί μέριμνα, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια προέρχονται από την ΙΔΙΑ παρτίδα. Όλες οι ταινίες που χρησιμοποιούνται πρέπει να προέρχονται από την ίδια αλουμινένια συσκευασία. Η αντικατάσταση οποιουδήποτε συστατικού μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένα αποτελέσματα. 5. Για να αποφύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων, χρησιμοποιείτε μόνο καινούργια ή καθαρά πλαστικά / γυάλινα υλικά. Ποτέ μην επιστρέφετε μη χρησιμοποιημένα αντιδραστήρια στα φιαλίδια. 6. Βεβαιωθείτε ότι η αραίωση του ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης γίνεται σε ένα καθαρό δοχείο και, αν το διάλυμα παρουσιάσει οποιαδήποτε σημάδια μικροβιακής μόλυνσης ή γίνει θολό, απορρίψτε το και ετοιμάστε ένα νέο διάλυμα. 7. Μην αφήνετε τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων με ανοιχτά καπάκια. Τυχόν επακόλουθη εξάτμιση ή μόλυνση θα οδηγήσει σε ασυνεπή αποτελέσματα. 8. Το υπόστρωμα TMB δεν πρέπει να εκτίθεται στο φως ή στο νερό. 9. Μικροβιακά μολυσμένος, αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός και δείγματα που περιέχουν σωματιδιακή ύλη δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. 10. Συνιστάται η χρήση βαθμονομημένων πιπετών και κατάλληλων δειγμάτων QC. 11. Η χρήση αυτόματων συστημάτων ανάλυσης, αραιωτών δειγμάτων και άλλου αυτόματου εξοπλισμού μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στα αποτελέσματα σε σύγκριση με την δια χειρός διαδικασία. Είναι ευθύνη κάθε εργαστηρίου να επικυρώσει πλήρως το σύστημα και να διασφαλίσει ότι τα αποτελέσματα είναι εντός των ορίων όπως προσδιορίζονται σε αυτό το ένθετο και το σχετικό πιστοποιητικό QC. 12. Όλος ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται πρέπει να βαθμονομείται και να συντηρείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συνθήκες αποθήκευσης 1. Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους 2-8 C και δεν πρέπει να καταψύχεται. Ακατάλληλες θερμοκρασίες αποθήκευσης θα επηρεάσουν τα αποτελέσματα. 2. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για 1 βδομάδα στους 2-8 C. 3. Η ημερομηνία λήξης του κιτ εμφανίζεται στην εξωτερική ετικέτα. Συλλογή δείγματος 1. Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται με φλεβοκέντηση, να αφήνονται να πήξουν φυσικά και ο ορός να διαχωρίζεται. 2. Ο ορός μπορεί να αποθηκεύεται στους 2-8 C για έως και 7 ημέρες πριν από την ανάλυση 6, ενώ για παρατεταμένη αποθήκευση, πρέπει να διαιρείται και να αποθηκεύεται στους 20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. 3. Η επανειλημμένη τήξη και ψύξη πρέπει να αποφεύγεται. 4. Τα δείγματα ορού δεν πρέπει να αδρανοποιούνται με θέρμανση, καθώς αυτό μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. 2
Διαδικασία Υλικά που παρέχονται Φυλλάδιο οδηγιών: Παρέχει πλήρεις λεπτομέρειες της ανάλυσης. Πιστοποιητικό QC: Υποδεικνύει την αναμενόμενη απόδοση της παρτίδας. Κοιλότητες Επικαλυμμένες με dsdna SC: 12 ταινίες 8 αποσπώμενων κοιλοτήτων επικαλυμμένων με αντιγόνο dsdna από θύμο μόσχου. Κάθε πλάκα είναι συσκευασμένη σε μια επανασφραγιζόμενη αλουμινένια συσκευασία που περιέχει δύο αφυγραντικές σακούλες. ELISA Αρνητικός ορός ελέγχου: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. dsdna SC Βαθμονομητές: 5 φιαλίδια, που το καθένα περιέχει 1,2mL αραιωμένο ανθρώπινο ορό, με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις αυτοαντισωμάτων αντι-dsdna: 1000, 333, 111, 37, 12,3 IU/mL. Έτοιμο για χρήση. dsdna SC Θετικός ορός ελέγχου: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. Τύπου III Αραιωτικό Δείγματος: 2 φιαλίδια που περιέχουν 50mL ρυθμιστικού διαλύματος για την αραίωση του δείγματος. Χρώματος κίτρινου, έτοιμο για χρήση. HRP Συμπύκνωμα Πλύσης (40X): 1 φιαλίδιο που περιέχει 25mL ενός 40-άκις συμπυκνωμένου ρυθμιστικού διαλύματος για την πλύση των κοιλοτήτων. dsdna SC Μονόκλωνος ορός ελέγχου: 1 φιαλίδιο που περιέχει 1,2mL αραιωμένου ανθρώπινου ορού. Η αναμενόμενη τιμή παρέχεται στο πιστοποιητικό QC. Έτοιμο για χρήση. HRP dsdna SC IgG Σύζευγμα: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL κεκαθαρμένης υπεροξειδάσης με προσδιοριζόμενη με ετικέτα αντίσωμα σε ανθρώπινη IgG. Χρώματος μπλε. Έτοιμο για χρήση. TMB Χρωμογόνο: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL TMB χρωμογόνο. Έτοιμο για χρήση. HRP Διάλυμα Διακοπής: 1 φιαλίδιο που περιέχει 10mL Θειικού οξέος 0,344M. Έτοιμο για χρήση. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Αυτόματη συσκευή πλύσης πλάκας μικροπλακών: Συνιστάται, ωστόσο, η πλύση των πλακών μπορεί να γίνει δια χειρός. Συσκευή ανάγνωσης της πλάκας: Ικανή να μετρήσει οπτικές πυκνότητες στα 450nm αναφερόμενα στον αέρα. Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό: Αυτό θα πρέπει να είναι της καλύτερης διαθέσιμης ποιότητας Βαθμονομημένες μικροπιπέτες: Για την προσθήκη 1000, 100 & 10µL Πιπέτα πολλαπλών καναλιών: Συνιστάται για την προσθήκη όγκου 100µL συζεύγματος, υποστρώματος και διαλύματος διακοπής. Γυάλινα/πλαστικά σωληνάρια: Για την αραίωση του δείγματος Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Επάγετε το κιτ σε θερμοκρασία δωματίου Το κιτ έχει σχεδιαστεί για χρήση σε θερμοκρασία δωματίου (20-24 C). Αφαιρέστε το κιτ από την αποθήκευση και διατηρήστε σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 60 λεπτά. Οι κοιλότητες δεν πρέπει να αφαιρεθούν από την αλουμινένια συσκευασία πριν φτάσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Σημείωση: Τα κιτ μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία δωματίου για έως και 1 εβδομάδα. 2. Στοιχεία του κιτ Αναδεύστε απαλά κάθε στοιχείο του κιτ πριν από τη χρήση. 3. Αραίωση ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης (40x συμπυκνώματα) Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου συμπυκνωμένου HRP διαλύματος πλύσεων σε 975mL αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Σε περίπτωση που δεν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη την πλάκα εντός αυτής της περιόδου, μπορείτε να ετοιμάσετε μικρότερη ποσότητα προσθέτοντας 2,0mL του συμπυκνώματος σε 78mL αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού για κάθε 16 κοιλότητες που θα χρησιμοποιηθούν. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα είναι σταθερό για μια εβδομάδα στους 2-8 o C. 4. Αραίωση δείγματος Αραιώστε 10µL από κάθε δείγμα με 1000µL αραιωτικό δείγματος (1:101) και αναδεύστε καλά. Σημείωση: Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών. 5. Χειρισμός ταινιών και πλαισίου Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό κοιλοτήτων στη συσκευή συγκράτησης των ταινιών. Τοποθετήστε από την κοιλότητα A1, γεμίζοντας τις στήλες από τα αριστερά προς τα δεξιά κατά μήκος της πλάκας. Κατά τον χειρισμό της πλάκας, συμπιέστε τις επιμήκεις άκρες του πλαισίου ώστε να μην πέσουν οι κοιλότητες. Σημείωση: Επιστρέψετε τις αχρησιμοποίητες κοιλότητες στην αλουμινένια συσκευασία αμέσως με τις δύο αφυγραντικές σακούλες και επανασφραγίστε σφικτά, ώστε να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση στην υγρασία. Μεριμνήστε έτσι ώστε να μην τρυπήσετε ή σκίσετε την αλουμινένια συσκευασία, δείτε παρακάτω. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Η έκθεση των κοιλοτήτων στην υγρασία ή η μόλυνση από σκόνη ή άλλη σωματιδιακή ύλη θα έχει ως επακόλουθο τον εκφυλισμό του αντιγόνου, που θα οδηγήσει σε ανεπαρκή ακρίβεια της ανάλυσης και δυνητικά ψευδή αποτελέσματα. Διαδικασία ανάλυσης 1. Προσθήκη δείγματος Προσθέστε 100µL από κάθε βαθμονομητή, ορό ελέγχου και αραιωμένο (1:101) δείγμα στις κατάλληλες κοιλότητες της πλάκας που παρέχεται. Σημείωση: Τα δείγματα θα πρέπει να προστίθενται όσο το δυνατόν ταχύτερα στην πλάκα ώστε να ελαχιστοποιείται η απόκλιση της ανάλυσης και ο χρονομετρητής να ξεκινάει μετά την προσθήκη του τελευταίου δείγματος. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 3
2. Πλύση Η διαδικασία πλύσης είναι κρίσιμη και απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή. Μία ακατάλληλα ξεπλυμένη πλάκα θα δώσει ανακριβή αποτελέσματα, με ανεπαρκή ακρίβεια και πολλές παρεμβολές. Μετά την επώαση απομακρύνετε την πλάκα και πλύνετε τις κοιλότητες 3 φορές με 200-300µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης ανά κοιλότητα. Πλύνετε την πλάκα είτε χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο μηχάνημα πλύσης πλακών είτε δια χειρός, όπως υποδεικνύεται παρακάτω. Μετά από την τελική αυτόματη πλύση, αναποδογυρίστε την πλάκα και χτυπήστε απαλά τις κοιλότητες, ώστε να στεγνώσουν σε απορροφητικό χαρτί. Οι πλάκες μπορούν να πλυθούν δια χειρός κατά τα ακόλουθα: α. Aδειάστε το περιεχόμενο της πλάκας στην λεκάνη απόπλυσης. β. Xτυπήστε απαλά τις κοιλότητες ώστε να στεγνώσουν σε απορροφητικό χαρτί. γ. Γεμίστε κάθε κοιλότητα με 200-300µL ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης χρησιμοποιώντας μια πιπέτα πολλαπλών καναλιών. δ. Αναδεύστε απαλά την πλάκα σε μια επίπεδη επιφάνεια. ε. Επαναλάβετε το α - δ δύο φορές. φ. Επαναλάβετε το α. και β.. 3. Προσθήκη υποστρώματος Προσθέστε 100µL υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα, σκουπίστε το πάνω μέρος των κοιλοτήτων με ένα χαρτομάντιλο για να απομακρύνετε τυχόν πιτσιλιές. Σημείωση: Για να αποφύγετε τυχόν μόλυνση, ποτέ μην επιστρέφετε το περίσσιο υπόστρωμα στο φιαλίδιο του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 4. Πλύση Επαναλάβετε το βήμα 2. 5. Προσθήκη Χρωμογόνου (TMB) Προσθέστε 100µL χρωμογόνου TMB σε κάθε κοιλότητα, σκουπίστε το πάνω μέρος των κοιλοτήτων με χαρτομάντιλο για να απομακρύνετε τυχόν πιτσιλιές. Σημείωση: Για να αποφύγετε τυχόν μόλυνση, μην επιστρέφετε το περίσσιο TMB στο φιαλίδιο του αντιδραστηρίου. Επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. 6. Διακοπή Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Αυτό προκαλεί μια αλλαγή χρώματος από μπλε σε κίτρινο. 7. Μέτρηση οπτικής πυκνότητας Μετρήστε την οπτική πυκνότητα (ΟΠ) κάθε κοιλότητας στα 450nm σε ένα μετρητή μικροκοιλοτήτων, εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. Έλεγχος ποιότητας 1. Έλεγχος Ποιότητας Για να είναι έγκυρη μια ανάλυση, πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα παρακάτω κριτήρια: Οι βαθμονομητές, οι θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι καθώς και οι μονόκλωνοι οροί ελέγχου πρέπει να συμπεριλαμβάνονται σε κάθε σειρά μετρήσεων. Οι τιμές που αποκομίζονται για όλους του ορούς ελέγχου θα πρέπει να είναι εντός του εύρους που προσδιορίζεται στο Πιστοποιητικό QC. Το σχήμα της καμπύλης πρέπει να είναι παρόμοιο με της καμπύλης βαθμονόμησης, που εμφανίζεται στο Πιστοποιητικό QC. Εάν τα παραπάνω κριτήρια δεν ικανοποιούνται, η ανάλυση είναι άκυρη και η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί. 2. Υπολογίστε τις μέσες οπτικές πυκνότητες (Για αναλύσεις που γίνονται εις διπλούν μόνο) Για κάθε βαθμονομητή, έλεγχο και δείγμα υπολογίστε την μέση ΟΠ των διπλότυπων ενδείξεων. Το ποσοστό του συντελεστή μεταβλητότητας (% Σ.Μ.) για κάθε διπλότυπη ΟΠ θα πρέπει να είναι λιγότερο από 15%. 3. Σχεδιασμός καμπύλης βαθμονόμησης Η καμπύλη βαθμονόμησης μπορεί να σχεδιαστεί είτε αυτόματα είτε δια χειρός όπως προκύπτει σχεδιάζοντας τη συγκέντρωση αυτοαντισωμάτων αντι-dsdna στη λογαριθμική κλίμακα έναντι της ΟΠ στην γραμμική κλίμακα για κάθε βαθμονομητή: Αυτόματα - χρησιμοποιήστε καταλλήλως επικυρωμένα λογισμικά και την εφαρμογή καμπύλης που ταιριάζει καλύτερα στα δεδομένα. Διά χειρός - χρησιμοποιήστε λογαριθμικό/γραμμικό χαρτί γραφήματος, σχεδιάστε μια ομαλή καμπύλη δια μέσου των σημείων (όχι ευθεία γραμμή ή από σημείο σε σημείο). 4. Αντιμετώπιση ανώμαλων σημείων Εάν οποιοδήποτε σημείο δεν βρίσκεται εντός της καμπύλης μπορεί να απαλειφθεί. Εάν η απουσία του σημείου αυτού σημαίνει ότι η καμπύλη έχει ένα σχήμα ανόμοιο με εκείνο της καμπύλης βαθμονόμησης του δείγματος ή αν παραπάνω από ένα σημείο φαίνεται να είναι ανώμαλο, τότε πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση. 5. Υπολογισμός του επιπέδου αυτοαντισωμάτων σε ορούς ελέγχου και αραιωμένα δείγματα Μετρήστε το επίπεδο των αυτοαντισωμάτων αντι-dsdna στους ορούς ελέγχου και τα αραιωμένα δείγματα απευθείας από την καμπύλη βαθμονόμησης. Οι τιμές πρέπει να κυμαίνονται εντός του εύρους που δίνεται στο Πιστοποιητικό QC. Σημείωση: Οι τιμές του βαθμονομητή έχουν ρυθμιστεί με παράγοντα του 100 ώστε να ερμηνεύσουν μια αραίωση δείγματος 1:101. Δεν απαιτείται περαιτέρω διόρθωση. 6. Βαθμονόμηση ανάλυσης Η ανάλυση έχει βαθμονομηθεί σε IU/mL έναντι του βαθμονομητή αναφοράς του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ), Wo80 7. 4
Περιορισμοί της διαδικασίας 1. Αυτό το κιτ χρησιμοποιείται μόνο για να βοηθήσει στη διάγνωση. Ένα θετικό αποτέλεσμα αποτελεί ένδειξη για ορισμένες ασθένειες, οι οποίες πρέπει να επιβεβαιωθούν από κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 2. Τα αποτελέσματα που αποκομίζονται από αυτή την ανάλυση δεν είναι διαγνωστική απόδειξη της παρουσίας ή της απουσίας νοσήματος. 3. Τα οριακά αποτελέσματα θα πρέπει να επαναλαμβάνονται, είτε με νέο δείγμα ή σε επόμενη ημερομηνία. Είναι σημαντικό να εξετάζετε τους ασθενείς τακτικά, ώστε να παρακολουθείτε τυχόν αλλαγές στο επίπεδο των αυτοαντισωμάτων dsdna. Αναμενόμενες Τιμές Το φυσιολογικό εύρος προσδιορίστηκε σε ορό από 113 φυσιολογικούς αιμοδότες. Το ανώτατο όριο των φυσιολογικών τιμών εκφράζεται ως η μέση συγκέντρωση + 5 ΤΑ (τυπική απόκλιση) και ισούται με 30 IU/mL, με μέσο όρο της τάξης του 9,2 και ΤΑ 4,4 IU/mL. Το εύρος παρέχεται μόνο ως οδηγός. Οι αναλύσεις Elisa είναι πολύ ευαίσθητες και ικανές να ανιχνεύσουν μικρές διαφορές σε πληθυσμούς δειγμάτων. Συνιστάται ο ξεχωριστός προσδιορισμός του φυσιολογικού εύρους από κάθε εργαστήριο, βάσει των τεχνικών πληθυσμού και εξοπλισμών που χρησιμοποιούνται. ΕΡΜΗΝΕΙΑ < 30 IU/mL Αρνητικό αποτέλεσμα 30-75 IU/mL Οριακό αποτέλεσμα > 75 IU/mL Θετικό αποτέλεσμα Ακρίβεια Η ακρίβεια εντός της ανάλυσης και μεταξύ των αναλύσεων μετρήθηκε με τη χρήση τριών δειγμάτων εντός του εύρους της καμπύλης βαθμονόμησης. Ο μέσος όρος και το % Σ.Μ. για κάθε δείγμα δίνονται παρακάτω: ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΕΝΤΟΣ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ n=16 Συγκέντρωση (IU/mL) % Σ.Μ. Δείγμα 1 81 5,0 Δείγμα 2 283 3,7 Δείγμα 3 719 8,1 ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ n=3 Συγκέντρωση (IU/mL) % Σ.Μ. Δείγμα 1 81 9,2 Δείγμα 2 283 9,5 Δείγμα 3 674 8,6 ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΙΜΕΣ Τα επίπεδα αυτοαντισωμάτων αντι-dsdna μετρήθηκαν στον ορό 113 φυσιολογικών αιμοδοτών και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο παρακάτω γράφημα. Βάσει μιας αρνητικής αποκοπής της τάξης των 30 IU/mL, κανένα από τα δείγματα δεν θα θεωρείτο οριακό ή θετικό αποτέλεσμα. ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ, ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ, ΣΥΜΦΩΝΙΑ Η σχετική ειδικότητα, ευαισθησία και συμφωνία προσδιορίστηκαν έναντι ενός εναλλακτικού κιτ αντι-dsdna EIA και ανοσοφθορισμού σε Crithidia luciliae χρησιμοποιώντας 69 δείγματα δοκιμασίας. Στη σύγκριση με Crithidia, τα δείγματα που απέδωσαν οριακά αποτελέσματα σε ELISA θεωρήθηκαν θετικά. EIA Εναλλακτικό EIA + Οριακό αποτέλεσμα - + 41 0 0 BINDAZYME Οριακό αποτέλεσμα 0 4 1 Αντι-dsDNA EIA - 0 1 22 Σχετική ευαισθησία 97,8% Σχετική ειδικότητα 95,7% Σχετική συμφωνία 97,1% 5
Crithidia luciliae BINDAZYME Αντι-dsDNA EIA Crithidia luciliae + - + 44 2-2 21 Σχετική ευαισθησία 95,7% Σχετική ειδικότητα 91,3% Σχετική συμφωνία 94,2% ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Η ευαισθησία προσδιορίστηκε ως η μέση συγκέντρωση + 2 ΤΑ (τυπική απόκλιση) βάσει 20 προσδιορισμών του αραιωτικού δείγματος. Αυτό ισούται με 4,6 IU/mL. ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Έγιναν δοκιμές με διάφορους τύπους ορών, προκειμένου να εξεταστεί η πιθανή επίδραση των παρεμβαλλόμενων ουσιών με τη χρήση του κιτ Interference Check A plus (Kokusai, Ιαπωνία). Ουσία Χολερυθρίνη F (Ελεύθερη) Χολερυθρίνη C (Σύζευγμα) Αιμοσφαιρίνη σε κατάσταση Αιμόλυσης Εντερικός χυλός Ρευματοειδής παράγοντας Συγκέντρωση 18,3mg/dL 19,0mg/dL 490mg/dL 1930 Μονάδες 50 IU/mL Δεν παρατηρήθηκε καμία παρεμβολή στην ελεύθερη ή τη συζευγμένη χολερυθρίνη, την αιμοσφαιρίνη, το λιπώδη ή το ρευματοειδή παράγοντα. ΕΥΡΟΣ ΜΕΤΡΗΣΗΣ Το εύρος μέτρησης της ανάλυσης είναι 12,3-1000 IU/mL. Περίληψη της διαδικασίας 1. Προσθέστε 100µL από κάθε βαθμονομητή, ορό ελέγχου και 1:101 αραιωμένο δείγμα στις κατάλληλες κοιλότητες. Επωάστε για 30 λεπτά. Ξεπλύνετε. 2. Προσθέστε 100µL συζεύγματος σε κάθε κοιλότητα. Επωάστε για 30 λεπτά. Ξεπλύνετε. 3. Προσθέστε 100µL υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα. Επωάστε για 30 λεπτά. 4. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής σε κάθε κοιλότητα. Μετρήστε την απορρόφηση στα 450nm. Σχεδιάγραμμα Πλάκας A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B Γ Δ E Φ Γ Χ 6
Βιβλιογραφία 1. Stollar B D. Antibodies to DNA. CRC Critical Review of Biochemistry, 1986; 20: 1-36. 2. Stollar B D. The specificity and applications of antibodies to helical nucleic acids. CRC Critical Review of Biochemistry, 1975; 3: 45-69. 3. Swaak AJ et al. Anti-dsDNA and complement profiles as prognostic guides in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheumatism, 1979; 22: 226-235. 4. Koffler D et al. Systemic lupus erythematosis: Prototype of immune complex nephritis in man. J Exp Med, 1971; 134 (suppl): 169. 5. ter Borg EJ et al. Measurement of increases in anti-double stranded DNA antibody levels as a predictor of disease exacerbation on systemic lupus erythematosus, a long term, prospective study. Arthritis Rheumatism, 1990; 33: 634-643. 6. Protein Reference Unit Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004 Ed A Milford Ward. J. Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. 7. Feltkamp T E W. et al. The First International Standard for Antibodies to Double Stranded DNA. Annals of Rheumatic diseases, 1988; 47: 740 746. 8. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. QUANTA Lite και INOVA Diagnostics είναι σήματα κατατεθέντα Copyright 2011 All Rights Reserved Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624650GRC July 2012 Revision 3 7