ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ LC-ESI-QTOF-MS/MS ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗΣ ΣΕ ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ LC-ESI-QTOF-MS/MS ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗΣ ΣΕ ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΝΑΡΓΥΡΟΣ ΦΟΙΒΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ Ε.Κ.Π.Α ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΘΗΝΑ 2015

Η έγκριση διατριβής ειδίκευσης από το Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. (Ν. 5343/1932, άρθρο 202)

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΠΑΝΤΕΡΗ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΕΚΠΑ Ε. ΓΚΙΚΑΣ Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ Ι. ΝΤΟΤΣΙΚΑΣ Επίκουρος Καθηγητής ΕΚΠΑ (Επιβλέπων)

ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε σε συνεργαζόμενο εργαστήριο του επίκουρου καθηγητή κ. Ιωάννη Ντότσικα, του Τομέα Φαρμακευτικής Χημείας, του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών Φαρμακευτική Ανάλυση-Έλεγχος ποιότητας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Ιωάννη Ντότσικα για την ανάθεση του θέματος, καθώς επίσης και για το αμείωτο ενδιαφέρον και την άψογη συνεργασία που είχαμε καθ όλη τη διάρκεια της δεδομένης προσπάθειας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής που συνέβαλλαν στη διόρθωση και βελτίωση της παρούσας εργασίας.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...1 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...5 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο Η ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ 1.1 Εισαγωγή...6 1.2 Αρχή μεθόδου...7 1.3 Συστήματα εισαγωγής δείγματος...8 1.3.1 Σύστημα μεμονωμένης εισαγωγής μέσω διαφράγματος 9 1.3.2 Σύστημα άμεσης εισαγωγής με δειγματολήπτη 9 1.3.3 Σύστημα χρωματογραφικής εισαγωγής 10 1.4 Τεχνικές Ιοντισμού...11 1.4.1 Ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων...13 1.4.2 Χημικός ιοντισμός...14 1.4.3 Ιοντισμός πεδίου...16 1.4.4 Ιοντισμός πεδίου με εκρόφηση...16 1.4.5 Ιοντισμός βομβαρδισμού με ταχέως κινούμενα άτομα...17 1.4.6 Ιοντισμός εκρόφησης με λέιζερ υποβοηθούμενος από τη μήτρα...18 1.4.7 Χημικός ιοντισμός σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης...20 1.4.8 Ιοντισμός με δέσμη φωτονίων σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης...20 1.4.9 Ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό...21 1.5 Αναλυτές μάζας...22 1.5.1 Αναλυτής μαγνητικού τομέα...27 1.5.2 Αναλυτής κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντος με μετασχηματισμό Fourier...28 1.5.3 Αναλυτής χρόνου πτήσης...30 1.5.4 Ηλεκτροστατική παγίδα...32 1.5.5 Τετραπολικός αναλυτής μάζας...33 1.5.6 Παγίδες ιόντων...35 1.5.6.1 Τετραπολική παγίδα ιόντων...35 1.5.6.2 Γραμμική παγίδα ιόντων...36 1.6 Ανιχνευτές ιόντων...38 1.7 Συζευγμένη φασματομετρία μάζας...40 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο Η ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗ ΩΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΓΛΑΥΚΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΙΚΤΗΣ ΓΩΝΙΑΣ 2.1 Συνοπτική παράθεση της φυσιολογίας του οφθαλμικού βολβού...44 2.2 Ορισμός και κατάταξη των μορφών του γλαυκώματος...47 1

2.3 Παθοφυσιολογία, διάγνωση και θεραπευτική αντιμετώπιση του πρωτοπαθούς γλαυκώματος ανοικτής γωνίας...47 2.4 Η βρινζολαμίδη ως αναστολέας της καρβονικής ανυδράσης...50 2.5 Φαρμακοδυναμικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες της βρινζολαμίδης...53 2.6 Θεραπευτικές ενδείξεις, αντενδείξεις και προφυλάξεις κατά τη θεραπεία με βρινζολαμίδη...55 2.7 Τοξικολογικό προφίλ και ανεπιθύμητες ενέργειες κατά τη θεραπεία με βρινζολαμίδη...57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ 3.1 Εισαγωγή...59 3.2 Περιγραφή της δειγματοληπτικής πορείας που ακολουθείται στις ξηραμένες κηλίδες αίματος...61 3.3 Παράγοντες που επηρεάζουν τα ποσοτικά αποτελέσματα της ανάλυσης των ξηραμένων κηλίδων αίματος...66 3.4 Περιορισμοί που σχετίζονται με τη χρήση των ξηραμένων κηλίδων αίματος...69 3.5 Εφαρμογές των ξηραμένων κηλίδων αίματος...71 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 4.1 Σύστημα υγροχρωματογραφίας συζευγμένο με φασματομετρία μάζας (LC-QTOF-MS)...75 4.2 Αναλυτικός ζυγός...76 4.3 Αναλυτικές πιπέτες...76 4.4 Διηθητικός χάρτης...76 4.5 Συστήματα διάτρησης διηθητικού χάρτη...76 4.6 Ανακίνηση-Ανάμιξη...76 4.7 Διαλύτες-Αναλυτικές στήλες...77 4.8 Πρότυπες ουσίες...77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗΣ ΜΕ ΔΙΔΥΜΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗΣ ΣΕ ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ 5.1 Εισαγωγή...78 5.2 Επιλογή εσωτερικού προτύπου...78 5.3 Παρασκευή διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάπτυξη και επικύρωση της βιοαναλυτικής μεθόδου...80 5.3.1 Παρασκευή διαλυμάτων παρακαταθήκης...80 2

5.3.2 Παρασκευή διαλυμάτων εργασίας...80 5.3.3 Παρασκευή διαλύματος εξωτερικής βαθμονόμησης φασματόμετρου μάζας...81 5.3.4 Παρασκευή διαλυμάτων για τη ρύθμιση των παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας...81 5.3.5 Παρασκευή διαλύτη εκχύλισης...82 5.4 Παρασκευή εμβολιασμένων ξηραμένων κηλίδων αίματος που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάπτυξη και επικύρωση της βιοαναλυτικής μεθόδου...82 5.4.1 Παρασκευή προτύπων βαθμονόμησης...82 5.4.2 Παρασκευή δειγμάτων επικύρωσης μεθόδου...83 5.4.3 Παρασκευή δειγμάτων ελέγχου σταθερότητας...84 5.4.4 Παρασκευή δειγμάτων ελέγχου ακεραιότητας αραίωσης δείγματος...84 5.5 Ρύθμιση των παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας...85 5.6 Εύρεση των προδρόμων και θυγατρικών ιόντων...88 5.7 Προσδιορισμός χρωματογραφικών συνθηκών...93 5.8 Προσδιορισμός διαδικασίας εκχύλισης...98 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗΣ ΜΕ ΔΙΔΥΜΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗΣ ΣΕ ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ 6.1 Εισαγωγή...101 6.2 Αξιολόγηση εκλεκτικότητας βιοαναλυτικής μεθόδου...102 6.3 Αξιολόγηση καμπύλης βαθμονόμησης βιοαναλυτικής μεθόδου...106 6.3.1 Αξιολόγηση συσχέτισης των μεταβλητών x και y...107 6.3.2 Μελέτη της ομοσκεδαστικότητας του γραμμικού μοντέλου...110 6.3.3 Επιλογή του καταλληλότερου παράγοντα ζύγισης...113 6.4 Αξιολόγηση μόλυνσης εκ μεταφοράς βιοαναλυτικής μεθόδου...120 6.5 Αξιολόγηση ακρίβειας βιοαναλυτικής μεθόδου...122 6.6 Αξιολόγηση πιστότητας βιοαναλυτικής μεθόδου...131 6.7 Κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης βιοαναλυτικής μεθόδου...134 6.8 Αξιολόγηση ακεραιότητας αραίωσης δείγματος βιοαναλυτικής μεθόδου...135 6.9 Αξιολόγηση σταθερότητας αναλύτη...137 6.10.1 Αξιολόγηση βραχύχρονης και μακρόχρονης σταθερότητας αναλύτη στο βιολογικό υλικό...138 6.10.2 Αξιολόγηση σταθερότητας αναλύτη στα διαλύματα παρακαταθήκης και εργασίας...141 6.11 Αξιολόγηση ανάκτησης αναλύτη από το μητρικό υλικό...142 6.12 Αξιολόγηση επίδρασης μητρικού υλικού...145 6.13 Αξιολόγηση ομοιογένειας ξηραμένης κηλίδας αίματος...148 3

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗ ΔΙΟΡΘΩΣΗΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΡΡΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΚΡΙΤΗ ΣΤΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ 7.1 Υπολογισμός συντελεστή διόρθωσης...150 7.2 Εφαρμογή συντελεστή διόρθωσης σε πραγματικό δείγμα...154 7.3 Αλγόριθμος υπολογισμού εμβαδού ξηραμένης κηλίδας αίματος...156 7.4 Πορεία παρασκευής αίματος διαφορετικών τιμών αιματοκρίτη...157 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...159 SUMMARY...161 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...162 4

ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος (Dried Blood Spots/DBS) αποτελούν μια πολλά υποσχόμενη τεχνική δειγματοληψίας η οποία γνωρίζει ευρεία εφαρμογή στα πλαίσια του νεογνικού ελέγχου και της πληθυσμιακής παρακολούθησης νοσημάτων. Την τελευταία δεκαετία, η επιστημονική κοινότητα έχει εκδηλώσει θερμό ενδιαφέρον για τη διερεύνηση των εφαρμογών της προαναφερθείσας τεχνικής κυρίως στο χώρο των φαρμακοκινητικών και τοξικοκινητικών μελετών. Η υιοθέτηση των ξηραμένων κηλίδων αίματος στις δεδομένες μελέτες υπόσχεται τη μείωση των χρησιμοποιούμενων πειραματόζωων, λόγω της ελάχιστης ποσότητας αίματος που συλλέγεται όπως επίσης και τη μείωση του κόστους αποθήκευσης και μεταφοράς δειγμάτων, λόγω των απλούστερων συνθηκών φύλαξης που απαιτούνται. Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε η ανάπτυξη και επικύρωση μιας βιοαναλυτικής μεθόδου για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βρινζολαμίδης σε ξηραμένες κηλίδες αίματος. Η βρινζολαμίδη αποτελεί έναν εκλεκτικό αναστολέα της καρβονικής ανυδράσης ΙΙ που χρησιμοποιείται για τη μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης σε ασθενείς που πάσχουν από γλαύκωμα ανοικτής γωνίας ή εμφανίζουν εμμένουσα ενδοφθάλμια υπέρταση. Η βρινζολαμίδη εφαρμόζεται τοπικά στον οφθαλμό, συνήθως με τη μορφή εναιωρήματος και ακολούθως απορροφάται στη συστηματική κυκλοφορία εκδηλώνοντας έναν παρατεταμένο χρόνο ημιζωής ίσο με 111 ημέρες. Πιο συγκεκριμένα, η βρινζολαμίδη κατανέμεται σχεδόν αποκλειστικά στα ερυθροκύτταρα λόγω σύνδεσης με την ερυθροκυτταρική καρβονική ανυδράση ΙΙ με αποτέλεσμα ο προσδιορισμός της στο πλάσμα να καθίσταται αρκετά δύσκολος. Με τον τρόπο αυτό, η ανάλυση ολικού αίματος αποτελεί μάλλον μονόδρομο για την εξαγωγή των διαφόρων φαρμακοκινητικών δεδομένων τόσο για τη βρινζολαμίδη, όσο και για το σύνολο των φαρμάκων που κατανέμονται εκτενώς στα έμμορφα συστατικά του αίματος. Η ανάλυση ξηραμένων κηλίδων αίματος αποτελεί ένα ιδιαίτερο είδος ανάλυσης ολικού αίματος που διατηρεί αρκετά πλεονεκτήματα λόγω της στέρεας φύσης των αναλυόμενων δειγμάτων. Η αναπτυσσόμενη βιοαναλυτική μέθοδος βασίστηκε στη συζευγμένη αναλυτική τεχνική της υγροχρωματογραφίας-δίδυμης φασματομετρίας μάζας, ενώ η επικύρωσή της πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες του ΕΜΑ και του FDA. Πέρα από τα κλασικά χαρακτηριστικά αναλυτικής επίδοσης, αξιολογήθηκαν ορισμένα χαρακτηριστικά που αφορούν τις ξηραμένες κηλίδες αίματος όπως είναι η ομοιογένεια κηλίδας και η επίδραση αιματοκρίτη. 5

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο Η ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ 1.1 Εισαγωγή Η φασματομετρία μάζας (1) (Mass Spectrometry/MS) αποτελεί μια από τις σημαντικότερες και ταχύτερα αναπτυσσόμενες αναλυτικές τεχνικές που διαθέτει η σύγχρονη επιστημονική κοινότητα. Η δεδομένη αναλυτική τεχνική παρέχει ποιοτικά και ποσοτικά δεδομένα στα πλαίσια τόσο της οργανικής όσο και της ανόργανης ανάλυσης, βρίσκοντας ευρεία εφαρμογή στη χημεία, τη βιολογία, τις βιοϊατρικές επιστήμες και την επιστήμη υλικών. Πιο συγκεκριμένα, η φασματομετρία μάζας χρησιμοποιείται επιτυχώς στη διασαφήνιση της μοριακής δομής ποικίλων αναλυτών, στην ποιοτική και ποσοτική ανάλυση εξαιρετικά πολύπλοκων μιγμάτων και στον προσδιορισμό διαφόρων φυσικοχημικών ιδιοτήτων της ύλης. Ενδογενή χαρακτηριστικά της παρούσας τεχνικής αποτελούν η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, που βελτιώνονται συνεχώς με την εισαγωγή καινοτόμου οργανολογίας. Ιστορικά, η απαρχή της φασματομετρίας μάζας εντοπίζεται στην ερευνητική δραστηριότητα που έλαβε χώρα στις αρχές του 20 ου αιώνα από τους φυσικούς J.J.Thomson (2) (1912), A.J. Dempster (3) (1918), F.W. Aston (4) (1919). Αν και από τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης της δεδομένης τεχνικής προτάθηκε η εφαρμογή της στα πλαίσια της χημικής ανάλυσης, αυτό κατέστη τελικά πραγματικότητα αρκετές δεκαετίες αργότερα. Αρχικά η φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της σχετικής αφθονίας ορισμένων αέριων ισοτόπων και τον υπολογισμό της ακριβής τους μάζας. Το εγχείρημα αυτό συνέβαλε τόσο σε αρκετές ανακαλύψεις στο χώρο των φυσικών επιστημών όσο και στην αναγνώριση της αναλυτικής αξίας της τεχνικής. Για πρώτη φορά, τη δεκαετία του 1940, η φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε αμιγώς ως αναλυτική τεχνική για τον προσδιορισμό υδρογονανθράκων σε πετρελαϊκά κλάσματα. Η ευρεία υιοθέτηση της φασματομετρίας μάζας από τη βιομηχανία πετρελαίου έδωσε το έναυσμα για την παραγωγή τεχνικά βελτιωμένης και αξιόπιστης οργανολογίας η οποία έγινε σταδιακά εμπορικά διαθέσιμη σε πολλούς άλλους κλάδους ενθαρρύνοντας την αποδοχή της τεχνικής από την επιστημονική κοινότητα. Στις επόμενες δεκαετίες, η διασύνδεση της φασματομετρίας μάζας με διάφορες αναλυτικές τεχνικές διαχωρισμού όπως η αεριοχρωματογραφία, η υγροχρωματογραφία και η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση, επέτρεψε τον προσδιορισμό ενός μεγάλου εύρους αναλυτών αυξάνοντας εκθετικά τις εφαρμογές της τεχνικής. 1.2 Αρχή μεθόδου (5) Με τον όρο φασματομετρία μάζας αναφερόμαστε στην αναλυτική τεχνική που βασίζεται στην παραγωγή, το διαχωρισμό και την ακόλουθη καταγραφή ιόντων αέριας κατάστασης. Θεμέλιο αναλυτικό μέγεθος της δεδομένης τεχνικής βάσει του οποίου πραγματοποιείται ο διαχωρισμός των παραγόμενων αέριων ιόντων και κατ επέκταση παρέχονται τα διάφορα ποσοτικά και ποιοτικά δεδομένα είναι ο λόγος μάζα προς φορτίο (m/z). Πιο συγκεκριμένα, 6

στον παραπάνω λόγο, ως μονάδα μάζας χρησιμοποιείται η ενιαία μονάδα ατομικής μάζας (unified atomic mass unit/amu/u ή Dalton/Da) η οποία ορίζεται ως το 1/12 της μάζας του ισοτόπου 12 C. Αντίθετα, ως μονάδα φορτίου χρησιμοποιείται η θεμελιώδης μονάδα ηλεκτρικού φορτίου που αντιστοιχεί στο μέτρο του φορτίου που φέρει το ηλεκτρόνιο και παίρνει μόνο ακέραιες τιμές. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα παραγόμενα αέρια ιόντα φέρουν ένα φορτίο με αποτέλεσμα ο μετρούμενος λόγος m/z να ισούται αριθμητικά με τη μοριακή μάζα του ιόντος εκφρασμένη σε amu ή Da. Πρόσφατα, έχει γίνει προσπάθεια για την υιοθέτηση του όρου Thomson (Th) ως ενιαία μονάδα του λόγου m/z προκειμένου να απλοποιηθούν εφαρμογές που εξετάζουν πολλαπλά φορτισμένα ιόντα. Το τελικό αποτέλεσμα μιας φασματομετρικής ανάλυσης είναι η λήψη ενός γραφήματος που ονομάζεται φάσμα μάζας (mass spectrum). Το δεδομένο φάσμα απεικονίζει τη σχετική αφθονία των παραγόμενων ιόντων συναρτήσει του λόγου m/z (Σχήμα 1.1). Πιο συγκεκριμένα, η κορυφή που αντιστοιχεί στο ιόν με τη μεγαλύτερη αφθονία ονομάζεται βασική κορυφή (base peak) και λαμβάνει αυθαίρετα τιμή σχετικής αφθονίας 100 % ενώ οι λοιπές κορυφές λαμβάνουν τιμές σχετικής αφθονίας που αντιστοιχούν στην εκατοστιαία αναλογία τους, συγκριτικά με τη βασική κορυφή. Τόσο η τιμή του λόγου m/z των προκυπτόντων ιόντων, όσο και η σχετική τους αφθονία αποτελούν τη βάση των ποιοτικών και ποσοτικών δεδομένων που παρέχει στο σύνολο της η φασματομετρία μάζας. Όπως θα δούμε και στη συνέχεια, με τη βοήθεια διαφόρων φασματομετρικών τεχνικών μπορούμε να εξάγουμε αναλυτική πληροφορία συγκεκριμένης φύσης και έκτασης. Σχήμα 1.1 Φάσμα μάζας ακετοφαινόνης. Παρατηρώντας τα διάφορα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά τη διάρκεια ενός φασματομετρικού κύκλου μπορούμε να συμπεράνουμε την ύπαρξη τριών κύριων και διακριτών σταδίων. Το πρώτο στάδιο κάθε φασματομετρικής ανάλυσης δεν είναι άλλο από την παραγωγή αέριων ιόντων από το αναλυόμενο δείγμα. Η διαδικασία μετατροπής των προσδιοριζόμενων αναλυτών σε αέρια ιόντα ονομάζεται τεχνική ιοντισμού (ionization technique) και πραγματοποιείται σε μια οργανολογική μονάδα που ονομάζεται πηγή ιόντων (ion source). Ανάλογα με την φυσική κατάσταση του αναλυόμενου δείγματος, καθώς επίσης και τις διάφορες φυσικοχημικές ιδιότητες των προσδιοριζόμενων αναλυτών, επιλέγεται κατάλληλη τεχνική ιοντισμού. Αξίζει να σημειωθεί ότι ένα από τα σημαντικότερα 7

πεδία έρευνας και ανάπτυξης στο χώρο της φασματομετρίας μάζας είναι η εύρεση νέων τεχνικών ιοντισμού που θα επιτρέψουν την αύξηση των αναλυτών που μπορεί να προσδιορίσει η δεδομένη τεχνική. Στη συνέχεια, τα παραγόμενα ιόντα με τη μεσολάβηση ηλεκτρικών πεδίων και υψηλού κενού οδηγούνται σε μια δεύτερη οργανολογική μονάδα που ονομάζεται αναλυτής μάζας (mass analyzer). Ο αναλυτής μάζας με τη βοήθεια ηλεκτρικού ή μαγνητικού πεδίου διαχωρίζει τα ιόντα ανάλογα με το λόγο m/z βασιζόμενος σε διάφορα φυσικά μεγέθη όπως είναι η κινητική ενέργεια, η ορμή και η ταχύτητα. Το δεύτερο αυτό στάδιο της φασματομετρικής ανάλυσης μπορεί να θεωρηθεί ως το σημαντικότερο καθώς προσδιορίζεται εκείνο το αναλυτικό μέγεθος που τελικά μεταφράζεται στα διάφορα ποσοτικά και ποιοτικά δεδομένα. Το τελευταίο στάδιο της δεδομένης διαδικασίας λαμβάνει χώρα σε μια τρίτη οργανολογική μονάδα που ονομάζεται ανιχνευτής ιόντων. Τα διαχωρισμένα πλέον με βάση το λόγο m/z ιόντα προσκρούουν στον ανιχνευτή ιόντων παράγοντας μετρήσιμο ηλεκτρικό ρεύμα σε ένα κύκλωμα ανίχνευσης. Συνολικά οι προαναφερθείσες οργανολογικές μονάδες συγκροτούν το αναλυτικό όργανο που ονομάζεται φασματόμετρο μάζας (mass spectrometer). Παρά τη φαινομενική απλότητα ενός φασματόμετρου μάζας, θα πρέπει να τονιστεί ότι η λειτουργία του βασίζεται σε περίπλοκη και υψηλής τεχνολογίας οργανολογία. Επίσης, όλες οι τεχνολογικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται σήμερα στα σύγχρονα φασματόμετρα μάζας υπόκεινται σε αρκετούς περιορισμούς, υπαγορεύοντας πάντα την ανάγκη για καινοτομία και νεοτερισμό. Θα μπορούσαμε να πούμε ότι ένα φασματόμετρο μάζας αποτελείται από τα ακόλουθα κοινά και διακριτά τμήματα: το σύστημα εισαγωγής δείγματος, την πηγή ιόντων, τον αναλυτή μάζας και τον ανιχνευτή ιόντων (Σχήμα 1.2). Εκτός από αυτά τα συστήματα κάθε φασματόμετρο μάζας περιλαμβάνει συστήματα δημιουργίας υψηλού κενού καθώς και συστήματα παρουσίασης των φασμάτων μάζας όπως καταγραφείς και παλμογράφους. Τα σύγχρονα φασματόμετρα μάζας περιλαμβάνουν ηλεκτρονικό υπολογιστή, τόσο για τον κεντρικό έλεγχο της λειτουργίας τους, όσο και για την ταχεία επεξεργασία, παρουσίαση και ερμηνεία του φάσματος μάζας. Σύστημα εισαγωγής δείγματος Πηγή ιόντων Αναλυτής μάζας Ανιχνεύτης ιόντων Σχήμα 1.2 Οργανολογικά μέρη ενός φασματόμετρου μάζας. 1.3 Συστήματα εισαγωγής δείγματος Ο σκοπός του συστήματος εισαγωγής δείγματος είναι να επιτρέπει την εισαγωγή ενός αντιπροσωπευτικού δείγματος στην πηγή ιοντισμού με ελάχιστη απώλεια κενού και υπό συνθήκες σταθερής ροής. Η επιλογή της μεθόδου εισαγωγής σχετίζεται άμεσα με το δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί. Πιο συγκεκριμένα, εξαρτάται από την πτητικότητα και τη θερμική σταθερότητα του δείγματος, την τεχνική ιοντισμού που έχει επιλεχθεί, καθώς και 8

από την ύπαρξη ανάγκης για διαχωρισμό των συστατικών του δείγματος πριν αναλυθούν. Τα σύγχρονα φασματόμετρα μάζας είναι εφοδιασμένα με μια ποικιλία συστημάτων εισαγωγής, ώστε να δέχονται διαφόρους τύπους δείγματος. 1.3.1 Σύστημα μεμονωμένης εισαγωγής μέσω διαφράγματος (septum inlet) (6) Το δεδομένο σύστημα αποτέλεσε μια από τις πρώτες μεθοδολογίες εισαγωγής δείγματος στα πλαίσια της φασματομετρίας μάζας, επιτρέποντας την εισαγωγή αεριών ή πτητικών υγρών δειγμάτων. Η προαναφερθείσα οργανολογία αποτελείται από μια εξωτερική θερμαινόμενη δεξαμενή και από μια γραμμή μεταφοράς (Σχήμα 1.3). Το αναλυόμενο δείγμα εισάγεται στη δεξαμενή μέσω ενός διαφράγματος με τη βοήθεια μιας σύριγγας. Στη συνέχεια, το δείγμα μεταφέρεται από τη δεξαμενή στην πηγή ιοντισμού μέσω της γραμμής μεταφοράς διατηρώντας πάντα τις συνθήκες υψηλού κενού του φασματόμετρου μάζας. Τόσο η δεξαμενή όσο και η γραμμή μεταφοράς διατηρούνται σε υψηλές σχετικά θερμοκρασίες, ώστε να διασφαλίζεται η εξαέρωση του δείγματος και να αποτρέπεται η συμπύκνωσή του κατά τη διαδρομή προς την πηγή ιοντισμού. Η δεδομένη τεχνική χρησιμοποιείται κυρίως για την εισαγωγή δειγμάτων υψηλής χημικής καθαρότητας ενώ, δεν βρίσκει εφαρμογή σε περιπτώσεις πολύπλοκων αέριων ή υγρών μιγμάτων. Μία από τις λίγες σύγχρονες εφαρμογές της παρούσας τεχνικής είναι η εισαγωγή πρότυπων δειγμάτων στα πλαίσια της διακρίβωσης ενός φασματόμετρου μάζας. Σχήμα 1.3 Σχηματική απεικόνιση septum inlet (1) διάφραγμα εισαγωγής, (2) βαλβίδες, (3) θερμαινόμενη δεξαμενή, (4) γραμμή μεταφοράς. 1.3.2 Σύστημα άμεσης εισαγωγής με δειγματολήπτη (probe inlet) (7) Το δεδομένο σύστημα χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις στερεών ή μη πτητικών υγρών δειγμάτων που διαθέτουν σημεία τήξεως/ζέσεως μικρότερα των 350 400 o C. Πιο συγκεκριμένα, το δείγμα φέρεται σε έναν ειδικό δειγματολήπτη-υποδοχέα, ο οποίος στη συνέχεια εισάγεται στην πηγή ιοντισμού με τη βοήθεια ενός μηχανισμού ο οποίος δεν διακόπτει το κενό του φασματόμετρου μάζας (Σχήμα 1.4). Ανάλογα με την πτητικότητα και το μοριακό βάρος των προσδιοριζόμενων αναλυτών, ο δειγματολήπτης υφίσταται αργή ή ταχεία βαλλιστική θέρμανση επιτρέποντας την επαρκή εξάτμιση του δείγματος. Όσο η πολικότητα και το μοριακό βάρος των προσδιοριζόμενων αναλυτών αυξάνεται, τόσο καθίσταται πιθανότερη η θερμική διάσπαση πριν από την εξαέρωσή τους. Με τον τρόπο αυτό, το προκύπτον φάσμα μάζας είναι περισσότερο ενδεικτικό των προϊόντων πυρόλυσης παρά των μορίων του αναλύτη. Το δεδομένο πρόβλημα μπορεί να λυθεί με τη βοήθεια μιας 9

απλής οργανολογικής τροποποίησης που σχετίζεται με τη χρήση ενός ταχέως θερμαινόμενου δειγματολήπτη. Οι συμβατικοί δειγματολήπτες είναι φτιαγμένοι από γυαλί ή ανοξείδωτο ατσάλι, επιτρέποντας τη βραδεία θέρμανση του δείγματος (της τάξεως του ενός λεπτού) με αποτέλεσμα ο ρυθμός θερμικής διάσπασης να ξεπερνά το ρυθμό εξαέρωσης. Αντίθετα, οι ταχέως θερμαινόμενοι δειγματολήπτες είναι φτιαγμένοι από εξαιρετικούς θερμικούς αγωγούς όπως το βολφράμιο και το ρήνιο, επιτρέποντας την ταχύτατη θέρμανση του δείγματος (< 1 s) με αποτέλεσμα ο ρυθμός εξαέρωσης να είναι πολύ μεγαλύτερος του ρυθμού θερμικής διάσπασης. Σχήμα 1.4 Σχηματική απεικόνιση probe inlet (1) πηγή ιόντων, (2) βαλβίδα κενού, (3) σύστημα διατήρησης κενού, (4) λαβή δειγματολήπτη, (5) υποδοχέας δείγματος, (6) σπείραμα θέρμανσης δείγματος. 1.3.3 Σύστημα χρωματογραφικής εισαγωγής (5) Η σύζευξη της φασματομετρίας μάζας με διάφορες αναλυτικές τεχνικές διαχωρισμού αποτέλεσε έναν από τους σημαντικότερους σταθμούς στην ιστορία της δεδομένης τεχνικής. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος πριν από τη φασματομετρική ανάλυση παρέχει τη δυνατότητα αδιαμφισβήτητης ταυτοποίησης και λήψης αξιόπιστων ποσοτικών δεδομένων για τους προσδιοριζόμενους αναλύτες. Οι συζευγμένες αυτές τεχνικές χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα και χρησιμοποιούνται εκτενώς για την ανάλυση εξαιρετικά πολύπλοκων μιγμάτων. Η σημαντικότερη οργανολογική πρόκληση για τη διασύνδεση ενός φασματόμετρου μάζας με έναν χρωματογράφο είναι η διατήρηση του υψηλού κενού στο εσωτερικό του φασματόμετρου μάζας, ταυτόχρονα με τη συνεχή ροή του χρωματογραφικού εκλούσματος. Η σχετικά διαχειρίσιμη αέρια φύση του εκλούσματος της αεριοχρωματογραφίας (Gas Chromatography/GC) επέτρεψε την αποτελεσματική διασύνδεση με τη φασματομετρία μάζας (8). Πιο συγκεκριμένα, η ανάπτυξη οργανολογικών μονάδων που περιορίζουν ή μειώνουν τη ροή του χρωματογραφικού εκλούσματος στο φασματόμετρο μάζας σήμανε την παραγωγή πολλών εμπορικά διαθέσιμων συζευγμένων οργάνων. Στις περισσότερες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν είτε διαχωριστές ροής είτε μονάδες που απομακρύνουν σταδιακά το φέρον αέριο από το χρωματογραφικό έκλουσμα. Σήμερα, η ευρεία υιοθέτηση της τριχοειδούς αεριοχρωματογραφίας εξαφάνισε την ανάγκη για μονάδες διασύνδεσης, καθώς οι πολύ χαμηλές ροές που αναπτύσσονται είναι πλήρως συμβατές με τη φασματομετρία μάζας. 10

Στη συνέχεια, η υγροχρωματογραφία (Liquid Chromatography/LC) αποτέλεσε μια ακόμα τεχνική διαχωρισμού που συζεύχθηκε επιτυχώς με τη φασματομετρία μάζας. Το υγρό πλέον χρωματογραφικό έκλουσμα αποτελεί το υπόστρωμα εφαρμογής της φασματομετρίας μάζας. Η σχετικά μεγάλη ποσότητα κινητής φάσης, όταν εξαερωθεί, παρέχει όγκο μεγαλύτερο κατά 100 έως 1000 φορές από τον αντίστοιχο όγκο του φέροντος αερίου που χρησιμοποιείται στην αεριοχρωματογραφία. Το δεδομένο πρόβλημα λύθηκε με την ανάπτυξη οργανολογικών μονάδων διασύνδεσης που απομακρύνουν την περίσσεια του παραγόμενου αερίου χρησιμοποιώντας διαδικασίες θέρμανσης και διαφορικής άντλησης, σε συνδυασμό συνήθως με τη ροή κάποιου αερίου ξήρανσης (9). Επίσης, η εφεύρεση τεχνικών ιοντισμού που λαμβάνουν χώρα σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης επέτρεψε τη χρήση υψηλότερων ροών κινητής φάσης, προσεγγίζοντας αυτές που χρησιμοποιούνται στην κλασική αναλυτική υγροχρωματογραφία. Πέρα από την αεριοχρωματογραφία και την υγροχρωματογραφία, η φασματομετρία μάζας έχει διασυνδεθεί επιτυχώς με την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση ζώνης (capillary zone electrophoresis/cze), την τριχοειδή ηλεκτροχρωματογραφία (capillary electrochromatography/cec) και τη χρωματογραφία υπερκρίσιμων υγρών (supercritical fluid chromatography). Τα αναλυτικά δεδομένα που παράγονται από όλες τις προαναφερθείσες συζευγμένες τεχνικές βασίζονται στην επαναλαμβανόμενη και συνεχή λήψη φασμάτων μάζας. Πιο συγκεκριμένα, το φασματόμετρο μάζας σαρώνει ταχύτατα και συνεχώς ένα προκαθορισμένο εύρος τιμών m/z καθ όλη τη διάρκεια της χρωματογραφικής ανάλυσης. Ο τρόπος με τον οποίο επιλέγουμε να απεικονίσουμε τα προκύπτοντα αποτελέσματα εξαρτάται από την πληροφορία που θέλουμε να εξάγουμε (10). Μια δυνατή προσέγγιση είναι η απεικόνιση του αθροίσματος των εντάσεων όλων των ιόντων που περιέχονται στο εξεταζόμενο φάσμα μάζας συναρτήσει του χρωματογραφικού χρόνου ανάσχεσης. Η δεδομένη απεικόνιση ονομάζεται χρωματογράφημα συνολικού ιοντικού ρεύματος (Total Ion Current chromatograph/tic) και ομοιάζει των χρωματογραφημάτων που λαμβάνονται με τους συμβατικούς χρωματογραφικούς ανιχνευτές. Εξαιρετικής αναλυτικής σημασίας είναι η απεικόνιση της έντασης μιας και μόνο τιμής του λόγου m/z συναρτήσει του χρωματογραφικού χρόνου ανάσχεσης. Η παραπάνω απεικόνιση ονομάζεται χρωματογράφημα εξαχθέντος ιόντος (Extracted Ion Chromatograph/XIC) και αποτελεί την πλέον ειδική και ευαίσθητη προσέγγιση που παρέχει η φασματομετρία μάζας. 1.4 Τεχνικές Ιοντισμού (11) Το εναρκτήριο βήμα κάθε φασματομετρικού κύκλου πραγματοποιείται με τη βοήθεια κάποιας τεχνικής ιοντισμού και επιχειρεί την παραγωγή αέριων ιόντων από το αναλυόμενο δείγμα. Η επιλογή της εκάστοτε τεχνικής ιοντισμού βασίζεται στη φύση του αναλύτη που θέλουμε να προσδιορίσουμε καθώς επίσης και στο είδος της αναλυτικής πληροφορίας που θέλουμε να εξάγουμε. Στην πραγματικότητα, η τεχνική ιοντισμού είναι εκείνη η παράμετρος που καθορίζει τη μορφή του λαμβανόμενου φάσματος μάζας (Πίνακας 1.1). Σε γενικές γραμμές θα μπορούσαμε να πούμε ότι οι τεχνικές ιοντισμού διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες: την κατηγορία των τεχνικών ιοντισμού αέριας φάσης (gas-phase ionization technique) και την κατηγορία των τεχνικών ιοντισμού εκρόφησης (desorption ionization technique). Απαραίτητη προϋπόθεση για την επιτυχή εφαρμογή των τεχνικών ιοντισμού της πρώτης ομάδας είναι η μετατροπή των μορίων του αναλύτη σε αέρια 11

κατάσταση πριν από τη διαδικασία ιοντισμού. Με τον τρόπο αυτό καταλαβαίνουμε ότι το περιοριστικό βήμα των δεδομένων τεχνικών είναι η πτητικότητα του αναλύτη. Αναλύτες με υψηλή τάση ατμών μπορούν εύκολα με μικρή αύξηση της θερμοκρασίας και εφαρμογή κενού να μεταβούν στην αέρια φάση. Αν θέλουμε να σκιαγραφήσουμε την φύση των αναλυτών που μπορούν να ιοντιστούν με τις δεδομένες τεχνικές, θα πρέπει να αναλογιστούμε τις σημαντικότερες παραμέτρους που καθορίζουν την πτητικότητα. Στα πλαίσια αυτού του συλλογισμού, φαίνεται ότι το μοριακό βάρος και η πολικότητα του αναλύτη είναι οι σημαντικότερες παράμετροι που επηρεάζουν, με αντίστροφης αναλογίας τρόπο, την πτητικότητα. Έτσι, σχετικά μικρού μοριακού βάρους (<1000 Da), πτητικές και θερμικά σταθερές ουσίες αποτελούν τους πιθανούς υποψηφίους των δεδομένων τεχνικών. Μόλις τα μόρια του αναλύτη μεταβούν στην αέρια κατάσταση αρχίζει η διαδικασία ιοντισμού, είτε μέσω βομβαρδισμού με υψηλής ενέργειας ηλεκτρόνια ή φωτόνια, είτε μέσω χημικής αντίδρασης με αέρια αντιδραστήρια που δρουν ως δότες ή δέκτες πρωτονίων. Οι πρώτες αυτές προσεγγίσεις των τεχνικών ιοντισμού αέριας φάσης απαιτούσαν την πραγματοποίηση των προαναφερθέντων γεγονότων σε συνθήκες υψηλού κενού, προκειμένου η απόδοση ιοντισμού να διατηρείται σε ικανοποιητικά επίπεδα. Ωστόσο, τις τελευταίες δεκαετίες έχουν εισαχθεί νέες τεχνικές ιοντισμού αέριας φάσης που επιτρέπουν την παραγωγή ιόντων από εξαερωμένους αναλύτες σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης. Η δεύτερη μεγάλη κατηγορία τεχνικών ιοντισμού που χρησιμοποιούνται στα πλαίσια της φασματομετρίας μάζας περιλαμβάνει τις τεχνικές ιοντισμού εκρόφησης. Πρόκειται για μεθοδολογίες οι οποίες δεν προϋποθέτουν την εξαέρωση των μορίων του αναλύτη πριν από τη διαδικασία ιοντισμού, επιτρέποντας έτσι την άμεση ανάλυση υγρών ή στερεών δειγμάτων. Πιο συγκεκριμένα, τα φαινόμενα ιοντισμού και μετάβασης στην αέρια φάση πραγματοποιούνται τόσο κοντά στη διάσταση του χώρου και του χρόνου, με αποτέλεσμα να θεωρούνται ένα ενιαίο γεγονός. Η πραγματικότητα αυτή, αναιρεί την απαίτηση υψηλής πτητικότητας επιτρέποντας τον προσδιορισμό αναλυτών μεγάλου μοριακού βάρους (>1000 Da) και πολικής φύσης. Επίσης, η απουσία αναγκαιότητας για θέρμανση επιτρέπει τον προσδιορισμό θερμικά ευαίσθητων ουσιών. Ένα δεύτερο κριτήριο με το οποίο μπορούμε να διακρίνουμε τις υπάρχουσες τεχνικές ιοντισμού είναι η έκταση της θραυσματοποίησης που προκαλούν στα μόρια του αναλύτη. Στην περίπτωση των σκληρών τεχνικών ιοντισμού, αυτές μεταδίδουν στα μόρια του αναλύτη αρκετή ενέργεια ώστε να προκαλούν εκτεταμένη θραυσματοποίηση και κατ επέκταση να παράγεται πλήθος ιοντικών θραυσμάτων, ενώ το μοριακό ιόν σχεδόν να απουσιάζει. Αντίθετα οι μαλακές τεχνικές ιοντισμού προκαλούν περιορισμένη θραυσματοποίηση, με αποτέλεσμα το λαμβανόμενο φάσμα μάζας να αποτελείται κυρίως από την κορυφή του μοριακού ιόντος και από λίγες μόνο επιπλέον κορυφές. Το φάσματα τόσο μιας σκληρής όσο και μιας μαλακής τεχνικής είναι εξίσου χρήσιμα στην ανάλυση. Οι πολλές κορυφές σε ένα φάσμα σκληρής τεχνικής παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τα είδη των χαρακτηριστικών ομάδων και επομένως για τη δομή των αναλυτών. Τα φάσματα μαλακών πηγών είναι χρήσιμα επειδή παρέχουν ακριβείς πληροφορίες ως προς το μοριακό βάρος των μορίων του αναλύτη. 12

Πίνακας 1.1 Διάφορες τεχνικές ιοντισμού. Τύπος τεχνικής Όνομα τεχνικής Παράγοντας ιοντισμού Αέριας φάσης Χημικός ιοντισμός Ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων Ιοντισμός πεδίου Αντιδραστήρια-ιόντα αέριας φάσης Ηλεκτρονική δέσμη Ηλεκτρόδιο υψηλού κενού Εκρόφησης Ιοντισμός πεδίου με εκρόφηση Ηλεκτρόδιο υψηλού κενού Ιοντισμός εκρόφησης με λέιζερ υποβοηθούμενος από τη μήτρα Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό Ιοντισμός βομβαρδισμού με ταχέως κινούμενα άτομα Ιοντισμός με θερμοψεκασμό Φασματομετρία μάζας δευτερογενούς ιόντος Εκρόφηση πλάσματος Ακτίνα λέιζερ Ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο Ατομική δέσμη Υψηλή θερμοκρασία Ιοντική δέσμη Θραύσματα σχάσης 252 Cf 1.4.1 Ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων Ο ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων (12) (Electron Ionization/Electron Impact/EI) αποτελεί την περισσότερο διαδεδομένη τεχνική ιοντισμού των τελευταίων έξι δεκαετιών. Σήμερα θεωρείται η τεχνική επιλογής για τον προσδιορισμό μικρού έως μεσαίου μεγέθους (<1000 Da) πτητικών οργανικών ουσιών. Η εγγενής αναπαραγωγιμότητα των λαμβανομένων φασμάτων μάζας επιτρέπει την άμεση ταυτοποίηση των αναλυτών με απλή αντιπαραβολή των φασμάτων τους με πρότυπα φάσματα ηλεκτρονικών βιβλιοθηκών. Η δεδομένη τεχνική είναι συμβατή με το σύστημα μεμονωμένης εισαγωγής δείγματος μέσω διαφράγματος, το σύστημα άμεσης εισαγωγής δείγματος με δειγματολήπτη και φυσικά την τριχοειδή αεριοχρωματογραφία. Από οργανολογικής άποψης, ο ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων λαμβάνει χώρα σε ένα μικρό θερμαινόμενο διαμέρισμα που διαθέτει ένα σπείραμα βολφραμίου ή ρηνίου το οποίο βρίσκεται σε κοντινή γειτνίαση με ένα ηλεκτρόδιο-συλλέκτη (Σχήμα 1.5). Με ηλεκτρική θέρμανση του σπειράματος παράγονται ελεύθερα ηλεκτρόνια τα οποία επιταχύνονται ελικοειδώς προς το ηλεκτρόδιο-συλλέκτη λόγω διαφοράς δυναμικού μεταξύ του σπειράματος και του ηλεκτροδίου. Η παρουσία μικρών μαγνητών σταθεροποιεί την τροχιά της ηλεκτρονικής δέσμης, ενώ η διαφορά δυναμικού ρυθμίζει την ενέργεια των περιεχόμενων ηλεκτρονίων. Η επιλογή διαφοράς δυναμικού που παράγει ηλεκτρόνια ενέργειας 70 ev εξασφαλίζει τη λήψη των επαναληψιμότερων αποτελεσμάτων. 13

Η αλληλεπίδραση των παραγόμενων ηλεκτρονίων με αέρια μόρια του αναλύτη σε συνθήκες υψηλού κενού προκαλούν μοριακές διεγέρσεις τόσο ηλεκτρονικής όσο και δονητικής φύσης. Επακόλουθο της δεδομένης ενεργειακής μεταφοράς είναι η αποβολή ενός ηλεκτρονίου από τα μόρια του αναλύτη με αποτέλεσμα την παραγωγή μια κατιονικής ρίζας με περιττό αριθμό ηλεκτρονίων γνωστή ως μοριακό ιόν : M + e - M +. + 2e - Η παραγόμενη αυτή κατιονική ρίζα είναι αρκετά ασταθής και υφίσταται εκτεταμένη αποσύνθεση στην πηγή ιοντισμού μέσω διαδοχικών και αλληλοσχετιζόμενων αντιδράσεων. Οι σημαντικότερες πορείες θραυσματοποίησης είναι οι ακόλουθες: αποβολή ελεύθερης ρίζας : [Α-Β] +. Α + + Β. ή Α. + Β + αποβολή ουδέτερου μορίου : [Α-Β] +. Α +. + Β ή Α + Β +. θραυσματοποίηση μέσω μετάθεσης Το σύνολο των ιόντων που παράγεται, εξωθείται από την πηγή ιόντων, συγκεντρώνεται με τη μορφή δέσμης και επιταχύνεται προς τον αναλυτή μάζας με τη βοήθεια διάφορων ηλεκτροστατικών πεδίων. Το λαμβανόμενο φάσμα μάζας χαρακτηρίζεται από την παρουσία πολλών ιοντικών θραυσμάτων και πολλές φορές την απουσία του μοριακού ιόντος. Σχήμα 1.5 Πηγή ιοντισμού πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (1) μαγνήτης, (2) σπείραμα, (3) ηλεκτρόδιο-συλλέκτης, (4) ηλεκτρονική δέσμη, (5) παραγόμενα ιόντα, (6),(7) ηλεκτρόδια οδηγοί. 1.4.2 Χημικός ιοντισμός Ο χημικός ιοντισμός (12,13) (Chemical Ionization/CI) αποτελεί μια κοντινή παραλλαγή του ιοντισμού με πρόσκρουση ηλεκτρονίων και παρέχει εκείνη την αναλυτική πληροφορία που απουσιάζει από τα συνήθη φάσματα πρόσκρουσης ηλεκτρονίων. Πιο συγκεκριμένα, ως μαλακή τεχνική ιοντισμού, εφαρμόζεται σε μικρού έως μεσαίου μεγέθους πτητικές οργανικές ενώσεις για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους τους. Όπως ο ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων έτσι και ο χημικός ιοντισμός αποτελεί τεχνική αέριας φάσης και είναι συμβατός με τα ίδια συστήματα εισαγωγής δείγματος. Από οργανολογικής άποψης, η πηγή χημικού ιοντισμού είναι ανάλογη της πηγής ιοντισμού με πρόσκρουση ηλεκτρονίων με εξαίρεση τριών βασικών σημείων. Πρώτα από 14

όλα, η πηγή χημικού ιοντισμού διαθέτει ένα σύστημα παροχής ενός αέριου αντιδραστηρίου το οποίο όπως θα δούμε μεσολαβεί στη διαδικασία ιοντισμού. Επίσης, στην πηγή χημικού ιοντισμού διατηρούνται συνθήκες υψηλότερης πίεσης, προκειμένου να ενθαρρύνονται ορισμένες αλληλεπιδράσεις μορίου-ιόντος. Τέλος, η παρουσία περίσσειας αέριου αντιδραστηρίου υπαγορεύει την παραγωγή ηλεκτρονίων υψηλότερης ενέργειας, ώστε η προκύπτουσα ηλεκτρονική δέσμη να έχει μεγαλύτερη διεισδυτική ικανότητα. Αναφορικά με τη μηχανιστική διάσταση του χημικού ιοντισμού, μπορούμε να πούμε ότι αυτή διαφέρει από τον ιοντισμό με πρόσκρουση ηλεκτρονίων στο γεγονός ότι τα παραγόμενα ηλεκτρόνια υψηλής ενέργειας αλληλεπιδρούν με τα μόρια του αέριου αντιδραστηρίου και όχι με τα μόρια του αναλύτη. Αποτέλεσμα αυτής της αλληλεπίδρασης είναι η μετατροπή των ουδέτερων μορίων του αέριου αντιδραστηρίου σε κατιονικές ρίζες οι οποίες με τη σειρά τους συμμετέχουν σε αντιδράσεις ιόντος-μορίου και παράγουν τα κύρια αέρια αντιδρώντα ιόντα που μεσολαβούν τον ιοντισμό των μορίων του αναλύτη. Αν και ένας μεγάλος αριθμός αέριων αντιδραστηρίων έχει προταθεί, σήμερα χρησιμοποιούνται κυρίως το μεθάνιο (CH 4), το ισοβουτάνιο (C 4H 10) και η αμμωνία (NH 3). Τα παραγόμενα αντιδρώντα ιόντα ιοντίζουν τα μόρια του αναλύτη κυρίως μέσω των ακόλουθων αντιδράσεων: μεταφορά πρωτονίου : M + CH + 5 [M+H] + + CH 4 απόσπαση πρωτονίου : M + OH - [M-H] - + H 2O ανταλλαγή φορτίου : M + C 6H 6 +. M +. + C6H 6 πρόσληψη ηλεκτρονίου : M + e - M -. πυρηνόφιλη προσθήκη : M + Cl - [M+Cl] - πυρηνόφιλη μετάθεση : M + O -. [M+O-H] - + O απόσπαση ιόντος : M + NO + [M-OH] + + HONO ηλεκτρονιόφιλη προσθήκη : M + NH + 4 [M+NH 4] + ιοντική εξαγωγή υδριδίου: M + X + [M-H] + + XH Από τις προαναφερθείσες αντιδράσεις, η μεταφορά πρωτονίου και κατ επέκταση η δημιουργία ενός πρωτονιωμένου μοριακού ιόντος αποτελεί τη συνηθέστερη οδό. Η σχετικά μικρή ενεργειακή διέγερση των μορίων του αναλύτη σε συνδυασμό με την παραγωγή ιοντικών μορφών που διαθέτουν ζυγό αριθμό ηλεκτρονίων περιορίζει δραστικά τις διαδικασίες θραυσματοποίησης, παράγοντας απλά φάσματα μάζας που περιέχουν ένα μικρό αριθμό ισχυρών κορυφών (Σχήμα 1.6). Σχήμα 1.6 Φάσμα μάζας ΕΙ (αριστερά) και φάσμα μάζας CI (δεξιά) της ίδιας ουσίας. 15

1.4.3 Ιοντισμός πεδίου (14) Ο ιοντισμός πεδίου (Field Ionization/FI) αποτελεί μια μαλακή τεχνική ιοντισμού που παράγει κατά κύριο λόγο χαμηλής εσωτερικής ενέργειας κατιονικές ρίζες. Με τον τρόπο αυτό, παρατηρείται ελάχιστη ή μηδενική θραυσματοποίηση και τα λαμβανόμενα φάσματα μάζας απεικονίζουν κυρίως το μοριακό ιόν του αναλύτη. Όπως ο χημικός ιοντισμός έτσι και ο ιοντισμός πεδίου αποτελεί τεχνική αέριας φάσης και είναι συμβατός με το σύστημα μεμονωμένης εισαγωγής δείγματος μέσω διαφράγματος και φυσικά την τριχοειδή αεριοχρωματογραφία. Ο ιοντισμός των αέριων μορίων του αναλύτη βασίζεται στην επίδραση ενός ιδιαίτερου και ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου (έντασης 10 7-10 8 V/cm) το οποίο αποσπά ηλεκτρόνια από τα μόρια του αναλύτη παράγοντας κατιονικές ρίζες. Το δεδομένο ηλεκτρικό πεδίο αναπτύσσεται μεταξύ ενός θετικά φορτισμένου ηλεκτροδίου που ονομάζεται πομπός και μιας αρνητικά φορτισμένης καθόδου. Η αρχιτεκτονική του πομπού καθορίζει τη μορφή του ηλεκτρικού πεδίου παίζοντας καθοριστικό ρόλο στη διαδικασία ιοντισμού του αναλύτη. Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενα πομποί έχουν τη μορφή αιχμηρής ακίδας ή λεπίδας ή σύρματος μικρής διαμέτρου (Σχήμα 1.7). Σχήμα 1.7 Πηγή ιοντισμού πεδίου (1) πομπός, (2) παραγόμενα ιόντα, (3) κάθοδος, (4) ηλεκτρόδιο οδηγός. 1.4.4 Ιοντισμός πεδίου με εκρόφηση (14) Ο ιοντισμός πεδίου με εκρόφηση (Field Desorption Ionization/FD) αποτελεί μια παραλλαγή του ιοντισμού πεδίου που αναλύθηκε προηγουμένως. Πρόκειται για μια μαλακή τεχνική ιοντισμού που παράγει κατά κύριο λόγο πρωτονιωμένα μοριακό ιόντα. Σε αντίθεση με τον ιοντισμό πεδίου, ο ιοντισμός πεδίου με εκρόφηση αποτελεί μια τεχνική ιοντισμού εκρόφησης και είναι συμβατός μόνο με το σύστημα άμεσης εισαγωγής δείγματος με δειγματολήπτη. Λόγω της απουσίας εξαέρωσης του δείγματος πριν από τη διαδικασία ιοντισμού, η δεδομένη τεχνική ενδείκνυται για τον προσδιορισμό μεγάλου μεγέθους θερμικά ασταθών ουσιών όπως είναι τα πεπτίδια και οι υδατάνθρακες. Από μεθοδολογικής άποψης, ο ιοντισμός πεδίου με εκρόφηση διαφέρει από τον ιοντισμό πεδίου στον τρόπο με τον οποίο εισάγεται το αναλυόμενο δείγμα στην πηγή, ιοντισμού καθώς επίσης και στη φυσική κατάσταση του δείγματος. Πιο συγκεκριμένα, το 16

δείγμα βρίσκεται υπό τη μορφή διαλύματος και εφαρμόζεται απευθείας στην επιφάνεια ενός ειδικού πομπού που φέρεται στην άκρη ενός δειγματολήπτη. Ο χρησιμοποιούμενος πομπός είναι στην πραγματικότητα ένα λεπτό σύρμα που φέρει πολλές μικρής διαμέτρου (της τάξεως των 0,1 nm) κοντές βλεφαρίδες. Όταν ο διαλύτης του δείγματος εξατμιστεί, τότε ο φορτισμένος, πλέον, με το δείγμα πομπός εισάγεται στην πηγή ιοντισμού με τη βοήθεια ενός δειγματολήπτη. Σε γενικές γραμμές, η διαδικασία ιοντισμού των μορίων του αναλύτη είναι ανάλογη αυτής του ιοντισμού πεδίου και οφείλεται στην παρουσία του ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου. Πιο συγκεκριμένα, η παραγωγή ιόντων λαμβάνει χώρα τόσο στην επιφάνεια του πομπού, όσο και σε μικρή απόσταση από αυτή. Στην πρώτη περίπτωση η παραγωγή ιόντων οφείλεται στην έκρηξη προσχηματισμένων ιόντων λόγω της επίδρασης του ισχυρού πεδίου, ενώ στη δεύτερη περίπτωση κυριαρχούν διαδικασίες ιοντισμού αέριας φάσης. Η δεδομένη τεχνική χαίρει πλέον ιστορικής σημασίας καθώς έχει αντικατασταθεί στο σύνολό της από περισσότερο σύγχρονες τεχνικές ιοντισμού εκρόφησης. 1.4.5 Ιοντισμός βομβαρδισμού με ταχέως κινούμενα άτομα (15) Ο ιοντισμός βομβαρδισμού με ταχέως κινούμενα άτομα (Fast Atom Bombardment Ionization/FAB) αποτέλεσε την πρώτη ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική ιοντισμού εκρόφησης που επέτρεψε τον αποτελεσματικό και εύκολο προσδιορισμό μεγάλου μεγέθους (της τάξεως των 10 kda) θερμικά ασταθών αναλυτών (Σχήμα 1.8). Η ανάπτυξη της δεδομένης τεχνικής βασίστηκε σε μεθοδολογίες ιοντισμού στερεών επιφανειών, γνωστές ως φασματομετρία μάζας δευτερογενούς ιόντος (Secondary Ion Mass Spectrometry/SIMS) που σήμερα βρίσκουν εφαρμογή στην απεικόνιση στερεών ανόργανων υλικών. Από μεθοδολογικής άποψης ο ιοντισμός FAB διαφοροποιείται από τις προαναφερθείσες τεχνικές ιοντισμού στο γεγονός ότι το δείγμα ενσωματώνεται σε ένα μητρικό υλικό (matrix) πριν από τη διαδικασία ιοντισμού. Πιο συγκεκριμένα, το δείγμα διαλύεται σε έναν πολικό ιξώδη διαλύτη με υψηλό σημείο ζέσεως όπως είναι η γλυκερόλη, η θειογλυκερόλη και η νιτρο-βενζυλαλκοόλη. Στη συνέχεια, μικρή ποσότητα διαλύματος τοποθετείται σε ένα μεταλλικό στόχο που φέρεται στην άκρη ενός δειγματολήπτη και εισάγεται στην πηγή ιοντισμού. Η παραγωγή ιόντων βασίζεται στο βομβαρδισμό της επιφάνειας του υγρού δείγματος με μια δέσμη ταχέως κινούμενων ατόμων ξένου (Xe) ή αργού (Ar). Τα παρατηρούμενα ιόντα προκύπτουν είτε από διαδικασίες εκρόφησης προσχηματισμένων ιόντων από την επιφάνεια του υγρού δείγματος, είτε από διαδικασίες ιοντισμού αέριας φάσης που λαμβάνουν χώρα σε μικρή απόσταση από την επιφάνεια. Η προαναφερθείσα δέσμη ταχέως κινούμενων ατόμων παράγεται με μια μεθοδολογία που ονομάζεται εξουδετέρωση ιοντικής δέσμης. Πιο συγκεκριμένα, σε μια πρώτη φάση τα άτομα του ξένου ή αργού μετατρέπονται μέσω ηλεκτρικής εκκένωσης σε ιόντα και επιταχύνονται προς το δείγμα με τη βοήθεια ηλεκτρικού πεδίου. Ακολούθως, η ταχέως κινούμενη δέσμη ιόντων εξουδετερώνεται ηλεκτρικά διερχόμενη ενός θαλάμου υψηλής πίεσης, διατηρώντας, ωστόσο, την ταχύτητά της. Μια παραλλαγή της δεδομένης τεχνικής, γνωστή ως υγρή φασματομετρία μάζας δευτερογενούς ιόντος (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry/LSIMS), συνίσταται στην αντικατάσταση των ταχέως κινούμενων ατόμων με ιόντα καισίου (Cs). Επίσης, η δυνατότητα εφαρμογής της δεδομένης τεχνικής ιοντισμού σε υγρά δείγματα επέτρεψε τη διασύνδεσή της με συστήματα υγροχρωματογραφικής 17

εισαγωγής μέσω μιας παραλλαγής γνωστή ως δυναμικό-fab (dynamic Fast Atom Bombardment Ionization/dynamic FAB). Τα λαμβανόμενα φάσματα μάζας περιλαμβάνουν κυρίως πρωτονιωμένα μοριακά ιόντα ή ιόντα προσθήκης (με Na +, Κ +, NH 4+ ), ενώ παράλληλα παρατηρείται σημαντικός βαθμός θραυσματοποίησης. Τέλος, ο εκτεταμένος ιοντισμός των μορίων του μητρικού υλικού παράγει υψηλό φασματικό θόρυβο, μειώνοντας σημαντικά την ευαισθησία της τεχνικής. Σχήμα 1.8 Πηγή FAB. 1.4.6 Ιοντισμός εκρόφησης με λέιζερ υποβοηθούμενος από τη μήτρα (16,17) Άλλη μια εξαιρετικής σημασίας τεχνική ιοντισμού εκρόφησης που επέτρεψε τον προσδιορισμό οργανικών ουσιών τεράστιου μοριακού βάρους (της τάξεως των 300 kda) είναι ο ιοντισμός εκρόφησης με λέιζερ υποβοηθούμενος από τη μήτρα (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/MALDI). Η δεδομένη τεχνική βασίζεται στην ενσωμάτωση του αναλυόμενου δείγματος σε ένα μητρικό υλικό και την ακόλουθη ακτινοβόλησή του με μια ακτίνα λέιζερ υπεριώδους ακτινοβολίας (Σχήμα 1.9). Η παρουσία του μητρικού υλικού συμβάλλει καταλυτικά στον ιοντισμό των μορίων του αναλύτη και εξυπηρετεί σημαντικές διαδικασίες όπως είναι: η απορρόφηση της προσπίπτουσας ακτινοβολίας η ταχεία θέρμανση και εξάχνωση των μορίων του αναλύτη η παροχή ιοντικής ατμόσφαιρας προκειμένου τα μόρια του αναλύτη να φορτιστούν η απορρόφηση της πλεονάζουσας ενέργειας περιορίζοντας τα φαινόμενα θραυσματοποίησης. Σχήμα 1.9 Πηγή MALDI (1) επιφάνεια-στόχος, (2) πηγή λέιζερ, (3) συγκρυστάλλωμα δείγματος-μήτρας (4) παραγόμενα ιόντα, (5) ηλεκτρόδιο οδηγός. 18

Ως μητρικά υλικά χρησιμοποιούνται μικρού μοριακού βάρους αρωματικές ενώσεις που απορροφούν ισχυρά στα μήκη κύματος εκπομπής των εμπορικά διαθέσιμων λέιζερ υπεριώδους ακτινοβολίας. Η χρήση του 2,5-διυδροξυβενζοικού οξέος ως μητρικού υλικού σε συνδυασμό με την ακτινοβόληση στα 337 nm με ακτίνα λέιζερ N 2, αποτελούν τις συνηθέστερες πειραματικές συνθήκες της δεδομένης τεχνικής. Από άποψη μεθοδολογίας, τόσο το μητρικό υλικό όσο και το αναλυόμενο δείγμα διαλύονται σε κατάλληλο διαλύτη με τέτοια αναλογία, ώστε η προκύπτουσα σχετική συγκέντρωση μητρικού υλικού προς δείγμα να είναι της τάξεως του 5000:1 έως 10000:1. Ακολούθως, μικρές ποσότητες του δεδομένου διαλύματος φέρονται υπό τη μορφή σταγονιδίων σε κατάλληλη επιφάνεια-στόχο και αφήνονται μέχρι την εξάτμιση του διαλύτη και την παραγωγή στερεών συγκρυσταλλωμάτων μητρικού υλικού-δείγματος. Στη συνέχεια έπεται η ακτινοβόληση των προκυπτόντων συγκρυσταλλωμάτων και ο ιοντισμός των μορίων του αναλύτη. Πέρα από τις κλασικές μεθοδολογικές προσεγγίσεις που υπαγορεύουν την ακτινοβόληση του δείγματος υπό συνθήκες υψηλού κενού, σήμερα υπάρχει η δυνατότητα εφαρμογής της δεδομένης τεχνικής σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης. Στα λαμβανόμενα φάσματα μάζας απαντούν κυρίως τα πρωτονιωμένα και τα διπρωτονιωμένα μοριακά ιόντα του αναλύτη καθώς επίσης και σύνθετα ιόντα αποτελούμενα από 2 ή 3 μόρια του αναλύτη συνδεδεμένα μεταξύ τους μέσω ασθενών ιοντικών δυνάμεων (Σχήμα 1.10). Σχήμα 1.10 Φάσμα μάζας MALDI ενός πρωτεϊνικού μορίου. Η κορυφή στα 12359 m/z αντιστοιχεί στο ίον [Μ+Η] +, ενώ οι κορυφές στα 6183 m/z και στα 24720 m/z αντιστοιχούν στα ιόντα [Μ+2Η] 2+ και [2Μ+Η] + αντίστοιχα. 19

1.4.7 Χημικός ιοντισμός σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (18) Ο χημικός ιοντισμός σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (Atmospheric Pressure Chemical Ionization/APCI) αποτελεί μια μαλακή τεχνική ιοντισμού που γνωρίζει σημαντική αποδοχή λόγω συμβατότητας με διάφορα υγροχρωματογραφικά συστήματα. Η δεδομένη τεχνική μοιράζεται αρκετά κοινά σημεία με τον κλασικό χημικό ιοντισμό αλλά διατηρεί και ορισμένες διαφορές, με σημαντικότερη τις ατμοσφαιρικές συνθήκες υπό τις οποίες πραγματοποιείται ο ιοντισμός των αναλυτών. Πιο συγκεκριμένα, στην περίπτωση του APCI ο ιοντισμός λαμβάνει χώρα εκτός του συστήματος υψηλού κενού που διαθέτει το φασματόμετρο μάζας, ενώ στη δεύτερη περίπτωση ο ιοντισμός πραγματοποιείται εντός του δεδομένου συστήματος. Επίσης, το ρόλο του αέριου αντιδραστηρίου παίζει πλέον η κινητή φάση, ενώ το νήμα βολφραμίου αντικαθίσταται από μια ακίδα εκφόρτισης. Η ηλεκτρική εκκένωση της προαναφερθείσας ακίδας είναι υπεύθυνη για τη μετατροπή ορισμένων συστατικών της κινητής φάσης σε αέρια αντιδραστήρια ιόντα (όπως H 3O +, CH 3CNH +, CH 3OH 2+ ) τα οποία με τη σειρά τους ιοντίζουν τα μόρια του αναλύτη, κυρίως μέσω διαδικασιών πρωτονίωσης. Ένας από τους σημαντικότερους περιορισμούς της δεδομένης τεχνικής είναι το σχετικά μικρό εύρος αναλυτών που μπορεί να προσδιορίσει, καθώς επίσης και τα χαμηλά επίπεδα ευαισθησίας που επιτυγχάνονται για ορισμένες κλάσεις χημικών ουσιών. Πιο συγκεκριμένα, οι συνήθεις διαλύτες που χρησιμοποιούνται στα πλαίσια της υγροχρωματογραφίας όπως είναι το νερό, η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο και το τετραϋδροφουράνιο παράγουν ασθενή αέρια αντιδραστήρια ιόντα που δεν προκαλούν εκτενή ιοντισμού των μορίων του αναλύτη. 1.4.8 Ιοντισμός με δέσμη φωτονίων σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (19) Ο ιοντισμός με δέσμη φωτονίων σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (Atmospheric Pressure Photo-Ionization/APPI) αποτελεί μια κοντινή παραλλαγή του APCI όπου η ακίδα εκφόρτισης έχει αντικατασταθεί από μια λάμπα εκπομπής υπεριώδους ακτινοβολίας. Η δεδομένη τεχνική αποσκοπεί στον ιοντισμού αναλυτών που στερούνται χαρακτηριστικών ομάδων με βασικές ιδιότητες οπότε δεν μπορούν να ιοντιστούν μέσω της κλασικής προσέγγισης πρωτονίωσης. Ο APPI είναι πλήρως συμβατός με συστήματα υγροχρωματογραφίας και μάλιστα η σύσταση της χρησιμοποιούμενης κινητής φάσης επηρεάζει σημαντικά τις διαδικασίες ιοντισμού. Πιο συγκεκριμένα, η χρήση απρωτικών διαλυτών ενθαρρύνει τη μετατροπή των μορίων του αναλύτη σε κατιονικές ρίζες, ενώ η παρουσία πρωτικών διαλυτών προωθεί την παραγωγή πρωτονιωμένων μοριακών ιόντων. Η ανάλυση ουσιών που δεν είναι επιδεκτικές σε φωτοϊοντισμό εξυπηρετείται με τη χρήση ενός παράγοντα (dopant) που δρα ως αντιδραστήριο μεταφοράς φορτίου. Ο δεδομένος παράγοντας προστίθεται στην κινητή φάση και αντιστοιχεί σε ουσίες με υψηλή απορροφητικότητα υπεριώδους ακτινοβολίας όπως είναι η ακετόνη, το τολουόλιο και η ανισόλη. Μέχρι στιγμής οι βιβλιογραφικές αναφορές της δεδομένης τεχνικής είναι περιορισμένες, αλλά πιστεύεται ότι στο μέλλον οι εφαρμογές της θα αυξηθούν σημαντικά. 20

1.4.9 Ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (20) Ο ηλεκτροψεκασμός ως τεχνική ιοντισμού (Electrospray ionization/ms) στη φασματομετρία μάζας περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1984 από τον Fenn και σήμερα αποτελεί μια από τις σημαντικότερες τεχνικές για τη φασματομετρική ανάλυση ασταθών, πολικών συστατικών και βιολογικών μακρομορίων τα οποία μέχρι πρότινος ήταν εξαιρετικά δύσκολο να αναλυθούν. Ο ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό πραγματοποιείται σε συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (Atmospheric Pressure Ionization / API) και συνδυάζει τα χαρακτηριστικά της μαλακής πηγής ιοντισμού και της πηγής εκρόφησης, όπως αυτά περιγράφηκαν παραπάνω. Ο ηλεκτροψεκασμός βασίζεται στην εφαρμογή ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου, υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης, σε διάλυμα που διέρχεται με χαμηλή ροή (10-1000 μl/min) μέσα από ένα μεταλλικό τριχοειδές (Σχήμα 1.11). Το ηλεκτρικό πεδίο δημιουργείται από την εφαρμογή υψηλού δυναμικού (3-6 kv) μεταξύ του μεταλλικού τριχοειδούς και ενός παρακείμενου αντι-ηλεκτροδίου, τα οποία βρίσκονται σε απόσταση 0,3-2 cm. Με τον τρόπο αυτό, δημιουργείται ηλεκτρικό πεδίο της τάξεως των 10 6 V/m. Το ηλεκτρικό πεδίο προκαλεί τη συσσώρευση ιόντων στην επιφάνεια του διαλύματος που βρίσκεται στο τέλος του τριχοειδούς, με αποτέλεσμα κάποια στιγμή η επιφάνεια να καταστραφεί και να δημιουργηθούν υψηλά φορτισμένα σταγονίδια. Η ομοαξονική έγχυση αερίου, υπό χαμηλή ροή, βοηθά στη μείωση της διασπορά του ηλεκτρικά φορτισμένου αερολύματος. Στη συνέχεια, τα φορτισμένα σταγονίδια διέρχονται είτε μέσα από ένα θερμό ρεύμα αδρανούς αερίου, όπως το άζωτο, είτε μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδές προκειμένου να απομακρυνθούν τα τελευταία μόρια του διαλύτη. Σχήμα 1.11 Πηγή ηλεκτροψεκασμού (1) μεταλλικό τριχοειδές, (2) ηλεκτρικά φορτισμένο αερόλυμα, (3) αντι-ηλεκτρόδιο, (4) ρεύμα αδρανούς αερίου, (5) αναλυτής μάζας. Το φορτισμένο αερόλυμα δημιουργείται όταν το δυναμικό λάβει μια οριακή τιμή (onset voltage) η οποία για συγκεκριμένη πηγή εξαρτάται από την επιφανειακή τάση του διαλύτη. Αν παρατηρήσουμε τη σταγόνα του διαλύματος που βρίσκεται στο άκρο του τριχοειδούς σε διάφορες τιμές του δυναμικού θα δούμε, ότι σε χαμηλές τιμές η σταγόνα διατηρεί 21

σφαιρικό σχήμα, ενώ με την αύξηση του δυναμικού επιμηκύνεται, λόγω του ισχυρότερου πεδίου που προκύπτει, το οποίο προκαλεί περαιτέρω συσσώρευση ιόντων στο άκρο της σταγόνας. Μάλιστα, στην οριακή κατάσταση όπου η ηλεκτρική δύναμη, που ασκείται στην επιφάνεια της σταγόνας του διαλύματος, είναι μεγαλύτερη από τη συνεκτική δύναμη της επιφανειακής τάσης, έχουμε τη μετατροπή της σταγόνας στον κώνο του Taylor από τον οποίο δημιουργείται το φορτισμένο αερόλυμα. Όπως είδαμε και παραπάνω, τα προκύπτοντα σταγονίδια στη συνέχεια οδηγούνται είτε μέσα από ένα θερμό ρεύμα αδρανούς αερίου, είτε μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδές, με αποτέλεσμα την εξάτμιση του διαλύτη, γεγονός που προκαλεί τη συρρίκνωση των σταγονιδίων και κατ επέκταση την αύξηση του φορτίου ανά μονάδα όγκου. Η διαδικασία αυτή σε συνδυασμό με την επιρροή του ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου, οδηγεί στην περαιτέρω αποδιάταξη των σταγονιδίων. Πιο συγκεκριμένα, κάθε σταγονίδιο που δημιουργήθηκε από τον κώνο του Taylor, θα αποτελέσει έναν καινούριο κώνο του Taylor που θα παραγάγει περίπου 20 μικρότερα θυγατρικά σταγονίδια με επταπλάσια τιμή φορτίου ανά μονάδα όγκου, συγκριτικά με τα πρωταρχικά σταγονίδια. Η διαδικασία αυτή θα επαναληφθεί αρκετές φορές, με αποτέλεσμα την παραγωγή θυγατρικών γενεών με πολύ μικρά και υψηλά φορτισμένα σταγονίδια, τα οποία θα καταστήσουν δυνατή την εκρόφηση ιόντων στο περιβάλλον. Θα πρέπει να τονίσουμε ότι η εκρόφηση ιόντων πραγματοποιείται μόνο στην επιφάνεια των σταγονιδίων και για το λόγο αυτό, παρατηρείται μεγαλύτερη ευαισθησία σε ουσίες που απαντούν με μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Μοναδικό χαρακτηριστικό της δεδομένης τεχνικής είναι η λήψη φασμάτων μάζας που περιλαμβάνουν κυρίως πολλαπλά πρωτονιωμένα μοριακά ιόντα του αναλύτη. Το φαινόμενο αυτό βρίσκει ευρεία εφαρμογή στην ανάλυση πρωτεϊνών καθώς επιτρέπει τη μετατροπή μεγάλου μοριακού βάρους πρωτεϊνών σε ιόντα με μικρή τιμή m/z και επίσης καθιστά δυνατό τον ακριβή υπολογισμό του μοριακού τους βάρους. 1.5 Αναλυτές μάζας (21) Ο αναλυτής μάζας αποτελεί εκείνη την οργανολογική μονάδα του φασματόμετρου μάζας που παρεμβάλλεται μεταξύ της πηγής ιοντισμού και του ανιχνευτή ιόντων. Η κύρια λειτουργία του αναλυτή μάζας είναι ο διαχωρισμός των παραχθέντων αέριων ιόντων συναρτήσει του λόγου m/z, προκειμένου να καταστεί δυνατή η ανεξάρτητη μέτρηση του ιοντικού ρεύματος των επιμέρους ιόντων. Ο επιδιωκόμενος διαχωρισμός στηρίζεται στις φυσικές αρχές που διέπουν την κίνηση ιόντων μέσα σε πεδία μαγνητικής ή ηλεκτρομαγνητικής φύσης. Η ανάπτυξη νέων αναλυτών μάζας όπως επίσης και η βελτίωση των ήδη απαντώμενων οργανολογιών αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους τομείς έρευνας στο χώρο της φασματομετρίας μάζας. Η τεχνολογική βελτίωση των αναλυτών μάζας παρέχει τη δυνατότητα εξαγωγής πληρέστερης και ακριβέστερης αναλυτικής πληροφορίας διευρύνοντας σημαντικά τις εφαρμογές της δεδομένης τεχνικής. Η επιλογή του κατάλληλου αναλυτή μάζας εξαρτάται τόσο από την τεχνική ιοντισμού που χρησιμοποιείται, όσο και από τη φύση της πληροφορίας που επιχειρείται να εξαχθεί. Μια σύγχρονη οργανολογική τάση που βρίσκει ευρεία εφαρμογή στην παραγωγή καινοτόμων φασματόμετρων μάζας είναι ο σειριακός συνδυασμός δύο διαφορετικών αναλυτών μάζας. Το δεδομένο εγχείρημα 22

επιτρέπει την ανάπτυξη υβριδικών αναλυτών μάζας που συνδυάζουν τα πλεονεκτήματα των επιμέρους μονάδων και ταυτόχρονα ξεπερνούν προηγούμενους περιορισμούς. Σε γενικές γραμμές η σημαντική ετερογένεια μεταξύ των απαντώμενων αναλυτών μάζας καθιστά δύσκολη την κατηγοριοποίησή τους (Πίνακας 1.2). Ωστόσο, σε μια αδρή προσπάθεια ομαδοποίησης θα μπορούσαμε να πούμε ότι οι αναλυτές μάζας διακρίνονται σε τρεις κύριες κατηγορίες ανάλογα με τον τρόπο λειτουργίας τους: οι συνεχείς αναλυτές μάζας, όπως ο τετραπολικός αναλυτής μάζας και ο αναλυτής μάζας μαγνητικού τομέα οι παλμικοί αναλυτές μάζας, όπως ο αναλυτής μάζας χρόνου πτήσης οι αναλυτές μάζας παγίδας ιόντων, όπως η τετραπολική παγίδα ιόντων, η γραμμική παγίδα ιόντων, ο αναλυτής κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντος με μετασχηματισμό Fourier και το orbitrap. Πίνακας 1.2 Διάφοροι αναλυτές μάζας. Τύπος αναλυτή μάζας Ακρωνύμιο Αρχή διαχωρισμού Μαγνητικού τομέα B Ορμή Τετραπόλου Q Σταθερότητας τροχιάς Γραμμικής παγίδας ιόντων LIT >> Τετραπολικής παγίδας ιόντων QIT >> Χρόνου πτήσης TOF Χρόνος πτήσης Κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντος με μετασχηματισμό Fourier Ηλεκτροστατικής παγίδας ιόντων με μετασχηματισμό Fourier (Orbitrap) FTICR FT-OT Συχνότητα κυκλοτρονιακού συντονισμού Συχνότητα συντονισμού Ο καθορισμός της επίδοσης του εκάστοτε αναλυτή μάζας αποτελεί προϋπόθεση για τον προσδιορισμό των εφαρμογών που μπορεί να φέρει εις πέρας, όπως επίσης και την οριοθέτηση των περιορισμών που συνεπάγουν τη χρήση του. Το δεδομένο εγχείρημα εξυπηρετείται από τη χρήση συγκεκριμένων χαρακτηριστικών επίδοσης που επιτρέπουν την άμεση σύγκριση διαφορετικών αναλυτών μάζας και την επιλογή του καταλληλότερου αναφορικά με το υπό εξέταση αναλυτικό πρόβλημα. Τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά επίδοσης είναι: I. Διακρισιμότητα και διακριτική ικανότητα (22) Ο ακριβής ορισμός της διακρισιμότητας (Resolution) και της διακριτικής ικανότητας (Resolving power/r) αποτελεί μια από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στο χώρο της 23

φασματομετρικής ορολογίας. Αν και πολλές φορές χρησιμοποιούνται ως συνώνυμα, οι δύο αυτοί όροι είναι διαφορετικοί. Η σύγχυση στη χρήση των δεδομένων όρων σχετίζεται με το γεγονός ότι και οι δύο όροι αναφέρονται γενικά στην ικανότητα ενός αναλυτή μάζας να παράγει διακριτά σήματα για δύο ιόντα που έχουν μικρή διαφορά στο λόγου m/z. Αναφορικά με τον προσδιορισμό της διακρισιμότητας, απαιτείται η χρήση δύο γειτονικών φασματικών κορυφών ίσου ύψους που σχηματίζουν κοιλάδα αλληλεπικάλυψης συγκεκριμένου ποσοστού (συνήθως 10-20%). Χρησιμοποιώντας αυτά τα δεδομένα η διακρισιμότητα ορίζεται ως η διαφορά των τιμών m/z (Δm) των δύο κορυφών εκφρασμένη σε Da (Σχήμα 1.12). Με τη σειρά της η διακρισιμότητα οριοθετεί τον κλασικό ορισμό της διακριτικής ικανότητας. Πιο συγκεκριμένα, ως διακριτική ικανότητα ορίζεται ο λόγος μια δεδομένης τιμής m/z (Μ) προς την προαναφερθείσα διαφορά Δm: RR = MM ΔΔmm Συνήθως ως Μ χρησιμοποιείται η ονομαστική μάζα των φασματικών κορυφών. Σχήμα 1.12 Σχηματική απεικόνιση του κλασικού ορισμού της διακρισιμότητας (Δm) και του νεώτερου μεγέθους FWHM. Σε γενικές γραμμές η εύρεση κατάλληλων γειτονικών φασματικών κορυφών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό της διακρισιμότητας είναι αρκετά δύσκολη. Αν αναλογιστεί κανείς και το γεγονός ότι οι δεδομένες κορυφές θα πρέπει να βρίσκονται σε συγκεκριμένη περιοχή του λόγου m/z τότε το προαναφερθέν εγχείρημα κρίνεται ακόμα δυσκολότερο. Για την αντιμετώπιση του δεδομένου προβλήματος εισήχθη ένας νέος τρόπος υπολογισμού της διακριτικής ικανότητας που απαιτεί τη χρήση μιας και μόνο φασματικής κορυφής (Σχήμα 1.12). Πιο συγκεκριμένα, ο νέος ορισμός χρησιμοποιεί την ίδια μαθηματική σχέση με τη διαφορά ότι το μέγεθος Δm αντιστοιχεί πλέον στο εύρος που διατηρεί η φασματική κορυφή στο ήμισυ του ύψους της (Full Width Half Maximum/FWHM). Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η εφαρμογή των δύο ορισμών της διακριτικής ικανότητας στα ίδια πειραματικά δεδομένα παρέχει διαφορετικά αριθμητικά αποτελέσματα (Σχήμα 1.13). Μάλιστα, στην περίπτωση φασματικών κορυφών σχήματος 24

καμπύλης Gauss, η υπολογιζόμενη με το νεώτερο ορισμό τιμή της διακριτικής ικανότητας είναι περίπου διπλάσια από εκείνη που υπολογίζει ο κλασικός ορισμός. Με τον τρόπο αυτό, κάθε αναφορά στη διακριτική ικανότητα πρέπει να συνοδεύεται από τον τρόπο υπολογισμού της. Σχήμα 1.13 Υπολογισμός του κλασικού και του νεώτερου ορισμού της διακριτικής ικανότητας βασιζόμενοι στα ίδια δεδομένα. Εξετάζοντας τους ορισμούς της διακριτικής ικανότητας και της διακρισιμότητας μπορούμε να καταλάβουμε ότι πρόκειται για αλληλοεξαρτώμενα μεγέθη τα οποία διατηρούν ωστόσο κάποιες λεπτές διαφορές. Η διαφοροποίησή τους γίνεται καλύτερα αντιληπτή χρησιμοποιώντας ορισμένα παραδείγματα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί ο τετραπολικός αναλυτής μάζας όπου η διακρισιμότητα διατηρείται σταθερή σε όλο το εύρος τιμών m/z, ενώ η διακριτική ικανότητα αυξάνεται αναλογικά συναρτήσει του λόγου m/z. Ακριβώς αντίθετη λογική παρατηρείται στην περίπτωση του αναλυτή χρόνου πτήσης όπου η διακριτική ικανότητα παραμένει σταθερή, ενώ η διακρισιμότητα μειώνεται αναλογικά συναρτήσει του λόγου m/z. Τέλος, σε άλλες περιπτώσεις τόσο η διακρισιμότητα όσο και η διακριτική ικανότητα μεταβάλλονται συναρτήσει του λόγου m/z. II. Ακρίβεια μάζας Η ακρίβεια μάζας (mass accuracy) αποτελεί το χαρακτηριστικό επίδοσης ενός αναλυτή μάζας που φανερώνει την ακρίβεια μα την οποία αποδίδονται οι διάφορες τιμές του λόγου m/z. Πιο συγκεκριμένα, ως ακρίβεια μάζας ορίζεται η διαφορά που σημειώνεται μεταξύ μιας πειραματικά προσδιοριζόμενης τιμής m/z (measured mass) και της αντίστοιχης θεωρητικά υπολογιζόμενης τιμής m/z (theoretical mass). Η διαφορά αυτή εκφράζεται είτε 25

με απόλυτο τρόπο ως χιλιοστά του Da (mda) είτε με σχετικό τρόπο ως μέρη στο εκατομμύριο (parts per million/ppm) χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: ttheeeeeeeeeeeeeeeeee mmmmmmmm mmmmmmmmmmmmmmmm mmmmmmmm ttheeeeeeeeeeeeeeeeee mmmmmmmm 10 6 Με τον όρο θεωρητικά υπολογιζόμενη τιμή m/z αναφερόμαστε στη μονοϊσοτοπική μάζα του υπό εξέταση ιόντος. Η μονοϊσοτοπική μάζα υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την ακριβή μάζα των φυσικά αφθονότερων ισοτόπων των στοιχείων που απαρτίζουν το ιόν. Η ακρίβεια μάζας βελτιώνεται με την αύξηση της διακριτικής ικανότητας. Το γεγονός αυτό οφείλεται στο ότι όσο μεγαλύτερη είναι η διακριτική ικανότητα ενός αναλυτή μάζας τόσο μικρότερο είναι το εύρος των λαμβανομένων φασματικών κορυφών και κατ επέκταση τόσο μεγαλύτερη είναι η ακρίβεια με την οποία αποδίδονται οι τιμές m/z στις προκύπτουσες κορυφές. Όσο η πειραματικά προσδιοριζόμενη τιμή m/z προσεγγίζει την μονοϊσοτοπική μάζα ενός ιόντος τόσο περισσότερες πληροφορίες λαμβάνονται σχετικά με τη στοιχειακή σύσταση του ιόντος. Μάλιστα, στην περίπτωση άπειρης ακρίβειας μάζας, η πειραματικά προσδιοριζόμενη τιμή m/z μπορεί να αποδώσει την στοιχειακή σύσταση του ιόντος. Η δεδομένη σκέψη, αν και διαθέτει τεράστια θεωρητική βάση, δεν μπορεί να εφαρμοστεί καθολικά σήμερα καθώς οι απαντώμενοι αναλυτές μάζας παρέχουν περιορισμένη ακρίβεια μάζας, με αποτέλεσμα η άντληση ποιοτικής πληροφορίας να είναι δυνατή μόνο σε περιπτώσεις ιόντων μικρού μοριακού βάρους. III. Εύρος μάζας Το εύρος μάζας (mass range) καθορίζει το εύρος του λόγου m/z μέσα στο οποίο ο αναλυτής μάζας μπορεί να μετρήσει ιόντα. Εκφράζεται συνήθως σε Thompson (Th) ή Dalton (Da). IV. Ταχύτητα ανάλυσης ή ταχύτητα σάρωσης Η ταχύτητα ανάλυσης ή ταχύτητα σάρωσης (Analysis speed/scan speed) αποτελεί το ρυθμό με τον οποίο ένα φασματόμετρο σαρώνει ένα συγκεκριμένο εύρος μάζας. Το παραπάνω μέγεθος εκφράζεται σε μονάδες ατομικής μάζας ανά δευτερόλεπτο (amu/s) ή μονάδες ατομικής μάζας ανά χιλιοστό του δευτερολέπτου (amu/ms). V. Απόδοση εκπομπής Η απόδοση εκπομπής (Transmission) ισούται με το λόγο του αριθμού των ιόντων που φτάνουν στον ανιχνευτή προς τον αριθμό των ιόντων που εισέρχονται στον αναλυτή μάζας. Η απόδοση εκπομπής μας πληροφορεί σχετικά με ιοντικές απώλειες που σημειώνονται σε διάφορα τμήματα του αναλυτή μάζας όπως για παράδειγμα στους ηλεκτροστατικούς φακούς. 26

1.5.1 Αναλυτής μαγνητικού τομέα (23) Ο αναλυτής μαγνητικού τομέα (magnetic sector analyzer) αποτέλεσε τον πρώτο αναλυτή μάζας που χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια της φασματομετρίας μάζας. Η λειτουργία του δεδομένου αναλυτή μάζας βασίζεται στη δύναμη που ασκεί ένα μαγνητικό πεδίο σε διερχόμενα ιόντα. Πιο συγκεκριμένα, ο αναλυτής μαγνητικού τομέα αποτελείται από μια σχισμή εισόδου, έναν μαγνήτη σφηνοειδούς σχήματος και μια σχισμή εξόδου (Σχήμα 1.14). Οι προαναφερθείσες οργανολογικές μονάδες διατάσσονται με τέτοια αρχιτεκτονική ώστε μόνο ιόντα που εκτελούν τμήμα κυκλικής κίνησης συγκεκριμένης ακτίνας r να φτάνουν στη σχισμή εξόδου και τελικά να ανιχνεύονται. Για να μπορέσει ένα ιόν να εκτελέσει κυκλική κίνηση ακτίνας r θα πρέπει να ασκηθεί κάποια κεντρομόλος δύναμη F : FF = mmuu2 rr Τον ρόλο αυτής της δύναμης παίζει η δύναμη του μαγνητικού πεδίου F : FF = BBBBBBBB Επίσης όλα τα ιόντα έχουν περίπου την ίδια κινητική ενέργεια καθώς επιταχύνονται προς τον αναλυτή μάζας με το ίδιο δυναμικό V : KKKK = zzzzzz = 1 2 mmuu2 Αν εξισώσουμε τον τύπο της κεντρομόλου και μαγνητικής δύναμης και αντικαταστήσουμε τον όρο της ταχύτητας στον τύπο της κινητικής ενέργειας προκύπτει η ακόλουθη σχέση : mm zz = BB2 rr 2 ee 2VV Η φυσική ερμηνεία αυτής της σχέσης είναι ότι για δεδομένες τιμές έντασης μαγνητικού πεδίου B και δυναμικού επιτάχυνσης V, μόνο ιόντα συγκεκριμένης τιμής m/z μπορούν να εκτελέσουν την επιθυμητή κυκλική κίνηση ακτίνας r και συνεπώς να φτάσουν στη σχισμή εξόδου. Με τον τρόπο αυτό επιτελείται ο διαχωρισμός των ιόντων της εισερχόμενης δέσμης. Η λήψη ενός φάσματος μάζας επιτυγχάνεται με τη μεταβολή της έντασης του μαγνητικού πεδίου, διατηρώντας σταθερό το δυναμικό επιτάχυνσης. Επίσης, αν και δεν χρησιμοποιείται ευρέως, η αντίθετης λογικής διαδικασία μπορεί με ανάλογο τρόπο να παραγάγει το φάσμα μάζας. Οι σημαντικότεροι περιορισμοί του δεδομένου αναλυτή μάζας σχετίζονται με την αδυναμία απόδοσης της ίδιας ακριβώς κινητικής ενέργειας σε όλα τα παραγόμενα ιόντα πριν από την είσοδό τους στο μαγνητικό πεδίο. Το γεγονός αυτό οφείλεται τόσο στην εγγενή κατανομή της κινητικής ενέργειας που διαθέτουν τα ουδέτερα μόρια πριν τον ιοντισμό τους, όσο και στις ατέλειες του ηλεκτρικού πεδίου που χρησιμοποιείται για την επιτάχυνσή τους. Αποτέλεσμα αυτών είναι η περιορισμένη διακριτική ικανότητα που διαθέτει ο απλός αναλυτής μαγνητικού τομέα. Η εισαγωγή μιας περαιτέρω οργανολογικής μονάδας βοήθησε στην επίλυση του δεδομένου προβλήματος και σήμανε την ανάπτυξη του αναλυτή μαγνητικού τομέα διπλής εστίασης (double focusing magnetic sector analyzer). 27

Πιο συγκεκριμένα, η χρήση ενός ηλεκτροστατικού πεδίου ως φίλτρο κινητικής ενέργειας επιτρέπει τη σημαντική μείωση της κατανομής της κινητικής ενέργειας των ιόντων που εισέρχονται στο μαγνητικό πεδίο. Με τον τρόπο αυτό, το εύρος των λαμβανομένων φασματικών κορυφών μειώνεται δραστικά, επιτυγχάνοντας σημαντική αύξηση της διακριτικής ικανότητας. Σχήμα 1.14 Σχηματική απεικόνιση αναλυτή μαγνητικού τομέα (1) εισερχόμενη ιοντική ακτίνα, (2) σχισμή εισόδου, (3) μαγνητικό πεδίο, (4) ακτίνα κυκλικής κίνησης, (5) σχισμή εξόδου, (6) ανιχνευτής ιόντων. 1.5.2 Αναλυτής κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντος με μετασχηματισμό Fourier (24) Ο αναλυτής κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντος με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance analyzer/ft-icr) αποτελεί έναν ιδιαίτερο αναλυτή μάζας που διαφοροποιείται αισθητά από τις προαναφερθείσες οργανολογίες. Η λειτουργία του δεδομένου αναλυτή μάζας βασίζεται στην κίνηση που εκτελεί ένα ιόν στο εσωτερικό ενός ισχυρού ομοιογενούς μαγνητικού πεδίου σταθερής έντασης Β. Πιο συγκεκριμένα, η κίνηση αυτού του ιόντος είναι κυκλική, λαμβάνει χώρα κάθετα ως προς τη διεύθυνση του μαγνητικού πεδίου και διατηρεί γωνιακή συχνότητα ω που εξαρτάται από τη τιμή m/z : ωω = zzzzzz mm Ο παραπάνω τύπος υποδεικνύει ότι ο υπολογισμός της τιμής m/z ενός ιόντος είναι δυνατός, αρκεί να γνωρίζουμε τη γωνιακή συχνότητα ω. Με τη σειρά της, η γωνιακή συχνότητα ω μπορεί να προσδιοριστεί με τη βοήθεια ενός ηλεκτροδίου ανίχνευσης. Αναλυτικότερα, εάν το κυκλικά κινούμενο ιόν βρεθεί σε μικρή απόσταση από την επιφάνεια του ηλεκτροδίου ανίχνευσης, τότε το ηλεκτρόδιο διαρρέεται από επαγωγικό ρεύμα που διατηρεί συχνότητα ίση με τη γωνιακή συχνότητα ω. Από οργανολογικής άποψης, ο αναλυτής FT-ICR αποτελείται από τρία ζεύγη τετράγωνων ηλεκτροδίων, διατεταγμένα με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζουν ένα κυβικό κελί που διατηρείται στο εσωτερικό του μαγνητικού πεδίου (Σχήμα 1.15). Το πρώτο ζεύγος ηλεκτροδίων εξυπηρετεί την είσοδο και την ακόλουθη παγίδευση των παραγόμενων ιόντων στο κέντρο του κυβικού κελιού. Πιο συγκεκριμένα, ένα εκ των δύο ηλεκτροδίων φέρει οπή 28

μέσω της οποίας εισέρχονται τα παραγόμενα ιόντα, ενώ και στα δύο ηλεκτρόδια εφαρμόζεται κατάλληλο δυναμικό παγίδευσης με αποτέλεσμα να περιορίζεται η κίνηση των ιόντων στο εσωτερικό του κελιού. Το δεύτερο ζεύγος ηλεκτρονίων είναι υπεύθυνο για την καταγραφή του επαγωγικού ρεύματος που προκύπτει από την κίνηση των ιόντων. Ωστόσο, για να καταστεί δυνατή η επαγωγή ρεύματος στα ηλεκτρόδια ανίχνευσης θα πρέπει τα ιόντα να κινηθούν πολύ κοντά στην επιφάνειά τους. Η προσέγγιση των ιόντων στην επιφάνεια των ηλεκτροδίων ανίχνευσης πραγματοποιείται με τη βοήθεια ενός φαινομένου που ονομάζεται κυκλοτρονιακός συντονισμός. Το δεδομένο φαινόμενο προβλέπει ότι η εφαρμογή ενός εγκάρσιου μεταβαλλόμενου ηλεκτρικού πεδίου που πάλλεται με συχνότητα ίση της γωνιακής συχνότητας ω προκαλεί συνεχή αύξηση της ακτίνας r της κυκλικής τροχιάς του περιστρεφόμενου ιόντος, με αποτέλεσμα να προκύπτει μια σπειροειδής κίνηση. Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι παρά τη συνεχή αύξηση της ακτίνας r, η γωνιακή συχνότητα ω παραμένει σταθερή, οπότε δεν επηρεάζεται ο προσδιορισμός της τιμής m/z του ιόντος. Το προαναφερθέν μεταβαλλόμενο πεδίο παράγεται με τη βοήθεια του τρίτου ζεύγους ηλεκτροδίων που είναι γνωστά ως ηλεκτρόδια διέγερσης. Η λήψη του φάσματος μάζας βασίζεται στην καταγραφή της ελεύθερης επαγόμενης απόσβεσης (Free Induction Decay/FID). Πιο συγκεκριμένα, η FID αποτελεί τη σύνθεση όλων των διαφορετικών επαγωγικών ρευμάτων που παράγονται στα ηλεκτρόδια ανίχνευσης λόγω της κίνησης των ιόντων. Απαραίτητη προϋπόθεση για την καταγραφή της FID, είναι η εκπομπή ενός ηλεκτρικού παλμού από τα ηλεκτρόδια διέγερσης, προκειμένου τα αναλυόμενα ιόντα να προσεγγίσουν την επιφάνεια των ηλεκτροδίων ανίχνευσης. Επειδή η FID αποτελεί χρονική συνάρτηση του αναλυτικού σήματος μετατρέπεται με τη βοήθεια του μετασχηματισμού Fourier σε συνάρτηση συχνοτήτων. Τέλος, η συνάρτηση συχνοτήτων μετατρέπεται στο φάσμα μάζας. Σχήμα 1.15 Σχηματική απεικόνιση FT-ICR (1) εισερχόμενη ιοντική ακτίνα, (2) ηλεκτρόδια παγίδευσης, (3) ηλεκτρόδια διέγερσης, (4) ηλεκτρόδια ανίχνευσης. 29

1.5.3 Αναλυτής χρόνου πτήσης (25,26) Ο αναλυτής χρόνου πτήσης (Time of Flight analyzer/tof) αποτελεί ένα σημαντικό αναλυτή μάζας που τις τελευταίες δεκαετίες γνωρίζει τεράστια απήχηση λόγω αρκετών οργανολογικών βελτιστοποιήσεων. Η αρχή διαχωρισμού των παραγόμενων ιόντων βασίζεται στην ελεύθερη κίνηση σωμάτων που διατηρούν ίδια κινητική ενέργεια. Πιο συγκεκριμένα, τα παραγόμενα ιόντα επιταχύνονται αρχικά με τη βοήθεια ενός ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου και στη συνέχεια εισέρχονται σε ένα θάλαμο πτήσης ελεύθερο ηλεκτρομαγνητικών πεδίων. Αυτή η αλληλουχία γεγονότων αποδίδει την ίδια κινητική ενέργεια σε όλα τα ιόντα, τα οποία με τη σειρά τους αναπτύσσουν διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με το λόγο m/z. Εφόσον τα ιόντα διατηρούν διαφορετική ταχύτητα θα χρειαστούν διαφορετικό χρόνο για να διατρέξουν το θάλαμο πτήσης μήκους L, στο τέλος του οποίου υπάρχει ένας ανιχνευτής ιόντων. Ο υπολογισμός του χρόνου πτήσης επιτρέπει τον προσδιορισμό του λόγου m/z, σύμφωνα με την ακόλουθη σχέση : tt 2 = mm zz LL2 2eeee Η μέχρι στιγμής περιγραφή αντιστοιχεί στο γραμμικό αναλυτή χρόνου πτήσης (Linear Time of Flight analyzer/ltof) που είναι συμβατός μόνο με πηγές ιοντισμού που λειτουργούν με παλμικό τρόπο (π.χ MALDI) και χαρακτηρίζεται από χαμηλή διακριτική ικανότητα. Οι δεδομένοι περιορισμοί ξεπεράστηκαν με την εισαγωγή οργανολογικών τροποποιήσεων επιτρέποντας τη διεύρυνση των εφαρμογών του αναλυτή χρόνου πτήσης. Αναφορικά με τη χαμηλή διακριτική ικανότητα του συμβατικού αναλυτή χρόνου πτήσης, αυτή οφείλεται στην αδυναμία απόδοσης της ίδιας ακριβώς κινητικής ενέργειας σε όλα τα αναλυόμενα ιόντα. Η εισαγωγή ενός ηλεκτροστατικού ανακλαστήρα στο τέλος του θαλάμου πτήσης, σε συνδυασμό με τη μετατόπιση του ανιχνευτή ιόντων δίπλα από την είσοδο του θαλάμου, επέτρεψε τη σημαντική μείωση της διασποράς του χρόνου πτήσης ιόντων ίδιου λόγου m/z που διατηρούν μικρές διαφορές κινητικής ενέργειας. Ο ηλεκτροστατικός ανακλαστήρας αποτελείται από μια σειρά κυκλικών ηλεκτροδίων και δρα ως ιοντικός καθρέπτης ανακλώντας τα εισερχόμενα ιόντα. Οι μικρές διαφορές στην κινητική ενέργεια ιόντων που διατηρούν ίδιο λόγο m/z αντισταθμίζονται από τους διαφορετικούς χρόνους που απαιτούνται για την πλήρη ανάκλασή τους (Σχήμα 1.16). Με τον τρόπο αυτό, η διόρθωση στους χρόνους πτήσης των αναλυόμενων ιόντων αποζημιώνει την αρχική διασπορά της κινητικής ενέργειας επιτρέποντας τον ακριβέστερο προσδιορισμό του λόγου m/z. Στη δεδομένη λογική στηρίχθηκε η ανάπτυξη του αναλυτή χρόνου πτήσης με ανακλαστήρα (Reflector Time of Flight analyzer/rtof). Όπως μπορούμε εύκολα να καταλάβουμε, ο αναλυτής χρόνου πτήσης λειτουργεί με μια παλμική λογική, η οποία προϋποθέτει την παραγωγή ιόντων κατά διακριτό τρόπο. Η δεδομένη σύμβαση διασφαλίζει ότι όλα τα αναλυόμενα ιόντα διατηρούν κοινό σημείο έναρξης πτήσης και αποτελεί ενδογενές χαρακτηριστικό των παλμικών πηγών ιοντισμού. Η διασύνδεση του αναλυτή χρόνου πτήσης με μια συνεχή πηγή ιοντισμού επιτεύχθηκε με την ανάπτυξη ειδικής οργανολογίας που επιτρέπει τη διακριτή δειγματοληψία των συνεχώς παραγόμενων ιόντων. Η δεδομένη διαδικασία λαμβάνει χώρα σε δύο στάδια με το πρώτο 30

να ταξινομεί τα παραγόμενα ιόντα σε μια λεπτή ιοντική δέσμη και το δεύτερο να δειγματοληπτεί διακριτά και κάθετα ως προς τη διεύθυνση της δέσμης. Η δημιουργία της ιοντικής δέσμης πραγματοποιείται με τη βοήθεια ενός εξαπόλου, ενώ η κάθετη εξαγωγή ιόντων μεσολαβείται από ένα παράλληλο ως προς τη δέσμη ηλεκτρόδιο που έπεται του εξαπόλου. Μόλις τα ιόντα εξέλθουν από την κύρια ροή της δέσμης επιταχύνονται υπό την επίδραση ενός ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου και εισέρχονται τελικά στο θάλαμο πτήσης. Η παραπάνω λογική αποτελεί την αρχή λειτουργίας του αναλυτή χρόνου πτήσης ορθογώνιας επιτάχυνσης (Orthogonal Acceleration Time of Flight analyzer/oa-tof) (Σχήμα 1.17). Ο αναλυτής χρόνου πτήσης αποτελεί σήμερα έναν από τους περισσότερο διαδεδομένους αναλυτές μάζας διατηρώντας μοναδικά χαρακτηριστικά όπως σχεδόν απεριόριστο εύρος μάζα, υψηλό ρυθμό σάρωσης και μεγάλη διακριτική ικανότητα. Σχήμα 1.16 Σχηματική απεικόνιση του LTOF (άνω) και του RTOF (κάτω) (1) πηγή ιοντισμού, (2) ανιχνευτής ιόντων, (3) ηλεκτρόδιο επιτάχυνσης, (4) εισερχόμενη ιοντική ακτίνα, (5) θάλαμος πτήσης, (6) ηλεκτροστατικός ανακλαστήρας. 31

Σχήμα 1.17 Σχηματική απεικόνιση του oa-tof (1) εισερχόμενη δέσμη ιόντων, (2) εξάπολο, (3) ηλεκτρόδιο κάθετης εξαγωγής, (4) ηλεκτρόδιο επιτάχυνσης, (5) θάλαμος πτήσης, (6) ηλεκτροστατικός ανακλαστήρας, (7) ανιχνευτής ιόντων. 1.5.4 Ηλεκτροστατική παγίδα (27) Η λειτουργία της ηλεκτροστατικής παγίδας (orbitrap) βασίζεται στην αρμονική ταλάντωση ιόντων που λαμβάνει χώρα σε ένα ιδιαίτερο ηλεκτροστατικό πεδίο. Πιο συγκεκριμένα, το orbitrap αποτελείται από ένα εξωτερικό και ένα εσωτερικό ηλεκτρόδιο, με το πρώτο να διατηρεί μορφή βαρελιού διαιρεμένο σε δύο ίδια μέρη και με το δεύτερο να διατηρεί μορφή ατράκτου (Σχήμα 1.18). Στο εσωτερικό ηλεκτρόδιο εφαρμόζεται ηλεκτροστατικό δυναμικό αρκετών Volt (περίπου 3200 V κατά απόλυτη τιμή) ενώ το εξωτερικό ηλεκτρόδιο διατηρείται γειωμένο. Τα αναλυόμενα ιόντα διατηρώντας κινητική ενέργεια αρκετών ev, εισέρχονται εφαπτομενικά στο orbitrap διαμέσου του κενού που απαντά μεταξύ των δύο τμημάτων του εξωτερικού ηλεκτροδίου. Πριν την εισαγωγή τους στο orbitrap, τα αναλυόμενα ιόντα αποθηκεύονται σε μια δεύτερη παγίδα ιόντων που συνήθως είναι μια γραμμική παγίδα ιόντων ή μια παγίδα ιόντων σχήματος C. Τα εισερχόμενα ιόντα παγιδεύονται εντός του orbitrap λόγω της συνισταμένης επίδρασης ηλεκτροστατικών και φυγόκεντρων δυνάμεων. Ειδικότερα, τα ιόντα περιστρέφονται γύρω από το εσωτερικό ηλεκτρόδιο και ταυτόχρονα ταλαντεύονται κατά μήκος του άξονά τους, συνθέτοντας μια περίπλοκη σπειροειδή κίνηση. Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η συχνότητα αξονικής ταλάντωσης των ιόντων εξαρτάται αποκλειστικά και μόνο από το λόγο m/z, όπως φαίνεται στην ακόλουθη σχέση : ωω = kkkk mm 32

k : σταθερά που εξαρτάται από το σχήμα των ηλεκτροδίων και τη τιμή του εφαρμοζόμενου δυναμικού Με τον τρόπο αυτό, ο προσδιορισμός της αξονικής συχνότητας ω επιτρέπει τον υπολογισμό του λόγου m/z των ιόντων. Ο δεδομένος προσδιορισμός βασίζεται στην παραγωγή επαγωγικού ρεύματος στο εξωτερικό ηλεκτρόδιο λόγω της αξονικής ταλάντωσης των ιόντων. Στη συνέχεια, η εφαρμογή ενός μετασχηματισμού Fourier στο παρατηρούμενο επαγωγικό ρεύμα επιτρέπει την παραγωγή ενός φάσματος συχνοτήτων, το οποίο πολύ εύκολα μεταφράζεται στο φάσμα μάζας. Το orbitrap διατηρεί τεράστια διακριτική ικανότητα, υψηλή ακρίβεια μάζας και σχετικά μεγάλο εύρος μάζας επιτρέποντας την εξυπηρέτηση εξειδικευμένων εφαρμογών. Σχήμα 1.18 Σχηματική απεικόνιση εγκάρσιας τομής orbitrap (1) εισερχόμενη δέσμη ιόντων, (2) εξωτερικό ηλεκτρόδιο, (3) εσωτερικό ηλεκτρόδιο. 1.5.5 Τετραπολικός αναλυτής μάζας (28,29) Ο τετραπολικός αναλυτής μάζας (Quadrupole Mass Analyzer, Q) αποτελεί το συνηθέστερο τύπο αναλυτή μάζας που χρησιμοποιείται στη φασματομετρία μάζας (Σχήμα 1.19). Χαρακτηρίζεται από μικρό μέγεθος, σχετικά μικρό κόστος και μεγάλη μηχανική σταθερότητα. Επίσης έχει το πλεονέκτημα των υψηλών ταχυτήτων σάρωσης, με αποτέλεσμα ολόκληρο το φάσμα μάζας να λαμβάνεται σε χρόνο μικρότερο των 100 ms. Καρδιά του τετραπολικού αναλυτή μάζας, αποτελούν οι τέσσερις παράλληλες κυλινδρικές ράβδοι, οι οποίες δρουν ως ηλεκτρόδια. Οι διαγώνιες ράβδοι συνδέονται ηλεκτρικά μεταξύ τους. Το ένα ζεύγος συνδέεται με το θετικό πόλο μιας πηγής μεταβλητού δυναμικού συνεχούς ρεύματος (DC, Direct Current), ενώ το άλλο με τον αρνητικό πόλο της πηγής. Επιπλέον σε κάθε ζεύγος ράβδων εφαρμόζονται μεταβλητά δυναμικά εναλλασσόμενου ρεύματος (AC, Alternative Current), που μεταξύ τους βρίσκονται σε διαφορά φάσης 180 ο. Συνολικά, στα δύο ζεύγη ράβδων εφαρμόζονται τα εξής συνιστάμενα δυναμικά : V (t) = -V DC -V ACcosωt V (t) = V DC + V ACcosωt 33

Για να ληφθεί το φάσμα μάζας, τα ιόντα επιταχύνονται στο χώρο ανάμεσα στις ράβδους με ένα δυναμικό 5 έως 10 V. Απαραίτητη προϋπόθεση για να διασχίσουν ιόντα το δίαυλο που σχηματίζεται μεταξύ των ράβδων, είναι να διαθέτουν κατάλληλο λόγο m/z, ώστε να διατηρούν σταθερή τροχιά καθ όλη τη διαδρομή και έτσι να μην προσκρούσουν σε κάποια ράβδο χάνοντας το φορτίο τους. Πιο συγκεκριμένα, το ένα ζεύγος ράβδων λειτουργεί ως υψιπερατό φίλτρο μαζών σε ένα επίπεδο και το άλλο ζεύγος ράβδων λειτουργεί ως βαθυπερατό φίλτρο μαζών σε επίπεδο που είναι κάθετο στο πρώτο. Με τον τρόπο αυτό, για δεδομένη συχνότητα ω του εναλλασσόμενου ρεύματος και δεδομένες τιμές V DC και V AC μόνο ιόντα με λόγους m/z που βρίσκονται σε μια στενή περιοχή τιμών έχουν σταθερή τροχιά και κατευθύνονται προς τον ανιχνευτή ιόντων. Τα υπόλοιπα ιόντα έχουν ασταθείς τροχιές, προσκρούουν στις ράβδους και χάνουν το φορτίο τους. Σχήμα 1.19 Σχηματική απεικόνιση του τετραπολικού αναλυτή μάζας. Θα πρέπει να τονίσουμε ότι η διακριτική ικανότητα ενός τετραπολικού αναλυτή μάζας προσδιορίζεται από το λόγο των δυναμικών AC προς DC και μεγιστοποιείται, όταν ο λόγος αυτός είναι λίγο μικρότερος από 6. Με τον τρόπο αυτό, προκειμένου να διατηρείται η μέγιστη δυνατή διακρισιμότητα, οι τετραπολικοί αναλυτές μαζών λειτουργούν με σταθερό τον παραπάνω λόγο και σε τιμή περίπου 6. Η σάρωση ενός φάσματος μάζας πραγματοποιείται με την ταυτόχρονη αύξηση από το μηδέν έως μια μέγιστη τιμή (± 250 V για το δυναμικό DC και 1500 V για το δυναμικό AC) τόσο του δυναμικού DC, όσο και του δυναμικού AC. Σε κάθε περίπτωση ο λόγος των δυναμικών AC προς DC διατηρείται σταθερός. Με την παραπάνω λογική, σε κάθε χρονική στιγμή της σάρωσης, έχουμε διαφορετικές τιμές του δυναμικού AC και DC με αποτέλεσμα να επιτρέπεται η διέλευση και κατ επέκταση η ανίχνευση ιόντων συγκεκριμένου λόγου m/z και να συγκροτείται το φάσμα μάζας. Ο τετραπολικός αναλυτής μάζας ενδείκνυται για ποσοτικούς προσδιορισμούς και χρησιμοποιείται ευρέως σε συζευγμένες αναλυτικές τεχνικές όπως η υγροχρωματογραφία - φασματομετρία μάζας (LC/MS). Οι μέτριες απαιτήσεις κενού (10-5 Torr) τον καθιστούν 34

ιδανικό για σύζευξη με πηγές ιοντισμού ατμοσφαιρικής πίεσης. Επίσης, η μεγάλη ταχύτητα σάρωσης (> 1000 amu/s) επιτρέπει τη λήψη φάσματος μάζας μέσα σε λίγα ms. Θα μπορούσαμε να πούμε ότι ο τετραπολικός αναλυτής μαζών μειονεκτεί στο επίπεδο της διακριτικής ικανότητας (R = 1000-2000) και στο εύρος μάζας που δεν μπορεί να ξεπεράσει τα 2000 amu. 1.5.6 Παγίδες ιόντων Με τον όρο παγίδα ιόντων (Ion Trap, IT) αναφερόμαστε σε έναν τύπο αναλυτή μάζας, που χρησιμοποιεί ένα ταλαντευμένο ηλεκτρικό πεδίο, προκειμένου να αποθηκεύει ιόντα. Η λειτουργία της παγίδας ιόντων βασίζεται στη δημιουργία ενός τετραπολικού πεδίου, ταλαντευόμενου στην περιοχή των ραδιοσυχνοτήτων (Radio Frequency, RF), το οποίο μπορεί να παγιδεύει ιόντα σε δύο ή τρεις διαστάσεις. Με βάση τον παραπάνω ορισμό οι παγίδες ιόντων μπορούν να διακριθούν σε δύο κατηγορίες : τις τρισδιάστατες ή τετραπολικές παγίδες ιόντων (3D-Ion Trap/3D-IT, Quadrupole Ion Trap, QIT, Paul Ion Trap) που προηγήθηκαν χρονικά και τις δισδιάστατες ή γραμμικές παγίδες ιόντων (2D Ion Trap/2D-IT, Linear Ion Trap/LIT), που αναπτύχθηκαν αργότερα. Αυτοί οι δύο τύποι αναλυτών μάζας, διαφοροποιούνται αρκετά, τόσο σε επίπεδο οργανολογικής διάταξης, όσο και σε επίπεδο ποιοτικών χαρακτηριστικών απόδοσης. 1.5.6.1 Τετραπολική παγίδα ιόντων (29) Η τετραπολική παγίδα ιόντων αποτελείται από ένα κεντρικό δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο (Ring electrode) και από δύο ελλειψοειδή πλευρικά ηλεκτρόδια-κάλυπτρα (End-cap electrodes). Θα μπορούσαμε να φανταστούμε την τετραπολική παγίδα ιόντων ως έναν τετραπολικό αναλυτή μάζας κατάλληλα λυγισμένο, ώστε να προκύπτει ένας κλειστός βρόγχος (Σχήμα 1.20). Σύμφωνα με την παραπάνω αναλογία, η εξωτερική ράβδος του τετραπολικού αναλυτή αντιστοιχεί στο δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο της παγίδας ιόντων, η εσωτερική ράβδος έχει συρρικνωθεί σε σημειακό επίπεδο, ενώ οι άνω και κάτω ράβδοι αποτελούν τα ηλεκτρόδια-κάλυπτρα. Η εφαρμογή δυναμικού που αποτελείται από συνεχείς και εναλλασσόμενες συνιστώσες, δημιουργεί ένα τρισδιάστατο ηλεκτρικό πεδίο μέσα στο οποίο παγιδεύονται τα ιόντα, διαφορετικού λόγου m/z, που παρήχθησαν νωρίτερα στην πηγή ιοντισμού. Τα ιόντα αυτά, εξαναγκάζονται σε τρισδιάστατες τροχιές και στη συνέχεια αποσταθεροποιούνται με τη βοήθεια κατάλληλης τεχνικής, προκειμένου να εξέλθουν της παγίδας ιόντων, συναρτήσει του λόγου m/z και να φτάσουν στον ανιχνευτή ιόντων συγκροτώντας το φάσμα μάζας. Για να αποφευχθούν αλλοιώσεις στις τροχιές των ιόντων, λόγω των απωστικών δυνάμεων που αναπτύσσονται μεταξύ τους, μέσα στην παγίδα ιόντων υπάρχει ποσότητα αέριου ηλίου που μέσω σύγκρουσης αφαιρεί την πλεονάζουσα ενέργεια από τα ιόντα. Οι περισσότερες, εμπορικά διαθέσιμες τετραπολικές παγίδες ιόντων, λειτουργούν εφαρμόζοντας ένα εναλλασσόμενο δυναμικό RF στο δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο. Το δυναμικό αυτό διατηρεί σταθερή συχνότητα, αλλά το πλάτος του μπορεί να ποικίλλει. Επιπλέον, εναλλασσόμενα δυναμικά RF συγκεκριμένης συχνότητας και πλάτους μπορούν να εφαρμοστούν στα ηλεκτρόδια-κάλυπτρα. Τα ιόντα που δημιουργήθηκαν στην πηγή ιοντισμού, εισέρχονται στην παγίδα ιόντων, μέσω οπών που 35

βρίσκονται στο άνω ηλεκτρόδιο-κάλυπτρο και αφού αναλυθούν, εξέρχονται συναρτήσει του λόγου m/z, από αντίστοιχες οπές που διαθέτει το κάτω ηλεκτρόδιο-κάλυπτρο. Η τετραπολική παγίδα ιόντων μπορεί να αναλύσει τα ιόντα που έχει αποθηκεύσει με την εφαρμογή δυο διαφορετικών τεχνικών. Στην πρώτη περίπτωση εφαρμόζεται στο δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο ένα εναλλασσόμενο δυναμικό RF, με συγκεκριμένη συχνότητα και μεταβλητό πλάτος, ενώ τα ηλεκτρόδια-κάλυπτρα διατηρούνται γειωμένα. Η σάρωση του πλάτους του εναλλασσόμενου δυναμικού RF, οδηγεί στη σταδιακή αποσταθεροποίηση των αποθηκευμένων ιόντων και κατ επέκταση στην ανάλυσή τους βάσει του λόγου m/z. Στη δεύτερη περίπτωση το πλάτος του δυναμικού που εφαρμόζεται στο δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο δεν μεταβάλλεται, αλλά έχουμε την εφαρμογή εναλλασσόμενων δυναμικών RF, με συγκεκριμένη συχνότητα, στα ηλεκτρόδια-κάλυπτρα. Η συχνότητα των δυναμικών αυτών, αντιστοιχεί στη συχνότητα συντονισμού ιόντων με συγκεκριμένο λόγο m/z, με αποτέλεσμα την αποσταθεροποίησή τους. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η εκλεκτική έξοδος των αποθηκευμένων ιόντων και κατ επέκταση η ανάλυσή τους βάσει του λόγου m/z. Σχήμα 1.20 Σχηματική απεικόνιση τετραπολικής παγίδας ιόντων. 1.5.6.2 Γραμμική παγίδα ιόντων (30) Η γραμμική παγίδα ιόντων, γνωστή και ως δισδιάστατη παγίδα ιόντων, μοιάζει αρκετά με τον τετραπολικό αναλυτή μάζας, καθώς αποτελείται από τέσσερις παράλληλες ράβδους οι οποίες ωστόσο, καταλήγουν σε τελικά ηλεκτρόδια-φακούς. Τα τελικά ηλεκτρόδια αποσκοπούν στην παγίδευση των ιόντων, καθώς τα διατηρούν στο χώρο που σχηματίζεται μεταξύ των ράβδων. Σε αυτό τον τύπο αναλυτή μάζας η κίνηση των ιόντων στην ακτινική διάσταση περιορίζεται με τη βοήθεια ενός τετραπολικού πεδίου, ενώ η κίνηση στην αξονική διάσταση περιορίζεται από τα ηλεκτρικά πεδία των τελικών ηλεκτροδίων. Πιο 36

συγκεκριμένα, η ταυτόχρονη εφαρμογή εναλλασσόμενου δυναμικού RF στις ράβδους και συνεχούς δυναμικού (DC) στα τελικά ηλεκτρόδια, επιτρέπει την ταλαντούμενη αξονική κίνηση των ιόντων μεταξύ των τελικών ηλεκτροδίων. Η εκλεκτική έξοδος, σύμφωνα με το λόγο m/z, των παγιδευμένων ιόντων και κατ επέκταση η ανάλυσή τους μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε κατά την αξονική διάσταση, είτε κατά την ακτινική διάσταση. Με τον τρόπο αυτό, οι εμπορικά διαθέσιμες γραμμικές παγίδες ιόντων διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με τον τρόπο εξόδου των ιόντων. Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει τις παγίδες ιόντων που λειτουργούν με αξονική αποβολή των παγιδευμένων ιόντων. Η αρχή της λειτουργίας τους βασίζεται στην εφαρμογή του ίδιου εναλλασσόμενου δυναμικού RF, τόσο στη διάταξη των ράβδων όσο και στο τελικό ηλεκτρόδιο που παρεμβάλλεται μεταξύ των ράβδων και του ανιχνευτή ιόντων. Τα ιόντα που βρίσκονται κοντά στο τέλος της διάταξης των ράβδων, επηρεάζονται από τα ακραία πεδία (Fringe Fields) που αναπτύσσονται μεταξύ των δύο διατάξεων (ράβδοι και τελικό ηλεκτρόδιο), με αποτέλεσμα να επιτυγχάνεται η εκλεκτική αξονική έξοδός τους. Αντίστοιχα, η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει τις παγίδες ιόντων που λειτουργούν με βάση την ακτινική αποβολή ιόντων. Στην περίπτωση αυτή, από οργανολογικής άποψης, τα τελικά ηλεκτρόδια παραμένουν ίδια, ενώ η διάταξη των ράβδων διαφοροποιείται. Η διαφοροποίηση αυτή βασίζεται στο γεγονός, ότι μέχρι στιγμής δε διατίθεται διάταξη ράβδων που να επιτρέπει την ακτινική διέλευση ιόντων μεταξύ δύο ράβδων. Για την επίλυση του παραπάνω προβλήματος έχουν αναπτυχθεί διατάξεις ράβδων, που το ένα ζεύγος αντικρινών ράβδων φέρει επιμήκη ανοίγματα. Η εφαρμογή κατάλληλου εναλλασσόμενου δυναμικού RF σε αυτό το ζεύγος ράβδων, επιτρέπει την εκλεκτική έξοδο, μέσω των ανοιγμάτων, των παγιδευμένων ιόντων και κατ επέκταση την ανάλυσή τους βάσει του λόγου m/z. Και στους δύο τύπους παγίδων διατηρείται ποσότητα αδρανούς αερίου που προφυλάσσει τις τροχιές των ιόντων από τις απωστικές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ τους Οι γραμμικές παγίδες ιόντων πλεονεκτούν σημαντικά των τετραπολικών παγίδων ιόντων και το γεγονός αυτό περιγράφεται κυρίως σε δύο ποιοτικά χαρακτηριστικά απόδοσης. Το πρώτο χαρακτηριστικό ονομάζεται χωρητικότητα παγίδευσης (Trapping capacity) και εκφράζει το μέγιστο αριθμό ιόντων που μπορούν να αποθηκευτούν σε μια παγίδα ιόντων, χωρίς την εμφάνιση προβλημάτων λόγω ανάπτυξης απωστικών δυνάμεων. Η γραμμική παγίδα ιόντων μπορεί να αποθηκεύσει έως 20000 ιόντα σε αντίθεση με την τετραπολική παγίδα ιόντων, όπου τα παγιδευμένα ιόντα δεν πρέπει να ξεπεράσουν τα 500. Η μεγαλύτερη χωρητικότητα παγίδευσης σχετίζεται τόσο με τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της παγίδας, όσο και με την ικανότητα που διαθέτει να συγκεντρώνει τα ιόντα κατά μήκος ενός κεντρικού άξονα, παρά γύρω από ένα σημείο. Το δεύτερο χαρακτηριστικό ονομάζεται αποδοτικότητα παγίδευσης (Trapping efficiency) και εκφράζει το ποσοστό των εισερχόμενων ιόντων που τελικά αποθηκεύτηκε. Στην περίπτωση των γραμμικών παγίδων ιόντων το ποσοστό αυτό είναι μεγαλύτερο του 50% ενώ στις τετραπολικές παγίδες ιόντων είναι μόλις 5%. Τα παραπάνω ποιοτικά χαρακτηριστικά συμβάλλουν στην αυξημένη ευαισθησία και το μεγάλο εύρος μάζας που χαρακτηρίζουν τις γραμμικές παγίδες ιόντων. 37

1.6 Ανιχνευτές ιόντων (31) Ο ανιχνευτής ιόντων αποτελεί εκείνη την οργανολογική μονάδα ενός φασματόμετρου μάζας που μεταφράζει την παρουσία ιόντων σε κατάλληλο ηλεκτρικό σήμα. Η επιλογή του ιδανικού ανιχνευτή ιόντων εξαρτάται άμεσα από τα χαρακτηριστικά απόδοσης του χρησιμοποιούμενου αναλυτή μάζας. Ο απλούστερος ανιχνευτής ιόντων ονομάζεται φαραντεϊκό κύπελλο (Faraday cup) (Σχήμα 1.21) και αντιστοιχεί σε ένα κυλινδρικό ηλεκτρόδιο που φέρει μια οπή και συνδέεται με μια ηλεκτρική αντίσταση. Τα αναλυόμενα ιόντα, διέρχονται μέσω της οπής και προσκρούουν στα τοιχώματα του ηλεκτροδίου, με αποτέλεσμα η αντίσταση να διαρρέεται από ρεύμα. Το δεδομένο σήμα, μετά την ενίσχυσή του, επιτρέπει την ανίχνευση των ιόντων. Το φαραντεϊκό κύπελλο παρέχει υψηλή ακρίβεια ανάγνωσης σήματος αλλά υστερεί σημαντικά σε ευαισθησία και χρόνο απόκρισης με αποτέλεσμα να βρίσκει ελάχιστες φασματομετρικές εφαρμογές. Σχήμα 1.21 Σχηματική απεικόνιση φαραντεϊκού κυπέλλου (1) εισερχόμενη δέσμη ιόντων, (2) κυλινδρικό ηλεκτρόδιο, (3) ηλεκτρική αντίσταση. Σήμερα, οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές ιόντων βασίζονται στη λογική του ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστή (Electron Multiplier). Οι δεδομένοι ανιχνευτές ιόντων διαθέτουν κατάλληλες δυνόδους οι οποίες εκπέμπουν από την επιφάνειά τους δευτερογενή σωματίδια μετά από γεγονότα πρόσκρουσης. Σε πρώτο επίπεδο, τα αναλυόμενα ιόντα προσκρούουν στην επιφάνεια μιας ειδικής δυνόδου που ονομάζεται δύνοδος μετατροπής και διατηρείται σε υψηλό και αντίθετης πολικότητας δυναμικό (±3 έως ±30 kv). Κατά την πρόσκρουση ανιόντων απελευθερώνονται δευτερογενή κατιόντα, ενώ κατά την πρόσκρουση κατιόντων απελευθερώνονται δευτερογενή ιόντα και ηλεκτρόνια. Η δύνοδος μετατροπής ακολουθείται από ένα σύστημα διακριτών και αντικριστών δυνόδων (12-20) που διατηρούν μειούμενες τιμές αρνητικού δυναμικού. Τα εκπεμπόμενα από τη δύνοδο μετατροπής σωματίδια προσκρούουν στην πρώτη διακριτή δύνοδο απελευθερώνοντας πολλά ηλεκτρόνια. Με τη σειρά τους τα παραγόμενα ηλεκτρόνια προσκρούουν διαδοχικά στις ακόλουθες διακριτές δυνόδους επάγοντας έναν ηλεκτρονικό καταρράκτη. Αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας είναι η ταυτόχρονη με την ανίχνευση ιόντων, ενίσχυση του σήματος. Ο δεδομένος ανιχνευτής ιόντων ονομάζεται ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής διακριτής δυνόδου (Discrete Dynode Electron Multiplier) και αποτέλεσε σημείο αναφοράς αρκετών οργανολογικών παραλλαγών (Σχήμα 1.22). 38

Σχήμα 1.22 Σχηματική απεικόνιση ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστή διακριτής δυνόδου (1) εισερχόμενη δέσμη ιόντων, (2) δύνοδος μετατροπής, (3) δέσμη δευτερευόντων ηλεκτρονίων, (4) διακριτή δύνοδος, (5) παγίδα ηλεκτρονίων. Μια σημαντική παραλλαγή του προαναφερθέντος ανιχνευτή ιόντων σχετίζεται με την αντικατάσταση του συστήματος των διακριτών δυνόδων με μια συνεχή δύνοδο που διατηρεί σχήμα ευθύγραμμου ή κυρτού σωλήνα. Η κατασκευή του σωλήνα από ειδικό ημιαγωγό επιτρέπει την κατά μήκος πτώση του δυναμικού με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός αντίστοιχου ηλεκτρονικού καταρράκτη. Αυτός ο ανιχνευτής ιόντων ονομάζεται ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής καναλιού (Channel Electron Multiplier) (Σχήμα 1.23). Σχήμα 1.23 Σχηματική απεικόνιση ηλε/στή καναλιού ευθύγραμμου (α) και κυρτού σωλήνα (β) (1) εισερχόμενη δέσμη ιόντων, (2) κανάλι ηλεκτρονιοπολλαπλασιασμού, (3) δέσμη δευτερευόντων ηλεκτρονίων, (4) εξερχόμενη δέσμη ηλεκτρονίων. Άλλη μια ενδιαφέρουσα παραλλαγή προέκυψε κατά τη σημαντική μείωση των διαστάσεων του ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστή καναλιού. Πιο συγκεκριμένα, διατηρώντας διαστάσεις μικροκλίμακας αποτέλεσε τη λειτουργική μονάδα νέων οργανολογιών. Για παράδειγμα, η παράλληλη διάταξη εκατομμυρίων τέτοιων μονάδων επέτρεψε την ανάπτυξη του δίσκου μικροκαναλιών (Microchannel plate). Ο δεδομένος ανιχνευτής ιόντων μπορεί να λειτουργήσει είτε ως μια ενιαία μονάδα είτε ως μια κυψέλη αυτόνομων μονάδων. Η δεύτερη λειτουργία επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση ιόντων διαφορετικού 39

λόγου m/z που έχουν διαχωριστεί στο χώρο. Επίσης, η παράλληλη τοποθέτηση δύο και τριών δίσκων μικροκαναλιών οδήγησε στην ανάπτυξη βελτιωμένων οργανολογιών (Σχήμα 1.24). Σχήμα 1.24 Σχηματική απεικόνιση του δίσκου μικροκαναλιών (1) ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής καναλιού διαστάσεων μικροκλίμακας. Ο ηλεκτροπτικός ανιχνευτής ιόντων (Electro-Optical Ion Detector) αποτελεί έναν ανιχνευτή που διαφοροποιείται αισθητά από τις προαναφερθείσες μονάδες. Αποτελείται από μια δύνοδο μετατροπής, μια οθόνη φωσφορισμού και ένα φωτοπολλαπλασιαστή. Η λειτουργία του βασίζεται στη μετατροπή των αναλυόμενων ιόντων σε ηλεκτρόνια μέσω της δυνόδου μετατροπής, τα οποία με τη σειρά τους μετατρέπονται σε φωτόνια μέσω της οθόνης φωσφορισμού. Τελικά, τα παραγόμενα φωτόνια μετατρέπονται σε ηλεκτρικό ρεύμα μέσω του φωτοπολλαπλασιαστή επιτρέποντας την ανίχνευση των ιόντων (Σχήμα 1.25). Σχήμα 1.25 Σχηματική απεικόνιση ηλεκτροπτικού ανιχνευτή ιόντων (1) εισερχόμενη δέσμη ιόντων, (2) δύνοδος μετατροπής, (3) δέσμη δευτερευόντων ηλεκτρονίων, (4) οθόνη φωσφορισμού, (5) εκπεμπόμενα φωτόνια, (6) φωτοπολλαπλασιαστής. 1.7 Συζευγμένη φασματομετρία μάζας (32) Με τον όρο συζευγμένη φασματομετρία μάζας (Tandem mass spectrometry, MS/MS, MS n ), αναφερόμαστε σε οποιαδήποτε γενική φασματομετρική μέθοδο που περιλαμβάνει τουλάχιστον δύο στάδια ανάλυσης μάζας, σε συνδυασμό με μια διαδικασία θραυσματοποίησης, που προκαλεί αλλαγή στη μάζα και το φορτίο των αναλυόμενων ιόντων. Στα πιο συνήθη πειράματα συζευγμένης φασματομετρίας μάζας, το πρώτο στάδιο 40

ανάλυσης μάζας αποσκοπεί στην απομόνωση ενός πρόδρομου ιόντος, το οποίο μετά υφίσταται αυθόρμητη ή επαγόμενη με ενεργοποίηση θραυσματοποίηση με αποτέλεσμα την παραγωγή θυγατρικών ιόντων και ουδέτερων θραυσμάτων. Στη συνέχεια, το δεύτερο στάδιο ανάλυσης μάζας προσδιορίζει τα προκύπτοντα ιόντα. Θα μπορούσαμε να πούμε ότι τα φασματόμετρα μάζας που παρέχουν τη δυνατότητα συζευγμένης φασματομετρίας διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα με το αν η σύζευξη γίνεται στο χρόνο ή στο χώρο. Στη πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται τα όργανα που επιτυγχάνουν τη συζευγμένη φασματομετρία μάζας με την πραγματοποίηση μιας κατάλληλης αλληλουχίας γεγονότων μέσα σε μια συσκευή αποθήκευσης ιόντων. Πιο απλά, αναφερόμαστε σε φασματόμετρα μάζας που έχουν ως αναλυτή μάζας, είτε μια παγίδα ιόντων (τετραπολική ή γραμμική), είτε μια ηλεκτροστατική παγίδα, είτε έναν αναλυτή κυκλοτρονιακού συντονισμού ιόντος με μετασχηματισμό Fourier. Οι αναλυτές αυτοί είναι προγραμματισμένοι με τέτοιο τρόπο ώστε τα διαδοχικά στάδια απομόνωσης / θραυσματοποίησης να πραγματοποιούνται στο ίδιο όργανο. Ο μέγιστος αριθμός σταδίων απομόνωσης / θραυσματοποίησης είναι 7 με 8 και το δεδομένο όριο οφείλεται στο γεγονός, ότι με την πραγματοποίηση κάθε σταδίου οδηγούμαστε σε μικρότερες ποσότητες θραυσμάτων, που από κάποιο σημείο και μετά δεν μπορούν να ανιχνευθούν. Στη δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνονται φασματόμετρα μάζας που προκύπτουν από τη διαδοχική σύνδεση, φυσικά διαχωρισμένων οργάνων. Και στην περίπτωση αυτή, ο αριθμός των οργάνων που μπορούμε να διασυνδέσουμε είναι πεπερασμένος και δεν μπορεί να ξεπεράσει τα 3 με 4 όργανα. Ο περιορισμός αυτός βασίζεται στο γεγονός, ότι το κλάσμα των ιόντων που μεταδίδεται από όργανο σε όργανο είναι μικρό, με αποτέλεσμα από κάποιο σημείο και μετά να μην είναι δυνατή η ανίχνευση των ιόντων. Συνήθη φασματόμετρα μάζας που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία, περιλαμβάνουν δύο αναλυτές μάζας και επιτρέπουν τη διεξαγωγή πειραμάτων MS/MS, δηλαδή φασματομετρικών πειραμάτων, στα οποία πραγματοποιούνται δύο στάδια ανάλυσης μάζας. Η διαδοχική σύνδεση αναλυτών μάζας οδηγεί στη δημιουργία υβριδικών οργάνων και αποσκοπεί στο συνδυασμό των δυνατοτήτων των επιμέρους αναλυτών. Η συζευγμένη φασματομετρία μάζας παρέχει τη δυνατότητα εφαρμογής πολλών διαφορετικών τεχνικών ανάλυσης. Θα επικεντρωθούμε στις τεχνικές ανάλυσης, που βασίζονται στη θραυσματοποίηση ιόντων μέσω συγκρούσεων με αδρανή αέρια. Οι τέσσερις κυριότερες τεχνικές είναι οι εξής (Σχήμα 1.26) : 1. Η σάρωση θυγατρικού ιόντος (Product Ion Scan) αποτελεί μια κοινή τεχνική ανάλυσης στη συζευγμένη φασματομετρία μάζας. Το πρώτο στάδιο ανάλυσης μάζας αποσκοπεί στην απομόνωση ιόντων, συγκεκριμένου λόγου m/z, που ονομάζονται πρόδρομα (Ρrecursor) ή μητρικά (Parent) ιόντα. Στη συνέχεια, τα επιλεχθέντα ιόντα ενεργοποιούνται μέσω συγκρούσεων με ένα αδρανές αέριο (Collision-Induced Dissociation, CID) και τελικά θραυσματοποιούνται, παράγοντας ουδέτερα θραύσματα και θυγατρικά ιόντα (Product ions). Το δεύτερο στάδιο ανάλυσης μάζας αποσκοπεί στον προσδιορισμό όλων των θυγατρικών ιόντων, που παρήχθησαν και κατ επέκταση στη συγκρότηση του φάσματος θυγατρικού ιόντος. Το φάσμα αυτό δίνει πληροφορίες για τα ιοντικά θραύσματα που προκύπτουν από τα μοριακά ιόντα των αναλυόμενων ουσιών και επιτρέπει τη δημιουργία βάσεων δεδομένων θραυσματοποίησης, που παρέχουν τη δυνατότητα δομικής διερεύνησης ενώσεων. 41

2. Η σάρωση πρόδρομου ιόντος (Precursor Ion Scan) αποτελεί μια τεχνική ανάλυσης που πραγματοποιείται μόνο σε φασματόμετρα μάζας που επιτυγχάνουν συζευγμένη φασματομετρία στο χώρο. Στην τεχνική αυτή, ο δεύτερος αναλυτής επιτρέπει τη διέλευση θυγατρικού ιόντος συγκεκριμένου λόγου m/z, ενώ ο πρώτος αναλυτής μάζας επιτρέπει τη διέλευση πρόδρομων ιόντων με λόγους m/z που ανήκουν σε ένα συγκεκριμένο εύρος τιμών. Μεταξύ των αναλυτών μάζας, παρεμβάλλεται μια περιοχή θραυσματοποίησης, που συνήθως περιέχει ποσότητα κάποιου αδρανούς αερίου. Θα πρέπει να τονίσουμε, ότι τα πρόδρομα ιόντα που διέρχονται του πρώτου αναλυτή μάζας θα ανιχνευθούν μόνο, αν μετά τη θραυσματοποίησή τους παράγουν το θυγατρικό ιόν που απομονώνει ο δεύτερος αναλυτής μάζας. Η τεχνική αυτή, χρησιμοποιείται συνήθως για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους μιας ένωσης, που περιέχει κάποια συγκεκριμένη λειτουργική ομάδα, η οποία αντιστοιχεί στο ανιχνευόμενο θυγατρικό ιόν. 3. Η παρακολούθηση σταθερής απώλειας ουδέτερου θραύσματος (Constant Neutral Loss) επιτυγχάνεται με την επιλογή ενός ουδέτερου θραύσματος δεδομένης μάζας και την ανίχνευση όλων των θραυσματοποιήσεων που οδηγούν στη συγκεκριμένη απώλεια μάζας. Για την πραγματοποίηση της παραπάνω τεχνικής, οι δύο αναλυτές μάζας σαρώνουν συγκεκριμένα εύρη μάζας, διατηρώντας μια συνεχή διαφορά m/z μεταξύ τους. Ένα πρόδρομο ιόν που διέρχεται του πρώτου αναλυτή μάζας, θα ανιχνευθεί μόνο, αν μετά τη θραυσματοποίησή του παράγει ένα θυγατρικό ιόν με λόγο m/z που ικανοποιεί τη δεδομένη απώλεια μάζας. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για εκλεκτικούς προσδιορισμούς ενώσεων, βάσει δομικών χαρακτηριστικών και πραγματοποιείται σε φασματόμετρα μάζας που επιτυγχάνουν συζευγμένη φασματομετρία στο χώρο. 4. Η παρακολούθηση προεπιλεγμένου ιόντος / ιόντων (Single ή Selected / Μultiple Reaction Monitoring, SRM / MRM ) βασίζεται στη μελέτη μιας συγκεκριμένης αντίδρασης θραυσματοποίησης. Για την επίτευξη της τεχνικής αυτής, τόσο ο πρώτος όσο και ο δεύτερος αναλυτής μάζας, απομονώνουν πρόδρομα και θυγατρικά ιόντα συγκεκριμένου λόγου m/z. Με τον τρόπο αυτό, ανιχνεύονται μόνο τα πρόδρομα ιόντα, που μετά τη θραυσματοποίησή τους, παράγουν το προεπιλεγμένο θυγατρικό ιόν. Η απουσία ανάγκης για σάρωση κάποιου εύρους μάζας, επιτρέπει την παρακολούθηση των προεπιλεγμένων ιόντων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα και αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου. Επίσης η μετάβαση μεταξύ ιόντων διαφορετικού λόγου m/z επιφέρει τη βελτίωση της εκλεκτικότητας του πειράματος. 42

Σχήμα 1.26 Σχηματική απεικόνιση των διαφόρων τεχνικών της συζευγμένης φασματομετρίας μάζας. 43

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο Η ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗ ΩΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΓΛΑΥΚΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΙΚΤΗΣ ΓΩΝΙΑΣ 2.1 Συνοπτική παράθεση της φυσιολογίας του οφθαλμικού βολβού (33) Ο οφθαλμικός βολβός (bulbus ophthalmicus) αποτελεί την απαρχή του αισθητήριου οργάνου της όρασης και απαντά εντός μιας οστέινης κοιλότητας του σπλαχνικού κρανίου που ονομάζεται οφθαλμικός κόγχος (orbita). Ο οφθαλμικός κόγχος προστατεύει τον οφθαλμικό βολβό από όλες τις κατευθύνσεις πλην της πρόσθιας επιφάνειας που καλύπτεται από δύο κινούμενα δερματομυώδη πέταλα που ονομάζονται βλέφαρα (palpebrae). Ο οφθαλμικός βολβός διατηρεί σχήμα σφαιρικό με διάμετρο περίπου 24 mm και το τοίχωμά του αποτελείται από τους ακόλουθους τρεις χιτώνες: Σχήμα 2.1 Σχηματική απεικόνιση κάθετης τομής του οφθαλμικού βολβού. Ο ινώδης χιτώνας (fibrous tunic) αποτελεί τον εξωτερικό χιτώνα του οφθαλμικού βολβού και διαιρείται σε ένα πρόσθιο τμήμα που είναι διαφανές και ονομάζεται κερατοειδής χιτώνας (cornea) και σε ένα οπίσθιο τμήμα που είναι αδιαφανές και ονομάζεται σκληρός χιτώνας (sclera) (Σχήμα 1.1). Ο αγγειώδης χιτώνας (uvea) αποτελεί τον ενδιάμεσο χιτώνα του τοιχώματος του οφθαλμικού βολβού και αποτελείται από την ίριδα (iris), το ακτινωτό σώμα (ciliary body) και το χοριοειδή χιτώνα (choroid). Η ίριδα αποτελεί το πρόσθιο τμήμα του αγγειώδους χιτώνα και φέρει μια οπή που ονομάζεται κόρη (papilla), ενώ ο χοριοειδής χιτώνας αποτελεί το οπίσθιο τμήμα του αγγειώδους χιτώνα. Μεταξύ των δύο προαναφερθέντων ανατομικών δομών παρεμβάλλεται το ακτινωτό σώμα που φέρει ακτινοειδείς προβολές (ciliary processes) και περιβάλλει κυκλοτερώς τον κρυσταλλοειδή φακό του οφθαλμού. Πιο 44

συγκεκριμένα, από τις ακτινοειδείς προβολές του ακτινωτού σώματος εκφύονται οι ίνες της ζιννείου ζώνης (fibers of zonule of Zinn) οι οποίες καταφύονται στην περιφέρεια του φακού (Σχήμα 2.2). Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι ο χώρος που εκτείνεται από τον κερατοειδή χιτώνα μέχρι τον κρυσταλλοειδή φακό ονομάζεται θάλαμος του οφθαλμού. Με τη σειρά του ο θάλαμος του οφθαλμού χωρίζεται από την ίριδα σε πρόσθιο και οπίσθιο θάλαμο (anterior chamber, posterior chamber). Ο αμφιβληστροειδής χιτώνας (retina) συνιστά τον εσωτερικό χιτώνα του τοιχώματος του οφθαλμικού βολβού και αποτελεί τον πρώτο αισθητήριο χώρο που αλληλεπιδρά με το φωτεινό ερέθισμα. Ο αμφιβληστροειδής χιτώνας αποτελείται εξωτερικά (δηλαδή προς τον αγγειώδη χιτώνα) από το μελάγχρουν επιθήλιο (retinal pigment epithelium) και εσωτερικά (δηλαδή προς το κέντρο του οφθαλμού) από τον ιδίως αμφιβληστροειδή (retina proper). Με τη σειρά του, ο ιδίως αμφιβληστροειδής αποτελείται από πολλές στιβάδες εξειδικευμένων κυττάρων, κάθε μια από τις οποίες παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάδοση του φωτεινού ερεθίσματος. Απαριθμώντας τις δεδομένες στιβάδες από το εξωτερικό του οφθαλμικού βολβού προς το εσωτερικό, αυτές είναι η στιβάδα των κωνίων και ραβδίων (layer of cones and rods), η στιβάδα των διπόλων κυττάρων (layer of bipolar cells) και η στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων (gaglionic layer) από όπου ξεκινούν οι οπτικές ίνες του αμφιβληστροειδούς (optic nerve fibers/stratum opticum). Οι οπτικές ίνες κατά την ενδοαμφιβληστροειδή τους πορεία συρρέουν προς τον οπίσθιο πόλο του οφθαλμού και σχηματίζουν την κεφαλή του οπτικού νεύρου (optic nerve head). Η περιοχή αυτή αποτελεί την οπτική θηλή ή όπως αλλιώς αναφέρεται τον οπτικό δίσκο (optic disc)(σχήμα 2.3). Μάλιστα, η οπτική θηλή διατηρεί στο κέντρο της μια μικρή κοίλανση (optic disc cupping) που όπως θα δούμε και αργότερα διαθέτει τεράστια διαγνωστική αξία. Σχήμα 2.2 Σχηματική απεικόνιση εγκάρσιας τομής οφθαλμικού βολβού. 45

Εντός του τοιχώματος του οφθαλμικού βολβού περιέχεται ο κρυσταλλοειδής φακός (crystalline lens), το υαλώδες σώμα (vitreous body) και το υδατοειδές υγρό (aqueous humor). Ο κρυσταλλοειδής φακός βρίσκεται μεταξύ της ίριδας και του υαλώδους σώματος και συγκρατείται στη θέση του μέσω των ινών της ζιννείου ζώνης. Είναι διαφανής, αμφίκυρτος και εύπλαστος, με αποτέλεσμα να συγκεντρώνει τις οπτικές ακτίνες στον αμφιβληστροειδή, ανεξάρτητα αν προέρχονται από ένα κοντινό ή μακρινό αντικείμενο. Η δυνατότητα αυτή οφείλεται στην ευπλαστότητα του φακού, καθώς επίσης και στην ικανότητα που διατηρεί να μεταβάλλει την ακτίνα καμπυλότητάς του. Το υαλώδες σώμα ή υαλοειδές αποτελεί μια πηκτώδη διάφανη μάζα που καταλαμβάνει την κοιλότητα που σχηματίζει η οπίσθια επιφάνεια του κρυσταλλοειδούς φακού με τον αμφιβληστροειδή χιτώνα. Αποτελείται από ένα δίκτυο ινών κολλαγόνου το διάκενα του οποίου καταλαμβάνονται από μόρια υαλουρονικού οξέος. Το υαλώδες σώμα δίνει την υπόσταση στον οφθαλμικό βολβό αποτελώντας το μεγαλύτερο ποσοστό του όγκου του. Το υδατοειδές υγρό αποτελεί ένα διαυγές και άχρωμο υγρό που καταλαμβάνει το θάλαμο του οφθαλμικού βολβού. Διατηρεί συνολικό όγκο περίπου 0,36 ml εκ του οποίου το 80 % καταλαμβάνει τον πρόσθιο θάλαμο και το 20 % τον οπίσθιο θάλαμο. Το υδατοειδές υγρό αποτελείται κατά 98 % περίπου από νερό και περιέχει όλα τα συστατικά του πλάσματος σε διαφορετική, ωστόσο, συγκέντρωση. Πιο συγκεκριμένα το υδατοειδές υγρό: I. Αποτελεί το βασικό παράγοντα ρύθμισης της ενδοφθάλμιας πίεσης. II. Εξυπηρετεί σε μικρότερο βαθμό τη διάθλαση των φωτεινών ακτινών. III. Συμμετέχει στις μεταβολικές διαδικασίες του κρυσταλλοειδούς φακού προσκομίζοντας θρεπτικά συστατικά. Το υδατοειδές υγρό κυκλοφορεί συνεχώς στον οφθαλμικό θάλαμο παραγόμενο στον οπίσθιο θάλαμο και αποχετευόμενο στον πρόσθιο θάλαμο. Η μετακίνηση του υδατοειδούς υγρού μεταξύ των προαναφερθέντων χώρων πραγματοποιείται μέσω της κόρης. Το υδατοειδές υγρό παράγεται από τις ακτινοειδείς προβολές του ακτινωτού σώματος, μέσω μιας περίπλοκης βιοχημικής διαδικασίας που μέχρι σήμερα δεν είναι πλήρως τεκμηριωμένη. Η δεδομένη διαδικασία παραγωγής διακρίνεται σε ενεργητική και παθητική και λαμβάνει χώρα σε διαφορετικές ανατομικές δομές της ακτινοειδούς προβολής. Κάθε ακτινοειδής προβολή αποτελείται από το σώμα και το επιθήλιο. Το σώμα συνίσταται από αγγειοβριθή συνδετικό ιστό, ενώ το επιθήλιο αποτελείται από μια εξωτερική στιβάδα μελαγχρόων κυττάρων και μια εσωτερική στιβάδα διαυγών κυττάρων. Η παθητική παραγωγή του υδατοειδούς υγρού λαμβάνει χώρα στο σώμα της ακτινοειδούς προβολής μέσω της τριχοειδικής διήθησης του πλάσματος, ενώ η ενεργητική παραγωγή του υδατοειδούς υγρού πραγματοποιείται στο επιθήλιο της ακτινοειδούς προβολής μέσω διαφόρων οξειδαναγωγών αντιδράσεων. Το υδατοειδές υγρό απομακρύνεται ως επί το πλείστον μέσω μιας ανατομικής συσκευής που ονομάζεται αποχετευτικό σύστημα της γωνίας του πρόσθιου θαλάμου (trabeculum). Η γωνία του πρόσθιου θαλάμου (angle of anterior chamber) αντιστοιχεί στη δίεδρη γωνία που σχηματίζει η οπίσθια επιφάνεια του κερατοειδούς με την πρόσθια επιφάνεια της ίριδας. Η κορυφή της δεδομένης γωνίας αντιστοιχεί στο ακτινωτό σώμα. Το αποχετευτικό σύστημα διατηρεί διάφορα λειτουργικά στοιχεία που απάγουν το υδατοειδές υγρό από τον πρόσθιο θάλαμο σε ένα παρακείμενο φλεβικό δίκτυο. 46

Σχήμα 2.3 Απεικόνιση της επιφάνειας του αμφιβληστροειδούς και της οπτικής θηλής. 2.2 Ορισμός και κατάταξη των μορφών του γλαυκώματος (34) Με τον όρο γλαύκωμα (glaucoma) αναφερόμαστε σε μια ομάδα νευροεκφυλιστικών παθήσεων του οφθαλμού που διατηρούν ως κοινό σημείο αναφοράς το σταδιακό εκφυλισμό των γαγγλιακών κυττάρων και των οπτικών ινών του αμφιβληστροειδούς. Η βιολογική βάση της δεδομένης ασθένειας δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως όπως επίσης και οι διάφοροι παράγοντες που συμβάλλουν στην εξέλιξή της. Χωρίς την κατάλληλη θεραπευτική αγωγή, το γλαύκωμα προκαλεί προοδευτική έκπτωση της όρασης με τελικό αποτέλεσμα την τύφλωση του ασθενούς. Το γλαύκωμα διακρίνεται σε συγγενές και επίκτητο. Το συγγενές γλαύκωμα οφείλεται σε διαμαρτία περί τη διάπλαση του οφθαλμού κατά την εμβρυϊκή ηλικία με αποτέλεσμα να εκδηλώνεται κατά τη γέννηση του νεογνού ή στους πρώτους μήνες της ζωής του. Πιο συγκεκριμένα, αν η διαμαρτία αφορά αποκλειστικά τη γωνία του πρόσθιου θαλάμου τότε το παρατηρούμενο συγγενές γλαύκωμα αναφέρεται ως πρωτοπαθές (primary congenital glaucoma), ενώ αν η διαμαρτία αφορά άλλους ιστούς πλησίον της γωνίας τότε αναφέρεται ως δευτεροπαθές (secondary congenital glaucoma). Αντίθετα, το επίκτητο γλαύκωμα δεν συνοδεύεται από κάποια συγγενή δυσπλασία του οφθαλμού και εκδηλώνεται σε κάθε περίοδο της ζωής του ατόμου. Με τη σειρά του, το επίκτητο γλαύκωμα διακρίνεται σε πρωτοπαθές (primary acquired glaucoma) όταν αποτελεί τη μοναδική παθολογική εκδήλωση του οφθαλμού και σε δευτεροπαθές (secondary acquired glaucoma) όταν αποτελεί την επιπλοκή κάποιας άλλης οφθαλμικής πάθησης. Το πρωτοπαθές επίκτητο γλαύκωμα διακρίνεται περαιτέρω σε γλαύκωμα ανοικτής (open angle) ή κλειστής (closed angle) γωνίας με βάση την κλινική παρατήρηση της γωνίας του πρόσθιου θαλάμου. 2.3 Παθοφυσιολογία, διάγνωση και θεραπευτική αντιμετώπιση του πρωτοπαθούς γλαυκώματος ανοικτής γωνίας (35,36) Το πρωτοπαθές γλαύκωμα ανοικτής γωνίας (Primary Open Angle Glaucoma/POAG) αποτελεί τη συνηθέστερη μορφή γλαυκώματος και ευθύνεται για το 80 % περίπου των περιπτώσεων της νόσου. Αποτελεί τη δεύτερη συνηθέστερη αιτία τύφλωσης παγκοσμίως 47

με ιδιαίτερα υψηλό επιπολασμό στα άτομα της μαύρης φυλής. Πρόκειται για μια αμφοτερόπλευρη πάθηση που κάποιες φορές η προσβολή του ενός οφθαλμού προηγείται του άλλου. Η απόδοση ενός αυστηρού ορισμού στο γλαύκωμα ανοιχτής γωνίας είναι μάλλον αδύνατη καθώς τα αίτια της νόσου δεν έχουν τεκμηριωθεί πλήρως με αποτέλεσμα να γίνονται συνεχείς αναθεωρήσεις των δεδομένων παθοφυσιολογίας. Η απόδοση ενός κλινικά προσανατολισμένου ορισμού, με βάση τα μέχρι τώρα δεδομένα, αποτελεί μια εναλλακτική προσέγγιση που εξυπηρετεί, μέχρι κάποιο βαθμό, την ταξινόμηση και το χαρακτηρισμό της νόσου. Με τον τρόπο αυτό σήμερα, το πρωτοπαθές γλαύκωμα ανοικτής γωνίας ορίζεται ως μια νευροεκφυλιστική πάθηση του οφθαλμού που προκαλεί σταδιακές και χαρακτηριστικές αλλοιώσεις της οπτικής θηλής και της στιβάδας των οπτικών ινών, με παράλληλη διατήρηση της διαβατότητας της γωνίας του πρόσθιου θαλάμου. Μέχρι πρότινος, ο κλινικός ορισμός περιελάμβανε επίσης την παρουσία υψηλής ενδοφθάλμιας πίεσης και διαταραχών του οπτικού πεδίου, ωστόσο σήμερα έχει αποδειχθεί ότι τα δεδομένα κλινικά ευρήματα πολλές φορές δε συνοδεύουν τη νόσο ή εμφανίζονται σε προχωρημένα στάδιά της. Η παθοφυσιολογία της παρούσας νόσου σχετίζεται με τον προοδευτικό εκφυλισμό των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς. Η δεδομένη εκφυλιστική πορεία προκαλεί την εκτεταμένη ατροφία της στιβάδας των οπτικών ινών του αμφιβληστροειδούς, που στην πραγματικότητα αποτελείται από τους νευράξονες των προαναφερθέντων γαγγλιακών κυττάρων. Το παραπάνω γεγονός επιφέρει σημαντικές μορφολογικές αλλοιώσεις της κεφαλής του οπτικού νεύρου, που πολλές φορές αναφέρεται ως οπτική θηλή. Η σημαντικότερη από αυτές τις αλλοιώσεις είναι η διεύρυνση της φυσιολογικά απαντώμενης κοίλανσης της οπτικής θηλής, με αποτέλεσμα τη συρρίκνωση της δακτυλιοειδούς επιφάνειας που εσωκλείεται μεταξύ της περιφέρειας της κοίλανσης και της περιφέρειας της οπτικής θηλής. Ο ακριβής παθοφυσιολογικός μηχανισμός εκφυλισμού των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς δεν είναι γνωστός, αλλά σήμερα επικρατούν δύο κύριες θεωρίες που επιχειρούν την ερμηνεία του φαινομένου. Η πρώτη θεωρία σχετίζεται με το μηχανισμό του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και υποστηρίζει ότι η καταστροφή των γαγγλιακών κυττάρων οφείλεται στην ελλιπή παροχή ορισμένων νευροτροφικών παραγόντων που είναι απαραίτητοι για την επιβίωση των δεδομένων κυττάρων. Οι νευροτροφικοί παράγοντες είναι πεπτιδικής φύσης μόρια που ταξινομούνται σε νευροτροφίνες, κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες. Για την επιβίωση των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, ο σημαντικότερος νευροτροφικός παράγοντας είναι ο BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο δεδομένος παθοφυσιολογικός μηχανισμός σχετίζεται άμεσα με την ενδοφθάλμια πίεση και μάλιστα επιτείνεται με την αύξησή της. Η δεύτερη θεωρία σχετίζεται με τη μικροκυκλοφορία του αμφιβληστροειδούς και προτείνει την εμφάνιση τοπικών ισχαιμιών ως την κύρια αιτία εκφυλισμού των γαγγλιακών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με τη δεδομένη θεωρία, η προκαλούμενη από την ισχαιμία υποξία επάγει τη βιοσύνθεση παραγώγων του γλουταμικού οξέος που δρουν τοξικά επί των γαγγλιακών κυττάρων. Η διάγνωση του πρωτοπαθούς γλαυκώματος ανοιχτής γωνίας βασίζεται κυρίως στη μορφολογική αξιολόγηση της οπτικής θηλής και δευτερευόντως στην κλινική εξέταση του οπτικού πεδίου του ασθενούς. Πιο συγκεκριμένα, αξιολογείται το εμβαδόν της κοίλανσης της οπτικής θηλής καθώς επίσης και το πάχος της στιβάδας των οπτικών ινών του αμφιβληστροειδούς. Οι παραπάνω μετρήσεις βασίζονται σε σύγχρονες απεικονιστικές 48

μεθοδολογίες που παράγουν αντικειμενικά και ποσοτικά δεδομένα. Αναφορικά με την εξέταση του οπτικού πεδίου, αυτή επικεντρώνεται στον εντοπισμό χαρακτηριστικών σκοτωμάτων, κυρίως της περιφερικής όρασης. Μέχρι σήμερα έχουν ανιχνευθεί αρκετοί παράγοντες κινδύνου που προδιαθέτουν την εκδήλωση της νόσου, με σημαντικότερο παράγοντα την αυξημένη ενδοφθάλμια πίεση. Πιο συγκεκριμένα, η τιμή της ενδοφθάλμιας πίεσης παρουσιάζει ισχυρή θετική συσχέτιση με την πιθανότητα εκδήλωσης της νόσου. Με τον τρόπο αυτό, όσο υψηλότερη είναι η ενδοφθάλμια πίεση τόσο πιθανότερη είναι η ανάπτυξη πρωτοπαθούς γλαυκώματος ανοικτής γωνίας. Σε γενικές γραμμές δεν υπάρχει κάποια οριακή τιμή της ενδοφθάλμιας πίεσης που να θεωρείται προδιαθεσική του γλαυκώματος, ωστόσο στην κλινική πράξη οι τιμές άνω των 21 mm Hg (με φυσιολογική τα 15,5 mm Hg) χαρακτηρίζονται υπερτασικές και χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. Ένας ακόμα σημαντικός παράγοντας κινδύνου είναι η ηλικία. Ειδικότερα, το ποσοστό εκδήλωσης του γλαυκώματος ανοικτής γωνίας αυξάνεται εντυπωσιακά με την ηλικία και από το 0,2% σε ηλικίας από 50 έως 54 ετών φτάνει περίπου το 2% σε ηλικίες άνω των 70 ετών. Κάποιες συνοδές οφθαλμικές παθήσεις και ορισμένα, ιδιαίτερα ανατομικά χαρακτηριστικά του οφθαλμού έχουν αναφερθεί ως πιθανοί παράγοντες κινδύνου, με χαρακτηριστικότερα παραδείγματα την υψηλή μυωπία και το λεπτό κερατοειδή που διατηρεί πάχος μικρότερο από 550 μm. Αναφορικά με τη γενετική βάση της ασθένειας, αυτή δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως, αλλά έχουν ανιχνευθεί αρκετά γονίδια που φαίνεται να συμβάλλουν στην εκδήλωσή της με σημαντικότερο το γονίδιο GLC1A που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1. Ωστόσο, η κληρονομικότητα φαίνεται να αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα κινδύνου καθώς ένα μεγάλο ποσοστό ατόμων (από 13% έως 47%) που εμφανίζει γλαύκωμα ανοικτής γωνίας διατηρεί θετικό οικογενειακό ιστορικό αναφορικά με τη νόσο. Τέλος οι διάφορες αγγειακές παθήσεις αποτελούν δυνητικούς παράγοντες κινδύνου με σημαντικότερες τις εξής: Συστηματική υπέρταση Περιφερικός αγγειόσπασμος Σακχαρώδης διαβήτης Αιμορραγίες της οπτικής θηλής Περιθηλαία χοριοειδή ατροφία Η θεραπευτική αντιμετώπιση του πρωτοπαθούς γλαυκώματος ανοικτής γωνίας επικεντρώνεται στη μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης, καθώς αποτελεί το μοναδικό κλινικά αποδεδειγμένο και διαχειρίσιμο παράγοντα κινδύνου της δεδομένης νόσου. Η μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης επιτυγχάνεται κυρίως μέσω φαρμακευτικής αγωγής, ενώ σε περιπτώσεις που αποτυγχάνει η φαρμακευτική προσέγγιση υιοθετούνται χειρουργικές λύσεις. Στο σημείο αυτό θα πρέπει να τονίσουμε ότι η μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης δεν αντιμετωπίζει το γενεσιουργό αίτιο της νόσου, αλλά επιβραδύνει σημαντικά την εξέλιξη της παρατηρούμενης νευροπάθειας του οφθαλμού. Στην κλινική πράξη επιδιώκεται η ρύθμιση της ενδοφθάλμιας πίεσης σε τέτοια τιμή, ώστε να μην παρατηρείται περαιτέρω εκφυλισμός της οπτικής θηλής και της στιβάδας των οπτικών ινών του αμφιβληστροειδούς. Συνήθως, η επιθυμητή τιμή της ενδοφθάλμιας πίεσης αντιστοιχεί στο 50% με 80% αυτής που παρατηρείται κατά τη διάγνωση της νόσου. Επίσης, όσο εξελίσσεται η παρατηρούμενη νευροπάθεια του οφθαλμού, τόσο χαμηλότερη τιμή ενδοφθάλμιας πίεσης απαιτείται. 49

Σήμερα απαντώνται οι εξής 5 κατηγορίες αντιγλαυκωματικών (37,38) ενδείκνυνται για τη μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης: φαρμάκων που 1. Ανάλογα προσταγλανδινών : Πρόκειται για φάρμακα που αυξάνουν την αποχέτευση του υδατοειδούς υγρού εφαρμοζόμενα τοπικά στον οφθαλμό με τη μορφή κολλυρίου. Αποτελούν τη θεραπευτική αγωγή πρώτης γραμμής καθώς μειώνουν αποτελεσματικά την ενδοφθάλμια πίεση και προκαλούν ελάχιστες συστηματικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Κύριοι εκπρόσωποι είναι η λατανοπρόστη (latanoprost), η τραβοπρόστη (travoprost) και η βηνατοπρόστη (binatoprost). 2. α 2-αδρενεργικοί αγωνιστές : Πρόκειται για φάρμακα που αρχικά μειώνουν την έκκριση του υδατοειδούς υγρού και στη συνέχεια αυξάνουν την αποχέτευσή του. Αναφορικά με τη μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης, είναι λιγότερο αποτελεσματικά από τα ανάλογα προσταγλανδινών και παρά την τοπική τους εφαρμογή μπορούν να προκαλέσουν συστηματικές συμπαθομιμητικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Κύριοι εκπρόσωποι είναι η βριμονιδίνη (brimonidine) και η απροκλονιδίνη (aproclonidine). 3. β-αδρενεργικοί ανταγωνιστές : Πρόκειται για φάρμακα που μειώνουν την έκκριση του υδατοειδούς υγρού κατά την τοπική εφαρμογή τους στον οφθαλμό. Επιφέρουν σημαντική μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης ωστόσο προκαλούν σημαντικές συστηματικές ανεπιθύμητες ενέργειες καρδιαγγειακής και αναπνευστικής φύσης. Κύριοι εκπρόσωποι είναι η τιμολόλη (timolol), η βηταξολόλη (betaxol), η λεβοβουνολόλη (levobunolol), η καρτεολόλη (carteolol) και η μετιπρανολόλη (metipranolol). 4. Χολινεργικοί αγωνιστές : Πρόκειται για φάρμακα που αυξάνουν την αποχέτευση του υδατοειδούς υγρού εφαρμοζόμενα τοπικά στον οφθαλμό. Ωστόσο, διατηρούν περιορισμένη κλινική αξία λόγω των σημαντικών οφθαλμικών ανεπιθύμητων ενεργειών. Ο κυριότερος εκπρόσωπος είναι η πιλοκαρπίνη (pilocarpine). 5. Αναστολείς της καρβονικής ανυδράσης : Πρόκειται για φάρμακα που μειώνουν την έκκριση του υδατοειδούς υγρού εφαρμοζόμενα τοπικά στον οφθαλμό ή δρώντας συστηματικά μετά από του στόματος χορήγηση. Κύριοι εκπρόσωποι είναι η ακεταζολαμίδη (acetazolamide) και η μεθαζολαμίδη (methazolamide) που χρησιμοποιούνται συστηματικά με τη μορφή δισκίων και η βρινζολαμίδη (brinzolamide) και η δορζολαμίδη (dorzolamide) που χρησιμοποιούνται τοπικά με τη μορφή κολλυρίων. 2.4 Η βρινζολαμίδη ως αναστολέας της καρβονικής ανυδράσης Η καρβονική ανυδράση (39,40) (Carbonic Anhydrase/CA) αποτελεί ένα μεταλλοένζυμο ευρέως διαδεδομένο στο φυλογενετικό δέντρο της έμβιας ύλης, που εμφανίζει πέντε γενετικά διακριτές ενζυμικές οικογένειες: την α, τη β, τη γ, τη δ και τη ζ. Η καρβονική ανυδράση καταλύει την αντίδραση μετατροπής του διοξειδίου του άνθρακα (CO 2) σε όξινα ανθρακικά ανιόντα (HCO 3- ) και κατιόντα υδρογόνου (Η + ) : CCCC 2 + HH 2 OO ΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚΚή ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑάσσσσ HHHHHH 3 + HH + Πρόκειται για μια πολύ απλή χημική αντίδραση που πραγματοποιείται βραδύτατα απουσία καταλύτη και συμμετέχει σε έναν τεράστιο αριθμό κρίσιμων φυσιολογικών λειτουργιών του 50

οργανισμού όπως είναι η διατήρηση της ομοιόστασης του ph, η διαμερισματική μεταφορά CO 2 και HCO 3-, η έκκριση ηλεκτρολυτών σε διάφορους ιστούς, η γλυκονεογένεση και η λιπογένεση. Αναφορικά με τα θηλαστικά και κατ επέκταση τον άνθρωπο, ανιχνεύεται η α- καρβονική ανυδράση (α-ca) για την οποία μέχρι σήμερα έχουν εντοπιστεί 16 διαφορετικές ισοενζυμικές μορφές. Οι δεδομένες ισομορφές αποτελούν διαφορετικές εκδοχές του ενζύμου και απαντούν στο κυτταρόπλασμα, στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, στα μιτοχόνδρια, στο σίελο και στο μητρικό γάλα. Επίσης, υπάρχουν και τρεις μη καταλυτικές μορφές του ενζύμου με ακαθόριστο ρόλο. Σχήμα 2.4 Στάδια καταλυτικής πορείας της α-ca. Η καταλυτική δράση (41,42) της α-ca βασίζεται στην παρουσία ενός δισθενούς κατιόντος ψευδαργύρου (Zn 2+ ) στο εσωτερικό της ενεργής κοιλότητας του ενζύμου (Σχήμα 2.4). Το κατιόν Zn 2+ σχηματίζει ένα τετραεδρικό σύμπλοκο, συνδεόμενο με τρία διαφορετικά ενζυμικά αμινοξέα ιστιδίνης (His 94, His 96, His 119) και ένα περιβαλλοντικό ανιόν υδροξειδίου (OH - ). Το ανιόν υδροξειδίου συνδέεται επίσης μέσω δεσμού υδρογόνου με την υδροξυλομάδα ενός παρακείμενου αμινοξέος θρεονίνης (Thr 199). Η δεδομένη στερεοδιάταξη ενισχύει σημαντικά τον πυρηνόφιλο χαρακτήρα του ανιόντος υδροξειδίου και κατ επέκταση ενθαρρύνει την πυρηνόφιλη προσβολή του CO 2 που βρίσκεται εγκλωβισμένο σε μια γειτονική υδρόφοβη εσοχή της ενεργής κοιλότητας (στάδιο α). Η δεδομένη πυρηνόφιλη προσβολή οδηγεί στο σχηματισμό του HCO 3 -, το οποίο με τη σειρά του απελευθερώνεται από το μεταλλικό ιόν μέσω της αντικατάστασής του με ένα μόριο νερού (Η 2Ο) (στάδιο β). Η ενυδατωμένη πλέον μορφή του τετραεδρικού συμπλόκου στερείται καταλυτικής ικανότητας και απαιτείται συνεπώς κάποια διαδικασία αναγέννησης του ενζύμου. Το ένζυμο αναγεννάται μέσω της αποπρωτονίωσης του δεσμευμένου υδατικού μορίου, με αποτέλεσμα τον επανασχηματισμό του δραστικού ανιόντος υδροξειδίου (στάδιο γ). Η προαναφερθείσα αναγεννητική πορεία αποτελεί το περιοριστικό 51

βήμα του ρυθμού κατάλυσης και εξυπηρετείται μέσω ενός παρακείμενου αμινοξέος ιστιδίνης (His 64). Αξίζει να σημειωθεί ότι η α-ca και πιο συγκεκριμένα η ισομορφή CA-II αποτελεί ένα από τα δραστικότερα ένζυμα που απαντούν στη φύση. Η βρινζολαμίδη ανήκει στη φαρμακοχημική οικογένεια των μη υποκατεστημένων σουλφοναμιδίων (H 2NSΟ 2R) και δρα ως εκλεκτικός αναστολέας της α-ca (43) (Σχήμα 2.5). Ο μηχανισμός αναστολής της α-ca από τη δεδομένη κατηγορία φαρμακομορίων είναι αντιστρεπτός, μη ανταγωνιστικός και βασίζεται στην αλληλεπίδραση της μη υποκατεστημένης ομάδας σουλφοναμιδίου με την ενυδατωμένη μορφή του τετραεδρικού συμπλόκου του ενζύμου. Πιο συγκεκριμένα, η αποπρωτονιωμένη μορφή του σουλφοναμιδίου ( - HNSΟ 2R) αντικαθιστά το δεσμευμένο υδατικό μόριο δημιουργώντας ένα νέο τετραεδρικό μεταλλοσύμπλοκο που στερείται ωστόσο καταλυτικής δράσης (Σχήμα 2.6). Η συναρμογή του φαρμακομορίου με το σχηματιζόμενο σύμπλοκο σταθεροποιείται, επίσης, μέσω δύο δεσμών υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ της ομάδας του σουλφοναμιδίου και του αμινοξέος θρεονίνη (Thr 199) που υπό φυσιολογικές συνθήκες σταθεροποιεί το υδατικό μόριο ή το ανιόν υδροξειδίου. Ο πρώτος δεσμός υδρογόνου αναπτύσσεται μεταξύ της αμινομάδας του σουλφοναμιδίου και της υδροξυλομάδας της θρεονίνης, ενώ ο δεύτερος δεσμός υδρογόνου αναπτύσσεται μεταξύ του σουλφονυλικού οξυγόνου του σουλφοναμιδίου και της αμιδικής αμινομάδας της θρεονίνης. Σχήμα 2.5 Χημική δομή της βρινζολαμίδης. Σχήμα 2.6 Μηχανισμός ανασταλτικής δράσης μη υποκατεστημένων σουλφοναμιδίων επί της α-ca. 52

2.5 Φαρμακοδυναμικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες της βρινζολαμίδης Η βρινζολαμίδη (44,45) αποτελεί έναν τοπικά χορηγούμενο αναστολέα της α-ca που εισάγεται στον οφθαλμό με τη μορφή οφθαλμικού εναιωρήματος. Ο φαρμακολογικός μηχανισμός δράσης της βρινζολαμίδης έγκειται στην αντιστρεπτή και μη ανταγωνιστική αναστολή του κυτταροπλασματικού ισοενζύμου CA-II που απαντά στα επιθηλιακά κύτταρα των ακτινοειδών προβολών του ακτινωτού σώματος του οφθαλμού. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το προαναφερθέν ισοένζυμο ευθύνεται για την ενδοκυττάρια παραγωγή των HCO 3 - τα οποία, συνοδευόμενα από κατιόντα νατρίου (Na + ), διέρχονται της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και δημιουργούν εκείνο το οσμωτικό πρανές που υποκινεί την έκκριση του υδατοειδούς υγρού στον οφθαλμικό θάλαμο. Η αναστολή του δεδομένου ισοενζύμου μειώνει την έκκριση του υδατοειδούς υγρού και κατ επέκταση μειώνει την ενδοφθάλμια πίεση. Η ανασταλτική δράση της βρινζολαμίδης επί του ισοενζύμου CA-II κρίνεται ισχυρή, διατηρώντας σταθερά διάστασης K d ίση με 0,13 nm και in vitro συγκέντρωση ενζυμικής ημιαναστολής IC 50 ίση με 3,2 nm. Πέρα από το προαναφερθέν ισοένζυμο, στα επιθηλιακά κύτταρα των ακτινοειδών προβολών απαντά επίσης το μεμβρανικό ισοένζυμο CA-IV η φυσιολογική λειτουργία του οποίου δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως. Η βρινζολαμίδη δρα επίσης επί του ισοενζύμου CA-IV προκαλώντας ωστόσο αρκετά ασθενέστερη αναστολή. Η βρινζολαμίδη εμφανίζει σημαντική ειδικότητα ενζυμικής αναστολής, καθώς διατηρεί ελάχιστη ή μηδενική συγγένεια με περισσότερους από 30 κύριους ορμονικούς και νευροδιαβιβαστικούς υποδοχείς όπως επίσης και με διάφορα βιοχημικά συστήματα δευτερογενών αγγελιαφόρων. Με τον τρόπο αυτό, αναμένεται ότι οι διάφορες ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με τη χρήση του φαρμάκου θα προέρχονται κυρίως από την αναστολή των ισοενζυμικών μορφών της α-ca που απαντούν στον ανθρώπινο οργανισμό. Σύμφωνα με τις κλινικές μελέτες που έχουν διεξαχθεί μέχρι σήμερα, η τοπικά εφαρμοζόμενη βρινζολαμίδη μειώνει την ενδοφθάλμια πίεση χορηγούμενη είτε ως μονοθεραπεία είτε ως συμπληρωματική θεραπεία (46,47). Πιο συγκεκριμένα, το οφθαλμικό εναιώρημα βρινζολαμίδης 1% w/v μειώνει την ενδοφθάλμια πίεση κατά 3,4 έως 5,7 mm Hg, χορηγούμενο δύο φορές ημερησίως και κατά 4,1 έως 5,6 mm Hg χορηγούμενο τρεις φορές ημερησίως. Αναφορικά με τη χρήση της βρινζολαμίδης ως συμπληρωματική θεραπεία, έχουν ελεγχθεί οι συνδυασμοί της με τον κλινικά σημαντικότερο β-αδρενεργικό αναστολέα και το σημαντικότερο ανάλογο προσταγλανδινών που είναι η τιμολόλη και η τραβοπρόστη, αντίστοιχα (48,49). Ο συνδυασμός του προαναφερθέντος εναιωρήματος με οφθαλμικό διάλυμα τιμολόλης 0,5% w/v προκαλεί περαιτέρω μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης κατά 3,2 έως 4,1 mm Hg, ενώ ο συνδυασμός με οφθαλμικό διάλυμα τραβοπόστης 0,004% w/v προκαλεί οριακή μείωση η οποία είναι στατιστικά σημαντική, για ένα μέρος των ερευνητών. Μετά την τοπική της εφαρμογή, η βρινζολαμίδη απορροφάται στη συστηματική κυκλοφορία και εμφανίζει εκτενή κατανομή σε ιστούς που διατηρούν μεγάλη ποσότητα α- CA όπως είναι το αίμα, ο σπλήνας, το ήπαρ, οι νεφροί, ο στόμαχος, το λεπτό έντερο, οι πνεύμονες και οι σιελογόνοι αδένες. Αναφορικά με το αίμα, η βρινζολαμίδη συνδέεται ισχυρά κυρίως με το ισοένζυμο CA-II των ερυθροκυττάρων εμφανίζοντας έναν παρατεταμένο χρόνο ημιζωής ίσο με περίπου 111 ημέρες (48). Στο παραπάνω γεγονός οφείλεται η ελάχιστη συγκέντρωση ελεύθερης βρινζολαμίδης στο πλάσμα του αίματος που 53

αντιστοιχεί σε λιγότερο από 7,5 ng/ml. Σύμφωνα με in vitro πειράματα πρωτεϊνικής σύνδεσης, η βρινζολαμίδης βρέθηκε να συνδέεται μερικώς με τις πρωτεΐνες του πλάσματος διατηρώντας ποσοστό σύνδεσης που κυμαίνεται από 58,5 % έως 62,7 % και παραμένει σταθερό για ένα μεγάλο εύρος της συγκέντρωσής της. Για το λόγο αυτό, η βρινζολαμίδη δεν αναμένεται να εμφανίζει φαρμακοκινητικές αλληλεπιδράσεις με άλλα συγχορηγούμενα φάρμακα. Η εκτενής σύνδεση της βρινζολαμίδης με το ερυθροκυτταρικό ισοένζυμο CA-II θα μπορούσε να αποτελέσει πηγή συστηματικών ανεπιθύμητων ενεργειών όπως είναι η έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας και οι διαταραχές της αναπνοής και της οξεοβασικής ισορροπίας. Η εμφάνιση των δεδομένων ανεπιθύμητων ενεργειών πραγματοποιείται όταν η αναστολή της συνολικής ενεργότητας της ερυθροκυτταρικής α-ca υπερβεί το 90 %. Ωστόσο, κατάλληλη κλινική μελέτη απέδειξε ότι η τοπική χρήση του οφθαλμικού εναιωρήματος βρινζολαμίδης 1% w/v προκαλεί αναστολή μόλις 40 % με 70 % οπότε κρίνεται απίθανη η εμφάνιση των προαναφερθέντων συστηματικών εκδηλώσεων. Η συγκέντρωση της βρινζολαμίδης στα ερυθροκύτταρα σταθεροποιείται μετά από χορήγηση 6 έως 9 μηνών και ανέρχεται περίπου σε 20 μm. Αναφορικά με το μεταβολισμό της βρινζολαμίδης, αυτός εξυπηρετείται μέσω των ηπατικών ενζύμων του κυτοχρώματος P-450 και πιο συγκεκριμένα πρωτίστως μέσω του ενζύμου CYP3A4 και δευτερευόντως μέσω των ενζύμων CYP2A6, CYP2C8 και CYP2C9. Ο σημαντικότερος μεταβολίτης της βρινζολαμίδης φαίνεται να είναι η Ν-αποαιθυλ-βρινζολαμίδη που ανιχνεύεται σε υψηλές συγκεντρώσεις τόσο στο αίμα όσο και στα ούρα. Η Ν-αποαιθυλ-βρινζολαμίδη αθροίζεται επίσης στα ερυθροκύτταρα συνδεόμενη ωστόσο στο ισοένζυμο CA-I (Σχήμα 2.7). Μικρότερης σημασίας μεταβολίτες είναι η Ν-απομεθοξυπροπυλ-βρινζολαμίδη και η Ο-απομεθυλ-βρινζολαμίδη οι οποίες δεν ανιχνεύονται στο αίμα αλλά στα ούρα και σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις (Σχήμα 2.8, 2.9). Η βρινζολαμίδη απεκκρίνεται κυρίως μέσω των νεφρών σε ποσοστό περίπου 60%. Ειδικότερα, περίπου το 80% της χορηγούμενης δόσης βρινζολαμίδης απεκκρίνεται αναλλοίωτο ενώ το 20% απεκκρίνεται με τη μορφή των προαναφερθέντων μεταβολιτών. Η Ν-αποαιθυλ-βρινζολαμίδη διατηρεί την υψηλότερη συγκέντρωση ενώ οι υπόλοιποι δύο μεταβολίτες απαντούν σε ίχνη ( 1%). Σχήμα 2.7 Χημική δομή της Ν-αποαιθυλ-βρινζολαμίδης. 54

Σχήμα 2.8 Χημική δομή της Ν-απομεθοξυπροπυλ-βρινζολαμίδης. Σχήμα 2.9 Χημική δομή της Ο-απομεθυλ-βρινζολαμίδης. 2.6 Θεραπευτικές ενδείξεις, αντενδείξεις και προφυλάξεις κατά τη θεραπεία με βρινζολαμίδη (45) Η θεραπευτική ένδειξη της βρινζολαμίδης έγκειται στη μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης σε περιπτώσεις πρωτοπαθούς γλαυκώματος ανοικτής γωνίας ή οφθαλμικής υπέρτασης. Η βρινζολαμίδη προτείνεται ως μονοθεραπεία για τους ενήλικους ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με β-αδρενεργικούς ανταγωνιστές ή για τους οποίους η δεδομένη φαρμακολογική ομάδα αντεδείκνυται. Επίσης, η βρινζολαμίδη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως συμπληρωματική θεραπεία σε ενήλικους ασθενείς που λαμβάνουν ήδη κάποιο ανάλογο προσταγλανδινών ή κάποιον β-αδρενεργικό ανταγωνιστή προκειμένου να μειωθεί περαιτέρω η ενδοφθάλμια πίεση. Σε γενικές γραμμές οι προτεινόμενες αντενδείξεις της βρινζολαμίδης προκύπτουν τόσο από τις κλινικές μελέτες του φαρμάκου όσο και από τη μακρόχρονη εμπειρία της χρήσης των συστηματικά χορηγούμενων σουλφοναμιδικών αναστολέων της καρβονικής 55

ανυδράσης. Το παραπάνω γεγονός οφείλεται στη συστηματική έκθεση του ασθενή που ακολουθεί την τοπική χρήση του δεδομένου φαρμάκου. Σε ένα πρώτο επίπεδο, η χρήση της βρινζολαμίδης αντεδείκνυται σε άτομα που εμφανίζουν υπερευαισθησία στις σουλφοναμίδες. Ο δεδομένος τύπος υπερευαισθησίας μπορεί να προκαλέσει σημαντικές και απειλητικές για τη ζωή αντιδράσεις όπως είναι το σύνδρομο Stevens-Johnson, η τοξική επιδερμική νέκρωση, η αιφνίδια ηπατική νέκρωση, η ακοκκιοκυτταραιμία και η απλαστική αναιμία. Επίσης, η χρήση της βρινζολαμίδης αντεδείκνυται σε περιπτώσεις σοβαρής νεφρικής ανεπάρκειας όπου η παρατηρούμενη κάθαρση κρεατινίνης είναι μικρότερη από 30 ml/min. Αυτή η αντένδειξη σχετίζεται με το γεγονός ότι η βρινζολαμίδη απεκκρίνεται κυρίως μέσω της νεφρικής οδού οπότε παθολογικές καταστάσεις αυτής μπορούν να οδηγήσουν σε εκτεταμένη συσσώρευση του φαρμάκου στον οργανισμό. Επιπλέον, η χρήση της βρινζολαμίδης αντεδείκνυται σε ασθενείς που παρουσιάζουν υπερχλωραιμική μεταβολική οξέωση, καθώς μπορεί να προκληθεί περαιτέρω διαταραχή της οξεοβασικής ισορροπίας. Αναφορικά με τις δυνητικές αλληλεπιδράσεις φαρμάκων, αντενδείκνυται η συγχορήγηση της βρινζολαμίδης με σαλικυλικά παράγωγα και συστηματικά χορηγούμενους αναστολείς της καρβονικής ανυδράσης. Οι προαναφερθέντες συνδυασμοί φαρμάκων μπορούν να προκαλέσουν διαταραχές της οξεοβασικής ισορροπίας και των ηλεκτρολυτών του αίματος. Πέρα από τις προτεινόμενες αντενδείξεις υπάρχει μια σειρά περιπτώσεων κατά τις οποίες απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή όταν επιλέγεται η θεραπεία με βρινζολαμίδη. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι ασθενείς με εκφυλισμένο κερατοειδή χιτώνα οι οποίοι είναι επιρρεπείς σε κερατοειδικό οίδημα κατά την τοπική χορήγηση φαρμάκων. Σε περίπτωση τέτοιας εκδήλωσης θα πρέπει να διακόπτεται αμέσως η χρήση του φαρμάκου. Μια ακόμα περίπτωση που χρήζει ιδιαίτερης προσοχής είναι η χρήση της βρινζολαμίδης σε εγκυμονούσες. Η βρινζολαμίδη κατατάσσεται στην κατηγορία φαρμάκων C, καθώς διάφορες μελέτες σε πειραματόζωα έχουν καταδείξει αρνητική επίδραση στο έμβρυο, αλλά μέχρι στιγμής δεν απαντούν εξακριβωμένες αναφορές εμβρυοτοξικότητας στον άνθρωπο. Με τον τρόπο αυτό, η βρινζολαμίδη χρησιμοποιείται κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης μόνο όταν τα θεραπευτικά οφέλη για την εγκυμονούσα υπερτερούν του πιθανού κινδύνου για το εμβρύου. Αναφορικά με τη χρήση της βρινζολαμίδης κατά την περίοδο της γαλουχίας, δεν είναι γνωστό ακόμα αν το φάρμακο εκκρίνεται στο μητρικό γάλα. Πειράματα σε ζώα έχουν καταδείξει ότι η βρινζολαμίδη εκκρίνεται στο μητρικό γάλα οπότε και πάλι η απόφαση για τη χρήση της βρινζολαμίδης έγκειται στην αξιολόγηση της σχέσης οφέλους-κινδύνου. Τέλος, η βρινζολαμίδη μπορεί να επηρεάσει την ικανότητα οδήγησης και χειρισμού μηχανημάτων καθώς προκαλεί παροδική θόλωση της όρασης και μείωση της ικανότητας εκτέλεσης εργασιών που απαιτούν εγρήγορση και συντονισμό κινήσεων. 2.7 Τοξικολογικό προφίλ και ανεπιθύμητες ενέργειες κατά τη θεραπεία με βρινζολαμίδη (45) Η βαρύτητα της οξείας τοξικότητας της βρινζολαμίδης αξιολογήθηκε μέσω του προσδιορισμού της θανατηφόρου δόσης LD 50 σε μύες, η οποία βρέθηκε να είναι σχετικά υψηλή κυμαινόμενη από 1000 έως 2000 mg/kg. Αναφορικά με τη χρόνια τοξικότητα της βρινζολαμίδης, αυτή συμφωνεί με το γενικότερο προφίλ των αναστολέων της καρβονικής ανυδράσης. Πιο συγκεκριμένα, η εξάμηνη συστηματική έκθεση μυών σε δόση 56

βρινζολαμίδης που ήταν 166 φορές μεγαλύτερη της αντίστοιχης ανθρώπινης οφθαλμικής δόσης, προκάλεσε νεφρική λιθογένεση και ορισμένες περιπτώσεις ήπιας έως ενδιάμεσης νεφροπάθειας. Αντίθετα, μύες που εκτέθηκαν σε 20-πλάσια δόση βρινζολαμίδης δεν παρουσίασαν νεφρικές και ουροποιητικές αλλοιώσεις. Για τη βρινζολαμίδη μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν σαφή δεδομένα καρκινογένεσης αλλά διάφορα in vitro και in vivo πειράματα έχουν καταδείξει ότι στερείται μεταλλαξιογόνου δράσης. Η επίδραση της βρινζολαμίδης στην αναπαραγωγική ικανότητα αξιολογήθηκε με τη συστηματική έκθεση μυών σε δόση φαρμάκου που ήταν 375 φορές μεγαλύτερη από την αντίστοιχη ανθρώπινη οφθαλμική δόση. Η παραπάνω μελέτη δεν ανίχνευσε κάποια αρνητική επίδραση του φαρμάκου στη γονιμότητα ή την αναπαραγωγική ικανότητα των αρσενικών και θηλυκών πειραματόζωων. Τέλος, η εμβρυοτοξική δράση της βρινζολαμίδης αξιολογήθηκε με τη συστηματική έκθεση κυοφορούντων μυών σε δόση φαρμάκου που ήταν 375 φορές μεγαλύτερη της αντίστοιχης ανθρώπινης οφθαλμικής δόσης. Στην προαναφερθείσα μελέτη δεν ανιχνεύθηκε κάποια αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη οργάνων και ιστών, ωστόσο παρατηρήθηκε μειωμένο σωματικό βάρος των νεογνών. Οι ανεπιθύμητες ενέργειας που συνοδεύουν τη τοπική χρήση της βρινζολαμίδης μελετήθηκαν εκτενώς σε διάφορες κλινικές μελέτες που συμμετείχαν συνολικά 2732 ασθενείς. Σε γενικές γραμμές, οι παρατηρούμενες ανεπιθύμητες ενέργειες ήταν ήπιες με αποτέλεσμα κανένας ασθενής να μην εγκαταλείψει τη θεραπεία. Οι συχνότερα απαντώμενες ανεπιθύμητες ενέργειες είναι η δυσγευσία με ποσοστό 6,0 % και η θόλωση της όρασης με ποσοστό 5,4 %, που διαρκούν από μερικά δευτερόλεπτα έως μερικά λεπτά μετά την ενστάλαξη του φαρμάκου. Οι συστηματικές ανεπιθύμητες ενέργειες της βρινζολαμίδης πιστεύεται ότι οφείλονται εν μέρει στην απορρόφηση του φαρμάκου από το ρινικό βλεννογόνο. Η βρινζολαμίδη μεταφέρεται στη ρινική κοιλότητα μέσω του ρινοδακρυϊκού πόρου και με τον τρόπο αυτό οι ασθενείς συμβουλεύονται, μετά την ενστάλαξη του φαρμάκου, να ασκούν ολιγόλεπτη πίεση με το δάκτυλό τους στην άκρη του οφθαλμού προκειμένου να φράσουν τον προαναφερθέντα πόρο και να μειώνουν τη συστηματική έκθεση. Ακολούθως παρατίθενται οι διάφορες ανεπιθύμητες ενέργειες που αναμένεται να συνοδεύουν την τοπική θεραπεία με βρινζολαμίδη : Συνήθεις ανεπιθύμητες ενέργειες που επηρεάζουν έως 1 στους 10 ασθενείς Οφθαλμικές εκδηλώσεις : θόλωση της όρασης, ερεθισμός του οφθαλμού, οφθαλμικός πόνος, ξηροφθαλμία, οφθαλμική καταρροή, οφθαλμική δυσφορία. Συστηματικές εκδηλώσεις : δυσγευσία. Ασυνήθιστες ανεπιθύμητες ενέργειες που επηρεάζουν έως 1 στους 100 ασθενείς Οφθαλμικές εκδηλώσεις : φωτοευαισθησία, επιπεφυκίτιδα, οφθαλμικό οίδημα, κνησμός των βλεφάρων, ερυθρότητα του οφθαλμού, αυξημένος οφθαλμικός χρωματισμός. Συστηματικές εκδηλώσεις : μείωση της καρδιακής παροχής, αίσθημα παλμών, βραδυκαρδία, δυσκολία στην αναπνοή, βήχας, μείωση των ερυθροκυττάρων, ζαλάδα, διαταραχές της μνήμης, κατάθλιψη, νευρικότητα, αίσθημα κόπωσης, τρόμος, μείωση της libido, στυτική δυσλειτουργία, ρινίτιδα, ναυτία, έμετος, 57

ευκοιλιότητα, διάρροια, μετεωρισμός, νεφρικός πόνος, μυϊκός πόνος, μυϊκός σπασμός, ρινορραγία, πονοκέφαλος, ξηροστομία. Σπάνιες ανεπιθύμητες ενέργειες που επηρεάζουν έως 1 στους 1000 ασθενείς Οφθαλμικές εκδηλώσεις : οίδημα του κερατοειδούς, διπλωπία, περιοφθαλμικό οίδημα, ενδοφθάλμια υπέρταση, βλάβη του οπτικού νεύρου. Συστηματικές εκδηλώσεις : εξασθένιση της μνήμης, θωρακικός πόνος, συμφόρηση της ανώτερης αναπνευστικής οδού, ρινική συμφόρηση, ξήρανση της ρινικής κοιλότητας, εμβοές ώτων, αλωπεκία, γενικευμένος κνησμός, ακανόνιστος καρδιακός ρυθμός, αϋπνία, σωματική κόπωση. 58

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ 3.1 Εισαγωγή Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος (Dried Blood Spots/DBS) αποτελούν μια ιδιαίτερη μέθοδο δειγματοληψίας βιολογικού υλικού που βρίσκει αυξανόμενη εφαρμογή σε διάφορους κλάδους των βιοϊατρικών επιστημών. Η δεδομένη μεθοδολογία υπαγορεύει την εναπόθεση μικρού όγκου αίματος ( 100μL) στην επιφάνεια ενός κατάλληλου διηθητικού χάρτη και την ακόλουθη ξήρανσή του σε συνθήκες δωματίου. Η εφαρμοζόμενη ποσότητα αίματος μπορεί να αντιστοιχεί είτε σε τριχοειδικό αίμα που λαμβάνεται με την διάτρηση του δακτύλου ή της πτέρνας, είτε σε φλεβικό αίμα που λαμβάνεται μέσω κλασικής αιμοληψίας. Η τελική ανάλυση πραγματοποιείται σε έναν δίσκο συγκεκριμένης διαμέτρου (punch disk) που αποσπάται από τη ξηραμένη κηλίδα μέσω κατάλληλης διατρητικής συσκευής (puncher) (Εικόνα 3.1). Εικόνα 3.1 Ξηραμένες κηλίδες αίματος επί διηθητικού χάρτη. Η ιστορία των ξηραμένων κηλίδων αίματος αρχίζει το 1963 με την εμβληματική ερευνητική εργασία των Guthrie και Susi η οποία επέτρεψε τη νεογνική διάγνωση της φαινυλκετονουρίας χρησιμοποιώντας την προαναφερθείσα μέθοδο δειγματοληψίας για τη συλλογή αίματος από την πτέρνα νεογνών (50). Από τότε και μέχρι σήμερα, η χρήση των ξηραμένων κηλίδων αίματος έχει συνδεθεί άρρηκτα με τη διενέργεια του νεογνικού ελέγχου για τα διάφορα συγγενή μεταβολικά νοσήματα σε ευρεία πληθυσμιακή κλίμακα. Η υιοθέτηση των ξηραμένων κηλίδων αίματος ως μέθοδος δειγματοληψίας, ενθαρρύνθηκε από την ανάπτυξη ευαίσθητων αναλυτικών τεχνικών που επιτρέπουν την ανάλυση μικροποσοτήτων όπως είναι οι ανοσοχημικές τεχνικές και κυρίως η φασματομετρία μάζας. Την τελευταία δεκαετία εντοπίζεται μια ισχυρή τάση διεύρυνσης της χρήσης των ξηραμένων κηλίδων αίματος πέρα από τα πλαίσια του νεογνικού ελέγχου στον προσδιορισμό ξενοβιοτικών όπως είναι τα φάρμακα (51). Πιο συγκεκριμένα, επιδιώκεται η 59

εφαρμογή της δεδομένης μεθόδου δειγματοληψίας στις διάφορες φαρμακοκινητικές και τοξικοκινητικές μελέτες που συνοδεύουν τα προκλινικά και κλινικά στάδια ανάπτυξης νέων φαρμάκων (52), όπως επίσης και στην κλινική παρακολούθηση των θεραπευτικών επιπέδων τους σε ασθενείς (53). Από αναλυτικής σκοπιάς, οι ξηραμένες κηλίδες αίματος αποτελούν ένα ιδιότυπο μητρικό υλικό, το οποίο διαφοροποιείται αισθητά από τα κλασικά υγρά βιολογικά δείγματα όπως είναι το αίμα, το πλάσμα, ο ορός και τα ούρα. Τόσο οι αναλύτες όσο και τα διάφορα συστατικά του αίματος βρίσκονται προσροφημένα σε μια στέρεα κυτταρινική μήτρα. Θα πρέπει να τονίσουμε ότι τα διάφορα αποτελέσματα που προκύπτουν κατά την ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος αντιστοιχούν σε συγκεντρώσεις αναλύτη σε ολικό αίμα και δεν θα πρέπει να συγχέονται με τις συγκεντρώσεις επιμέρους διαμερισμάτων του αίματος όπως είναι τα ερυθροκύτταρα και το πλάσμα (54). Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος ως εναλλακτική μέθοδο δειγματοληψίας διατηρεί αρκετά σημαντικά πλεονεκτήματα ανεξάρτητα από τη φύση της προσδιοριζόμενης εφαρμογής. Πρώτα από όλα, η απαίτηση μικροποσοτήτων αίματος αποτελεί μια επιθυμητή εναλλακτική σε περιπτώσεις νεογνών, βρεφών και κρίσιμα νοσούντων ασθενών που δεν ενδείκνυται η λήψη μεγάλων ποσοτήτων αίματος. Κατά ανάλογο τρόπο, ο ελάχιστος απαιτούμενος όγκος αίματος εξυπηρετεί τις διάφορες προκλινικές μελέτες που πραγματοποιούνται κυρίως σε μύες επιτρέποντας την επαναλαμβανόμενη λήψη δειγμάτων χωρίς την πρόκληση αιμοδυναμικών διαταραχών στο πειραματόζωο. Έτσι, αφενός τα προκύπτοντα φαρμακοκινητικά και τοξικοκινητικά αποτελέσματα είναι περισσότερο αξιόπιστα και αφετέρου χρησιμοποιούνται λιγότερα πειραματόζωα (55). Ένα δεύτερο σημαντικό πλεονέκτημα των ξηραμένων κηλίδων αίματος σχετίζεται με την εύκολη αποθήκευση και μεταφορά τους. Σε αντίθεση μα τα υγρά βιολογικά δείγματα, για τις ξηραμένες κηλίδες αίματος δεν απαιτείται κατάψυξη καθώς στις περισσότερες περιπτώσεις διατηρούνται σταθερές για ικανό χρονικό διάστημα σε συνθήκες δωματίου. Έτσι, δεν απαιτείται κάποια εξειδικευμένη και δαπανηρή διαδικασία μεταφοράς αλλά μπορούν να αποσταλθούν εντός συμβατικού φακέλου μέσω ταχυδρομείου. Η δεδομένη απλοποίηση της αποθήκευσης και μεταφοράς των δειγμάτων μπορεί να μειώσει σημαντικά το κόστος μιας φαρμακοκινητικής μελέτης (56). Ένα ακόμα πλεονέκτημα των ξηραμένων κηλίδων αίματος σχετίζεται με την αυξημένη σταθερότητα που εμφανίζουν ορισμένοι αναλύτες σε αυτές. Το παραπάνω γεγονός οφείλεται στην στέρεα φύση του δείγματος η οποία αναστέλλει τη δράση των περιεχομένων ενζύμων που ευθύνονται κυρίως για τη μειωμένη σταθερότητα των αναλυτών (57). Επίσης, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις παρατεταμένης σταθερότητας φωτοευαίσθητων αναλυτών χωρίς να έχει διασαφηνιστεί ο μηχανισμός φωτοπροστασίας (58). Σε ένα δεύτερο επίπεδο, η στέρεα φύση των ξηραμένων κηλίδων αίματος ελαχιστοποιεί την πιθανότητα μόλυνσης από παθογόνους μικροοργανισμούς και ιούς όπως είναι ο HIV (59) και καθιστά δύσκολη την απώλεια ή επιμόλυνση δείγματος λόγω ατυχήματος κατά την αναλυτική πορεία. Τέλος, όπως θα δούμε και στη συνέχεια, οι ξηραμένες κηλίδες αίματος δεν απαιτούν κάποια περίπλοκη διαδικασία προκατεργασίας δείγματος οπότε μειώνεται σημαντικά ο συνολικός χρόνος ανάλυσης. 60

3.2 Περιγραφή της δειγματοληπτικής πορείας που ακολουθείται στις ξηραμένες κηλίδες αίματος Επιλογή κατάλληλου υλικού συλλογής Το πρώτο βήμα για την ανάπτυξη μιας βιοαναλυτικής μεθόδου που βασίζεται στις ξηραμένες κηλίδες αίματος είναι η επιλογή του κατάλληλου υλικού συλλογής πάνω στο οποίο θα απορροφηθεί η εφαρμοζόμενη ποσότητα αίματος. Στις περισσότερες περιπτώσεις χρησιμοποιείται διηθητικός χάρτης κυτταρίνης (DBS paper/filter paper) ο οποίος κατασκευάζεται αποκλειστικά από ίνες βαμβακιού. Ο δεδομένος διηθητικός χάρτης απαντά στην αγορά τόσο σε καθαρή μορφή (untreated DBS paper) όσο και εμποτισμένος με διάφορες χημικές ουσίες (treated DBS paper) που του προσδίδουν ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Από τους προαναφερθέντες τύπους διηθητικού χάρτη, ο καθαρός τύπος κατατάσσεται από τον FDA ως in vitro ιατρική συσκευή συλλογής αίματος, με αποτέλεσμα η παραγωγή του να εμπίπτει σε πρoγράμματα διασφάλισης ποιότητας (60). Ο συστηματικός έλεγχος της ποιότητας κατασκευής του καθαρού διηθητικού χάρτη έγκειται στο γεγονός ότι χρησιμοποιείται ευρέως στα πλαίσια του νεογνικού ελέγχου, οπότε απαιτείται να διατηρεί σαφή χαρακτηριστικά ποιότητας, (61) ώστε τα προκύπτοντα διαγνωστικά αποτελέσματα να είναι όσο το δυνατόν περισσότερο αξιόπιστα. Μέχρι σήμερα, μόλις δύο εμπορικά διαθέσιμοι καθαροί διηθητικοί χάρτες ο Whatman 903 και ο Ahlstrom 226, έχουν εγκριθεί από τον FDA ως ιατρικές συσκευές συλλογής αίματος. Οι δεδομένοι χάρτες ελέγχονται αναφορικά με το μέγεθος των πόρων, το πάχος και την προσροφητική ικανότητα που διατηρούν. Με τον τρόπο αυτό, εξασφαλίζεται η ομοιογένεια της προκύπτουσας κηλίδας και η επαναληψιμότητα του προσροφούμενου όγκου αίματος. Αναφορικά με τους εμποτισμένους τύπους διηθητικού χάρτη, αυτοί περιέχουν διάφορες χημικές ουσίες, που σύμφωνα με τους κατασκευαστές τους, εξυπηρετούν συγκεκριμένες διαδικασίες όπως είναι η απενεργοποίηση των περιεχομένων ενζύμων, η αποδιάταξη των πρωτεϊνών, η λύση των μεμβρανών και η βελτίωση της εκχύλισης του αναλύτη. Χαρακτηριστικά παραδείγματα τέτοιων διηθητικών χαρτών είναι ο FTA DMPK τύπου Α και τύπου Β και ο FTA Elute. Παρά τις πολλά υποσχόμενες ιδιότητες των εμποτισμένων διηθητικών χαρτών, η ποιότητά τους δεν ελέγχεται από τον FDA ή από κάποιον άλλο επίσημο φορέα με αποτέλεσμα η διασφάλισή της να άπτεται του ίδιου του κατασκευαστή. Σήμερα, στη βιβλιογραφία απαντούν αναφορές που υποστηρίζουν τη μεταβαλλόμενη ποιότητα των δεδομένων διηθητικών χαρτών αναφορικά με την ομοιογένεια των σχηματιζόμενων κηλίδων αίματος. Άλλες αναφορές υποστηρίζουν ότι οι περιεχόμενες χημικές ουσίες δυσχεραίνουν την ακόλουθη ανάλυση ειδικά στην περίπτωση της φασματομετρίας μάζας (62). Περά από τους διηθητικούς χάρτες κυτταρίνης, στην αγορά απαντούν διάφορα εναλλακτικά υλικά συλλογής που βασίζονται σε πολυμερή και γυαλί, τα οποία, ωστόσο, δεν χαίρουν ευρείας εφαρμογής. Συλλογή αίματος Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, οι ξηραμένες κηλίδες αίματος σχηματίζονται με την εναπόθεση μικρού όγκου αίματος στην επιφάνεια ενός κατάλληλου μέσου συλλογής. Η 61

ποσότητα και το είδος του εφαρμοζόμενου αίματος εξαρτάται από τη φύση της αναλυτικής πληροφορίας που επιδιώκεται να εξαχθεί. Σε περιπτώσεις όπου η προσδιοριζόμενη αναλυτική πληροφορία διατηρεί ποιοτικό χαρακτήρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν λίγες σταγόνες τριχοειδούς αίματος, το οποίο προέρχεται από τη διάτρηση του δακτύλου ή της πτέρνας. Η δεδομένη προσέγγιση αναφέρεται κυρίως σε διαγνωστικές εφαρμογές όπως είναι ο νεογνικός έλεγχος, όπου επιδιώκεται η ανίχνευση ενδογενών ουσιών οι οποίες υπό φυσιολογικές συνθήκες απουσιάζουν ή βρίσκονται σε ελάχιστες συγκεντρώσεις ενώ σε παθολογικές καταστάσεις απαντούν σε πολλαπλάσιες ποσότητες. Αντίθετα, σε περιπτώσεις που απατούνται αξιόπιστα ποσοτικά αποτελέσματα, όπως είναι οι φαρμακοκινητικές και τοξικοκινητικές μελέτες, η απλή συλλογή σταγόνων τριχοειδούς αίματος φαίνεται να μην επαρκεί για δύο κύριους λόγους. Σε ένα πρώτο επίπεδο, η συλλογή σταγόνων δεν εξασφαλίζει την επαρκή επαναληψιμότητα του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος με αποτέλεσμα οι αποσπώμενοι δίσκοι να φέρουν οριακά διαφορετικό όγκο αίματος κάθε φορά. Η δεδομένη πηγή μεταβλητότητας μπορεί να μην επηρεάζει τα ποιοτικά δεδομένα, αλλά παράγει σημαντικά σφάλματα στα ποσοτικά αποτελέσματα. Επίσης, το τριχοειδικό αίμα αποτελεί μια ιδιότυπη μορφή αίματος που διατηρεί ορισμένες διαφορές με το φλεβικό αίμα, το οποίο αποτελεί το ευρύτερα μελετημένο και αποδεκτό βιολογικό υγρό. Πιο συγκεκριμένα, η σύσταση του τριχοειδικού αίματος είναι περισσότερο επιρρεπής σε μεταβολές ανάλογα με τα διάφορα φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα στο σύστημα της μικροκυκλοφορίας. Με τον τρόπο αυτό, σε περιπτώσεις που επιδιώκεται η λήψη αξιόπιστων ποσοτικών αποτελεσμάτων θα πρέπει μάλλον να προτιμάται η εφαρμογή συγκεκριμένου όγκου φλεβικού αίματος στον εκάστοτε διηθητικό χάρτη. Η δεδομένη πρακτική, περιλαμβάνει τη λήψη ορισμένης ποσότητας φλεβικού αίματος μέσω κλασικής αιμοληψίας που ακολούθως μεταφέρεται σε σωλήνα που διαθέτει κάποιον αντιπηκτικό παράγοντα. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια μιας αναλυτικής πιπέτας, ακριβώς καθορισμένος όγκος αίματος μεταφέρεται στο διηθητικό χάρτη σχηματίζοντας τη χαρακτηριστική κηλίδα. Η χρήση αντιπηκτικού παράγοντα είναι απαραίτητη καθώς η πήξη του αίματος επέρχεται πολύ σύντομα μετά την αιμοληψία. Ως αντιπηκτικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται κυρίως η ηπαρίνη και το αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), με το τελευταίο να εμφανίζει ευρύτερη αποδοχή καθώς δρα ανασταλτικά επί διαφόρων φωσφολιπασών και εστερασών (63). Ξήρανση, αποθήκευση και μεταφορά ξηραμένων κηλίδων αίματος Μετά την εναπόθεση του αίματος στο διηθητικό χάρτη και το σχηματισμό της κηλίδας αίματος ακολουθεί η ξήρανσή της που λαμβάνει χώρα σε συνθήκες δωματίου και διαρκεί περίπου 2 με 3 h (Εικόνα 3.2). Ο ακριβής χρόνος που αιτείται για την ολοκλήρωση της διαδικασίας ξήρανσης εξαρτάται από το είδος του χρησιμοποιούμενου διηθητικού χάρτη όπως επίσης και από τον εφαρμοζόμενο όγκο αίματος. Σε γενικές γραμμές, προτείνεται οι 'φρέσκες' κηλίδες αίματος να μην εκτίθενται στο ηλιακό φως ή σε σκόνη και να μην στοιβάζονται η μία πάνω στην άλλη μέχρι να ολοκληρωθεί η ξήρανσή τους. Για πολλούς ερευνητές, η διαδικασία ξήρανσης αποτελεί το κρισιμότερο στάδιο που επηρεάζει τη σταθερότητα των περιεχομένων αναλυτών. Όντως, πριν την ολοκλήρωση της ξήρανσης, στις κηλίδες αίματος απαντά η διαλυμένη μορφή του αναλύτη και των συστατικών του αίματος με αποτέλεσμα να ενθαρρύνονται οι διάφορες αντιδράσεις αποικοδόμησης. Αντίθετα, η 62

στέρεα φύση των προκυπτουσών ξηραμένων κηλίδων αίματος δεν αποτελεί ευνοϊκό περιβάλλον για την πραγματοποίηση αντιδράσεων. Στη βιβλιογραφία προτείνονται διάφορες ειδικές συνθήκες ξήρανσης που επιχειρούν τον περιορισμό της αποικοδόμησης ασταθών αναλυτών κυρίως μέσω της ρύθμισης των επιπέδων υγρασίας, ph (64) και θερμοκρασίας (65). Ένα από τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα των ξηραμένων κηλίδων αίματος ως μέθοδος δειγματοληψίας, έγκειται στο γεγονός ότι δεν απαιτούν ειδικές συνθήκες φύλαξης, εν αντιθέσει με τα κλασικά υγρά βιολογικά δείγματα όπως είναι το ολικό αίμα και το πλάσμα. Ειδικότερα, οι ξηραμένες κηλίδες αίματος διατηρούνται σταθερές για ικανό χρονικό διάστημα σε θερμοκρασία δωματίου, χωρίς να απαιτείται η κατάψυξή τους χρησιμοποιώντας ξηρό πάγο ή ψυγείο. Το παραπάνω γεγονός απλοποιεί εξαιρετικά την αποστολή των ξηραμένων κηλίδων αίματος στο εκάστοτε αναλυτικό εργαστήριο, καθώς αυτή μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω του κλασικού ταχυδρομείου. Τα δεδομένα δείγματα δεν άπτονται κάποιας νομοθεσίας περί ειδικού τρόπου διακίνησης οπότε μπορούν να αποθηκευτούν σε μια αεροστεγή πλαστική ζελατίνα και στη συνέχεια να εσωκλειστούν σε έναν απλό ταχυδρομικό φάκελο. Ωστόσο, για να αποφευχθεί η τυχούσα βακτηριακή ανάπτυξη στα δείγματα, προτείνεται η παρουσία ξηραντικού παράγοντα στο εσωτερικό της ζελατίνας, ώστε να διατηρείται σε ασφαλές επίπεδο η υγρασία του μικροπεριβάλλοντος (66). Εικόνα 3.2 Ξήρανση κηλίδων αίματος σε συνθήκες δωματίου. Προσθήκη εσωτερικού προτύπου, εκχύλιση και ανάλυση ξηραμένων κηλίδων αίματος Όπως γνωρίζουμε, η χρήση εσωτερικού προτύπου αποτελεί μια ευρύτατα διαδεδομένη πρακτική στα πλαίσια της βιοανάλυσης. Η δεδομένη μεθοδολογία επιχειρεί τη διόρθωση των σφαλμάτων που προκύπτουν κατά την προκατεργασία των αναλυόμενων δειγμάτων όπως επίσης και κατά τη λήψη του αναλυτικού σήματος. Για να μπορέσει το εσωτερικό πρότυπο να εξυπηρετήσει τους προαναφερθέντες σκοπούς θα πρέπει να προστίθεται στα δείγματα σε σταθερές ποσότητες και πριν από την οποιαδήποτε διαδικασία προκατεργασίας. Στην περίπτωση των ξηραμένων κηλίδων αίματος, ο συνηθέστρος τρόπος εισαγωγής του εσωτερικού προτύπου εξυπηρετεί το ήμισυ του σκοπού του. Πιο συγκεκριμένα, στο σύνολο των εφαρμογών που χρησιμοποιούν τη δεδομένη μέθοδο δειγματοληψίας, το εσωτερικό πρότυπο προστίθεται είτε στο εκχύλισμα της ξηραμένης 63

κηλίδας αίματος, είτε ενσωματώνεται στο διαλύτη εκχύλισης (Εικόνα 3.3,β). Με τον τρόπο αυτό, το εσωτερικό πρότυπο δεν αντισταθμίζει τη διακύμανση της ανάκτησης του αναλύτη από το μητρικό υλικό αλλά εξυπηρετεί μόνο τη διόρθωση των σφαλμάτων που σχετίζονται με τις μεταβολές του αναλυτικού σήματος. Υπό ιδανικές συνθήκες, το εσωτερικό πρότυπο θα έπρεπε να προστίθεται στο λαμβανόμενο όγκο αίματος πριν αυτός εφαρμοστεί στο διηθητικό χάρτη (Εικόνα 3.3,α). Ωστόσο, η παραπάνω μεθοδολογία περιπλέκει περαιτέρω τη διαδικασία δειγματοληψίας, με αποτέλεσμα στις περισσότερες εφαρμογές να επιλέγεται η προσθήκη του εσωτερικού προτύπου στο τελικό εκχύλισμα. Στη βιβλιογραφία αναφέρονται διάφοροι εναλλακτικοί τρόποι εισαγωγής του εσωτερικού προτύπου που επιχειρούν τη διευθέτηση του προαναφερθέντος περιορισμού, όπως είναι (67,68) : η εναπόθεση συγκεκριμένου όγκου διαλύματος εσωτερικού προτύπου απευθείας στη ξηραμένη κηλίδα αίματος (Εικόνα 3.3, γ) η εναπόθεση συγκεκριμένου όγκου διαλύματος εσωτερικού προτύπου στο διηθητικό χάρτη πριν από την προσθήκη της ποσότητας αίματος (Εικόνα 3.3, δ) ο ταυτόχρονος σχηματισμός μιας κηλίδας αίματος και μιας κηλίδας διαλύματος εσωτερικού προτύπου οι οποίες μετά τη ξήρανσή τους συνεκλούονται (Εικόνα3.3, ε). Εικόνα 3.3 Διαφορετικές πορείες εισαγωγής εσωτερικού προτύπου. Παρά την ευρηματικότητα των προτεινόμενων λύσεων, αυτές δε συνεισφέρουν σημαντικά στη διόρθωση των αναλυτικών αποτελεσμάτων και μάλλον εισάγουν νέα προβλήματα που σχετίζονται με την ανάμειξη του αναλυόμενου αίματος με το διάλυμα του εσωτερικού προτύπου. Μια πολλά υποσχόμενη παραλλαγή των παραπάνω μεθοδολογιών σχετίζεται με την εισαγωγή του εσωτερικού προτύπου στο διηθητικό χάρτη ως αερόλυμα και όχι ως διάλυμα (69). Η δεδομένη προσέγγιση φαίνεται να βελτιώνει την ακρίβεια των αναλυτικών 64

αποτελεσμάτων αλλά απαιτεί τη χρήση εξειδικευμένης οργανολογίας και την αφιέρωση περισσότερου χρόνου για την ανάπτυξη της βιοαναλυτικής μεθόδου. Όπως για όλα τα διαφορετικά βιολογικά δείγματα, έτσι και για τις ξηραμένες κηλίδες αίματος η βιβλιογραφία βρίθει προτεινόμενων μεθόδων προκατεργασίας και ανάλυσης. Παρά την ποικιλία αναλυτικών προσεγγίσεων, η προκατεργασία των ξηραμένων κηλίδων αίματος επικεντρώνεται κυρίως στην στερεό-υγρό εκχύλιση (Solid-Liquid Extraction/ SLE), ενώ η κύρια ανάλυση βασίζεται κατά κόρον στη φασματομετρία μάζας. Αναφορικά με την προκατεργασία των ξηραμένων κηλίδων αίματος, αυτή προβλέπει την απόσπαση ενός δίσκου συγκεκριμένης διαμέτρου, ο οποίος στη συνέχεια εκχυλίζεται με τη βοήθεια κατάλληλου διαλύτη εκχύλισης. Ο παραπάνω δίσκος αποσπάται μέσω απλής διατρητικής συσκευής, η οποία μπορεί να λειτουργεί χειροκίνητα ή αυτόματα. Η διάμετρος του αποσπώμενου δίσκου ορίζει την ποσότητα του αίματος που αναλύεται και κατ' επέκταση την ευαισθησία της μεθόδου. Η σύσταση του διαλύτη εκχύλισης καθορίζει την ανάκτηση του εκάστοτε αναλύτη από τη ξηραμένη κηλίδα αίματος και αποτελεί σημαντικό στάδιο διερεύνησης κατά την ανάπτυξη μιας βιοαναλυτικής μεθόδου. Στο σύνολο των περιπτώσεων, ως διαλύτης εκχύλισης επιλέγεται κάποιο μίγμα οργανικού διαλύτη με νερό. Σε γενικές γραμμές, η αποκλειστική χρήση νερού ως διαλύτης εκχύλισης αποφεύγεται καθώς παράγονται εκχυλίσματα που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών όπως είναι η αιμοσφαιρίνη (70). Επίσης, το υψηλό ποσοστό νερού ενθαρρύνει την απελευθέρωση ινών από το διηθητικό χάρτη με αποτέλεσμα τα προκύπτοντα εκχυλίσματα να κρίνονται ακατάλληλα για άμεση εισαγωγή σε χρωματογραφικά συστήματα. Αντίθετα, με τη χρήση διαλυτών εκχύλισης που διατηρούν υψηλά ποσοστά οργανικών διαλυτών, όπως είναι η μεθανόλη (MeOH) και το ακετονιτρίλιο (ACN), παράγονται καθαρότερα εκχυλίσματα που στερούνται πρωτεϊνών και άλλων ενδογενών συστατικών του αίματος. Το παραπάνω γεγονός φαίνεται να οφείλεται στην κατακρήμνιση και ακόλουθη προσκόλληση των πρωτεϊνών του αίματος στο διηθητικό χάρτη. Εξαιρετικό ενδιαφέρων παρουσιάζει το γεγονός ότι ενώ τα υψηλά ποσοστά νερού έχουν αρνητική επίπτωση στο προκύπτον εκχύλισμα, τα χαμηλά ποσοστά (10-30 %) συνεισφέρουν συνήθως στην εκτενέστερη ανάκτηση του αναλύτη. Η περιγραφόμενη προκατεργασία ξηραμένων κηλίδων αίματος που περιλαμβάνει την απλή απόσπαση και εκχύλιση δίσκου αποτελεί μια μη αυτοματοποιημένη διαδικασία που δεν βρίσκεται σε σύζευξη με την κύρια ανάλυση (off-line process). Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί ορισμένες οργανολογικές μονάδες που επιτρέπουν την σε σειρά σύνδεση της εκχύλισης και ανάλυσης των ξηραμένων κηλίδων αίματος (on-line process) (71,72). Οι δεδομένες προσεγγίσεις βασίζονται κυρίως στη μικροροή διαλύτη μέσω της ξηραμένης κηλίδας αίματος ο οποίος στη συνέχεια οδηγείται απευθείας και αυτοματοποιημένα στο αναλυτικό σύστημα. Μέχρι στιγμής, οι παραπάνω οργανολογίες γνωρίζουν ελάχιστη εφαρμογή καθώς αποτελούν δαπανηρό εξοπλισμό και η χρήση τους εγείρει ορισμένα ερωτήματα και προκλήσεις. Η φασματομετρία μάζας αποτελεί την ευρύτερα χρησιμοποιούμενη αναλυτική τεχνική για την ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος. Στο σύνολο των περιπτώσεων, το εκχύλισμα των ξηραμένων κηλίδων αίματος αναλύεται με τη βοήθεια κάποιας τεχνικής διαχωρισμού συζευγμένης με τη φασματομετρία μάζας όπως είναι η υγροχρωματογραφίαφασματομετρία μάζας, η αεριοχρωματογραφία-φασματομετρία μάζας και η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση-φασματομετρία μάζας. Πέρα από τις προαναφερθείσες τεχνικές, εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει η εφαρμογή της φασματομετρίας μάζας 65

περιβαλλοντικών συνθηκών (ambient mass spectrometry) στην ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος (73). Ο ιδιότυπος αυτός τύπος φασματομετρίας μάζας επιχειρεί την άμεση ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος χωρίς καμιά διαδικασία προκατεργασίας. Μέχρι στιγμής, η δεδομένη προσέγγιση παρουσιάζει μόνο ερευνητικό ενδιαφέρον και δεν διατηρεί κάποια πραγματική εφαρμογή. 3.3 Παράγοντες που επηρεάζουν τα ποσοτικά αποτελέσματα της ανάλυσης των ξηραμένων κηλίδων αίματος Η εξαγωγή ποσοτικής πληροφορίας από την ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος βασίζεται στην υπόθεση ότι ο αποσπώμενος δίσκος αποτελεί μια αξιόπιστη ογκομετρική μονάδα του αναλυόμενου αίματος. Υπό ιδανικές συνθήκες, ο αποσπώμενος δίσκος περιέχει συγκεκριμένο και επαναλήψιμο όγκο αίματος και αποτελεί αντιπροσωπευτικό δείγμα της ξηραμένης κηλίδας αίματος. Σύμφωνα με τα ανωτέρω, το αναλυτικό αποτέλεσμα που προκύπτει κατά την ανάλυση του αποσπώμενου δίσκου ανάγεται στο επίπεδο της κηλίδας αίματος και κατ' επέκταση στο επίπεδο του ολικού αίματος. Ωστόσο, υπάρχουν τρεις συγκεκριμένοι παράγοντες που επηρεάζουν την προαναφερθείσα υπόθεση και ασκούν αρνητική επίδραση στην ποιότητα των αναλυτικών αποτελεσμάτων. Οι δεδομένοι παράγοντες είναι οι εξής: Χρωματογραφικό φαινόμενο Η αξία του αποσπώμενου δίσκου ως ογκομετρική μονάδα αίματος βασίζεται στην παραδοχή ότι η εφαρμοζόμενη ποσότητα αίματος και συνεπώς οι περιεχόμενοι αναλύτες κατανέμονται ομοιόμορφα στη σχηματιζόμενη κηλίδα αίματος. Κάθε απόκλιση από την προαναφερθείσα παραδοχή ονομάζεται χρωματογραφικό φαινόμενο (chromatographic effect) και θίγει την αξιοπιστία της χρήσης του αποσπώμενου δίσκου. Το χρωματογραφικό φαινόμενο ισοδυναμεί με την ανομοιογένεια της κηλίδας αίματος και μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τα προκύπτοντα αναλυτικά αποτελέσματα. Η εφαρμοζόμενη ποσότητα αίματος διασπείρεται κατά μήκος και εν τω βάθει του διηθητικού χάρτη σχηματίζοντας τελικά έναν επίπεδο κόλουρο κώνο, η μεγάλη βάση του οποίου στρέφεται στην επιφάνεια του διηθητικού χάρτη που εφαρμόζεται το αίμα. Κατά τη δημιουργία του δεδομένου κώνου λαμβάνουν χώρα κάποια φαινόμενα κατανομής, τα οποία μάλλον επηρεάζουν την ομοιογένεια της προκύπτουσας κηλίδας. Μέχρι στιγμής, στη βιβλιογραφία δεν απαντά κάποια ικανοποιητική ερμηνεία των παραπάνω φαινομένων με αποτέλεσμα οι γνώσεις για το χρωματογραφικό φαινόμενο να είναι αρκετά περιορισμένες. Οι διάφορες ερευνητικές μελέτες που επιχείρησαν τη διασαφήνιση του χρωματογραφικού φαινομένου βασίστηκαν στη χρήση απεικονιστικών τεχνικών, όπως η αυτοραδιογραφία που επιτρέπει τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του αναλύτη σε όλη την επιφάνεια της ξηραμένης κηλίδας αίματος (74,75). Οι παραπάνω μελέτες κατέδειξαν ότι σε ορισμένες περιπτώσεις απαντά ανομοιογενής κατανομή αναλύτη κυρίως μεταξύ της κεντρικής και περιφερικής περιοχής της ξηραμένης κηλίδας αίματος. Η παρατηρούμενη ανομοιογενής κατανομή αναλύτη εμφανίζει είτε τη μορφή U, όπου η συγκέντρωση του αναλύτη είναι υψηλότερη στην περιφέρεια από ό,τι στο κέντρο, είτε τη μορφή ανεστραμμένου U όπου η συγκέντρωση του αναλύτη είναι υψηλότερη στο κέντρο από ό,τι στην περιφέρεια. Η φύση του αναλύτη όπως 66

επίσης και το είδος του χρησιμοποιούμενου διηθητικού χάρτη σχετίζονται άμεσα με την εμφάνιση ανομοιογενούς κατανομής αναλύτη. Σε γενικές γραμμές, φαίνεται ότι οι εμποτισμένοι διηθητικοί χάρτες είναι περισσότερο επιρρεπείς στο χρωματογραφικό φαινόμενο από ότι οι καθαροί διηθητικοί χάρτες. Επίσης, η χημική δομή του αναλύτη φαίνεται να σχετίζεται με την έκταση του χρωματογραφικού φαινομένου, χωρίς ωστόσο να έχει επιτευχθεί η συσχέτιση κάποιας φυσικοχημικής παραμέτρου με το παρατηρούμενο φαινόμενο. Μια ενδιαφέρουσα ερμηνεία του χρωματογραφικού φαινομένου βασίζεται στην παραδοχή ότι τα συστατικά του αίματος και κυρίως τα ερυθροκύτταρα κατανέμονται με ιδιότυπο τρόπο κατά μήκος της σχηματιζόμενης κηλίδας. Η παραπάνω προσέγγιση υποστηρίζει ότι τα ερυθροκύτταρα συσσωρεύονται στην περιφέρεια της κηλίδας και βασίζεται σε ορισμένες μελέτες που κατέδειξαν την αυξημένη περιφερική συγκέντρωση αναλυτών οι οποίοι κατανέμονται εκτενώς στο ερυθροκυτταρικό κλάσμα (76,77). Ωστόσο, άλλες μελέτες έχουν αποκαλύψει την περιφερική συσσώρευση αναλυτών που κατανέμονται αποκλειστικά στο πλάσμα (78). Τα προαναφερθέντα αντικρουόμενα αποτελέσματα φανερώνουν μάλλον την περιορισμένη γνώση επί του θέματος και σημαίνουν την ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση του χρωματογραφικού φαινομένου. Γενικά, κατά την ανάπτυξη νέων βιοαναλυτικών μεθόδων προτείνεται η αξιολόγηση του χρωματογραφικού φαινομένου μέσω της ανάλυσης κεντρικά και περιφερικά αποσπώμενων δίσκων. Η απουσία σημαντικής διαφοράς μεταξύ των κεντρικών και περιφερικών συγκεντρώσεων του αναλύτη αποτελεί μια σημαντική ένδειξη ότι το χρωματογραφικό φαινόμενο είναι επαρκώς περιορισμένο ή απόν. Αιματοκρίτης Με τον όρο αιματοκρίτης (hematocrit) αναφερόμαστε στο εκατοστιαίο κλάσμα του όγκου του αίματος που καταλαμβάνεται από ερυθροκύτταρα. Ο αιματοκρίτης αποτελεί ένα πολύ σημαντικό χαρακτηριστικό του αίματος και η τιμή του κυμαίνεται από 41 % έως 51 % στους άνδρες και από 37 % έως 47 % στις γυναίκες. Αν και ο αιματοκρίτης παραμένει σχετικά σταθερός, υπάρχουν ορισμένες περιπτώσεις που παρατηρούνται σημαντικές αποκλίσεις όπως σε διάφορες ασθένειες και κατά τη βρεφική ηλικία. Ο αιματοκρίτης αποτελεί τη σημαντικότερη παράμετρο που επηρεάζει το ιξώδες του αίματος και κατ επέκταση όλες τις ρεολογικές ιδιότητές του. Το παραπάνω γεγονός, διατηρεί εξαιρετική σημασία στην περίπτωση των ξηραμένων κηλίδων αίματος, καθώς επηρεάζει τη διάχυση της εφαρμοζόμενης ποσότητας αίματος στο διηθητικό χάρτη (79,80). Πιο συγκεκριμένα, όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή του αιματοκρίτη, τόσο περισσότερο ιξώδες είναι το αίμα με αποτέλεσμα να περιορίζεται η διάχυσή του στο διηθητικό χάρτη. Η δεδομένη συλλογιστική πορεία υπαγορεύει ότι ο ίδιος όγκος αίματος παράγει μειούμενης διαμέτρου κηλίδες αίματος όσο αυξάνεται ο αιματοκρίτης του (Εικόνα 3.4). Με τον τρόπο αυτό, ο αιματοκρίτης του εφαρμοζόμενου αίματος επηρεάζει τον περιεχόμενο όγκο αίματος του αποσπώμενου δίσκου. Ειδικότερα, όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή του αιματοκρίτη, τόσο μεγαλύτερος είναι ο όγκους του αίματος που περιέχεται στον αποσπώμενο δίσκο. Η προαναφερθείσα διακύμανση του όγκου αίματος που τελικά υφίσταται την ανάλυση, οδηγεί σε σημαντικά αναλυτικά σφάλματα που μειώνουν την αξία των ποσοτικών αποτελεσμάτων. Η σχέση που συνδέει τον αιματοκρίτη με τη διάμετρο της σχηματιζόμενης κηλίδας φαίνεται να είναι αρκετά περίπλοκη και να εξαρτάται άμεσα από το είδος του χρησιμοποιούμενου 67

διηθητικού χάρτη. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η προαναφερθείσα σχέση βρέθηκε να είναι σχεδόν γραμμική, ενώ σε άλλες δεν κατέστη δυνατός ο προσδιορισμός της λόγω της μεγάλης ετερογένειας των πειραματικών δεδομένων (81). Το παραπάνω φαινόμενο περιπλέκεται περαιτέρω αν αναλογιστούμε ότι υπάρχουν αναφορές που υποστηρίζουν ότι η επίδραση του αιματοκρίτη στο τελικό αναλυτικό αποτέλεσμα εξαρτάται επίσης και από τη φύση του αναλύτη. Σύμφωνα με τα ανωτέρω, διατηρείται η άποψη ότι δεν υπάρχει κάποιος γενικός κανόνας ή κάποιο μαθηματικό μοντέλο που να ερμηνεύει καθολικά την επίδραση του αιματοκρίτη με αποτέλεσμα να απαιτείται ειδική μελέτη του φαινομένου για κάθε αναπτυσσόμενη βιοαναλυτική μέθοδο. Ένας απλός τρόπος περιορισμού της επίδρασης του αιματοκρίτη στα αναλυτικά αποτελέσματα είναι ο σχεδιασμός της βιοαναλυτικής μεθόδου σύμφωνα με την τιμή του αιματοκρίτη που αναμένεται να έχουν τα άτομα του πληθυσμού από τον οποίο θα προέρθουν τα δείγματα. Πιο συγκεκριμένα, όσο πλησιέστερα βρίσκεται η τιμή του αιματοκρίτη των προτύπων βαθμονόμησης και των δειγμάτων ποιοτικού ελέγχου με τη μέση τιμή του αιματοκρίτη των αναλυόμενων δειγμάτων, τόσο πιο αξιόπιστα είναι τα προκύπτοντα αποτελέσματα. Για παράδειγμα, στην περίπτωση του νεογνικού ελέγχου, για την ανάπτυξη και επικύρωση των βιοαναλυτικών μεθόδων, προτείνεται η χρήση εμβολιασμένων δειγμάτων αιματοκρίτη 55 % που αντιστοιχεί στο μέσο αιματοκρίτη των νεογνών (82). Φυσικά, η παραπάνω προσέγγιση δεν μπορεί να αντιμετωπίσει τις έκτακτες περιπτώσεις δειγμάτων που διατηρούν αιματοκρίτη πολύ διαφορετικό από εκείνον που στηρίχθηκε η ανάπτυξη της εκάστοτε μεθόδου. Για το λόγο αυτό, στα πλαίσια της επικύρωσης, θα πρέπει να αξιολογείται η ανταπόκριση της μεθόδου σε δείγματα που διατηρούν ρεαλιστικά αποκλίνουσες τιμές αιματοκρίτη. Στην περίπτωση που τα αποτελέσματα των προαναφερθέντων δειγμάτων βρίσκονται εντός των κριτηρίων αποδοχής, μπορεί να ισχυριστεί ότι η μέθοδος παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα για το συγκεκριμένο εύρος αιματοκρίτη. Εικόνα 3.4 Επίδραση του αιματοκρίτη στο εμβαδόν της σχηματιζόμενης κηλίδας (α) αιματοκρίτης 20 %, (β) αιματοκρίτης 60 %. Εφαρμοζόμενος όγκος αίματος Μια ακόμα παράμετρος που φαίνεται να επηρεάζει την ποιότητα των αναλυτικών αποτελεσμάτων είναι ο όγκος του αίματος που τελικά εφαρμόζεται στο διηθητικό χάρτη. Η δεδομένη παράμετρος διατηρεί σημασία σε περιπτώσεις όπου ο εφαρμοζόμενος όγκος αίματος δεν είναι απόλυτα καθορισμένος όπως κατά τη δειγματοληψία μέσω διάτρησης του δακτύλου ή της πτέρνας. Σε αυτές τις εφαρμογές συνήθως πραγματοποιείται συνεχής ενστάλαξη τριχοειδικού αίματος μέχρι η σχηματιζόμενη κηλίδα αίματος να λάβει 68

συγκεκριμένες γεωμετρικές διαστάσεις. Με τον τρόπο αυτό, ο εφαρμοζόμενος όγκος αίματος δεν είναι γνωστός αλλά διατηρείται εντός καθορισμένων ορίων. Αντίθετα, η προαναφερθείσα παράμετρος δεν ασκεί κάποια επίδραση στα αναλυτικά αποτελέσματα όταν επιλέγεται η εφαρμογή συγκεκριμένου όγκου φλεβικού αίματος στο διηθητικό χάρτη με τη βοήθεια κάποιας αναλυτικής πιπέτας. Υπό ιδανικές συνθήκες, θα θεωρούσε κανείς ότι η διάχυση του εφαρμοζόμενου αίματος στο διηθητικό χάρτη είναι συνεχής, ομοιόμορφη και ανεξάρτητη του προστιθεμένου όγκου. Η δεδομένη άποψη φαίνεται να είναι αληθής για συγκεκριμένους τύπους διηθητικού χάρτη και για σχετικά μικρή διακύμανση (±20 μl) του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος (83). Ωστόσο, σήμερα στη βιβλιογραφία απαντούν αρκετές αναφορές που καταδεικνύουν την επίδραση του όγκου του αίματος στα τελικά αποτελέσματα συγκέντρωσης αναλύτη (84,85). Ειδικότερα, σημαντικές αποκλίσεις παρατηρούνται όταν ο εφαρμοζόμενος όγκος αίματος μεταβάλλεται αισθητά, όπως σε περιπτώσεις διπλασιασμού και τριπλασιασμού. Οι ακραίες αυτές περιπτώσεις συνοδεύονται από την αύξηση του βάρους του αποσπώμενου δίσκου γεγονός που ενθαρρύνει την άποψη ότι η σημαντική μεταβολή του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος μπορεί να επηρεάσει τον περιεχόμενο όγκο αίματος του αποσπώμενου δίσκου. Η παρατήρηση σημαντικής επίδρασης στο αναλυτικό αποτέλεσμα μόνο σε περιπτώσεις μεγάλης απόκλισης του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος, οδήγησε στην διατύπωση ενός μοντέλου κορεσμού του διηθητικού χάρτη (78). Σύμφωνα με το δεδομένο μοντέλο, το αναλυτικό αποτέλεσμα διαφοροποιείται αισθητά μεταξύ της κορεσμένης και της ακόρεστης μορφής του διηθητικού χάρτη. Με τον τρόπο αυτό, οι μικρές διακυμάνσεις του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος διασφαλίζουν τη διατήρηση του χάρτη σε ακόρεστη μορφή και δεν επηρεάζουν το αναλυτικό αποτέλεσμα. Αντίθετα, οι μεγάλες διακυμάνσεις του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος προκαλούν κατά περίπτωση τον κορεσμό του διηθητικού χάρτη, με αποτέλεσμα να επηρεάζουν σημαντικά τα αναλυτικά δεδομένα. Σε γενικές γραμμές, κατά την ανάπτυξη και επικύρωση μιας βιοαναλυτικής μεθόδου που στηρίζεται στη συλλογή τριχοειδικού αίματος μέσω διηθητικού χάρτη, προτείνεται η μελέτη της επίδρασης του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος στην ποιότητα των αναλυτικών αποτελεσμάτων. 3.4 Περιορισμοί που σχετίζονται με τη χρήση των ξηραμένων κηλίδων αίματος Παρά την ευρεία εφαρμογή που γνωρίζουν σήμερα οι ξηραμένες κηλίδες αίματος, υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί και ερωτήματα που συνοδεύουν τη χρήση τους και αναμένουν απάντησης. Ορισμένοι από τους προαναφερθέντες περιορισμούς είναι οι εξής: Ο ελάχιστος όγκος αίματος (μερικές δεκάδες μl) που περιέχεται στον αποσπώμενο δίσκο και κατ' επέκταση αναλύεται υπαγορεύει τη χρήση εξαιρετικά ευαίσθητων και εξειδικευμένων αναλυτικών τεχνικών όπως είναι η φασματομετρία μάζας. Με τον τρόπο αυτό, η ανάλυση ξηραμένων κηλίδων αίματος δεν είναι πολλές φορές εφικτή μέσω συμβατικών και ευρέως διαδεδομένων τεχνικών όπως είναι η υγροχρωματογραφία υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή υπεριώδους (HPLC-UV). Αντίθετα, τα κλασικά βιολογικά υλικά όπως το αίμα και το πλάσμα επιτρέπουν ορισμένους χειρισμούς που καθιστούν δυνατή την ανάλυσή τους χρησιμοποιώντας τις προαναφερθείσες συμβατικές τεχνικές. Έτσι, η χρήση των ξηραμένων κηλίδων αίματος 69

επικεντρώνεται κυρίως σε περιπτώσεις αναλυτών που απαντούν σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα. Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος φαίνεται να αποτελούν ένα κατάλληλο μητρικό υλικό για μεταβολικά ασταθείς και φωτοευαίσθητους αναλύτες. Ωστόσο, η μεγάλη επιφάνεια των ξηραμένων κηλίδων αίματος ευθύνεται για την εκτενή έκθεση των αναλυτών στον ατμοσφαιρικό αέρα με αποτέλεσμα να παρατηρούνται προβλήματα σταθερότητας σε περιπτώσεις αναλυτών που είναι ασταθείς στον αέρα και σε περιπτώσεις πτητικών ουσιών (86). Η συμφωνία της τριχοειδικής συγκέντρωσης των αναλυτών με την αντίστοιχη φλεβική συγκέντρωση αποτελεί ένα θέμα που χρήζει περαιτέρω διερεύνησης και δύναται να περιπλέξει την ερμηνεία των παραγόμενων αποτελεσμάτων. Αν και σε γενικές γραμμές δεν αναμένονται σημαντικές διαφορές στις δεδομένες συγκεντρώσεις, στη βιβλιογραφία απαντούν ορισμένες αναφορές που υποστηρίζουν το αντίθετο (87,88). Η κλασική προκατεργασία των ξηραμένων κηλίδων αίματος μέσω στερεό-υγρό εκχύλισης παράγει εκχυλίσματα στα οποία απουσιάζουν ορισμένοι αναλύτες οι οποίοι ωστόσο ανιχνεύονται στο ολικό αίμα και στο πλάσμα. Οι δεδομένοι αναλύτες αναφέρονται σε διάφορα παράγωγα του μεταβολισμού που ανιχνεύονται στα πλαίσια της μεταβονομικής (89). Η σημαντική αποδοχή των ξηραμένων κηλίδων αίματος ως μέθοδος δειγματοληψίας έχει ενθαρρύνει την ανάπτυξη διαφορετικών διηθητικών χαρτών κυρίως εμποτισμένου τύπου. Οι δεδομένοι διηθητικοί χάρτες συνήθως περιέχουν μη πτητικές επιφανειοδραστικές ουσίες οι οποίες σχηματίζουν ζεύγη ιόντων με τους προσδιοριζόμενους αναλύτες προκαλώντας χρωματογραφικά προβλήματα και καταστέλλοντας το αναλυτικό σήμα, κυρίως στην περίπτωση της φασματομετρίας μάζας (62). Η επικύρωση μιας βιοαναλυτικής μεθόδου που βασίζεται στις ξηραμένες κηλίδες αίματος είναι περισσότερο επίπονη και χρονοβόρα από εκείνη που βασίζεται στο πλάσμα. Πέρα από τα κλασικά αναλυτικά χαρακτηριστικά επίδοσης, απαιτείται η αξιολόγηση ορισμένων ειδικών παραμέτρων όπως είναι η ομοιογένεια της σχηματιζόμενης κηλίδας αίματος και η επίδραση του αιματοκρίτη και του εφαρμοζόμενου όγκου αίματος στο αναλυτικό αποτέλεσμα. Όπως γνωρίζουμε, μόνο η ελεύθερη διαλυμένη μορφή του φαρμάκου έχει την ικανότητα να διέρχεται των διαμερισμάτων του οργανισμού και να αλληλεπιδρά με τα διάφορα βιολογικά συστήματα εκδηλώνοντας την φαρμακολογική του δράση. Με τον τρόπο αυτό, θα περίμενε κανείς να χρησιμοποιείται η ελεύθερη συγκέντρωση του φαρμάκου στο πλάσμα του αίματος για την περιγραφή των διαφόρων φαρμακοκινητικών και φαρμακοδυναμικών ιδιοτήτων. Ωστόσο, ο υπολογισμός της δεδομένης συγκέντρωσης είναι αρκετά δύσκολος με αποτέλεσμα να επιλέγεται ο προσδιορισμός εναλλακτικών συγκεντρώσεων όπως είναι η συγκέντρωση του 70

φαρμάκου στο πλάσμα και η συγκέντρωση του φαρμάκου στο ολικό αίμα. Υπό συγκεκριμένες συνθήκες, οι εναλλακτικές αυτές συγκεντρώσεις είναι ενδεικτικές της ελεύθερης συγκέντρωσης φαρμάκου (54). Όπως παρατηρούμε από την ακόλουθη σχέση, η συγκέντρωση του φαρμάκου στο ολικό αίμα (CC bb ) μπορεί να περιγράψει την ελεύθερη συγκέντρωση στο πλάσμα (CC uu ) μόνο όταν οι παράμετροι HH, ρρ, ff uu διατηρούνται σε εύλογο βαθμό σταθεροί: CC bb = 1 HH ff uu + HH ρρ CC uu ff uu : Το κλάσμα του ελεύθερου φαρμάκου στο πλάσμα. ρρ: Ο λόγος της συγκέντρωσης του φαρμάκου στα κύτταρα του αίματος προς την συγκέντρωση ελεύθερου φαρμάκου στο πλάσμα. HH: Αιματοκρίτης. Συνήθως, οι παράμετροι HH και ff uu διατηρούνται σταθεροί αλλά η παράμετρος ρρ μπορεί να μεταβληθεί σε περιπτώσεις φαρμάκων που καθαίρονται βραδέως από τον οργανισμό και συνδέονται με κορέσιμο τρόπο στα έμμορφα συστατικά του αίματος. Σε αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να γίνεται προσεκτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από την ανάλυση ολικού αίματος ή ξηραμένων κηλίδων αίματος. Τέλος, η επικράτηση φαρμακοκινητικών δεδομένων που βασίζονται στην ανάλυση πλάσματος καθιστά ακόμα δυσκολότερη την ερμηνεία των δεδομένων αποτελεσμάτων. Η παράθεση των ανωτέρω περιορισμών δεν έχει αποτρεπτικό σκοπό αλλά αποτελεί μια προσπάθεια αντικειμενικής απαρίθμησης των θεμάτων προς διερεύνηση που σχετίζονται με τη χρήση των ξηραμένων κηλίδων αίματος. Αξίζει να σημειωθεί ότι ενώ οι ξηραμένες κηλίδες αίματος αποτελούν αναγνωρισμένη μέθοδο δειγματοληψίας στα πλαίσια της κλινικής διάγνωσης ασθενειών, δεν αναγνωρίζονται από τους ελεγκτικούς οργανισμούς που αξιολογούν τις φαρμακοκινητικές μελέτες, οι οποίες απαιτούνται για την έγκριση νέων φαρμακευτικών προϊόντων. Ωστόσο, πιστεύεται ότι η απάντηση των ανωτέρω ερωτημάτων στο προσεχές μέλλον θα ενθαρρύνει την ευρύτερη αποδοχή των ξηραμένων κηλίδων αίματος. 3.5 Εφαρμογές των ξηραμένων κηλίδων αίματος Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος αποτελούν μια πολλά υποσχόμενη μέθοδο δειγματοληψίας που βρίσκει ευρεία εφαρμογή σε διάφορους χώρους των βιοϊατρικών επιστημών (Πίνακας 3.1). Οι κυριότερες εφαρμογές των ξηραμένων κηλίδων αίματος είναι οι εξής: Προκλινικές φαρμακοκινητικές και τοξικοκινητικές μελέτες Η ελάχιστη ποσότητα αίματος που συλλέγεται μέσω των ξηραμένων κηλίδων αίματος επιτρέπει την πολλαπλή δειγματοληψία από το ίδιο πειραματόζωο χωρίς την πρόκληση 71

αιμοδυναμικών διαταραχών. Με τον τρόπο αυτό, συλλέγονται περισσότερα δεδομένα για τη συγκρότηση του φαρμακοκινητικού προφίλ ενός φαρμάκου και παράλληλα μειώνεται έως 60 % ο απαιτούμενος αριθμός πειραματόζωων. Μάλιστα, στην περίπτωση των φαρμάκων που κατανέμονται εκτενώς στα ερυθροκύτταρα φαίνεται ότι η ανάλυση ξηραμένων κηλίδων αίματος παρέχει περισσότερο αξιόπιστα αποτελέσματα συγκριτικά με την ανάλυση πλάσματος. Το δεδομένο γεγονός οφείλεται στην αποφυγή σφαλμάτων που σχετίζονται με την αιμόλυση του αίματος. Παρακολούθηση θεραπευτικών επιπέδων φαρμάκου Ο όρος παρακολούθηση θεραπευτικών επιπέδων φαρμάκου (Therapeutic Drug Monitoring/TDM) αναφέρεται στον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του φαρμάκου στο αίμα του ασθενούς σε διάφορες χρονικές στιγμές προκειμένου να βελτιωθεί η χορηγούμενη δόση. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η βέλτιστη θεραπευτική δράση του φαρμάκου, όπως επίσης και ο περιορισμός της εμφάνισης ανεπιθύμητων ενεργειών. Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος αποτελούν μια πολύτιμη εναλλακτική δειγματοληψίας, η οποία, μάλιστα, στη περίπτωση χρήσης τριχοειδικού αίματος επιτρέπει τη συλλογή των δειγμάτων από τον ίδιο τον ασθενή χωρίς τη μεσολάβηση εξειδικευμένου προσωπικού, όπως στην περίπτωση της κλασικής αιμοληψίας. Στη συνέχεια, τα δείγματα μπορούν να αποσταλθούν στο εκάστοτε αναλυτικό εργαστήριο το οποίο με τη σειρά του θα ενημερώσει το θεράποντα ιατρό γα τα προκύπτοντα αποτελέσματα. Έτσι, επιτυγχάνεται η απλοποίηση της παρακολούθησης των θεραπευτικών επιπέδων του φαρμάκου, ο ασθενής παρακολουθείται στενότερα και επωφελείται της αποτελεσματικότερης δόσης. Νεογνικός έλεγχος μεταβολικών νοσημάτων Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος βρίσκουν ευρεία εφαρμογή στα πλαίσια της διάγνωσης συγγενών ασθενειών σε μεγάλη πληθυσμιακή κλίμακα. Η σημαντικότερη διαγνωστική εφαρμογή των ξηραμένων κηλίδων αίματος σχετίζεται με τη διενέργεια του νεογνικού ελέγχου κατά τον οποίο ανιχνεύονται διάφορες συγγενείς διαταραχές του μεταβολισμού. Η δεδομένη ανίχνευση βασίζεται στον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών μεταβολιτών οι οποίοι στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση συγκεκριμένων διαγνωστικών βιοδεικτών. Η απλοποιημένη δειγματοληπτική προσέγγιση που παρέχουν οι ξηραμένες κηλίδες αίματος συνέβαλε, μεταξύ άλλων, στην ευρεία υιοθέτηση του νεογνικού ελέγχου από τα συστήματα δημόσιας υγείας με πρωτοπόρο των ΗΠΑ όπου ελέγχεται πάνω από το 95 % όλων των νεογνών (90). Επιδημιολογική παρακολούθηση νοσημάτων Πέρα από τον προσδιορισμό ενδογενών μεταβολιτών, οι ξηραμένες κηλίδες αίματος έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς στην απομόνωση DNA και την ακόλουθη διάγνωση γενετικών ασθενειών ή ακόμα και ιογενών λοιμώξεων. Επίσης, η προαναφερθείσα μέθοδος δειγματοληψίας έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση αντισωμάτων, ενζύμων και θρεπτικών συστατικών, βρίσκοντας εφαρμογή στον επιδημιολογικό έλεγχο ασθενειών. 72

Πίνακας 3.1 Παραδείγματα εφαρμογών ξηραμένων κηλίδων αίματος. Είδος εφαρμογής Αναλύτης Συγγραφείς Φαρμακοκινητικές μελέτες Διαζεπάμη Λοσαρτάνη Alfazil AA, Anderson RA. Rao RN, Raju SS, Vali RM, Sankar GG. Μιδαζολάμη Lad R. TDM Ποσακοναζόλη Λεβετιρακετάμη Κυκλοσπορίνη Α Ριφαμπικίνη Μεθαδόνη Reddy TM, Tama CI, Hayes RN. Shah NM, Hawwa AF, Millership JS, Collier PS, McElnay JC. Mohamed R, Mercolini L, Cuennet- Cosandey S, Chavent J, Raggi MA, Peyrou M. Allanson AL, Cotton MM, Tettey JN, Boyter AC. Saracino MA, Marcheselli C, Somaini L, Pieri MC, Gerra G, Ferranti A, Raggi MA. Νεογνικός έλεγχος 17α-υδροξυπρογεστερόνη Deng C, Ji J, Zhang L, Zhang X. 25-υδροξυβιτανίνη D3 Kvaskoff D, Ko P, Simila HA, Eyles DW. Ομοκυστεΐνη Bowron A, Barton A, Scott J, Stansbie D. Φαινυλαλανίνη Chace DH, Millington DS, Terada N, Kahler SG, Roe CR, Hofman LF. 73

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 74

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Για την ανάπτυξη της δεδομένης βιοαναλυτικής μεθόδου χρησιμοποιήθηκε ο εξής εργαστηριακός εξοπλισμός : 4.1 Σύστημα υγροχρωματογραφίας συζευγμένο με φασματομετρία μάζας (LC-QTOF-MS) Το δεδομένο αναλυτικό όργανο αποτελείται από δύο διακριτές οργανολογικές μονάδες (Εικόνα 4.1). Η πρώτη μονάδα αντιστοιχεί σε ένα υγροχρωματογραφικό σύστημα το οποίο εξυπηρετεί την εισαγωγή του αναλυόμενου δείγματος στη δεύτερη μονάδα του οργάνου που αντιστοιχεί σε ένα φασματόμετρο μάζας. Πιο συγκεκριμένα, το υγροχρωματογραφικό σύστημα αποτελείται από μια δυαδική αντλία HPLC της εταιρίας Agilent σειράς 1100 που διαθέτει ενσωματωμένο αυτόματο δειγματολήπτη, φούρνο στήλης και απαερωτή κινητής φάσης. Το φασματόμετρο μάζας αντιστοιχεί στο μοντέλο microtof Q III της εταιρίας Bruker και παρέχει τη δυνατότητα εκτέλεσης πειραμάτων δίδυμης φασματομετρίας μάζας. Η προαναφερθείσα δυνατότητα βασίζεται στο γεγονός ότι το δεδομένο φασματόμετρο μάζας διαθέτει δύο διαφορετικούς αναλυτές μάζας μεταξύ των οποίων παρεμβάλλεται ένας θάλαμος θραυσματοποίησης. Ο πρώτος αναλυτής μάζας αντιστοιχεί σε έναν απλό τετραπολικό αναλυτή, ενώ ο δεύτερος αναλυτής μάζας αντιστοιχεί σε έναν αναλυτή χρόνου πτήσης. Ο αναλυτής χρόνου πτήσης διατηρεί σύστημα ορθογώνιας επιτάχυνσης ιόντων καθώς επίσης και ηλεκτροστατικό ανακλαστήρα, με αποτέλεσμα να επιτρέπεται η διασύνδεσή του με πηγές ιόντων συνεχούς τύπου και να επιτυγχάνεται η λήψη φασμάτων μάζας υψηλής διακρισιμότητας. Ως ανιχνευτής ιόντων χρησιμοποιείται η πλάκα μικροκαναλιών. Η διασύνδεση του φασματόμετρου μάζας με το υγροχρωματογραφικό σύστημα πραγματοποιείται μέσω της πηγής ηλεκτροψεκασμού τύπου ionbooster, ενώ κατά τη λειτουργία του απαιτείται η χρήση αντλία κενού και γεννήτριας N 2. Για τη ρύθμιση των παραμέτρων, την επεξεργασία και την καταγραφή των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε ηλεκτρονικός υπολογιστής της εταιρίας Dell. Τα λογισμικά που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο του συστήματος και την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων ήταν το OtofSeries 3.2, το Hystar 3.2, το DataAnalysis 4.1 και το QuantAnalysis 2.1. Εικόνα 4.1 HPLC series 1100 (αριστερά) Agilent, microtof Q III Bruker (δεξιά). 75

4.2 Αναλυτικός ζυγός Για τις ζυγίσεις των προτύπων ουσιών χρησιμοποιήθηκε αναλυτικός ζυγός Kern 770-12 με ακρίβεια ανάγνωσης τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων και ελάχιστο και μέγιστο όριο ζύγισης 1 mg και 120 g, αντίστοιχα. 4.3 Αναλυτικές πιπέτες Για την παρασκευή των προτύπων διαλυμάτων και την προετοιμασία των δειγμάτων προς ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν ρυθμιζόμενες αναλυτικές πιπέττες Finnpipette 20 μl, 200 μl και 1000 μl. 4.4 Διηθητικός χάρτης Για τη συλλογή των κηλίδων αίματος χρησιμοποιήθηκε διηθητικός χάρτης τύπου Whatman 903 της εταιρίας GE. Ο δεδομένος διηθητικός χάρτης διαθέτει στην επιφάνεια του 4 προσχεδιασμένους δακτυλίους μέσα στους οποίους τοποθετείται ο όγκος του αίματος. 4.5 Συστήματα διάτρησης διηθητικού χάρτη Για την απόσπαση δίσκων από τις ξηραμένες κηλίδες αίματος χρησιμοποιήθηκε ένας κοινός διακορευτής χαρτιού της εταιρίας SAX. Ο δεδομένος διακορευτής χαρτιού παράγει αποσπώμενους δίσκους διαμέτρου 5,5 mm. Για την αξιολόγηση της ομοιογένειας των ξηραμένων κηλίδων αίματος χρησιμοποιήθηκε αυτόματη διατρητική μηχανή Wallac DBS Puncher της εταιρίας PerkinElmer που παράγει αποσπώμενους δίσκους διαμέτρου 3,2 mm (Εικόνα 4.2). Εικόνα 4.2 Κοινός διακορευτής χαρτιού (αριστερά), Wallac DBS Puncher (δεξιά). 4.6 Ανακίνηση-Ανάμιξη Για την ανάμιξη των διαφόρων περιεχομένων των φιαλιδίων Eppendorf χρησιμοποιήθηκε ο αναμικτήρας Multi-Vortex V-32 της εταιρίας Biosan (Εικόνα 4.4). Ο δεδομένος αναμικτήρας επιτρέπει την ταυτόχρονη ανακίνηση έως και 32 φιαλιδίων 76

Eppendorf. Για την ανάμιξη διαλυτών καθώς επίσης και την περαιτέρω διάλυση προτύπων ουσιών χρησιμοποιήθηκε λουτρό υπερήχων της εταιρίας Selecta. Εικόνα 4.4 αναμικτήρας Multi-Vortex V-32 Biosan. 4.7 Διαλύτες-Αναλυτικές στήλες Οι οργανικοί διαλύτες μεθανόλη (MeOH) και ακετονιτρίλιο (ACN) και το μυρμηκικό οξύ (HCOOH) που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των διαλυμάτων εργασίας, των κινητών φάσεων και των διαλυτών εκχύλισης ήταν καθαρότητας HPLC. Επίσης το νερό (H 2O) που χρησιμοποιήθηκε ήταν καθαρότητας HPLC και παραγόταν από συσκευή PureLab Flex της εταιρίας Elga. Οι αναλυτικές στήλες τύπου CN και C 8 που χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των χρωματογραφικών συνθηκών της μεθόδου διατηρούσαν διαστάσεις 50 x 4 mm, διάμετρο σωματιδίων 3 μm, μέγεθος πόρων 120 Å και ελήφθησαν από την εταιρία YMC. 4.8 Πρότυπες ουσίες Οι χρησιμοποιούμενες πρότυπες ουσίες βρινζολαμίδης (brinzolamide) και ραμπεπραζόλης (rabeprazole) ήταν καθαρότητας μεγαλύτερης από 99 % w/w και ελήφθησαν από την εταιρία Ranbaxy Laboratories και Pharmathen, αντίστοιχα. Η χρησιμοποιούμενη πρότυπη ουσία φορμικού αμμωνίου (HCOONH 4) ήταν καθαρότητας μεγαλύτερης από 99 % w/w και ελήφθη από την εταιρία Sigma-Aldrich. Τέλος, το διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (NaOH) κανονικότητας 1Ν ελήφθη επίσης από την εταιρία Sigma-Aldrich. 77

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗΣ ΜΕ ΔΙΔΥΜΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΡΙΝΖΟΛΑΜΙΔΗΣ ΣΕ ΞΗΡΑΜΕΝΕΣ ΚΗΛΙΔΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ 5.1 Εισαγωγή Στην παρούσα εργασία θα επιχειρηθεί η ανάπτυξη και επικύρωση μιας βιοαναλυτικής μεθόδου για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βρινζολαμίδης σε ξηραμένες κηλίδες αίματος χρησιμοποιώντας τη συζευγμένη αναλυτική τεχνική της υγροχρωματογραφίας-δίδυμης φασματομετρίας μάζας (LC-MS/MS). Στόχος της δεδομένης ανάπτυξης είναι ο σχεδιασμός μιας απλής αναλυτικής πορεία που θα επιτρέπει τη γρήγορη και αξιόπιστη ανάλυση δειγμάτων. Με τον τρόπο αυτό, θα επιδιωχθεί η ανάπτυξη μιας όσο το δυνατόν απλούστερης διαδικασίας προκατεργασίας και ανάλυσης. Στη συνέχεια, παρατίθενται οι μέθοδοι προσδιορισμού της βρινζολαμίδης που απαντούν στη βιβλιογραφία : Πίνακας 5.1 Αναλυτικοί μέθοδοι προσδιορισμού της βρινζολαμίδης Εσωτερικό πρότυπο 4-μεθοξυβουτυλβρινζολαμίδη 4-μεθοξυαιθυλβρινζολαμίδη Τιμολόλη Μητρικό υλικό Αίμα Ούρα Οφθαλικοί ιστοί κουνελιού Μέθοδος προκατεργασίας Διπλή υγρό-υγρό εκχύλιση με οξικό αιθυλεστέρα και υδατικό διάλυμα οξικού οξέος Εκχύλιση στερεάς φάσης με στήλη C 18 Αναλυτική τεχνική LC-UV (91) (254 nm) (91) LC-MS (-ESI) Ομογενοποίηση ιστών, διπλή υγρόυγρό εκχύλιση με LC-MS/MS (92) (+ESI) οξικό αιθυλεστέρα Κινητή φάση ACN/ρυθμιστικό διάλυμα 0,5 % H 3 PO 4 ph 3,0, 0,7 % τριαιθυλαμίνη, 6mM δέκανο-1- σουλφονικό οξύ (28/72) ACN/ρυθμιστικό διάλυμα 5mM CH 3 COONH 4, ph 3,5 (16/84) ACN/ρυθμιστικό διάλυμα 5mM CH 3 COONH 4 (βαθμιδωτή έκλουση Α: 40 90 40) Ροή 1,8 ml/min 0,3 ml/min 0,3 ml/min Στατική φάση C 18 100 x 4,6 mm C 18 250 x 2 mm C 18 50 x 2,1 mm LLOQ (ng/ml) 350 1 25 5.2 Επιλογή εσωτερικού προτύπου Η προσθήκη εσωτερικού προτύπου αποτελεί μια ιδιαίτερη τεχνική βαθμονόμησης η οποία συνδυάζεται συχνά με την κλασική μέθοδο προσθήκης πολλαπλών εξωτερικών προτύπων. Η δεδομένη μεθοδολογία υπαγορεύει την προσθήκη σταθερής ποσότητας εσωτερικού προτύπου σε όλα τα αναλυόμενα δείγματα προκειμένου να διορθωθούν συγκεκριμένοι τύποι αναλυτικού σφάλματος. Πιο συγκεκριμένα, η χρήση εσωτερικού προτύπου κρίνεται απαραίτητη σε περιπτώσεις όπου αναμένονται μεταβολές στην ευαισθησία της χρησιμοποιούμενης αναλυτικής οργανολογίας, όπως επίσης και σε περιπτώσεις όπου η αναλυτική πορεία περιλαμβάνει κάποιο στάδιο προκατεργασίας δείγματος. Η υποτιθέμενη αντιρροπιστική δράση του εσωτερικού προτύπου βασίζεται στην παραδοχή ότι η ίδια μεταβλητότητα που υπεισέρχεται στον προσδιορισμό του αναλύτη, 78

αντανακλάται τελικά και στον προσδιορισμό του εσωτερικού προτύπου. Με τον τρόπο αυτό, ο λόγος των αναλυτικών σημάτων του εσωτερικού προτύπου και του αναλύτη αναμένεται να είναι λιγότερο επιρρεπής στις μεταβολές του αναλυτικού σήματος και της προκατεργασίας των δειγμάτων. Για την ενίσχυση της παραπάνω παραδοχής επιδιώκεται η χρήση εσωτερικού προτύπου που διαθέτει παρόμοιες φυσικές και χημικές ιδιότητες με αυτές του προσδιοριζόμενου αναλύτη, καθώς επίσης και παρόμοια χρωματογραφική συμπεριφορά. Στην περίπτωση της φασματομετρίας μάζας παρέχεται η δυνατότητα χρήσης του ιδανικότερου μάλλον εσωτερικού προτύπου που δεν είναι άλλο από τον ισοτοπικά επισημασμένο αναλύτη. Για την παρούσα εργασία δεν κατέστη δυνατή η χρήση ισοτοπικά επισημασμένης βρινζολαμίδης οπότε αναζητήθηκε κάποια άλλη χημική ουσία ως εσωτερικό πρότυπο. Σε ένα πρώτο στάδιο εξετάστηκε η χρήση του υδροχλωροθειαζιδίου (ονομασία UPAC : 6-χλωρο-1,1-δϊοξυ-3,4-δϊυδρο-2Η-1λ 6,2,4-βενζοθειαδϊαζινο-7- σουλφοναμίδιο) ως εσωτερικό πρότυπο για τον προσδιορισμό της βρινζολαμίδης. Τόσο το υδροχλωροθειαζίδιο όσο και η βρινζολαμίδη ανήκουν στην κατηγορία των πρωτοταγών σουλφοναμιδίων και διατηρούν κάποια δομική αναλογία (Σχήμα 5.1). Σχήμα 5.1 Χημικές δομές υδροχλωροθειαζιδίου (πάνω) και βρινζολαμίδης (κάτω). Ωστόσο, η χρήση του υδροχλωροθειαζιδίου ως εσωτερικό πρότυπο εγκαταλείφτηκε αμέσως καθώς κατά τη διάρκεια προκαταρκτικών πειραμάτων διαπιστώθηκε ο ασθενής σχηματισμός μοριακού ιόντος σε συνθήκες θετικού ηλεκτροψεκασμού. Η δεδομένη παρατήρηση φαίνεται να συμφωνεί με το γεγονός ότι στη βιβλιογραφία απαντούν κυρίως φασματομετρικές μεθοδολογίες προσδιορισμού του υδροχλωροθειαζιδίου που βασίζονται στον αρνητικό ηλεκτροψεκασμό (93), (94). Ακολούθως αξιολογήθηκε η ραμπεπραζόλη (ονομασία UPAC : 2-{[4-(3-μεθοξυπροποξυ)- 3-μεθυλπυριδιν-2-υλ]μεθανοσουλφυνυλl}-1H-1,3-βενζοδιαζόλιο) ως εσωτερικό πρότυπο για τον προσδιορισμό της βρινζολαμίδης (Σχήμα 5.2). Όπως θα δούμε και στη συνέχεια, η ραμπεπραζόλη παράγει ισχυρό αναλυτικό σήμα σε συνθήκες θετικού ηλεκτροψεκασμού και ταυτόχρονα εμφανίζει ικανοποιητική χρωματογραφική συμπεριφορά με αποτέλεσμα να 79

επιλεχθεί ως το εσωτερικό πρότυπο της παρούσας εργασίας. Για τη δεδομένη βιοαναλυτική μέθοδο επιλέχθηκε ο συμβατικός τρόπος εισαγωγής του εσωτερικού προτύπου στις ξηραμένες κηλίδες αίματος που υπαγορεύει την ενσωμάτωση του εσωτερικού προτύπου στο διαλύτη εκχύλισης. Σχήμα 5.2 Χημική δομή ραμπεπραζόλης. 5.3 Παρασκευή διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάπτυξη και επικύρωση της βιοαναλυτικής μεθόδου 5.3.1 Παρασκευή διαλυμάτων παρακαταθήκης Για την παρασκευή του διαλύματος παρακαταθήκης (stock solution) της βρινζολαμίδης ζυγίστηκαν 10,0 mg πρότυπης ουσίας, με τη βοήθεια αναλυτικού ζυγού ακρίβειας 4 δεκαδικών ψηφίων, τα οποία στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml και αραιώθηκαν μέχρι χαραγής με MeOH. Με τον τρόπο αυτό, προέκυψε διάλυμα παρακαταθήκης βρινζολαμίδης συγκέντρωσης 400 μg/ml. Κατά ανάλογο τρόπο, για την παρασκευή του διαλύματος παρακαταθήκης της ραμπεπραζόλης ζυγίστηκαν 10,6 mg νατριούχου ραμπεπραζόλης, ισοδύναμης με 10,0 mg ραμπεπραζόλης, με τον ίδιο αναλυτικό ζυγό τα οποία στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και αραιώθηκαν μέχρι χαραγής με MeOH. Έτσι, προέκυψε διάλυμα παρακαταθήκης ραμπεπραζόλης συγκέντρωσης 100 μg/ml. Τα προκύπτοντα διαλύματα παρακαταθήκης μεταφέρθηκαν σε σκουρόχρωμους γυάλινους περιέκτες και διατηρήθηκαν στο ψυγείο στους 4 ο C. 5.3.2 Παρασκευή διαλυμάτων εργασίας Τα διαλύματα εργασίας (working solutions) παρασκευάστηκαν μέσω κατάλληλων αραιώσεων του διαλύματος παρακαταθήκης της βρινζολαμίδης και διατηρούν συγκέντρωση που κυμαίνεται από 10,0 έως 400 μg/ml. Για τις προαναφερθείσες αραιώσεις χρησιμοποιήθηκε μίγμα MeOH/H 2O (50:50), ενώ ο τελικός όγκος των διαλυμάτων εργασίας ήταν 1 ml. Οι διάφοροι όγκοι τόσο του διαλύματος παρακαταθήκης της βρινζολαμίδης, όσο και του μίγματος MeOH/H 2O (50:50) μεταφέρθηκαν με τη βοήθεια αναλυτικής πιπέτας σε φιαλίδια Eppendorf χωρητικότητας 2 ml. Τα διαλύματα εργασίας χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των προτύπων βαθμονόμησης, των δειγμάτων επικύρωσης μεθόδου και των δειγμάτων σταθερότητας αναλύτη. Πιο συγκεκριμένα, τα διαλύματα εργασίας διατηρούν κατάλληλη συγκέντρωση βρινζολαμίδης, έτσι ώστε όταν αραιώνονται 20 φορές 80

να παράγουν τις επιθυμητές συγκεντρώσεις των προαναφερθέντων δειγμάτων. Στον Πίνακα 5.2 παρουσιάζεται συνοπτικά η διαδικασία παρασκευής των διαλυμάτων εργασίας. Πίνακας 5.2 Συνοπτική παράθεση της πορείας παρασκευής των διαλυμάτων εργασίας της βρινζολαμίδης Διάλυμα εργασίας Τελική συγκέντρωση (μg/ml) Όγκος διαλύματος παρακαταθήκης (μl) Όγκος διαλύτη (μl) Τελικός όγκος (μl) Α 10,0 25 975 1000 Β 20,0 50 950 1000 Γ 40,0 100 900 1000 Δ 80,0 200 800 1000 Ε 160 400 600 1000 ΣΤ 240 600 400 1000 Ζ 400 1000 0 1000 Η 10 25 975 1000 Θ 30 75 925 1000 Ι 120 300 700 1000 Κ 300 750 250 1000 Λ 40 100 900 1000 Μ 300 750 250 1000 5.3.3 Παρασκευή διαλύματος εξωτερικής βαθμονόμησης φασματόμετρου μάζας Για την παρασκευή του δεδομένου διαλύματος απαιτείται, σε ένα πρώτο επίπεδο η παραγωγή μίγματος ισοπροπανόλης/νερού σε αναλογία όγκων 1:1. Το παραπάνω μίγμα διαλυτών προκύπτει με την ανάμιξη 12,5 ml απιονισμένου νερού με 12,5 ml ισοπροπανόλης. Ακολούθως, στο προκύπτον μίγμα διαλυτών προστίθενται 50 μl HCOOH και 250 μl διαλύματος NaOH κανονικότητας 1 Ν. 5.3.4 Παρασκευή διαλυμάτων για τη ρύθμιση των παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας Για τη ρύθμιση των παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας παρασκευάστηκαν δύο διαφορετικά διαλύματα εκ των οποίων το πρώτο διάλυμα περιείχε βρινζολαμίδη σε συγκέντρωση 2 μg/ml, ενώ το δεύτερο διάλυμα περιείχε ραμπεπραζόλη σε συγκέντρωση 4 μg/ml. Και στα δύο διαλύματα χρησιμοποιήθηκε ως διαλύτης ACN που περιείχε 0,1 % v/v HCOOH. Το πρώτο διάλυμα παρασκευάστηκε με την ανάμιξη 5 μl διαλύματος παρακαταθήκης βρινζολαμίδης με 995 μl του προαναφερθέντος διαλύτη, ενώ το δεύτερο διάλυμα παρασκευάστηκε με την ανάμιξη 40 μl διαλύματος παρακαταθήκης ραμπεπραζόλης με 960 μl του προαναφερθέντος διαλύτη. Οι παραπάνω αραιώσεις πραγματοποιήθηκαν εντός φιαλιδίου Eppendorf με τη βοήθεια αναλυτικής πιπέτας. 81

5.3.5 Παρασκευή διαλύτη εκχύλισης Η ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος βασίζεται στην απόσπαση ενός δίσκου διαμέτρου 5,5 mm ο οποίος στη συνέχεια εκχυλίζεται με τη βοήθεια ενός διαλύτη εκχύλισης που περιλαμβάνει το εσωτερικό πρότυπο. Στην παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο, ως διαλύτης εκχύλισης χρησιμοποιήθηκε ένα μίγμα MeOH/H 2O (80:20) το οποίο περιείχε 100 ng/ml ραμπεπραζόλης ως εσωτερικό πρότυπο. Ο δεδομένος διαλύτης εκχύλισης παρασκευάζεται μέσω των εξής δύο σταδίων : 20 μl διαλύματος παρακαταθήκης ραμπεπραζόλης αραιώνονται με την προσθήκη 980 μl μίγματος MeOH/H 2O (80:20). 500 μl του προκύπτοντος διαλύματος αραιώνονται με την προσθήκη 9500 μl μίγματος MeOH/H 2O (80:20) με αποτέλεσμα την παραγωγή 12 ml διαλύτη εκχύλισης. Οι ανωτέρω όγκοι διαλυμάτων μεταφέρονται με τη βοήθεια αναλυτικής πιπέτας σε φιαλίδια Eppendorf χωρητικότητας 2 και σε φιαλίδια Falcon χωρητικότητας 15 ml, αντίστοιχα. 5.4 Παρασκευή εμβολιασμένων ξηραμένων κηλίδων αίματος που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάπτυξη και επικύρωση της βιοαναλυτικής μεθόδου 5.4.1 Παρασκευή προτύπων βαθμονόμησης Η παρούσα βιοαναλυτική μέθοδος επιχειρεί την ανάλυση ξηραμένων κηλίδων αίματος οπότε τα πρότυπα βαθμονόμησης θα πρέπει να αντιστοιχούν σε ξηραμένες κηλίδες αίματος συγκεκριμένης συγκέντρωσης βρινζολαμίδης. Για τη δεδομένη βιοαναλυτική μέθοδο επιλέχθηκε η παρασκευή 7 διαφορετικών προτύπων βαθμονόμησης τα οποία διατηρούν τις εξής συγκεντρώσεις βρινζολαμίδης : 0,500 μg/ml, 1,00 μg/ml, 2,00 μg/ml, 4,00 μg/ml, 8,00 μg/ml, 12,0 μg/ml, 20,0 μg/ml. Το εύρος της προτεινόμενης καμπύλης βαθμονόμησης ορίστηκε από την ευαισθησία της χρησιμοποιούμενης αναλυτικής οργανολογίας όπως επίσης και από τις διάφορες βιβλιογραφικές αναφορές που υποστηρίζουν ότι η συγκέντρωση της βρινζολαμίδης στο αίμα μετά από τοπική οφθαλμική χορήγηση εναιωρήματος βρινζολαμίδης 1 % w/v κυμαίνεται περίπου από 3,5 μg/ml έως 6 μg/ml (95). Σε ένα πρώτο επίπεδο, για την παρασκευή των προτύπων βαθμονόμησης απαιτείται η αραίωση 25 μl κατάλληλου διαλύματος εργασίας με 475 μl αίματος. Η παραπάνω αραίωση πραγματοποιείται εντός φιαλιδίου Eppendorf χωρητικότητας 2 ml, ενώ οι όγκοι αίματος και διαλυμάτων εργασίας μεταφέρονται μέσω αναλυτικής πιπέτας. Αμέσως μετά την ανάμιξη, το φιαλίδιο ανακινείται στο vortex για 2 λεπτά και στη συνέχεια μεταφέρονται, μέσω αναλυτικής πιπέτας, 50 μl εμβολιασμένου πλέον αίματος σε διηθητικό χάρτη Whatman 903. Ο δεδομένος διηθητικός χάρτης φέρει στην επιφάνειά του εκτυπωμένους δακτυλίους με αποτέλεσμα να διευκολύνεται και να οριοθετείται η εφαρμογή του αίματος. Για να σχηματιστούν ομοιόμορφες και εντός ορίων κηλίδες αίματος θα πρέπει το στόμιο της πιπέτας να διατηρηθεί λίγα χιλιοστά πάνω από το κέντρο του δακτυλίου και να εφαρμοστεί σταθερή και συνεχής πίεση στο έμβολό της. Επειδή τόσο το φιαλίδιο Eppendorf, όσο και το στόμιο της πιπέτας στερείται αντιπηκτικού παράγοντα, θα πρέπει η παραπάνω διαδικασία να πραγματοποιηθεί όσο το δυνατόν ταχύτερα ώστε να αποφευχθεί η πήξη του αίματος. Ακολούθως, οι σχηματιζόμενες κηλίδες αίματος αφήνονται να 82

ξηρανθούν σε συνθήκες δωματίου για 3 h και στη συνέχεια διατηρούνται στο ψυγείο στους 4 ο C. Αξίζει να σημειωθεί ότι το ολικό αίμα που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των προτύπων βαθμονόμησης όπως και των υπολοίπων εμβολιασμένων ξηραμένων κηλίδων αίματος συλλέχθηκε από το ίδιο άτομο μέσω κλασικής φλεβοτομής και διατηρήθηκε για σύντομο χρονικό διάστημα (1 h) σε σωληνάρια που περιείχαν τον αντιπηκτικό παράγοντα EDTA. Το χρησιμοποιούμενο αίμα διατηρούσε αιματοκρίτη ίσο με 43,1. Στον Πίνακα 5.3 παρουσιάζεται συνοπτικά η διαδικασία παρασκευής των προτύπων βαθμονόμησης. Πίνακας 5.3 Συνοπτική παράθεση της πορείας παρασκευής των προτύπων βαθμονόμησης. Πρότυπο βαθμονόμησης Τελική συγκέντρωση (μg/ml) Όγκος διαλύματος εργασίας (μl) Όγκος αίματος (μl) Τελικός όγκος (μl) 7 20,0 25 του Ζ 475 500 6 12,0 25 του ΣΤ 475 500 5 8,00 25 του Ε 475 500 4 4,00 25 του Δ 475 500 3 2,00 25 του Γ 475 500 2 1,00 25 του Β 475 500 1 0,500 25 του Α 475 500 5.4.2 Παρασκευή δειγμάτων επικύρωσης μεθόδου Για την επικύρωση της παρούσας βιοαναλυτικής μεθόδου απαιτήθηκε η παρασκευή ξηραμένων κηλίδων αίματος συγκεκριμένης συγκέντρωσης βρινζολαμίδης. Πιο συγκεκριμένα, η οδηγία επικύρωσης του EMΑ υπαγορεύει την παρασκευή εμβολιασμένων δειγμάτων που διατηρούν 4 διαφορετικές συγκεντρώσεις αναλύτη. Το πρώτο επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να αντιστοιχεί στο LLOQ της αναπτυσσόμενης μεθόδου, το δεύτερο επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να είναι το πολύ 3 φορές υψηλότερο του LLOQ, το τρίτο επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να βρίσκεται μεταξύ του 30 % και 50 % του εύρους της καμπύλης βαθμονόμησης και το τέταρτο επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να είναι υψηλότερο του 75 % του εύρους της καμπύλης βαθμονόμησης. Με τον όρο LLOQ αναφερόμαστε στο πρότυπο βαθμονόμησης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση. Βασιζόμενοι στα ανωτέρω, επιλέχθηκε η παρασκευή δειγμάτων επικύρωσης που διατηρούν τις εξής συγκεντρώσεις βρινζολαμίδης : 0,500 μg/ml, 1,50 μg/ml, 6,00 μg/ml, 15,0 μg/ml. Τα δεδομένα δείγματα παρασκευάστηκαν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που παρασκευάστηκαν τα πρότυπα βαθμονόμησης, χρησιμοποιώντας διαλύματα εργασίας κατάλληλης συγκέντρωσης βρινζολαμίδης. Στον Πίνακα 5.4 παρουσιάζεται συνοπτικά η διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων επικύρωσης μεθόδου. Τα προκύπτοντα δείγματα επικύρωσης μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση διαφόρων αναλυτικών χαρακτηριστικών επίδοσης όπως είναι η ακρίβεια, η πιστότητα, η ανάκτηση αναλύτη και η επίδραση μητρικού υλικού. 83

Πίνακας 5.4 Συνοπτική παράθεση της πορείας παρασκευής των δειγμάτων επικύρωσης μεθόδου. Δείγμα επικύρωσης μεθόδου Τελική συγκέντρωση (μg/ml) Όγκος διαλύματος εργασίας (μl) Όγκος αίματος (μl ) Τελικός όγκος (μl) 4 15,0 25 του Κ 475 500 3 6,00 25 του Ι 475 500 2 1,50 25 του Θ 475 500 1 0,500 25 του Η 475 500 5.4.3 Παρασκευή δειγμάτων ελέγχου σταθερότητας Για την αξιολόγηση της βραχύχρονης και μακρόχρονης σταθερότητας της βρινζολαμίδης στις ξηραμένες κηλίδες αίματος, απαιτήθηκε η παρασκευή εμβολιασμένων δειγμάτων που διατηρούν ένα χαμηλό και ένα υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης αναλύτη. Για την παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο, ως χαμηλό επίπεδο συγκέντρωσης αναλύτη επιλέχθηκαν τα 2 μg/ml, ενώ ως υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης επιλέχθηκαν τα 15 μg/ml. Τα δείγματα ελέγχου σταθερότητας παρασκευάστηκαν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που παρασκευάστηκαν τα πρότυπα βαθμονόμησης χρησιμοποιώντας διαλύματα εργασίας κατάλληλης συγκέντρωσης βρινζολαμίδης. Στον Πίνακα 5.5 παρουσιάζεται συνοπτικά η διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων ελέγχου σταθερότητας. Πίνακας 5.5 Συνοπτική παράθεση της πορείας παρασκευής των δειγμάτων ελέγχου σταθερότητας. Δείγμα ελέγχου σταθερότητας Τελική συγκέντρωση (μg/ml) Όγκος διαλύματος εργασίας (μl) Όγκος αίματος (μl ) Τελικός όγκος (μl) 2 15,0 25 του Μ 475 500 1 2,00 25 του Λ 475 500 5.4.4 Παρασκευή δειγμάτων ελέγχου ακεραιότητας αραίωσης δείγματος Για την αξιολόγηση της ακεραιότητας αραίωσης δείγματος απαιτήθηκε η παρασκευή ξηραμένων κηλίδων αίματος που διατηρούν συγκέντρωση βρινζολαμίδης υψηλότερη από το ανώτερο σημείο της καμπύλης βαθμονόμησης. Με τον τρόπο αυτό, παρασκευάστηκαν ξηραμένες κηλίδες αίματος που διατηρούν συγκέντρωση βρινζολαμίδης ίση με 40 μg/ml. Για την παρασκευή των παραπάνω δειγμάτων απαιτείται η αραίωση 50 μl διαλύματος παρακαταθήκης βρινζολαμίδης με 450 μl αίματος. Η δεδομένη αραίωση πραγματοποιήθηκε εντός φιαλιδίου Eppendorf χωρητικότητας 2 ml, ενώ οι όγκοι αίματος και διαλύματος παρακαταθήκης μεταφέρθηκαν με τη βοήθεια αναλυτικής πιπέτας. Μετά τη σύντομη ανακίνηση του φιαλιδίου στο vortex, 50 μl εμβολιασμένου αίματος μεταφέρθηκαν μέσω πιπέτας σε διηθητικό χάρτη Whatman 903. Οι προκύπτουσες κηλίδες ξηράνθηκαν σε συνθήκες δωματίου για 3 h και ακολούθως αποθηκεύτηκαν στο ψυγείο στους 4 ο C. 84

5.5 Ρύθμιση των παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας Το χρησιμοποιούμενο φασματόμετρο μάζας διατηρεί ως κύριο αναλυτή μάζας έναν αναλυτή χρόνου πτήσης με ανακλαστήρα ο οποίος επιτρέπει τη λήψη φασμάτων μάζας υψηλής διακρισιμότητας. Όταν η υψηλή διακριτική ικανότητα ενός φασματόμετρου μάζας συνδυάζεται με μια κατάλληλη διαδικασία βαθμονόμησης μάζας (mass calibration) τότε επιτυγχάνονται μετρήσεις ακριβούς μάζας (accurate mass measurements). Ο όρος μέτρηση ακριβούς μάζας αναφέρεται στη λήψη πειραματικών τιμών m/z που προσεγγίζουν σημαντικά τη θεωρητική μονοϊσοτοπική μοριακή μάζα του εξεταζόμενου αναλύτη. Η βαθμονόμηση μάζας πραγματοποιείται με τη βοήθεια κατάλληλου διαλύματος βαθμονόμησης και διακρίνεται σε εσωτερική, όταν το προαναφερθέν διάλυμα εισάγεται ταυτόχρονα με το αναλυόμενο δείγμα και σε εξωτερική, όταν η εισαγωγή είναι διακριτή. Για την παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο επιλέχθηκε η εφαρμογή εξωτερικής βαθμονόμησης μάζας με τη χρήση διαλύματος μυρμηκικού νατρίου (NaCOOH). Πιο συγκεκριμένα, το διάλυμα βαθμονόμησης εισαγόταν βραδέως (140 μl/h) στο φασματόμετρο μάζας με τη βοήθεια αντλίας σύριγγας (syringe pump) στην αρχή κάθε εργαστηριακής μέρας. Για να καταστεί δυνατή η βαθμονόμηση μάζας θα πρέπει το χρησιμοποιούμενο διάλυμα βαθμονόμησης κατά την φασματομετρική ανάλυση να παράγει ένα σημαντικό αριθμό ιόντων καθορισμένης τιμής m/z που να καλύπτει ένα ικανό εύρος μάζας. Το διάλυμα NaCOOH ικανοποιεί την παραπάνω παραδοχή καθώς κατά τον ηλεκτροψεκασμό του παράγει μια ομόλογη σειρά μεταλλικών πλειάδων (metallic clusters) του τύπου : NNNN(NNNNNNNNNNNN) xx +, xx: 1,2,3, Το λογισμικό του φασματόμετρου μάζας χρησιμοποιεί τόσο τις θεωρητικές όσο και τις πειραματικές τιμές m/z των σχηματιζόμενων κατιονικών πλειάδων προκειμένου να βαθμονομεί συγκεκριμένα εύρη μάζας. Για την παρούσα εργασία, βαθμονομήθηκε το εύρος μάζας που εκτείνεται από τα 150 έως τα 500 m/z χρησιμοποιώντας τις μεταλλικές πλειάδες που αναφέρονται στον Πίνακα 5.6. Πίνακας 5.6 Χημικές δομές και θεωρητικές τιμές m/z των χρησιμοποιούμενων μεταλλικών πλειάδων. Μεταλλική πλειάδα Θεωρητική τιμή m/z Na(NaCOOH) + 2 158,96407 Na(NaCOOH) + 3 226,95149 Na(NaCOOH) + 4 294,93892 Na(NaCOOH) + 5 362,92634 Na(NaCOOH) + 6 430,91377 Na(NaCOOH) + 7 498,90119 85

Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας βαθμονόμησης μάζας, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός των προδρόμων και θυγατρικών ιόντων της βρινζολαμίδης και της ραμπεπραζόλης παράλληλα με τη ρύθμιση ορισμένων παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας. Πιο συγκεκριμένα, η ρύθμιση του φασματόμετρου μάζας πραγματοποιήθηκε με τη βραδεία εισαγωγή (140 μl/h) ενός διαλύματος βρινζολαμίδης συγκέντρωσης 2 μg/ml και ενός διαλύματος ραμπεπραζόλης συγκέντρωσης 4 μg/ml μέσω αντλίας σύριγγας. Και τα δύο διαλύματα είχαν ως διαλύτη ACN με 0,1 % (v/v) HCOOH. Όπως γνωρίζουμε το φασματόμετρο μάζας αποτελεί μια σύνθετη αναλυτική οργανολογία, η λειτουργία του οποίου ελέγχεται από ένα σημαντικό αριθμό παραμέτρων. Η φύση των δεδομένων παραμέτρων εξαρτάται άμεσα από το είδος των επιμέρους μονάδων που συγκροτούν το εκάστοτε φασματόμετρο μάζας και δύναται να διαφοροποιούνται μέχρι ενός σημείου ανάλογα με τον κατασκευαστή του οργάνου. Αναφορικά με την παρούσα οργανολογία, οι διάφορες παράμετροι μπορούν να ταξινομηθούν σε 4 διακριτές ομάδες ανάλογα με τη μονάδα του φασματόμετρου μάζας που ρυθμίζουν (Σχήμα 5.3). Σχήμα 5.3 Σχηματική απεικόνιση microtof Q III (1) πηγή ηλεκτροψεκασμού, (2) σύστημα μεταφοράς ιόντων, (3) τετραπολικός αναλυτής μάζας, (4) θάλαμος θραυσματοποίησης. Η πρώτη ομάδα παραμέτρων ελέγχει την πηγή ηλεκτροψεκασμού επιτρέποντας τη ρύθμιση του δυναμικού του μεταλλικού τριχοειδούς, της ροής και της θερμοκρασίας του αερίου ξήρανσης και της πίεσης του αερίου νεφελοποίησης. Αναφορικά με την πολικότητα του ηλεκτροψεκασμού επιλέχθηκε η θετική, ενώ ως αέριο ξήρανσης και νεφελοποίησης χρησιμοποιήθηκε το N 2. Στον Πίνακα 5.7 παρατίθενται οι τιμές των παραμέτρων της πηγής ηλεκτροψεκασμού. 86

Πίνακας 5.7 Παράμετροι πηγής ηλεκτροψεκασμού. Δυναμικό μεταλλικού τριχοειδούς (kv) Ροή αερίου ξήρανσης (L/min) Θερμοκρασία αερίου ξήρανσης ( o C) Πίεση αερίου νεφελοποίησης (Bar) 4500 9,5 200 2 Η δεύτερη ομάδα παραμέτρων ελέγχει ένα σύστημα μεταφοράς ιόντων που παρεμβάλλεται μεταξύ της πηγής ηλεκτροψεκασμού και του τετραπολικού αναλυτή μάζας. Το δεδομένο σύστημα αποτελείται από δύο διακριτές μονάδες και επιδιώκει την όσο το δυνατόν ποσοτικότερη μεταφορά των παραγόμενων ιόντων στον αναλυτή μάζας. Η πρώτη μονάδα αντιστοιχεί σε έναν ιδιότυπο ηλεκτροδυναμικό φακό εστίασης που ονομάζεται διπλό ιοντικό χωνί (Dual Ion Funnel) ενώ η δεύτερη μονάδα αντιστοιχεί σε ένα κλασικό εξάπολο. Το λογισμικό του χρησιμοποιούμενου φασματόμετρου μάζας επιτρέπει τη ρύθμιση του πλάτους του εναλλασσόμενου δυναμικού που εφαρμόζεται τόσο στα ιοντικά χωνιά όσο και στο εξάπολο. Μάλιστα, το διπλό ιοντικό χωνί παρέχει τη δυνατότητα θραυσματοποίησης των παραγόμενων ιόντων όταν τα πλάτη των εφαρμοζόμενων δυναμικών στα επιμέρους χωνιά διαφοροποιείται αισθητά. Ο δεδομένος τύπος θραυσματοποίησης καλείται θραυσματοποίηση εντός πηγής και περιγράφεται από μια παράμετρο που ονομάζεται ενέργεια θραυσματοποίησης εντός πηγής (in source Collision Induced Dissociation/isCID). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα πλάτη των εφαρμοζόμενων δυναμικών εκφράζονται σε μονάδες Vpp (peak to peak Voltage) ενώ οι ενέργειες των αναλυόμενων ιόντων σε ev. Στον Πίνακα 5.8 παρατίθενται οι τιμές των παραμέτρων του συστήματος μεταφοράς ιόντων. Πίνακας 5.8 Παράμετροι συστήματος μεταφοράς ιόντων. Πλάτος δυναμικού 1 ου χωνιού (Vpp) Πλάτος δυναμικού 2 ου χωνιού (Vpp) Πλάτος δυναμικού εξαπόλου (Vpp) Ενέργεια iscid (ev) 300 400 400 0 Η τρίτη ομάδα παραμέτρων αναφέρεται στον τετραπολικό αναλυτή μάζας και επιτρέπει τη ρύθμιση της ενέργειας των εξερχόμενων από αυτόν ιόντων όπως επίσης και τη ρύθμιση του κατώτερου ορίου της τιμής m/z των εισερχόμενων σε αυτόν ιόντων. Στον Πίνακα 5.9 παρατίθενται οι τιμές των παραμέτρων του τετραπολικού αναλυτή μάζας. Πίνακας 5.9 Παράμετροι τετραπολικού αναλυτή μάζας. Ενέργεια εξερχόμενων ιόντων (ev) Κατώτερη τιμή m/z εισερχόμενων ιόντων 4 350 87

Μια τελευταία ομάδα παραμέτρων ελέγχει τη λειτουργία του θαλάμου θραυσματοποίησης και περιλαμβάνει 4 διαφορετικές παραμέτρους. Οι δεδομένες παράμετροι επιτρέπουν τη ρύθμιση της ενέργειας σύγκρουσης των εισερχόμενων ιόντων, του πλάτους του εναλλασσόμενου δυναμικού του θαλάμου, του χρόνου διέλευσης των ιόντων μέσω του θαλάμου και του χρόνου συγκέντρωσης των εξερχόμενων ιόντων πριν από τον παλμό τους στον αναλυτή χρόνου πτήσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι από το σύνολο των παραμέτρων του φασματόμετρου μάζας, η ενέργεια σύγκρουσης, ο χρόνος διέλευσης και ο χρόνος συγκέντρωσης των ιόντων φαίνεται να ασκούν τη σημαντικότερη επίδραση στην ένταση των παραγόμενων θυγατρικών ιόντων. Στον Πίνακα 5.10 παρατίθενται οι παράμετροι του θαλάμου θραυσματοποίησης. Πίνακας 5.10 Παράμετροι θαλάμου θραυσματοποίησης. Ενέργεια σύγκρουσης (ev) Πλάτος δυναμικού θαλάμου (Vpp) Χρόνος διέλευσης (μs) Χρόνος συγκέντρωσης (μs) 24 (12)* 300 60 4 *Εντός παρένθεσης είναι η τιμή ενέργειας της ραμπεπραζόλης και εκτός είναι της βρινζολαμίδης. 5.6 Εύρεση των προδρόμων και θυγατρικών ιόντων Το χρησιμοποιούμενο φασματόμετρο μάζας επιτρέπει την εκτέλεση πειραμάτων απλής και δίδυμης φασματομετρίας μάζας. Αναφορικά με τα πειράματα δίδυμης φασματομετρίας μάζας, θα μπορούσαμε να πούμε ότι αυτά βασίζονται στην τεχνική της σάρωσης θυγατρικού ιόντος (daughter ion scan), παρά στην τεχνική της παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (Μultiple Reaction Monitoring/MRM) που χρησιμοποιείται στα ευρέως διαδεδομένα φασματόμετρα μάζας τριπλού τετραπόλου (triple quadrupole mass spectrometers). Η δεδομένη διάκριση βασίζεται στο γεγονός ότι ο δεύτερος αναλυτής μάζας δεν ανιχνεύει θυγατρικά ιόντα συγκεκριμένης τιμής m/z αλλά καταγράφει συνεχώς πλήρη φάσματα μάζας. Με τον τρόπο αυτό, το χρησιμοποιούμενο φασματόμετρο μάζας επιτρέπει τη συλλογή εξαιρετικής αναλυτικής πληροφορίας, αλλά φυσικά δεν μπορεί να ανταγωνιστεί την υψηλή ευαισθησία των φασματόμετρων μάζας τριπλού τετραπόλου. Στην παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο, ως πρόδρομο ιόν τόσο του αναλύτη, όσο και του εσωτερικού προτύπου επιλέχθηκε το πρωτονιωμένο μοριακό ιόν [Μ+Η] +. Τα πρόδρομα ιόντα απομονώνονται από το σύνολο των παραγόμενων ιόντων με τη βοήθεια του τετραπολικού αναλυτή μάζας και ακολούθως οδηγούνται στο θάλαμο θραυσματοποίησης. Η απομόνωση κάθε προδρόμου ιόντος πραγματοποιείται μέσω ενός παραθύρου επιλογής ιόντων που διατηρεί εύρος ίσο με 2 Da. Οι τιμές m/z των προδρόμων ιόντων είναι οι εξής : Ουσία m/z προδρόμου ιόντος Βρινζολαμίδη 384,0722 Ραμπεπραζόλη 360,1382 88

Μετά από την επιλογή των προδρόμων ιόντων του αναλύτη και του εσωτερικού προτύπου, πραγματοποιήθηκε η ανίχνευση των θυγατρικών ιόντων που παράγονται κατά τη διαδικασία θραυσματοποίησης. Η δεδομένη διαδικασία λαμβάνει χώρα εντός του θαλάμου θραυσματοποίησης και βασίζεται στη σύγκρουση των προδρόμων ιόντων με μόρια N 2. Αναφορικά με τη θραυσματοποίηση του προδρόμου ιόντος της βρινζολαμίδης, αυτή παρήγαγε ένα σημαντικό αριθμό θυγατρικών ιόντων διαφορετικής τιμής m/z και παρατηρούμενης έντασης (Σχήμα 5.4). Σχήμα 5.4 Φάσμα σάρωσης θυγατρικού ιόντος του πρωτονιωμένου μοριακού ιόντος της βρινζολαμίδης. Αξίζει να σημειωθεί ότι στη βιβλιογραφία απαντά σχετική δημοσίευση που προτείνει συγκεκριμένες χημικές δομές για αρκετά από τα θυγατρικά ιόντα της βρινζολαμίδης (96). Η προαναφερθείσα απόδοση χημικών δομών βασίζεται σε πειράματα δίδυμης φασματομετρίας μάζας ισοτοποεκλεκτικής θραυσματοποίησης μέσω σύγκρουσης (isotopeselective collision induced dissociation mass spectrometry). Στον Πίνακα 5.11 παρατίθενται οι προτεινόμενες χημικές δομές 6 θυγατρικών ιόντων όπως επίσης και οι αντίστοιχες πειραματικά προσδιοριζόμενες τιμές m/z. 89

Πίνακας 5.11 Προτεινόμενες δομές θυγατρικών ιόντων βρινζολαμίδης. Χημική δομή Θεωρητική τιμή m/z Πειραματική τιμή m/z Ακρίβεια μάζας (ppm) 217,0105 217,0115 4,6 258,0371 258,0264-42 275,0524 275,0531 2,5 280,9724 280,9740 5,7 306,9880 306,9897 5,5 339,0143 339,0171 8,3 90

Αναφορικά με τη ραμπεπραζόλη, η παρατηρούμενη θραυσματοποίηση του πρωτονιωμένου μοριακού ιόντος ήταν κατά πολύ ηπιότερη με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός απλού φάσματος μάζας που διαθέτει ελάχιστα θυγατρικά ιόντα (Σχήμα 5.5). Σχήμα 5.5 Φάσμα σάρωσης θυγατρικού ιόντος του πρωτονιωμένου μοριακού ιόντος της ραμπεπραζόλης. Αφού μελετήθηκαν τα πρόδρομα και θυγατρικά ιόντα τόσο της βρινζολαμίδης όσο και της ραμπεπραζόλης, προσδιορίστηκαν οι τελικές φασματομετρικές συνθήκες πάνω στις οποίες βασίζεται η παραγωγή του αναλυτικού σήματος. Σε ένα πρώτο επίπεδο πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ πειραμάτων απλής και δίδυμης φασματομετρίας μάζας προκειμένου να εντοπιστεί η φασματομετρική τεχνική για την οποία μεγιστοποιείται η ευαισθησία προσδιορισμού της βρινζολαμίδης. Στο σημείο αυτό γεννάται το ερώτημα αναφορικά με το εάν η παραπάνω σύγκριση είναι απαραίτητη δεδομένου ότι η δίδυμη φασματομετρία μάζας (MS/MS) παρέχει τη δυνατότητα προσδιορισμών πολλαπλάσιας ευαισθησίας συγκριτικά με την απλή φασματομετρία μάζα (MS). Ενώ η βαρύτητα της προαναφερθείσας άποψης είναι αδιαμφισβήτητη για τα φασματόμετρα μάζας τριπλού τετραπόλου φαίνεται να εξασθενεί στην περίπτωση της παρούσας οργανολογίας. Με τον τρόπο αυτό, ο ίδιος ο κατασκευαστής του οργάνου προτείνει τη δεδομένη σύγκριση. Για τη διερεύνηση του συγκεκριμένου ερωτήματος, συγκρίθηκαν οι λόγοι σήμα/θόρυβο (Signal/Noise, S/N) που κατεγράφησαν κατά την απλή παρακολούθηση του πρωτονιωμένου μοριακού ιόντος της βρινζολαμίδης και κατά τη θραυσματοποίηση αυτού και ακόλουθη 91

παρακολούθηση του θυγατρικού ιόντος με τιμή m/z ίση με 280,9740. Για τον υπολογισμό των λόγων S/N χρησιμοποιήθηκαν τα ύψη χρωματογραφικών κορυφών που προέκυψαν κατά την ανάλυση του ίδιου διαλύματος βρινζολαμίδης υπό ταυτόσημες χρωματογραφικές συνθήκες μεταβάλλοντας ωστόσο τη φασματομετρική τεχνική. Όπως παρατηρούμε στο Σχήμα 5.6 η δίδυμη φασματομετρία μάζας έδωσε περισσότερο ευαίσθητα αναλυτικά αποτελέσματα παράγοντας ένα σχεδόν πενταπλάσιο λόγο S/N συγκριτικά με την απλή φασματομετρία μάζας. Με τον τρόπο αυτό, επιλέχθηκε η χρήση πειραμάτων δίδυμης φασματομετρίας μάζας για τον προσδιορισμό του αναλύτη και του εσωτερικού προτύπου. Σχήμα 5.6 Σύγκρισης ευαισθησίας απλής και δίδυμης φασματομετρίας μάζας για τον προσδιορισμό της βρινζολαμίδης. Ανάλυση διαλύματος βρινζολαμίδης 1 μg/ml σε ACN με στήλη C 18 και κινητή φάση ACN/HCOOH 0,4 % (n=1). Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, η εκτενής θραυσματοποίηση της βρινζολαμίδης παρήγαγε ένα πλούσιο φάσμα μάζας από το οποίο πρέπει να επιλεχθεί κάποιο κατάλληλο θυγατρικό ιόν προκείμενου να καταστεί δυνατή η συγκρότηση των χρωματογραφημάτων εξαχθέντος ιόντος (EIC) της βρινζολαμίδης. Από το σύνολο των παρατηρούμενων θυγατρικών ιόντων επιλέχθηκε η ταυτόχρονη παρακολούθηση των 3 ισχυρότερων, χρησιμοποιώντας ένα παράθυρο επιλογής ιόντων εύρους 0,1 Da : Τιμές m/z θυγατρικών ιόντων 217,0115 278,9584 280,9740 92

Η άθροιση του σήματος 3 διαφορετικών θυγατρικών ιόντων επέτρεψε την αύξηση του συνολικού αναλυτικού σήματος χωρίς την επακόλουθη αύξηση του θορύβου. Το παραπάνω γεγονός συνοψίζεται στο Σχήμα 5.7 όπου απεικονίζεται η μεταβολή του λόγου S/N συναρτήσει του αριθμού των χρησιμοποιούμενων θυγατρικών ιόντων. Και πάλι για τον υπολογισμό των λόγων S/N χρησιμοποιήθηκαν τα ύψη χρωματογραφικών κορυφών που προέκυψαν κατά την ανάλυση του ίδιου διαλύματος βρινζολαμίδης και υπό τις ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Σχήμα 5.7 Σύγκριση των λόγων S/N συναρτήσει του αριθμού των θυγατρικών ιόντων της βρινζολαμίδης που παρακολουθούνται. Ανάλυση διαλύματος βρινζολαμίδης 1 μg/ml σε MeOH/H2O 80:20 με στήλη CN και κινητή φάση MeOH/HCOONH 4 10 mm (n=3). Αναφορικά με τη ραμπεπραζόλη επιλέχθηκε η παρακολούθηση του ισχυρότερου θυγατρικού ιόντος με τιμή m/z ίση με 242,0877 χρησιμοποιώντας επίσης ένα παράθυρο επιλογής ιόντων εύρους 0,1 Da. 5.7 Προσδιορισμός χρωματογραφικών συνθηκών Όπως έχει αναφερθεί ήδη, η χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας αποτελεί μια συζευγμένη τεχνική που συνδυάζει τις αρχές δύο διακριτών αναλυτικών τεχνικών. Η δεδομένη σύζευξη παράγει μια νέα αναλυτική τεχνική η οποία δεν θα πρέπει να αντιμετωπίζεται ως η απλή επέκταση των επιμέρους τεχνικών. Με τον τρόπο αυτό, ο 93

υγροχρωματογράφος δεν θα πρέπει να αντιμετωπίζεται μονοδιάστατα ως το σύστημα εισαγωγής του φασματόμετρου μάζας και αντίστροφα το φασματόμετρο μάζας δεν θα πρέπει να αντιμετωπίζεται μονοδιάστατα ως ο ανιχνευτής του υγροχρωματογράφου. Στα πλαίσια της δεδομένης τεχνικής, οι χρωματογραφικές συνθήκες φαίνεται να ασκούν σημαντική επιρροή στην φασματομετρική ανίχνευση των αναλυτών. Πιο συγκεκριμένα, οι χρωματογραφικές συνθήκες ορίζουν σε σημαντικό βαθμό τη σύσταση του εκλούσματος που εισάγεται στην πηγή ιόντων και υφίσταται την εκάστοτε διαδικασία ιοντισμού. Το παραπάνω γεγονός διατηρεί εξαιρετική σημασία στην περίπτωση του ηλεκτροψεκασμού καθώς επηρεάζει σημαντικά τον ιοντισμό των αναλυτών. Για την εύρεση των χρωματογραφικών συνθηκών της παρούσας βιοαναλυτικής μεθόδου, χρησιμοποιήθηκε ένα διάλυμα ACN συγκέντρωσης βρινζολαμίδης 1,00 μg/ml και ραμπεπραζόλης 100 ng/ml. Σε ένα πρώτο στάδιο αξιολόγησης της χρωματογραφίας, επιλέχθηκε η χρήση μιας στήλης αντιστρόφου φάσεως C 8 ως στατική φάση. Η επιλογή της κινητής φάσης βασίστηκε στην άποψη ότι κατά τον θετικό ηλεκτροψεκασμό η ανίχνευση βασικών ουσιών ενισχύεται όσο το ph της κινητής φάσης μειώνεται. Η δεδομένη άποψη σχετίζεται με την εκτενή πρωτονίωση των βάσεων σε χαμηλό ph και κατ επέκταση την ευχερέστερη παραγωγή του πρωτονιωμένου μοριακού ιόντος [M+H] +. Δεδομένου ότι η βρινζολαμίδη διαθέτει μια ελεύθερη αμινομάδα με pka=5,9 θεωρήθηκε κατάλληλη υποψήφιος για την ανωτέρω προσέγγιση. Με τον τρόπο αυτό, ως κινητή φάση επιλέχθηκε το μίγμα ACN με υδατικό διάλυμα HCOOH 0,4 %. Το υδατικό μέρος της δεδομένης κινητής φάσης είναι αρκετά όξινο και διατηρεί ph περίπου 2,5. Μετά από ένα σύντομο αριθμό δοκιμών η ροή της κινητής φάσης ρυθμίστηκε στα 0,350 ml/min και το ποσοστό του οργανικού τροποποιητή στα 85 % v/v με αποτέλεσμα να επιτευχθούν χρόνοι ανάσχεσης 2,2 min και 2,3 min για τον αναλύτη και το εσωτερικό πρότυπο, αντίστοιχα. Η προκύπτουσα χρωματογραφική κορυφή της βρινζολαμίδης αν και συμμετρική, διατηρούσε αρκετά περιορισμένο ύψος φανερώνοντας κάποιο είδος καταστολής σήματος. Για να αξιολογηθεί εάν η χρησιμοποιούμενη κινητή φάση καταστέλλει τον ιοντισμό της βρινζολαμίδης αντικαταστάθηκε το υδατικό της μέρος με υδατικό διάλυμα μυρμηκικού αμμωνίου (HCOONH 4) συγκέντρωσης 10 mm διατηρώντας σταθερό το ποσοστό του οργανικού τροποποιητή και τη ροή της κινητής φάσης. Το υδατικό μέρος της νέας κινητής φάσης ήταν ελαφρώς όξινο διατηρώντας ph περίπου 6,5. Στο σημείο αυτό θα περίμενε κανείς ότι η αύξηση του ph της κινητής φάσης θα προκαλούσε τη μείωση του παρατηρούμενου αναλυτικού σήματος της βρινζολαμίδης λόγω της αποπρωτονίωσης του αναλύτη. Ωστόσο, η νέα κινητή φάση ενθάρρυνε τελικά τον ιοντισμό της βρινζολαμίδης παράγοντας μια χρωματογραφική κορυφή που διατηρούσε διπλάσιο ύψος από την προηγούμενη (Σχήμα 5.8). Η δεδομένη παρατήρηση είναι ενδεικτική της πολυπλοκότητας της διαδικασίας ιοντισμού των αναλυτών που λαμβάνει χώρα στα πλαίσια του ηλεκτροψεκασμού. Δεν θα πρέπει να ξεχνάμε ότι το φαινόμενου του ηλεκτροψεκασμού βασίζεται σε γεγονότα που πραγματοποιούνται τόσο στην αέρια όσο και στη συμπυκνωμένη φάση. Με τον τρόπο αυτό, συχνά η ποιοτική και ποσοτική σύσταση της συμπυκνωμένης φάσης δεν αντικατοπτρίζει τη σύσταση της αέριας φάσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι στη βιβλιογραφία απαντούν δημοσιεύσεις που υποστηρίζουν ότι παραδόξως η ανίχνευση βασικών ουσιών καταστέλλεται όταν χρησιμοποιούνται όξινες κινητές φάσεις (97), (98). 94

Σχήμα 5.8 Σύγκριση χρωματογραφικών κορυφών διαλύματος βρινζολαμίδης 1,00 μg/ml. Μετά τον προσδιορισμό του υδατικού μέρους της κινητής φάσης πραγματοποιήθηκε περαιτέρω αξιολόγηση του οργανικού τροποποιητή. Πιο συγκεκριμένα, το ACN αντικαταστάθηκε με MeOH ενώ το ποσοστό οργανικού τροποποιητή αυξήθηκε από 85 % σε 90 %. Υπό τις δεδομένες συνθήκες και για την περίπτωση της βρινζολαμίδης, προέκυψε μια χρωματογραφική κορυφή που διατηρούσε ύψος περίπου 40 % μεγαλύτερο από εκείνο της προηγούμενης κορυφής (Σχήμα 5.9). Η παρατηρούμενη αύξηση του αναλυτικού σήματος θα μπορούσε να συσχετιστεί με το χαμηλότερο σημείο ζέσεως της MeOH (64,7 o C) συγκριτικά με το ACN (82 o C). Με τον τρόπο αυτό, η MeOH θα ενθαρρύνει την πληρέστερη ξήρανση του προκύπτοντος αερολύματος επιτρέποντας τον εκτενέστερο ιοντισμό των αναλυτών. Επίσης η μικρή αύξηση του ποσοστού του οργανικού τροποποιητή μπορεί με τη σειρά του να συμβάλλει σε κάποιο βαθμό στην αύξηση του αναλυτικού σήματος. Η παραπάνω λογική βασίζεται και πάλι στην ευχερέστερη ξήρανση του προκύπτοντος αερολύματος λόγω του μεγαλύτερου ποσοστού οργανικού τροποποιητή που είναι σαφώς πτητικότερος του υδατικού μέρους της κινητής φάσης. 95

Σχήμα 5.9 Σύγκριση χρωματογραφικών κορυφών διαλύματος βρινζολαμίδης 1,00 μg/ml. Βασιζόμενοι στα παραπάνω πειράματα καταλήξαμε στην επιλογή μιας κινητής φάσης η οποία αποτελείται από 90 % MeOH και 10 % υδατικό διάλυμα HCOONH 4 συγκέντρωσης 10 mm. Σε ένα τελικό στάδιο, αξιολογήθηκε η χρήση της δεδομένης κινητής φάσης σε συνδυασμό με μια στήλη CN ως στατική φάση. Ο ανωτέρω συνδυασμός παρήγαγε στην περίπτωση της βρινζολαμίδης μια συμμετρική χρωματογραφική κορυφή που διατηρούσε ύψος περίπου 80 % μεγαλύτερο από εκείνο της προηγούμενης κορυφής (Σχήμα 5.10). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι χρησιμοποιούμενες χρωματογραφικές συνθήκες ακολουθούν τη λογική της υγροχρωματογραφίας υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography/HILIC). Λόγω της ενίσχυσης του σήματος της βρινζολαμίδης επιλέχθηκε τελικά ως στατική φάση η στήλη CN. Αναφορικά με τη ραμπεπραζόλη, δεν απαιτείται η εύρεση χρωματογραφικών συνθηκών που να μεγιστοποιούν το αναλυτικό σήμα καθώς αποτελεί το εσωτερικό πρότυπο της μεθόδου και συνεπώς η συγκέντρωση της μπορεί εύκολα να ρυθμιστεί. Πέρα από αυτό, η ανίχνευση της ραμπεπραζόλης εμφάνισε εγγενή ευαισθησία παράγοντας πολλαπλάσιο αναλυτικό σήμα συγκριτικά με τη βρινζολαμίδη (Σχήμα 5.11). 96

Σχήμα 5.10 Σύγκριση χρωματογραφικών κορυφών διαλύματος βρινζολαμίδης 1,00 μg/ml. Σχήμα 5.11 Χρωματογράφημα ραμπεπραζόλης διαλύματος 100 ng/ml. 97

Ακολούθως παρατίθενται οι τελικές χρωματογραφικές συνθήκες της παρούσας βιοαναλυτικής μεθόδου : Κινητή φάση MeOH / 10 mm HCOONH 4 (90/10) Ροή Στατική φάση Θερμοκρασία 0,350 ml/min Αναλυτική στήλη CN, διαστάσεων 50 x 4 mm, με σωματίδια διαμέτρου 3 μm και μέγεθος πόρων 100 Å Θερμοκρασία δωματίου Όγκος ένεσης 30 μl t R αναλύτη 1,7 min t R IS 1,7 min Χρόνος ανάλυσης 2,5 min 5.8 Προσδιορισμός διαδικασίας εκχύλισης Απαραίτητη προϋπόθεση για τη χρωματογραφική ανάλυση των ξηραμένων κηλίδων αίματος αποτελεί η εκχύλιση του αποσπώμενου δίσκου με κάποιον κατάλληλο διαλύτη εκχύλισης. Συνήθως ως διαλύτες εκχύλισης επιλέγονται μίγματα νερού με οργανικούς διαλύτες. Πέρα από τη σύσταση του διαλύτη εκχύλισης σημαντικό ρόλο παίζει ο όγκος διαλύτη που τελικά χρησιμοποιείται. Πιο συγκεκριμένα, όσο μεγαλύτερος είναι ο χρησιμοποιούμενος όγκος διαλύτη, τόσο αραιότερο είναι το προκύπτον εκχύλισμα που υφίσταται τελικά την ανάλυση. Για την παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο, απαιτήθηκε η χρήση ενός σχετικά μεγάλου όγκου διαλύτη εκχύλισης, συγκριτικά με τον όγκο του δείγματος, της τάξεως των 240 μl, για δύο κύριους λόγους. Ο πρώτος λόγος σχετίζεται με το μέγεθος του αποσπώμενου δίσκου όπως επίσης και με τις διαστάσεις του φιαλιδίου Eppendorf εντός του οποίου πραγματοποιήθηκε η διαδικασία εκχύλισης. Ειδικότερα, για να καταστεί δυνατή η πλήρης διαβροχή της επιφάνειας του αποσπώμενου δίσκου το φιαλίδιο Eppendorf έπρεπε να φέρει τουλάχιστον 200 μl διαλύτη εκχύλισης. Ο δεύτερος λόγος που καθόρισε το χρησιμοποιούμενο όγκο διαλύτη σχετίζεται με το βάθος του φιαλιδίου δειγματολήπτη στο οποίο έφτανε η βελόνα δειγματοληψίας. Τα χρησιμοποιούμενα φιαλίδια δειγματολήπτη είχαν χωρητικότητα 1,5 ml και για να διασφαλιστεί η αξιόπιστη αναρρόφηση δείγματος έπρεπε να φέρουν τουλάχιστον 240 μl εκχυλίσματος. Σύμφωνα με τα παραπάνω, επιλέχθηκε η χρήση 240 μl διαλύτη για την εκχύλιση του αποσπώμενου 98

δίσκου εντός φιαλιδίου Eppendorf και ακόλουθη ποσοτική μεταφορά του προκύπτοντος εκχυλίσματος σε φιαλίδιο δειγματολήπτη. Για να επιτευχθεί η αποτελεσματικότερη εκχύλιση του αναλύτη από τον αποσπώμενο δίσκο, τα φιαλίδια Eppendorf ανακινούνταν για 15 min με τη βοήθεια αναμικτήρα τύπου Multi-Vortex V-32. Η ταχύτητα ανακίνησης ρυθμίστηκε σε τέτοιο επίπεδο ώστε ο αποσπώμενος δίσκος να περιβρέχεται συνεχώς από το διαλύτη εκχύλισης. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν επιλέχθηκε η μέγιστη δυνατή ταχύτητα ανακίνησης καθώς προκαλούσε έντονο στροβιλισμό του διαλύτη εκχύλισης με αποτέλεσμα ο αποσπώμενος δίσκος να εκδιώκεται από το υδατικό σώμα και να επικολλάται στα τοιχώματα του φιαλιδίου Eppendorf. Αναφορικά με τη σύσταση του διαλύτη εκχύλισης, επιλέχθηκε η χρήση δυαδίκου συστήματος που προκύπτει κατά την ανάμιξη νερού και οργανικού τροποποιητή. Ως οργανικοί τροποποιητές αξιολογήθηκαν τόσο η MeOH όσο και το ACN, ενώ η επιλογή της τελικής σύστασης του διαλύτη εκχύλισης έγινε με γνώμονα τη βελτιστοποίηση της εκχύλισης του αναλύτη. Τόσο η MeOH, όσο και το ACN, παρήγαγαν διαλύτες εκχύλισης που για τις δεδομένες συνθήκες παρουσίαζαν ανάλογη συμπεριφορά. Πιο συγκεκριμένα, όταν ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης εκχύλισης αποτελούταν εξ ολοκλήρου από οργανικό τροποποιητή, είτε MeOH, είτε ACN, η εκχύλιση της βρινζολαμίδης από τον αποσπώμενο δίσκο ήταν ασήμαντη. Αντίθετα, η παρουσία ενός, μικρού έστω, ποσοστού νερού επέτρεπε την αποτελεσματικότερη εκχύλιση του αναλύτη. Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το ποσοστό του νερού δεν μπορούσε να αυξηθεί υπέρμετρα καθώς τα προκύπτοντα εκχυλίσματα ήταν ακατάλληλα για άμεση ένεση στο υγροχρωματογραφικό σύστημα. Η ακαταλληλότητα των δεδομένων εκχυλισμάτων σχετιζόταν με το γεγονός ότι διατηρούσαν τη μορφή έγχρωμου εναιωρήματος. Το παραπάνω φαινόμενο παρατηρήθηκε όταν το ποσοστό νερού υπερέβαινε το 30 % στην περίπτωση της MeOH και το 60 % στην περίπτωση του ACN. Αναφορικά με το ACN, αξιολογήθηκαν τα μίγματα ACN/H 2O σε ποσοστά 70:30, 60:40 και 50:50, ενώ για την περίπτωση της MeOH αξιολογήθηκαν μίγματα MeOH/H 2O σε ποσοστά 90:10 και 80:20. Σε γενικές γραμμές, οι διαλύτες εκχύλισης που περιείχαν MeOH επέτρεπαν την αποτελεσματικότερη εκχύλιση της βρινζολαμίδης από τον αποσπώμενο δίσκο συγκριτικά με τους διαλύτες εκχύλισης που περιείχαν ACN. Επίσης, το ποσοστό του νερού φαίνεται να ασκούσε περιορισμένη επιρροή στην εκχύλιση του αναλύτη. Αναφορικά με τους διαλύτες εκχύλισης που περιείχαν ACN σε διαφορετικά ποσοστά, αυτοί παρήγαγαν ανάλογα αποτελέσματα με οριακά καλύτερο εκείνο του ποσοστού 60:40. Ωστόσο οι διαλύτες εκχύλισης που περιείχαν MeOH παρήγαγαν καλύτερα αποτελέσματα από το μίγμα ACN/H 2O 60:40 με συνέπεια την απόρριψη του ACN ως διαλύτης εκχύλισης (Σχήμα 5.12). Επίσης η χρήση ενός διαλύτη εκχύλισης που διατηρεί σύσταση ανάλογη της κινητής φάσης επιτρέπει την άμεση ένεση του εκχυλίσματος στο υγροχρωματογραφικό σύστημα χωρίς να απαιτείται προηγούμενη ανασύσταση. Βασιζόμενοι στα ανωτέρω επιλέξαμε ως διαλύτη εκχύλισης το μίγμα MeOH/H 2O 80:20. Όπως έχει αναφερθεί ήδη, για την παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο έχει επιλεχθεί η ενσωμάτωση του εσωτερικού προτύπου στο διαλύτη εκχύλισης με αποτέλεσμα αυτός να φέρει παράλληλα 100 ng/ml ραμπεπραζόλης. 99

Σχήμα 5.12 Σύγκριση ύψους χρωματογραφικών κορυφών βρινζολαμίδης που προέκυψαν κατά την ανάλυση διαφορετικών εκχυλισμάτων ξηραμένης κηλίδας αίματος που περιείχε 5 μg/ml βρινζολαμίδης. Ακολούθως παρατίθεται συνοπτική περιγραφή της διαδικασίας εκχύλισης που ακολουθείται στην παρούσα βιοαναλυτική μέθοδο : Ένας δίσκους διαμέτρου 5,5 mm αποσπάται χειροκίνητα από την εκάστοτε ξηραμένη κηλίδα αίματος με τη βοήθεια διατρητικής μηχανής και φέρεται σε φιαλίδιο Eppendorf χωρητικότητας 2 ml. 240 μl μίγματος MeOH/H 2O 80:20, που περιείχε 100 ng/ml ραμπεπραζόλης, φέρονται στο φιαλίδιο Eppendorf μέσω αναλυτικής πιπέτας το οποίο ακολούθως ανακινείται για 15 min στον αναμικτήρα. Το προκύπτον εκχύλισμα μεταφέρεται ποσοτικά σε φιαλίδιο δειγματολήπτη μέσω αναλυτικής πιπέτας. 100