Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία

3 κ ε φ ά λ α ι ο Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία Στην τυροκομία χρησιμοποιούνται διάφορα ένζυμα κυρίως για την πήξη του γάλακτος, την αύξηση της γεύσης και του αρώματος των τυριών, την επιτάχυνση της ωρίμανσής τους, την προστασία τους από τη βουτυρική ζύμωση και την καταστροφή του υπεροξειδίου του υδρογόνου, σε περιπτώσεις που αυτό προστίθεται στο γάλα της τυροκόμησης. Τα ένζυμα πήξης του γάλακτος προκαλούν αλλαγές στα συστατικά του πριν, κατά και μετά την τυροκόμηση, που επιτρέπουν την παραγωγή των τυριών και συμβάλλουν στην ανάπτυξη των μηχανικών ιδιοτήτων και των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών τους. Συχνά συνδυάζονται και με άλλα που αυξάνουν το άρωμα και τη γεύση των τυριών και επιταχύνουν την ωρίμαση. Συνήθως χρησιμοποιούνται διάφορες πρωτεάσες, πεπτιδάσες, εστεράσες, λιπάσες και λακτάση ή συνδυασμοί τους, ανάλογα με τον επιδιωκόμενο κάθε φορά σκοπό. Τα ένζυμα αυτά είναι δυνατόν να προέρχονται από φυτικούς ή ζωικούς ιστούς ή από μικρόβια. Σε όλες τις περιπτώσεις πρέπει να παρασκευάζονται κάτω από υγιεινές συνθήκες, να μην επιφέρουν αύξηση του συνολικού μικροβιακού φορτίου του γάλακτος και να μην περιέχουν παθογόνα μικρόβια ή τοξίνες. Τα μικροβιακά ένζυμα λαμβάνονται από επιλεγμένα για το σκοπό αυτό στελέχη μικροοργανισμών τα οποία πολλαπλασιάζονται σε βιοαντιδραστήρες, κάτω από αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες ή από στελέχη μικροβίων, το γενετικό υλικό των οποίων τροποποιήθηκε με επέμβαση του ανθρώπου, ώστε να παράγουν το επιθυμητό σε κάθε περίπτωση ένζυμο. Τα ζωικής προέλευσης πρέπει να λαμβάνονται από ιστούς που ανταποκρίνονται στις απαιτήσεις ελέγχου για το κρέας, τα φυτικής

3 κεφάλαιο προέλευσης να μην περιέχουν επικίνδυνα υπολείμματα φυτοφαρμάκων, ενώ τα μικροβιακής να παράγονται κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες, για να προληφθούν επιμολύνσεις από παθογόνους μικροοργανισμούς. Όλα τα συστατικά που χρησιμοποιούνται στην παραγωγή του τελικού ενζυμικού προϊόντος που προστίθεται στο γάλα της τυροκόμησης πρέπει να είναι αποδεκτά για χρήση στα τρόφιμα. Η μικτή επιτροπή εμπειρογνωμόνων για τα πρόσθετα των τροφίμων των ιεθνών Οργανισμών FAO και WHO όρισαν ανώτατα όρια για ορισμένες ουσίες και μικρόβια σε ενζυμικά προϊόντα που χρησιμοποιούνται στην τυροκομία, ως εξής: αρσενικό <3ppm, μόλυβδο <10ppm, βαρέα μέταλλα <40ppm, μυκοτοξίνες αρνητικό στη δοκιμή, αντιβακτηριακές ουσίες αρνητικό στη δοκιμή, κολοβακτηριδία <30/g, Ε. coli αρνητικό στα 25g, σαλμονέλα αρνητικό στα 25g, συνολικός αριθμός μικροβίων <5 10 4 /g. Ένζυμα Πήξης του Γάλακτος Όλα σχεδόν τα πρωτεολυτικά ένζυμα, κάτω από ορισμένες συνθήκες, είναι δυνατόν να προκαλέσουν την πήξη του γάλακτος. Πολλά απ αυτά έχουν δοκιμαστεί σε πειραματική κλίμακα, χωρίς ποτέ να χρησιμοποιηθούν σε βιομηχανική παρασκευή τυριών, γιατί δεν έδωσαν τα επιθυμητά αποτελέσματα. Σήμερα μόνον ένας πολύ μικρός αριθμός τους χρησιμοποιείται στην τυροκομία με επιτυχία, στα οποία θα αναφερθούμε στη συνέχεια. Για πολλά χρόνια το μοναδικό προϊόν με το οποίο έπηζαν το γάλα για την παρασκευή τυριών ήταν το εκχύλισμα που λαμβανόταν από το τέταρτο στομάχι ήνυστρο μη απογαλακτισμένων μηρυκαστικών, κατά κύριο λόγο μοσχαριών. Το προϊόν αυτό, το οποίο είναι γνωστό διεθνώς με το όνομα πυτιά (rennet), θεωρείται ακόμη και σήμερα ότι δίδει τα καλύτερα αποτελέσματα, γι αυτό και αποτελεί το πρότυπο προς το οποίο συγκρίνεται πάντοτε κάθε νέο ένζυμο, πριν χρησιμοποιηθεί στην παρασκευή τυριών. Μετά το 1950 παρατηρήθηκε, σε παγκόσμια κλίμακα, ταχεία αύξηση της παραγωγής τυριών σε βιομηχανική κλίμακα με αποτέλεσμα να μην επαρκούν τα ήνυστρα για την παρασκευή της απαραίτητης ποσότητας πυτιάς, να αυξηθεί υπερβολικά η τιμή της και σε πολλές περιπτώσεις να υπάρξει έλλειψή της από την αγορά. Το γεγονός αυτό συνετέλεσε, ώστε να αυξηθεί το ενδιαφέρον για την εξεύρεση υποκατάστατών της, ενδιαφέρον που συνεχίζεται αμείωτο μέχρι σήμερα. Αποτέλεσμα της προσπάθειας αυτής ήταν η παραγωγή μιας σειράς ενζυμικών προϊόντων που κυκλοφορούν στην αγορά και 158

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία χρησιμοποιούνται αποτελεσματικά στην παρασκευή τυριών. Αυτά λαμβάνονται από εδώδιμες φυτικές ή ζωικές πρώτες ύλες, από καλλιέργειες βακτηρίων ή μυκήτων και από μικροοργανισμούς με ανασυνδυασμένο DNA, προκαλούν την πήξη του γάλακτος, συμμετέχουν στην ωρίμαση των τυριών και συμβάλλουν στη διαμόρφωση της δομής και της γεύσης τους. Τα προϊόντα αυτά και το ένζυμο, που κατά κύριο λόγο περιέχουν, δίδονται στον πίνακα 3.1. Πίνακας 3.1: Ενζυμικά προϊόντα εμπορίου που χρησιμοποιούνται για την πήξη του γάλακτος και ένζυμα που περιέχουν. ΕΝΖΥΜΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΠΟΥ ΕΣΠΟΖΟΥΝ ΠΥΤΙΑ (από ήνυστρα νεαρών μοσχαριών) Χυμοσίνη Α,Β,C ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΤΑ ΠΥΤΙΑΣ Ένζυμα από ζωικούς ιστούς Πεψίνη βοοειδών Πεψίνη Πεψίνη χοίρων Πεψίνη Πεψίνη ορνίθων Πεψίνη Ένζυμα από φυτικούς ιστούς Cynara cardunculus Μίγμα πρωτεολυτικών ενζύμων Ένζυμα από μύκητες Mucor miehei Όξινη πρωτεάση Mucor pusillus Όξινη πρωτεάση Endothia parasitica Όξινη πρωτεάση Ένζυμα από μικροοργανισμούς (με ανασυνδυασμένο DNA) Chymax, (Escherichia coli) Χυμοσίνη Α Maxiren, (Aspergilus nidulans) Χυμοσίνη Β Chymogen, (Kluyveromyces lactis) Χυμοσίνη Β Μίγματα Πυτιά 50/50. Μίγμα πυτιάς μοσχαριών και πεψίνης χοίρων σε αναλογία 50/50. Chymogen S. Μίγμα πυτιάς μοσχαριών και Chymogen, η πηκτική δύναμη του οποίου προέρχεται κατά 90% από χυμοσίνη και 10% πεψίνη. Πυτιά Στη χώρα μας ονομάζουν πυτιά όλα τα προϊόντα του εμπορίου που χρησιμοποιούνται για την πήξη του γάλακτος κατά την παρασκευή των τυριών. Σε διεθνές επίπεδο όμως έχει καθιερωθεί η ονομασία 159

3 κεφάλαιο αυτή να δίδεται μόνον σε προϊόντα που λαμβάνονται με εκχύλιση από ήνυστρα μη απογαλακτισμένων νεαρών μηρυκαστικών, κατά κύριο λόγο μοσχαριών, ορολογία η οποία θα ακολουθηθεί στη συνέχεια. Τα σχετικά προϊόντα από άλλες πηγές χαρακτηρίζονται ως υποκατάστατά της ή απλά ως ένζυμα πήξης. Μάλιστα ο Οργανισμός Τροφίμων και Γεωργίας και η ιεθνής Ομοσπονδία Γάλακτος έχουν θέσει ορισμένες προϋποθέσεις στις οποίες πρέπει να ανταποκρίνεται ένα ενζυμικό προϊόν, για να χαρακτηριστεί ως υποκατάστατο της κλασικής πυτιάς, που συνοψίζονται ως εξής: Να είναι διαλυτό στο νερό, ώστε να εξασφαλίζεται εύκολα η ομοιόμορφη διασπορά του στο γάλα. Να στερείται γεύσεων και οσμών που μπορούν να επηρεάσουν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τυριού. Να μην είναι τοξικό. Να μην επιδεικνύει αντιβιοτική δράση. Να έχει περιορισμένη πρωτεολυτική και λιπολυτική δράση. Να μην επιφέρει εκτροπή στην αλληλουχία των φάσεων της τυροκόμησης, όπως διαμορφώνεται με την πυτιά. Να προκαλεί την πήξη υπό τα φυσικοχημικά δεδομένα του γάλακτος. Οι ρεολογικές ιδιότητες του τυροπήγματος, η πορεία της ωρίμασης και η απόδοση σε τυρί να είναι παραπλήσιες εκείνων που λαμβάνονται με την πυτιά. Η πυτιά χρησιμοποιήθηκε αρχικά και επί πολλούς αιώνες για την παρασκευή τυριών στις κτηνοτροφικές εκμεταλλεύσεις. Στις συνθήκες αυτές κάθε κτηνοτρόφος παρασκεύαζε μόνος του, κατά τρόπο εμπειρικό, την πυτιά για τις ανάγκες του. Από τα μέσα όμως του 19ου αιώνα, οπότε δημιουργήθηκαν τα πρώτα συνεταιρικά τυροκομεία, προέκυψε η ανάγκη παρασκευής μεγαλύτερων ποσοτήτων της και ένα στοιχειώδες εμπορικό ενδιαφέρον. Αργότερα δημιουργήθηκαν μεγάλες βιομηχανικές μονάδες, ενώ αυξήθηκε σημαντικά η ποσότητα του τυροκομούμενου γάλακτος, με αποτέλεσμα να αναπτυχθεί εμπορικό ενδιαφέρον που οδήγησε στην παραγωγή της σε βιομηχανική κλίμακα. Ένζυμα της πυτιάς Η πυτιά οφείλει την πηκτική της δύναμη, κατά κύριο λόγο, στο ένζυμο χυμοσίνη ή ρεννίνη, περιέχει όμως και άλλα ένζυμα σε πολύ μικρότερη αναλογία. Η πεψίνη, η τρυψίνη και διάφορες άλλες πεπτι- 160

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία δάσες είναι συνήθως συστατικά της. Η χυμοσίνη αφθονεί στο επιθήλιο των ηνύστρων, όπου απαντά υπό τη μορφή του προενζύμου της προχυμοσίνης ή προρεννίνης. Θεωρείται ότι είναι το μοναδικό ένζυμο που πρακτικά υπάρχει στο ήνυστρο αμέσως μετά τη γέννηση των ζώων. Με την ανάπτυξή τους όμως αυξάνει σταδιακά η αναλογία της πεψίνης ενώ μειώνεται αυτή της χυμοσίνης, ώστε σε ήνυστρα ζώων ηλικίας 5 έως 7 μηνών τα δύο ένζυμα υπάρχουν περίπου στην ίδια αναλογία. Ήνυστρα ζώων ηλικίας μεγαλύτερης των 2 χρόνων θεωρείται ότι περιέχουν πρακτικά μόνον πεψίνη. Στο σχήμα 3.1 δίδονται παραστατικά οι μεταβολές αυτές. Σχήμα 3.1: Αναλογία ρεννίνης και πεψίνης σε πυτιά από ήνυστρα: (α) μη απογαλακτισμένων μοσχαριών, (β) παχυνόμενων μοσχαριών, (γ) ενήλικων βοοειδών. Σημειώνεται ότι η σχέση μεταξύ χυμοσίνης και πεψίνης στα ήνυστρα, κατά συνέπεια και στην πυτιά, δεν καθορίζεται μόνον από την ηλικία των ζώων αλλά και από άλλους παράγοντες, μεταξύ των οποίων ο τρόπος διατροφής τους θεωρείται ο πιο σημαντικός. Για παράδειγμα, ήνυστρα μοσχαριών ηλικίας 6 μηνών, που διατρέφονταν με γάλα και βοσκή, έδωσαν πυτιά με 75% χυμοσίνη και 2,5% πεψίνη, ενώ άλλα από ζώα ίδιας ηλικίας, που διατρέφονταν με σανό και συμπυκνωμένες τροφές, έδωσαν πυτιά με 29% ρεννίνη και 71% πεψίνη. Σε γενικές γραμμές 161

3 κεφάλαιο μπορεί να λεχθεί ότι οι πυτιές του εμπορίου, που παρασκευάζονται από ήνυστρα νεαρών μηρυκαστικών, οφείλουν το 80-90% της πηκτικής τους δύναμης στη ρεννίνη και το 10-20% στην πεψίνη, ενώ συμβαίνει το αντίστροφο, όταν παρασκευάζονται από ήνυστρα ενήλικων ζώων. Η χυμοσίνη χαρακτηρίζεται από την πολύ υψηλή πηκτική της δύναμη και την περιορισμένη πρωτεολυτική της δράση. Ένα μέρος κρυσταλλικής ρεννίνης πήζει περίπου 5.000.000 μέρη γάλακτος στους 40 ο C. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η πρωτεολυτική της δράση επί της καζεΐνης, δεδομένου ότι το ένζυμο αυτό, εκτός του ότι προκαλεί την πήξη του γάλακτος κατά την τυροκόμηση, συμμετέχει και στο πολύπλοκο φαινόμενο της ωρίμασης των τυριών. Η δράση αυτή, που βρέθηκε ότι είναι περιορισμένη, αποκτά τη μέγιστη τιμή της σε pη γύρω στο 3,5. Το προένζυμο της χυμοσίνης, η προχυμοσίνη, απαντά σε αφθονία στο επιθήλιο των ηνύστρων των νεαρών μηρυκαστικών, απ όπου και εκκρίνεται στο γαστρικό τους υγρό, στο όξινο περιβάλλον του οποίου ενεργοποιείται. Κατά την ενεργοποίηση της προχυμοσίνης παρατηρείται μείωση του μοριακού της βάρους από 36.000 στο 31.000, με απόσπαση ενός πεπτιδίου από το μόριο της. Η διεργασία αυτή, όταν το pη είναι μεταξύ 5,0 και 6,0 γίνεται με πολύ βραδύ ρυθμό, επιταχύνεται σημαντικά σε τιμές κάτω του 5,0 και θεωρείται ότι γίνεται στιγμιαία σε ph 1,0. Εκείνο που έχει ιδιαίτερη πρακτική σημασία στην προκειμένη περίπτωση είναι η σταθερότητα της χυμοσίνης σε διάφορα ph. Αποδείχθηκε ασταθής σε τιμές ph γύρω από το 3,5, σχετικά σταθερή γύρω από το 2,0 και πολύ σταθερή στο ph 5,4 έως 5,6. Η ενεργοποίηση της προχυμοσίνης είναι δυνατόν να προκληθεί και από ένζυμα, πλην όμως στην περίπτωση αυτήν παρατηρείται συνήθως και γενική πρωτεόλυση που έχει ως αποτέλεσμα να λαμβάνεται μικρότερη απόδοση σε ενεργό ένζυμο απ ό,τι όταν γίνεται με οξίνιση. Η πεψίνη, για παράδειγμα, που υπάρχει πάντοτε στην πυτιά είναι δυνατόν να προκαλέσει την αντίδραση αυτή σε pη μεταξύ 5,0 και 6,0. Η αστάθεια της χυμοσίνης σε pη γύρω από το 3,5, όπου παρουσιάζει και τη μεγαλύτερη πρωτεολυτική της δράση, αποδίδεται στην αυτόλυσή της. Πέραν τούτου διάφορα πρωτεολυτικά ένζυμα είναι δυνατόν να την προσβάλουν στις συνθήκες αυτές και να την αδρανοποιήσουν. Η χυμοσίνη είναι ένζυμο που καταστρέφεται εύκολα σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 50 ο C. ιάφορες χημικές ουσίες επηρεάζουν επίσης τη σταθερότητά της. Το χλωροφόρμιο, η φορμαλδεύδη και το διχρωμικό κάλι την αδρανοποιούν. Αντίθετα, δεν την επηρεάζουν τα αλογόνα και το υπεροξείδιο του υδρογόνου, ενώ το φως μειώνει σημαντικά τη δραστικότητά της. 162

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία Πέραν της χυμοσίνης, που όπως αναφέρθηκε ήδη είναι το ένζυμο που δεσπόζει στην πυτιά, υπάρχει πάντοτε σ αυτήν και πεψίνη. Τα δύο ένζυμα ομοιάζουν πολύ μεταξύ τους και για μεγάλο χρονικό διάστημα θεωρούνταν ως ένα. Ο Hammarsten είναι ο πρώτος που διαπίστωσε, το 1918, ότι το γαστρικό υγρό των ηνύστρων των μοσχαριών περιέχει δύο διαφορετικά ένζυμα, τη χυμοσίνη, που έχει μεγάλη πηκτική ισχύ και περιορισμένη πρωτεολυτική, και την πεψίνη με ισχυρή πρωτεολυτική ισχύ σε όξινες διαλύσεις. Η πεψίνη υπάρχει στα επιθηλιακά κύτταρα τόσο των μη απογαλακτισμένων μοσχαριών όσο και των ενήλικων βοοειδών σε μορφή προενζύμου, του πεψινογόνου, από το οποίο και λαμβάνεται με οξίνιση, όπως και στην περίπτωση της χυμοσίνης. Η πρωτεολυτική δράση των δύο ενζύμων επί των καζεϊνικών κλασμάτων κατά την ωρίμαση των τυριών θεωρείται όμοια ως προς το κύριο προϊόν, πλην όμως στην περίπτωση της πεψίνης παράγεται μεγαλύτερος αριθμός πεπτιδίων χαμηλότερου μοριακού βάρους. Πηκτική δύναμη πυτιάς Εκτός από την ενζυμική σύσταση της πυτιάς, δηλαδή την αναλογία χυμοσίνης/πεψίνης, ιδιαίτερα σημαντική ιδιότητά της αποτελεί και η πηκτική της δύναμη. Η εμπορική αξία ενός οποιουδήποτε εμπορικού σκευάσματός της καθορίζεται κατά κύριο λόγο από τις δύο αυτές ιδιότητες. Όσο μεγαλύτερη είναι η πηκτική της δύναμη και η αναλογία της χυμοσίνης στην πυτιά τόσο υψηλότερη είναι η ποιότητα και η αξία της. Ως πηκτική δύναμη μιας πυτιάς ορίζονται τα μέρη του γάλακτος που πήζει ένα μέρος της στους 35 ο C σε 40 min. Εκφράζεται, συνήθως, σε μορφή κλάσματος στο οποίο αριθμητής είναι η μονάδα και παρανομαστής τα μέρη του γάλακτος που μπορεί να πήξει ένα μέρος της στις παραπάνω συνθήκες. Ο ακριβής προσδιορισμός της πηκτικής δύναμης παρουσιάζει ιδιαίτερο πρακτικό ενδιαφέρον και για το λόγο αυτό έχουν κατά καιρούς δοκιμαστεί διάφορες μέθοδοι, πλην όμως τα αποτελέσματα, στις περισσότερες περιπτώσεις, δεν ήταν ικανοποιητικά. Παράγοντες, όπως τα ιόντα ασβεστίου, η σύσταση του γάλακτος, το ph, η θερμοκρασία πήξης του και άλλοι, επηρεάζουν το χρόνο πήξης του με την πυτιά και κατά συνέπεια την πηκτική δύναμη. Για να περιοριστούν τα σφάλματα που επιφέρουν κατά τις μετρήσεις οι παραπάνω παράγοντες προτάθηκε η χρησιμοποίηση ειδικού υποστρώματος που λαμβάνεται με ανασύσταση 12g σκόνης άπαχου γάλακτος υψηλής διαλυτότητας σε 100ml διαλύματος χλωριούχου 163

3 κεφάλαιο ασβεστίου 0,01Μ. Μάλιστα συνιστάται η σκόνη γάλακτος να λαμβάνεται από ξήρανση μεγάλης ποσότητας γάλακτος που προέρχεται από πολλές εκτροφές, ώστε να περιορίζονται οι διακυμάνσεις στη σύστασή της. Η ποσότητα της πυτιάς που χρησιμοποιείται πρέπει να είναι τόση, ώστε να επιφέρει την πήξη σε 3 έως 6 min. Συνήθως, για τη μέτρηση της πηκτικής δύναμης χρησιμοποιούνται 100ml ανασυσταμένου γάλακτος και 1ml πυτιάς. Η πήξη γίνεται στους 35 ο C. Στις συνθήκες αυτές μετράται ο χρόνος πήξης (t) του γάλακτος σε sec και υπολογίζεται η πηκτική δύναμη της πυτιάς από τον τύπο: Πηκτική δύναμη = 100 2400 t Σε περιπτώσεις που αραιώνεται η πυτιά για να επιτευχθεί ο χρόνος πήξης εντός των ορίων που αναφέρθηκαν, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη και ο συντελεστής αραίωσης της. Παρασκευή της πυτιάς σε βιομηχανική κλίμακα Η πυτιά κυκλοφορεί στο εμπόριο, σε υγρή μορφή με συνήθη πηκτική ισχύ 1/15.000, ή σε μορφή σκόνης με πηκτική ισχύ 1/100.000 και σπανιότερα σαν πάστα της οποίας η ισχύς κυμαίνεται σημαντικά. Από εργασίες που έχουν κατά καιρούς δημοσιευθεί προκύπτει ότι η υγρή πυτιά είναι δυνατό να παρασκευασθεί με διάφορες μεθόδους. Ποιες είναι αυτές που χρησιμοποιούνται σήμερα από τις βιομηχανίες δεν είναι με ακρίβεια γνωστό. Το πιο πιθανό είναι ότι λαμβάνεται από τεμαχισμένα ξηρά ήνυστρα μοσχαριών ύστερα από εκχύλιση με διάλυμα 5-10% χλωριούχου νατρίου που περιέχει και συντηρητικό. Το εκχύλισμα ενεργοποιείται με οξίνιση, προσαρμόζεται το ph του στην περιοχή σταθερότητας της ρεννίνης και τυποποιείται η πηκτική του ισχύς, η περιεκτικότητά του σε χλωριούχο νάτριο και το χρώμα του. Στη συνέχεια συσκευάζεται σε φιάλες ή δοχεία και διατίθεται στο εμπόριο. Το ακατέργαστο εκχύλισμα πυτιάς έχει συνήθως ph 5,4 έως 5,8 και περιέχει κατά κύριο λόγο προρεννίνη και περιορισμένη ποσότητα ρεννίνης, πεψίνης και πεψινογόνου καθώς και άλλα ένζυμα. Η ενεργοποίηση των προενζύμων γίνεται με οξίνιση του εκχυλίσματος σε ph, κατά προτίμηση, γύρω από το 5,0 ή το 2,0. Τιμές ph μεταξύ 3 και 4 δε φαίνεται να συνηθίζονται, γιατί, όπως αναφέρθηκε ήδη, η ρεννίνη παρουσιάζει αστάθεια στην περιοχή αυτή, (σχήμα 3.2). Σε περίπτωση που επιλέγεται πολύ χαμηλό ph για την ενεργοποίη ση των ενζύμων σε συντομότερο χρονικό διάστημα, αυτό θα πρέπει να 164

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία διορθώνεται αμέσως μετά σε τιμές μεταξύ 5.4 και 5.6. Συνιστάται, επίσης, η ενεργοποίηση αλλά και η διατήρηση της πυτιάς να γίνεται σε χαμηλές θερμοκρασίες στις οποίες οι απώλειες πηκτικής δύναμης είναι περιορισμένες. Μετά την ενεργοποίηση της πυτιάς το ph διορθώνεται πάντοτε, ώστε να βρίσκεται στην περιοχή σταθερότητας του ενζύμου, συνήθως μεταξύ 5,4 και 5,6. Σχήμα 3.2: Η επίδραση του ph στη σταθερότητα της ρεννίνης, μετά από διατήρηση 48 ωρών στους 25 o C (- -) και στους 2 o C (- -). Η υγρή πυτιά έχει το πλεονέκτημα ότι μπορεί εύκολα να μετρηθεί από τους τυροκόμους, αλλά είναι πιο ασταθής από τη σκόνη και επιδεκτική προσβολής από μικρόβια. Μια καλή υγρή πυτιά εμπορίου πρέπει να έχει υψηλή πηκτική ισχύ, σταθερότητα κατά τη διάρκεια της διατήρησής της και να μην περιέχει παθογόνα ή άλλα μικρόβια ικανά να δημιουργήσουν ελαττώματα στα τυριά. Η απώλεια σε πηκτική ισχύ δεν πρέπει να υπερβαίνει το 1-2% το μήνα, αν διατηρείται σε θερμοκρασία ψυγείου. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες υπάρχει πάντα ο κίνδυνος τα μικρόβια να υπερκεράσουν σε κάποια στιγμή τα συντηρητικά και να προσβάλουν τη ρεννίνη, οπότε οι απώλειες είναι σημαντικά υψηλότερες. Τα ξηρά ήνυστρα που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή υγρής πυτιάς προετοιμάζονται κατά δύο τρόπους: Κατά τον ένα, το συντομότερο μετά τη σφαγή των ζώων, απομακρύνεται το περιεχόμενο τους, καθαρίζονται καλά, φουσκώνονται και στη συνέχεια ξηραίνονται σε 165

3 κεφάλαιο Σχήμα 3.3: Παρασκευή πυτιάς από ήνυστρα ενήλικων βοοειδών και μη απογαλακτισμένων μοσχαριών. 166

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία ξηρό ρεύμα αέρα. Κατά τον άλλο, ανοίγονται στα σφαγεία, καθαρίζονται πρόχειρα, συσκευάζονται σε κιβώτια με ταυτόχρονη προσθήκη χλωριούχου νατρίου και αποστέλλονται στο εργοστάσιο παρασκευής της πυτιάς. Εκεί καθαρίζονται καλά και ξηραίνονται σε ρεύμα ξηρού αέρα. Κατά τη χρησιμοποίησή τους για την παρασκευή πυτιάς τα ξηρά ήνυστρα που λαμβάνονται με τον ένα ή τον άλλο τρόπο κόβονται σε λωρίδες πλάτους 1-2 cm. Τα τελευταία χρόνια για την παρασκευή πυτιάς χρησιμοποιούνται καταψυγμένα ήνυστρα πλην, όμως ο ρυθμός εκχύλισης στην περίπτωση αυτή είναι βραδύτερος. Η διαδικασία που ακολουθείται συνήθως για την παρασκευή πυτιάς συνοψίζεται στο σχήμα 3.3. Πυτιά σε μορφή σκόνης είναι δυνατό να παρασκευασθεί από την υγρή πυτιά με οξίνιση ή κορεσμό με χλωριούχο νάτριο ή συνηθέστερα με οξίνιση και ταυτόχρονα κορεσμό. Το ίζημα που δημιουργείται ξηραίνεται στη συνέχεια και αποτελεί την πυτιά. Πολλές φορές χρησιμοποιείται ζελατίνη για να διευκολυνθεί ο διαχωρισμός του ιζήματος και κατά συνέπεια η λήψη περισσότερης ρεννίνης, ενώ σε άλλες περιπτώσεις συμπυκνώνεται η υγρή πυτιά με υπερδιήθηση. Για την παρασκευή μερικών τύπων Ιταλικών τυριών χρησιμοποιείται συχνά πάστα πυτιάς που λαμβάνεται με άλεσμα νωπών ηνύστρων μη απογαλακτισμένων μοσχαριών ή κατσικιών. Στην περίπτωση αυτή δεν απομακρύνονται το γαστρικό υγρό και το πηγμένο στα ήνυστρα μητρικό γάλα, αλλά αναμιγνύεται με τους ιστούς και αποτελούν συστατικό της πάστας. Για τη συντήρηση της αλατίζεται ισχυρά. Εγχώρια πυτιά Στη χώρα μας χρησιμοποιείται συχνά πυτιά που παρασκευάζουν μόνοι τους οι τυροκόμοι, κατά τρόπο εμπειρικό, από ήνυστρα μη απογαλακτισμένων αρνιών και κατσικιών. Η πυτιά αυτή είναι γνωστή σαν «ντόπια πυτιά» ή «φυσική πυτιά» ή «εγχώρια πυτιά». Ο τρόπος παρασκευής της διαφέρει από περιοχή σε περιοχή. Πολλές φορές την αποτελεί μόνο το πολτώδες ή αφυδατωμένο περιεχόμενο των ηνύστρων μη απογαλακτισμένων αρνιών και κατσικών, δηλαδή το πηγμένο μητρικό γάλα με το γαστρικό υγρό που συνυπάρχει. Το μίγμα αυτό έχει μικρή πηκτική ισχύ αμέσως μετά τη σφαγή των ζώων που αυξάνει στη συνέχεια. Στην πράξη τα ήνυστρα αλατίζονται εξωτερικά και αναρτούνται σε μέρος σκιερό, μέχρι να αποκτήσει το περιεχόμενό τους υφή πολτού ή ακόμη και να αφυδατωθεί, οπότε και χρησιμοποιείται σαν πυτιά. Κατά το διάστημα αυτό η πηκτική ισχύς του περιεχομένου των ηνύστρων αυξάνει, 167

3 κεφάλαιο γεγονός που αποδίδεται στην ενεργοποίηση της προρεννίνης που υπάρχει στο γαστρικό υγρό, στην αύξηση της συγκέντρωσης του ενζύμου λόγω της αφυδάτωσης που παρατηρείται κατά τη διατήρηση των ηνύστρων και στην καταστροφή του επιθηλιακού τους ιστού που είναι πλούσιος σε προρεννίνη, η οποία έτσι απελευθερώνεται και ενεργοποιείται. Η μορφή αυτή της εγχώριας πυτιάς, πριν από τη χρησιμοποίησή της για τυροκόμηση, αναμιγνύεται με μικρή ποσότητα άλμης ή νερού, γεγονός που διασφαλίζει την καλύτερη διασπορά της στο γάλα. Πρέπει να σημειωθεί ότι με τον τρόπο αυτόν αξιοποιείται μέρος μόνο της υπάρχουσας στο ήνυστρο των ζώων ρεννίνης, γιατί το μεγαλύτερο ποσοστό της υπάρχει στους ιστούς, που ουσιαστικά δε χρησιμοποιούνται. Συνηθέστερα, η εγχώρια πυτιά παρασκευάζεται με τη χρησιμοποίηση ολόκληρου του ηνύστρου. Στην περίπτωση αυτή οι ξηροί ιστοί μαζί με το πηγμένο γάλα που περιέχουν αλέθονται, αναμιγνύονται με περίπου τριπλάσια έως πενταπλάσια ποσότητα άλμης 10% και παραμένουν στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος για 48 ώρες. Επακολουθεί φυγοκέντρηση ή διήθηση για την απομάκρυνση των ιστών των ηνύστρων και των πηγμάτων γάλακτος που τυχόν υπάρχουν. Το διήθημα που λαμβάνεται κατ αυτόν τον τρόπο αποτελεί ένα είδος εγχώριας πυτιάς. Τούτο είναι όξινο από τη φύση του με αποτέλεσμα να ενεργοποιείται στο σύνολο της η προρεννίνη που περιέχει. Για καλύτερη διατήρηση της πυτιάς αυτής επιβάλλεται να προσαρμόζεται το ph της μεταξύ 5,4 και 5,6 που είναι, όπως αναφέρθηκε, η περιοχή μέγιστης σταθερότητας της ρεννίνης. Στην περίπτωση αυτή, αλλά και σε κάθε άλλη που χρησιμοποιείται το περιεχόμενο των ηνύστρων για την πήξη του γάλακτος, θα πρέπει να δίδεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε αυτά να προέρχονται από ζώα που διατρέφονται αποκλειστικά με γάλα. ιαφορετικά οι τροφές τους αναμιγνύονται με το πηγμένο στο ήνυστρο γάλα και το εκχύλισμα που λαμβάνεται είναι ακατάλληλο για χρήση στην τυροκόμηση, γιατί περιέχει ακαθαρσίες (εικόνα 3.1). Η εγχώρια πυτιά, που αποτελούσε παλαιότερα στη χώρα μας το συνηθέστερο μέσο πήξης του γάλακτος, θεωρήθηκε σε πολλές περιπτώσεις υπεύθυνη δηλητηριάσεων από κατανάλωση τυριών που παρασκευάστηκαν με αυτήν. Παρά ταύτα εξακολουθεί να χρησιμοποιείται, ιδιαίτερα στην παρασκευή των τυριών Φέτα και Κεφαλοτύρι, γιατί συμβάλλει στη διαμόρφωση πιπεράτης γεύσης που προτιμάται από μεγάλη μερίδα του ελληνικού καταναλωτικού κοινού. Σε ό,τι αφορά τις περιπτώσεις δηλητηριάσεων από τυριά που παρατηρήθηκαν στο παρελθόν και που σπανιότερα σημειώνονται ακόμη και σήμερα, διαπιστώθηκε ότι δεν οφείλονται στη δημιουργία τοξικών 168

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία προϊόντων που προέρχονται από τη δράση των ενζύμων της εγχώριας πυτιάς. Παρόμοια προβλήματα αντιμετωπίστηκαν παλαιότερα και με τη χρησιμοποίηση υγρής πυτιάς από ήνυστρα μοσχαριών, που όμως εξαφανίστηκαν μετά την παρασκευή της σε βιομηχανική κλίμακα, κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες. Εικόνα 3.1: Στομάχια αρνιών που έχουν τραφεί: α) αποκλειστικά με γάλα, β) κυρίως με γάλα και χορτάρι και γ) κυρίως με χορτάρι και γάλα (Ανυφαντάκης, 1998). Για να ληφθεί πυτιά καλής ποιότητας επιβάλλεται η σχολαστική τήρηση των κανόνων υγιεινής σε όλα τα στάδια της παρασκευής της. Σε αντίθετη περίπτωση, είναι δυνατόν η μικροχλωρίδα της να αναπτυχθεί κατά τρόπο ανεξέλεγκτο και να μολύνει κατά την πήξη το γάλα με ανεπιθύμητα μικρόβια. Τα αναερόβια σηψιγόνα βακτήρια, κυρίως εκείνα η ανάπτυξη των οποίων δεν περιορίζεται με τη χαμηλή οξύτητα, θεωρούνται ιδιαίτερα επικίνδυνα. Αυτά, αν αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται, είναι ικανά να παράγουν αμμωνία με την οποία εξουδετερώνουν την οξύτητα και δημιουργούν πιο πρόσφορες συνθήκες για την ανάπτυξή τους. ιάφορες αμίνες παράγονται στη συνέχεια, πολλές από τις οποίες είναι δηλητηριώδεις, με αποτέλεσμα τα τυριά να είναι επικίνδυνα για 169

3 κεφάλαιο κατανάλωση. Είναι προφανές ότι στις συνθήκες παρασκευής της εγχώριας πυτιάς δεν υπάρχει πάντοτε δυνατότητα αποτελεσματικού ελέγχου της μικροχλωρίδας που αναπτύσσεται και κατά συνέπεια υπάρχει κίνδυνος μόλυνσης του γάλακτος της τυροκόμησης με ανεπιθύμητους μικροοργανισμούς ικανούς να δημιουργήσουν προβλήματα. Μικροβιολογική χλωρίδα της πυτιάς Οι μικροοργανισμοί της πυτιάς ενδιαφέρουν, γιατί είναι δυνατό, κάτω από ορισμένες συνθήκες, να προσβάλουν τη ρεννίνη, με αποτέλεσμα να καταστρέψουν την ενζυματική της δραστηριότητα, αλλά και γιατί παίζουν κάποιο ρόλο, θετικό ή αρνητικό, στην ωρίμαση των τυριών. Η υγρή πυτιά του εμπορίου είναι συνήθως καλής ποιότητας, με σταθερή πηκτική ισχύ και καλή διατηρησιμότητα. Σε θερμοκρασίες μικρότερες των 12 o C διατηρείται αρκετά καλά για χρονικό διάστημα 6-9 μηνών. Μετά αρχίζει η φθορά της και παράλληλα αυξάνει ο αριθμός των βακτηρίων που περιέχει. Έρευνες σχετικές με τη μικροχλωρίδα της απέδειξαν ότι δε συμβάλλει σοβαρά στην ωρίμαση ή την ποιότητα των τυριών. Αυτό φυσικά υπό την προϋπόθεση ότι η πυτιά είναι καλής ποιότητας. Σε περιπτώσεις, όμως, που οι συνθήκες παρασκευής της δεν είναι οι ενδεδειγμένες από άποψη υγιεινής και ο έλεγχος είναι ανεπαρκής, τότε μπορεί να μολυνθεί και να μεταφέρει στη συνέχεια ανεπιθύμητα μικρόβια στο τυροκομούμενο γάλα, ικανά να προκαλέσουν ανώμαλες ζυμώσεις κατά την ωρίμαση των τυριών. Ο αριθμός και το είδος των μικροοργανισμών, κατά συνέπεια, που βρίσκονται σε μια υγρή πυτιά εξαρτάται από την επιμέλεια με την οποία παρασκευάστηκε και διατηρήθηκε. Η ποιότητα των ηνύστρων που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή της έχει επίσης ιδιαίτερη σημασία. Τα καλής ποιότητας ήνυστρα είναι πλούσια σε γαλακτοβακίλλους σε αντίθεση με τα κακής όπου αφθονούν τα κλωστρίδια και τα κολοβακτηρίδια. Σε ό,τι αφορά στην πυτιά σε μορφή σκόνης έχει αποδειχθεί ότι ο αριθμός των μικροβίων που περιέχει ανά γραμμάριο είναι πολύ μικρός και δεν επηρεάζει σημαντικά την χλωρίδα του γάλακτος της τυροκόμησης. Υποκατάστατα πυτιάς Από τον πίνακα 3.1 προκύπτει ότι σήμερα χρησιμοποιούνται στην τυροκομία πέραν της πυτιάς και υποκατάστατά της που λαμβάνονται από ζωικούς και φυτικούς ιστούς, καθώς και από μικρόβια, στα οποία γίνεται συνοπτική αναφορά στη συνέχεια. 170

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία Ένζυμα από ζωικούς ιστούς Πεψίνη χοίρων Εκκρίνεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του στομάχου των χοίρων, υπό την ανενεργή μορφή του πεψινογόνου το οποίο έχει μοριακό βάρος 40.400 και είναι σταθερό στις συνήθεις θερμοκρασίες, σε ουδέτερες και ελαφρά αλκαλικές διαλύσεις. Ενεργοποιείται σε όξινο περιβάλλον με απόσπαση από το μόριο του ενός πεπτιδίου μοριακού βάρους 5.000. Υπάρχουν 4 διαφορετικά κλάσματα πεψίνης τα Α, Β, C, D, τα οποία εμφανίζουν διαφορετική πηκτική ισχύ και εκ των οποίων κυριαρχεί το Α. Οι πεψίνες B & C πήζουν πολύ ταχύτερα το γάλα απ ό,τι η Α και είναι σχετικώς πιο σταθερές σε ph 6,9, ενώ η D είναι πολύ πιο ασταθής σε ph μεγαλύτερο του 6,0, αλλά έχει διπλάσια πηκτική ισχύ από την Α. Η πηκτική δύναμη της πεψίνης χοίρων μειώνεται με σημαντικά ταχύτερο ρυθμό απ ό,τι αυτή της ρεννίνης σε ph μεταξύ 6,3 και 6,8. Στην πραγματικότητα, συνήθεις ποσότητες πεψίνης δεν επιφέρουν την πήξη του γάλακτος σε ph 6,8 και άνω. Για το λόγο αυτό, όταν το γάλα της τυροκόμησης είναι πολύ καλής ποιότητας, παρατηρείται βραδεία πήξη του σε περιπτώσεις που χρησιμοποιείται πεψίνη χοίρων, με συνέπεια τη δημιουργία μαλακού πήγματος και μεγάλες απώλειες σε λίπος. Συχνά αναμειγνύεται σε σχέση 50/50 με την κλασική πυτιά για να αποφευχθούν οι δυσκολίες αυτές. Πεψίνη ορνίθων Λαμβάνεται από στομάχια ορνίθων. Η χρήση της περιορίζεται στο Ισραήλ, όπου αναφέρεται ότι έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα. Θα πρέπει, εντούτοις, να σημειωθεί ότι υπάρχουν και ερευνητικά δεδομένα που υποστηρίζουν την άποψη ότι το ένζυμο αυτό δεν είναι κατάλληλο υποκατάστατο της κλασικής πυτιάς. Πυτιά βοοειδών Το προϊόν αυτό, που είναι γνωστό και με το όνομα πεψίνη βοοειδών, λαμβάνεται από ήνυστρα βοοειδών μεγάλης ηλικίας, συνήθως μεγαλύτερης των 18 μηνών. Περιέχει, κατά κύριο λόγο, πεψίνη και σε μικρή αναλογία χυμοσύνη, σε μία σχέση μεταξύ τους αντίστροφη αυτής της κλασικής πυτιάς, δηλαδή 80-90% πεψίνη και 10-20% χυμοσίνη. Και στην περίπτωση αυτή τα δύο ένζυμα υπάρχουν σε μορφή προενζύμων στο επιθήλιο των ηνύστρων από όπου συνήθως λαμβάνονται με εκχύλιση. Η 171

3 κεφάλαιο ενεργοποίησή τους γίνεται κατά τρόπο ανάλογο με αυτόν που εφαρμόζεται στην περίπτωση της κλασικής πυτιάς, σε ένα ph γύρω στο 2,0. Η πεψίνη των βοοειδών έχει παρόμοια πηκτική ισχύ με την πεψίνη των χοίρων, πλην όμως παρουσιάζει αξιοσημείωτες διαφορές στη συμπεριφορά της στο ph. Μπορεί να πήξει το γάλα σε ph μέχρι 6,9, κάτι που δε συμβαίνει στην περίπτωση της πεψίνης χοίρων, ενώ είναι πολύ πιο σταθερή από αυτήν. Σε ph 6,35 η πεψίνη χοίρων καταστρέφεται πολύ γρήγορα, ενώ αυτή των βοοειδών είναι πολύ ανθεκτική. Θεωρείται το καλύτερο υποκατάστατο της πυτιάς. Ένζυμα από φυτικούς ιστούς Σε πειραματική κλίμακα έχουν χρησιμοποιηθεί πολλά ένζυμα της κατηγορίας αυτής, χωρίς ποτέ να περάσουν στην πράξη. Και αυτό, γιατί προκαλούν αυξημένη πρωτεόλυση, με συνέπεια σημαντική μείωση στην απόδοση και πίκρισμα στα τυριά που παρασκευάζονται. Εξαίρεση αποτελεί το ενζυμικό προϊόν που λαμβάνεται από άνθη του φυτού Cynara cardunculus, που χρησιμοποιείται στην Πορτογαλία για την παρασκευή του τυριού Sierra da Estrela, το οποίο είναι προϊόν Προστατευόμενης Ονομασίας Προέλευσης. Στη χώρα μας και σε επίπεδο αγροτικής εκμετάλλευσης έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την πήξη του γάλακτος χυμός της συκιάς, πρακτική που εφαρμόζεται από την αρχαιότητα. Ο Ευριπίδης (480-406 π.χ.) αναφέρει ένα τυρί φτιαγμένο από αγελαδινό γάλα και χυμό συκιάς «τυρός οπίας εστί και βοός γάλα» δηλαδή τυρί από αγελαδινό γάλα και χυμό συκιάς. Ένζυμα από μύκητες Πολλές πρωτεάσες από μύκητες έχουν χρησιμοποιηθεί σε πειραματική κλίμακα από διάφορους ερευνητές για την παρασκευή τυριών. Σήμερα διατίθενται στο εμπόριο τρεις τουλάχιστον από αυτές που λαμβάνονται από τον Endothia parasitica, το Mucor pussilus (Lind) και τον Mucor miehei. Τα ένζυμα αυτά έχουν γίνει δεκτά ως κατάλληλα και ασφαλή υποκατάστατα της κλασικής πυτιάς και κυκλοφορούν στο εμπόριο με τα ονόματα Suparen, Surecurd η τελευταία, Novaded, Noury, Meito, Emporase η δεύτερη και Hannilase, Rennilase, Fromage, Miki, Marzyme, η πρώτη. Χαρακτηρίζονται ως περισσότερο πρωτεολυτικά από την κλασική πυτιά και είναι δυνατόν, υπό ορισμένες συνθήκες, να δημιουργήσουν πίκρισμα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται συνήθως σε μίγμα με 172

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία την πυτιά. Μάλιστα από τη ιεθνή Ομοσπονδία Γάλακτος συνιστάται, πριν χρησιμοποιηθούν στην παρασκευή ενός τυριού σε βιομηχανική κλίμακα, να δοκιμάζονται προηγουμένως πειραματικά για το συγκεκριμένο τυρί. Και αυτό γιατί τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά και οι συνθήκες παρασκευής και ωρίμασης κάθε τυριού επηρεάζουν το τελικό αποτέλεσμα, που είναι δυνατόν να είναι θετικό ή αρνητικό ανάλογα με τον τύπο του τυριού. Ένζυμα από βακτήρια Τα βακτήρια έχουν αποτελέσει κατά καιρούς πηγή λήψης ενζύμων για την πήξη του γάλακτος, πλην όμως κανένα απ αυτά δεν κυκλοφορεί στο εμπόριο. Περισσότερο από όλα τα ένζυμα της κατηγορίας αυτής έχουν δοκιμαστεί αυτά των Bacillus cereus και Bacillus subtilis, για τα οποία διαφαίνονται προοπτικές να αποτελέσουν υποκατάστατα της πυτιάς για ορισμένα είδη τυριών. Ένζυμα από μικροοργανισμούς με ανασυνδυασμένο DNA Κατά την τελευταία δεκαετία, χάρη στις αλματώδεις εξελίξεις της βιοτεχνολογίας, έγινε δυνατή η παραγωγή χυμοσίνης με ζυμώσεις που προκαλούν γενετικά τροποποιημένοι μικροοργανισμοί (Fermentation produced chymosin, F.P.C.). Σήμερα κυκλοφορούν στο εμπόριο τρία τουλάχιστον ενζυμικά προϊόντα διαφορετικών οίκων που περιέχουν μικροβιακή χυμοσίνη, ενώ αναμένονται και άλλα. Τα προϊόντα αυτά είναι τα Chymax, Maxyren και Chymogen, που παράγονται από τους μικροοργανισμούς Escherichia coli, Kluyveromyces lactis και Aspergillus niger Var. Awamori, αντίστοιχα. Επίσης κυκλοφορεί ένα προϊόν με το όνομα Chymosin S που λαμβάνεται με ανάμειξη χυμοσίνης και πεψίνης βοοειδών σε αναλογία τέτοια, ώστε το μίγμα να περιέχει 90% μικροβιακή χυμοσίνη και 10% πεψίνη, το οποίο προορίζεται για καταναλωτές που προτιμούν πυτιά με ενζυμική σύσταση ανάλογη της κλασικής. Η διαδικασία παρασκευής F.P.C. από τον Aspergillus niger δίδεται συνοπτικά στο σχήμα 3.4. Τα πλεονεκτήματα των προϊόντων που περιέχουν χυμοσίνη από μικροβιακή ζύμωση είναι η τυποποίηση, η υψηλή καθαρότητα και ποιότητα, η δυνατότητα παραγωγής τους σε απεριόριστες ποσότητες και η σταθερότητα στην τιμή τους. εν περιέχουν άλλο πηκτικό ή πρωτεολυτικό ένζυμο πέραν της χυμοσίνης, σε αντίθεση με την πυτιά των μοσχαριών που περιέχει πεψίνη και διάφορες πεπτιδάσες. Η κλασική 173

3 κεφάλαιο πυτιά περιέχει τρεις χυμοσίνες, τις Α, Β και C, από τις οποίες οι Α και Β είναι προϊόντα διαφορετικών γόνων, ενώ η C είναι προϊόν διάσπασης της Α. Τα ενζυμικά προϊόντα που λαμβάνονται από μικροοργανισμούς με τροποποιημένο DNA περιέχουν ή την Α χυμοσίνη και το προϊόν διάσπασης της C (Maxiren) ή Β χυμοσίνη (Chymogen, Chymax). Σχήμα 3.4: ιάγραμμα παραγωγής χυμοσίνης με ζύμωση από τον Aspergillus niger. 174

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία Από την εφαρμογή στην τυροκόμηση της χυμοσίνης που παράγεται από μικροοργανισμούς με τροποποίηση του DNA τους, δε διαπιστώθηκε οποιαδήποτε σημαντική διαφορά από την κλασική πυτιά σε ό,τι αφορά στην πρωτεόλυση και στην ωρίμαση των τυριών. Ακινητοποιημένα ένζυμα Η δράση των ενζύμων που χρησιμοποιούνται κατά την τυροκόμηση δεν περιορίζεται στο να προκαλέσουν μόνο την πρώτη φάση της πήξης του γάλακτος. Κατά το μεγαλύτερο μέρος τους μεταφέρονται στο τυρόγαλα και δημιουργούν πολλές φορές προβλήματα κατά την επεξεργασία του, ενώ ένα μικρό μέρος τους μεταφέρεται στο τυρί και συμβάλλει στο πολύπλοκο φαινόμενο της ωρίμασης. Για την εξοικονόμηση των ενζύμων, που χάνονται στο τυρόγαλα, και την εξασφάλιση συνεχούς παρασκευής τυροπήγματος, που διευκολύνει τα μέγιστα τη μηχανοποίηση της παραγωγής, προτάθηκε η χρησιμοποίηση ακινητοποιημένων ενζύμων. Πρόκειται για σύστημα στο οποίο το ένζυμο είναι σταθερά ενωμένο με ένα πολυμερές υψηλού μοριακού βάρους. Η ιδέα ήταν να ολοκληρώνεται η πρώτη φάση της πήξης του γάλακτος με συνεχές πέρασμά του από το σύστημα αυτό σε θερμοκρασία μικρότερη των 10 ο C, χωρίς να προκληθεί πήξη του και να απομακρύνεται στη συνέχεια το ενζυμικό σύστημα για να ξαναχρησιμοποιηθεί. Η πήξη επιτυγχάνεται με ταχύτατη θέρμανση του γάλακτος στη συνέχεια στους 30 ο C περίπου, χωρίς να υπάρχει ένζυμο σ αυτό. Η τεχνική αυτή δεν πέρασε ποτέ στις βιομηχανίες, γιατί είναι αντιοικονομική. Πέραν αυτού, η πήξη του γάλακτος της τυροκόμησης πρέπει να γίνεται σε συνθήκες ακινησίας για να επιτυγχάνεται καλό πήγμα και να περιορίζονται οι απώλειες πρωτεϊνών και λίπους, κάτι που είναι δύσκολο να επιτευχθεί με την τεχνική αυτή, ενώ αντιμετωπίζονται από τις βιομηχανίες και προβλήματα τήρησης υγιεινής και εφαρμογής μέτρων για την καταπολέμηση των βακτηριοφάγων. Ένζυμα για Αύξηση της Γεύσης και του Αρώματος των Τυριών Το τυρί που λαμβάνεται με χρήση πυτιάς, αμέσως μετά την παρασκευή του, είναι άγευστο και τραχύ και δεν μπορεί να καταναλωθεί. Ο λόγος είναι ότι το μεγαλύτερο μέρος της καζεΐνης του διατηρείται άθικτη 175

3 κεφάλαιο ή έχει μετατραπεί σε μεγάλα πεπτίδια που δε συμβάλλουν ιδιαίτερα στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών του ιδιοτήτων. Για να αποκτήσει γεύση, πρέπει μεγάλο μέρος των καζεϊνών του να μετατραπεί σε μικρά πεπτίδια και αμινοξέα. Οι αλλαγές αυτές συνεπάγονται και μεταβολές στη δομή του. Πέραν τούτου, κατά την ωρίμαση των τυριών, το λίπος τους υφίσταται υδρόλυση, απελευθερώνονται λιπαρά οξέα τα οποία, ιδιαίτερα τα χαμηλομοριακά, θεωρούνται σημαντικά γευστικά συστατικά για πολλά είδη τυριών. Σε πολλές περιπτώσεις προκειμένου να αυξηθεί η γεύση και το άρωμα των τυριών και να επιταχυνθεί η ωρίμαση προστίθενται στο γάλα της τυροκόμησης πέραν της πυτιάς και διάφορα άλλα ενζυμικά προϊόντα. Όμως, πρέπει να σημειωθεί ότι η χρήση τους πρέπει να γίνεται με ιδιαίτερη προσοχή. Αν δε συμβεί αυτό, είναι δυνατόν αντί να βελτιώσουν και να υποβαθμίσουν τελικά την ποιότητά τους. Σε κάθε περίπτωση επιβάλλεται η δοκιμαστική χρήση τους για κάθε είδος τυριού. Τα ενζυμικά προϊόντα που χρησιμοποιούνται λαμβάνονται από διάφορες πηγές και περιέχουν πρωτεϊνάσες, πεπτιδάσες, λιπάσες ή μίγματά τους (πίνακας 3.2). Μια δυσκολία, που αντιμετωπίζεται κατά τη χρήση των προϊόντων αυτών στην πράξη, είναι η εξασφάλιση ομοιόμορφης διασποράς τους στη μάζα του τυριού. Εάν προστεθούν στο γάλα, οπότε και επιτυγχάνεται εύκολα η διασπορά τους, το μεγαλύτερο μέρος τους μεταφέρεται στο τυρόγαλα, γεγονός που αυξάνει το κόστος τους, καθώς απαιτούνται μεγαλύτερες ποσότητες, για να επιτευχθεί το επιθυμητό αποτέλεσμα. Πέραν αυτού, το τυρόγαλα που λαμβάνεται περιέχει ενεργά ένζυμα που είναι δυνατόν να περιορίσουν τις χρήσεις του. Η προσθήκη τους στο τυρόπηγμα μαζί με το αλάτι είναι δυνατή μόνο σε τυριά τύπου Cheddar. Όμως, στην περίπτωση αυτή δεν εξασφαλίζεται πάντοτε ομοιόμορφη διασπορά. Για να αποφευχθούν τα προβλήματα αυτά, τα ένζυμα εγκλωβίζονται σε λιποσώματα, τα οποία προστίθενται στο γάλα κατά την τυροκόμηση. Η μέθοδος των λιποσωμάτων, που βρίσκεται ακόμη σε πειραματικό στάδιο, χρησιμοποιεί ως όχημα φωσφολιπίδια τα οποία προστατεύουν τις πρωτεΐνες του γάλακτος από τη δράση των εγκλωβισμένων εξωγενών ενζύμων μέχρι να πιεστεί το τυρί. Στη συνέχεια αυτά απελευθερώνονται και συμβάλλουν στην ωρίμαση των τυριών. Έτσι, αποφεύγονται οι απώλειες σε απόδοση και το πίκρισμα των τυριών, ενώ το τυρόγαλα που παράγεται δεν περιέχει εξωγενή ένζυμα. Πέραν αυτού, τα φωσφολιπίδια είναι ουσίες που υπάρχουν σε υψηλές συγκεντρώσεις σε πολλά τρόφιμα και, κατά συνέπεια, αποδεκτές από διατροφική σκοπιά, ενώ προσφέρονται και για την παραγωγή λιποσωμάτων διάφορων μεγεθών και ευαισθησίας στο ph και στη θερμοκρασία. 176

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία Πίνακας 3.2: Ενζυμικά προϊόντα επιτάχυνσης της ωρίμασης των τυριών και πηγή λήψης τους. Ένζυμα β- γαλακτοσιδάση Maxilact Lactozym Πρωτεϊνάσες Newtrace Maxatase Maxazyme Corolase Prozyme Acid proteinase Λιπάσες Italase Capalase Kid lipase Lamb lipase Palatase 750L Picantase Μίγματα ενζύμων Flavour Age Accelase Πηγή Kluyveromyces lactis Kluyveromyces fragilis Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacillus subtilis Aspergillus sp. Aspergillus sp. Aspergillus oryzae Ήνυστρα αρνιών Ήνυστρα κατσικιών Ήνυστρα κατσικιών Ήνυστρα αρνιών Aspergillus niger Mucor miehei Πρωτεάση και λιπάση του Aspergillus oryzae Πρωτεάση και λιπάση Πρωτεϊνάσες Χρησιμοποιούνται παράλληλα με την πυτιά για την επιτάχυνση της ωρίμασης των τυριών. Προκαλούν αυξημένη πρωτεόλυση που συχνά συνοδεύεται από πικρή γεύση, ενώ μειώνουν τη σκληρότητα των τυριών και την απόδοση. Η πικρή γεύση αποδίδεται στην ανισορροπία μεταξύ των αρωματικών ουσιών του τυριού που προκαλεί η αυξημένη πρωτεόλυση από τη χρήση των πρωτεϊνασών. Καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται από τη χρήση μιγμάτων πρωτεϊνασών και πεπτιδασών από επιλεγμένους μικροοργανισμούς τα οποία περιέχουν και λιπάση. 177

3 κεφάλαιο Λιπάσες Πριν από το δεύτερο παγκόσμιο πόλεμο οι πυτιές σε μορφή πάστας είχαν ευρεία χρήση στην παρασκευή Ιταλικών τυριών με πικάντικη γεύση. Οι πυτιές αυτές παρασκευάζονταν με χρήση ολόκληρου του ηνύστρου ιστοί και περιεχόμενό τους νεαρών μοσχαριών, κατσικιών και αρνιών και περιείχαν τόσο ένζυμα πήξης του γάλακτος όσο και λιπολυτικά που βοηθούσαν στην ανάπτυξη της χαρακτηριστικής γεύσης και αρώματος στα τυριά. Αργότερα τα προϊόντα αυτά κρίθηκαν από πολλές χώρες ακατάλληλα για τυροκόμηση, γεγονός που οδήγησε στην αναζήτηση υποκατάστατών τους, προκειμένου να αναπτυχθεί η χαρακτηριστική πικάντικη γεύση που εξασφαλίζονταν με τις πάστες. Σήμερα χρησιμοποιούν για το σκοπό αυτό λιπάσες, ένζυμα που καταλύουν την υδρόλυση του λίπους και δίδουν ελεύθερα λιπαρά οξέα, τα οποία θεωρούνται ότι δίδουν τα τυπικά γευστικά χαρακτηριστικά σε πολλά γαλακτοκομικά προϊόντα. Τα ελεύθερα λιπαρά οξέα, ιδιαίτερα αυτά με άτομα άνθρακα <12, θεωρούνται υπεύθυνα για τη δριμεία πικάντικη γεύση των τυριών. Ενδιαφέρον έχει και η σχέση μεταξύ των διάφορων λιπαρών οξέων. Για παράδειγμα, καλό τυπικό άρωμα στο ώριμο Provolone αποκτάται όταν η σχέση C 4 /C 6 είναι 2.5/4.0. Η βασική αντίδραση που καταλύουν οι λιπάσες είναι: Τριγλυκερίδια + Η 2 Ο Λιπάση ιγλυκερίδια + Ελεύθερα λιπαρά οξέα Ανάλογα με την προέλευσή τους οι λιπάσες διακρίνονται σε ζωικές και μικροβιακές. Ζωικές λιπάσες Λαμβάνονται από ζωικούς ιστούς. Οι πιο σημαντικές πηγές τους είναι το πάγκρεας βοοειδών και χοίρων παγκρεατικές λιπάσες και οι προγαστρικοί ιστοί νεαρών κατσικιών, αρνιών και μοσχαριών προγαστρικές λιπάσες. Αυτές που χρησιμοποιούνται ευρύτερα στην τυροκομία είναι οι προγαστρικές λιπάσες^ γι αυτό και γίνεται στη συνέχεια εκτενής αναφορά σ αυτές. Χαρακτηριστικό των προγαστρικών λιπασών που παρουσιάζει τυροκομικό ενδιαφέρον και τις διακρίνει από τις άλλες λιπάσες είναι η εξειδίκευσή τους να υδρολύουν στα τριγλυκερίδια δεσμούς λιπαρών 178

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία οξέων μικρού μοριακού βάρους κατά προτίμηση στις θέσεις 1 και 3. Οι περισσότερες από τις άλλες λιπάσες ή δε δείχνουν καμία εξειδίκευση ή ελευθερώνουν κατά προτίμηση λιπαρά οξέα με μακρά άλυσο ατόμων άνθρακα. Για παράδειγμα, η προγαστρική λίπαση αιγών ελευθερώνει λιπαρά οξέα με αριθμό ατόμων C 10 σε ποσοστό 69% και με άτομα C 12 σε ποσοστό 31% ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τη μικροβιακή λιπάση ήταν 21% και 79%, αντίστοιχα. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία για το άρωμα και τη γεύση των τυριών. Η διαφορετική εξειδίκευση των λιπασών στην υδρόλυση του λίπους οδηγεί σε διαφορετικά αποτελέσματα κατά τη χρήση τους, γεγονός που επιβάλλει την επιλογή του ενδεδειγμένου κατά περίπτωση ενζύμου. Για παράδειγμα, η κατσικίσια και αρνίσια λιπάση, ιδιαίτερα η πρώτη, συνιστούνται σε περιπτώσεις τυριών με δριμεία γεύση, όπως το Romano, το Provolone και η πικάντικη Φέτα, ενώ η λιπάση από μοσχάρια προσφέρεται περισσότερο για τυριά με πιο ήπια γεύση, όπως είναι η Mozzarella (πίνακας 3.3). Οι προγαστρικές λιπάσες διατίθενται στο εμπόριο σε μορφή σκόνης και πάστας. Τα ένζυμα αυτά υπάρχουν και στις πυτιές εμπορίου που διατίθενται σε μορφή πάστας και χρησιμοποιούνται παραδοσιακά στην παρασκευή ορισμένων τύπων Ιταλικών τυριών. Οι πάστες αυτές παρασκευάζονται είτε με χρήση ολόκληρου του ηνύστρου νεαρών μοσχαριών με παραδοσιακή συνήθως μεθοδολογία είτε με ανάμειξη προγαστρικής λιπάσης, υγρής πυτιάς και άλλων συστατικών. Στην πρώτη περίπτωση εξαιτίας του τρόπου παρασκευής της πάστας λαμβάνονται προϊόντα με χαμηλή μικροβιακή ποιότητα και πηκτική και λιπασική δύναμη που κυμαίνεται. Αντίθετα, τα προϊόντα που λαμβάνονται στη δεύτερη περίπτωση έχουν εξαιρετική μικροβιακή ποιότητα και τυποποιημένη πηκτική και λιπασική δράση. Σημειώνεται ότι, πέραν από τις πάστες πυτιάς με προγαστρικές λιπάσες, στο εμπόριο κυκλοφορούν ανάλογα προϊόντα με μικροβιακές λιπάσες. Πίνακας 3.3: Λιπάσες που χρησιμοποιούνται στην παρασκευή των τυριών Provolone, Romano, Mozzarella, Parmesan και Φέτα. Provolone Romano Mozzarella Parmezana Φέτα Τυριά Λιπάσες Κατσικίσια ή κατσικίσια με μοσχαρίσια Κατσικίσια και αρνίσια Μοσχαρίσια ή κατσικίσια Μοσχαρίσια Κατσικίσια και αρνίσια 179

3 κεφάλαιο Μικροβιακές λιπάσες Λαμβάνονται από βακτήρια, ζύμες και μύκητες, μέσω ζυμώσεων. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για το σκοπό αυτό είναι, κατά κύριο λόγο, στελέχη των Mucor miehei, Rhizopus arrhizus, Aspergillus niger και Aspergillus oryzae. Στο εμπόριο κυκλοφορούν διάφορα ενζυμικά προϊόντα με λιπάσες μικροβιακής προέλευσης που χρησιμοποιούνται στην τυροκομία, όπως Piccantase (προϊόν ζύμωσης από Mucor Miehei), Lipase S (Rhizopus arrhizus), Palatase A (Aspergillus niger), Palatase M (Mucor miehei) και Lipase AP (Aspergillus niger). Οι μικροβιακές λιπάσες παρουσιάζουν εξειδικευμένη δράση στις θέσεις 1 και 3 των τριγλυκεριδίων και πολύ περιορισμένη στη θέση 2, ενώ υδρολύουν κατά προτίμηση δεσμούς λιπαρών οξέων μεγάλου μοριακού βάρους. Έχουν άριστο ph δράσης μεταξύ 5 και 9 και οι περισσότερες άριστη θερμοκρασία δράσης γύρω στους 45 ο C. Η χρήση λιπασών στην τυροκομία Οι λιπάσες προστίθενται στο γάλα της τυροκόμησης συνήθως μετά την καλλιέργεια και λίγο πριν από την προσθήκη της πυτιάς. Συνιστάται να ζυγίζεται με ακρίβεια η επιθυμητή κάθε φορά ποσότητα ενζύμου, να διασκορπίζεται σε εικοσαπλάσιο περίπου όγκο κρύου νερού, να αναδεύεται κατά διαστήματα για 15 λεπτά περίπου και στη συνέχεια να προστίθεται στο γάλα της τυροκόμησης. Από τον τύπο του τυριού που παρασκευάζεται, την επιδιωκόμενη ένταση στη γεύση και τον επιθυμητό χρόνο ωρίμασης προσδιορίζεται η ποσότητα και το είδος της λιπάσης που προστίθεται. Σε ό,τι αφορά την ποσότητα αυτή κυμαίνεται από 3 έως 30 g ανά 100 kg γάλακτος, συνήθως 10-15 g/100 kg γάλακτος. Σε κάθε περίπτωση συνιστάται να ακολουθούνται οι οδηγίες του παρασκευαστή του προϊόντος. Εκτός από τη χρήση τους στην παρασκευή των τυριών, οι λιπάσες χρησιμοποιούνται και στην παραγωγή τροποποιημένων με ένζυμα συστατικών από γάλα (Enzyme Modified Dairy Ingredients), ή τυριών (Enzyme Modified Cheeses) τα οποία στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για την παραγωγή διάφορων προϊόντων. Εκτενής αναφορά σε αυτά γίνεται σε άλλο κεφάλαιο. 180

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία Ένζυμα Προστασίας από Βουτυρική Ζύμωση Τα σκληρά και ημίσκληρα τυριά, που παρασκευάζονται από γάλα με μεγάλο αριθμό σπορίων βακτηρίων βουτυρικής ζύμωσης, εμφανίζουν συχνά φούσκωμα μετά από 1-2 μηνών ωρίμαση. Το ίδιο πρόβλημα αντιμετωπίζεται και στα ανακατεργασμένα τυριά, σε περιπτώσεις παρασκευής τους από πρώτη ύλη που έχει υποστεί βουτυρική ζύμωση. Για αντιμετώπιση του προβλήματος, μεταξύ άλλων, συνιστάται η προσθήκη στο γάλα της τυροκόμησης του ενζύμου λυσοζύμη και στην περίπτωση των ανακατεργασμένων τυριών της νισίνης, στα οποία γίνεται εκτενής αναφορά στο κεφάλαιο για τα πρόσθετα. Ένζυμα Καταστροφής του Υπεροξειδίου του Υδρογόνου Για τη συντήρηση του γάλακτος σε θερμές περιοχές και σε εκμεταλλεύσεις που δε διαθέτουν ψύξη χρησιμοποιείται πολλές φορές το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Όμως, μετά τη βακτηριοκτόνο δράση του, ένα μέρος του παραμένει αδιάσπαστο στο γάλα το οποίο είναι δυνατόν να δημιουργήσει προβλήματα κατά την τυροκόμησή του, καθώς επιδρά δυσμενώς επί των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Για να αποφευχθούν τα προβλήματα αυτά, προστίθεται στο γάλα της τυροκόμησης, στην περίπτωση αυτή, το ένζυμο καταλάση, το οποίο διασπά το υπεροξείδιο. Είναι γεγονός ότι ακόμα και μετά την πλήρη εξάλειψη του Η 2 Ο 2 έχουμε δυσμενές περιβάλλον για την ανάπτυξη των οξυγαλακτικών μικροοργανισμών για μια ώρα ακόμη. Στη συνέχεια ο πολλαπλασιασμός τους είναι κανονικός. Αυτό πρέπει να λαμβάνεται υπόψη και να παρατείνεται ο χρόνος επώασης των οξυγαλακτικών καλλιεργειών. Βιβλιογραφία Ανυφαντάκης, Ε. Μ. (1976). Συμβολή εις την μελέτη της λαμβανόμενης εξ ηνύστρων αμνών και εριφίων πυτιάς. ιατριβή επί υφηγεσία. Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Ανυφαντάκης Ε. Μ. & Ι. Γ. Κανδαράκης (1983). Αξιολόγηση της πυτιάς 50/50 για την παρασκευή τυριού φέτα από αγελαδινό γάλα. Γεωπονικά 298, 187-160. 181

3 κεφάλαιο Ανυφαντάκης, Ε. Μ. (1993). Τυροκομία, σελ. 30-52. Εκδόσεις Σταμούλη. Αθήνα. Ανυφαντάκης, Ε. Μ. (1998). Ελληνικά τυριά. Μία παράδοση αιώνων. Εθνική Επιτροπή Γάλακτος Ελλάδος. Βεϊνόγλου, Β. Κ. και Ανυφαντάκης Ε. Μ. (1981). Γαλακτοκομία, τόμος Β, σελ. 139-165. Εκδόσεις Καραμπερόπουλος, Αθήνα. Ζερφυρίδης, Γ. Κ. (2001). Τεχνολογία Προϊόντων Γάλακτος, Τυροκομία, σελ. 70-84. Εκδόσεις Γιαχούδη-Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη. Alichanidis E., E. M. Anifantakis, A. Polychroniadou & M. Nanou (1984). Suitability of some mocrobial coagulants for Feta cheese manufacture. Journal of Dairy Research 51, 146-147. Andrén, A. (1993). Characterization of bovine rennets with regard to composition and strength. Bulletin 284, pp. 16-17. I.D.F., Brussels. Andrén, A. (1998). Milk clotting activity of various rennets and coagulants. I.D.F. Bulletin 332, pp. 8-14. I.D.F., Brussels. Anifantakis E. M. & J. G. Kandarakis (1983). Utilisation de la pepsine bovine en fabrication de fromage Feta fait a partir du lait de brebis. Le Lait 63, 416-124. Anifantakis E. M. (1976). Influence d une pressure d agneau sur le qualite du fromage kefalotyri. Le Lait No 551-552, 76-83. Birschbach, P. (1994). Origins of lipases and their characteristics. I.D.F. Bulletin 294, pp. 7-10. I.D.F., Brussels. Buch Kristensen, J. M. B. (1999). Cheese technology A Northern European approach, pp. 63. International Dairy Books, Aarhus. Choisy, C., Desmazeaud, M., Gripon, J.C., Lamberet, G. and Lenoir, J. (2000). The biochemistry of ripening. In Cheesemaking from science to quality, 2 nd edition, pp. 82-143. A. Eck & J. - C. Gillis. Lavoisier publishing, Paris, France. Collin, J.- C., Repelius C., Harboe, M. K. (2003). Detection of Fermentation- Produced Chymosin (FPC) in Rennet. I.D.F. Bulletin No 380. I.D.F., Brussels. Corradini, C. and Neviani, E. (1994). Determination of lipolytic action in cheese. I.D.F. Bulletin 294, pp. 17-18. I.D.F., Brussels. Davis, J.G. (1965). Basic technology, Vol I, pp. 262-276. J. and A. Churchill Ltd, London. Eck, A. and Gillis, J. - C. (2000). Cheesemaking, from science to quality assurance, second edition, pp. 155-163. Lavoisier Publishing, Paris. 182

Ένζυμα που Χρησιμοποιούνται στην Τυροκομία El soda, M. (1997). Control and enhancement of flavour in cheese. In Microbiology and biochemistry of cheese and fermented milk, 2 nd edition, pp. 219-252. Edr B.A. Law, Blackie Academic and Professional, London. Harboe, M. K. (1994). Use of lipases in cheesemaking. I.D.F. Bulletin 294, pp. 11-16. I.D.F., Brussels. Ιnternational Dairy Federation, (1998). The Use of Enzymes in Dairying. I.D.F. Bulletin No 332. I.D.F., Brussels. Ιnternational Dairy Federation, (2002). Use of enzyme preparations in cheesemaking (other than rennet). I.D.F. Bulletin No 371. I.D.F., Brussels. Law, B.A. (2000). Technology of cheese ripening, pp. 163-192. Sheffield Academic Press, Canada. Roos de, A. L., Geurts, T. J. and Walstra, P. (1998). On the mechanism of rennet retention in cheese. I.D.F. Bulletin 332, pp. 20-24. I.D.F., Brussels. Salvador del Prato, O. (1998). Trattato di technologia casearia, pp. 147-194. Edagricole, Bologna, Italy. Siezen, R. J. and Van der Berg, G. (1994). Lipases and their action on milk fat. I.D.F. Bulletin 294, pp. 4-6. I.D.F., Brussels. Visser, S. (1998). Enzymatic breakdown of milk proteins during cheese ripening. I.D.F. Bulletin 332, pp. 20-24. I.D.F., Brussels. 183