ΜΑΘΗΜΑ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΜΕΤΡΗΣΗ ΟΛΙΚΟΥ ΦΑΙΝΟΛΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ (TPh) ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ FOLIN-CIOCALTEU ΣΕ ΑΠΟΒΛΗΤΑ ΕΛΑΙΟΤΡΙΒΕΙΟΥ Επιμέλεια κειμένου: Τζάθας Κωνσταντίνος ΥΔ ΣΚΟΠΟΣ Η εργαστηριακή άσκηση αυτή έχει ως σκοπό τη γνωριμία των σπουδαστών με το πρόβλημα της διαχείρισης και αξιοποίησης απόβλητων ελαιοτριβείων μέσω της παραλαβής αντιοξειδωτικών φαινολικών ενώσεων από αυτά. Εφαρμόζεται η μέθοδος Folin-Ciocalteau για τη μέτρηση του ολικού φαινολικού περιεχομένου σε δείγματα αποβλήτων ελαιοτριβείων και αναλύονται οι μέθοδοι εξαγωγής και παραλαβής των φαινολικών ενώσεων από το απόβλητο. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Παραγωγή Ελαιόλαδου (Διαδικασία, Απόβλητα) Η παραγωγή τόσο της ελιάς όσο και του ελαιόλαδου εντοπίζεται κυρίως στις χώρες της Ευρώπης όπου παράγεται σχεδόν το 80,2 % της παγκόσμιας παραγωγής ελαιόλαδου (περίπου 2.056.200 τόνοι, κατά μέσο όρο, για τις ελαιοκομικές περιόδους 1999/2000 2002/2003). Η Ελλάδα είναι η τρίτη ελαιοπαραγωγός χώρα σε παγκόσμιο επίπεδο (405.600 τόνοι κατά μέσο όρο, που αντιστοιχεί στο 19.7% της ευρωπαϊκής παραγωγής, για τις ελαιοκομικές περιόδους 1999/2000 2002/2003), μετά την Ισπανία (978.800 τόνοι κατά μέσο όρο, που αντιστοιχεί στο 47.6% της ευρωπαϊκής παραγωγής, για τις ελαιοκομικές περιόδους 1999/2000 2002/2003) και την Ιταλία (633.700 τόνοι κατά 1 μέσο όρο, που αντιστοιχεί στο 30.8% της ευρωπαϊκής παραγωγής, για τις ελαιοκομικές περιόδους 1999/2000 2002/2003) Η παραγωγή του ελαιολάδου αποτελείται από επτά βήματα: 1. Παραλαβή του καρπού: Μετά την συγκομιδή οι ελιές παραδίδονται στις μεταποιητικές μονάδες για επεξεργασία. Η μεταφορά τους γίνεται σε πλαστικά τελάρα με οπές αερισμού ή πλαστικούς σάκους. Η επεξεργασία πρέπει να γίνει το γρηγορότερο δυνατόν.
Σε διαφορετική περίπτωση ο καρπός θα πρέπει να μείνει σε χώρο με καλό αερισμό για μικρό χρονικό διάστημα. 2. Πλύσιμο: Απομακρύνονται τα φύλλα και άλλα φερτά υλικά. Ακολουθεί πλύσιμο για την απομάκρυνση ξένων υλών (σκόνη, χώμα, κ.λ.π.). 3. Σπάσιμο-άλεση: ελαιόκαρπου Στα παραδοσιακά ελαιοτριβεία η άλεση του καρπού γίνεται με κυλινδρικές μυλόπετρες. Στις σύγχρονες μονάδες χρησιμοποιούνται μεταλλικοί μύλοι, σφυρόμυλοι και σπαστήρες με οδοντωτούς δίσκους. 4. Μάλαξη: Μετά την άλεση, η ελαιοζύμη αναμιγνύεται στο μαλακτήρα μετά την προσθήκη ζεστού νερού. Η μάλαξη αποτελεί βασικό στάδιο της επεξεργασίας και συντελεί στην συνένωση των μικρών ελαιοσταγονιδίων με μεγαλύτερες σταγόνες λαδιού. Για τη διευκόλυνση της διαδικασίας η ελαιοζύμη θερμαίνεται στους 28-30ºC. Στο μαλακτήρα προστίθεται νερό μέχρι και 10 % της ποσότητας της ελαιοζύμης, πριν την εξαγωγή του ελαιόλαδου σε διφασικό ή τριφασικό φυγοκεντρικό σύστημα. 5. Παραλαβή του ελαιόλαδου: Υπάρχουν τρεις μέθοδοι για την παραλαβή του ελαιόλαδου: η παραδοσιακή πιεστική, η διφασική και η τριφασική. Η παραδοσιακή μέθοδος της πίεσης και η διαδικασία των τριών φάσεων παράγουν το παρθένο ελαιόλαδο και δύο τύπους αποβλήτων: τα υγρά απόβλητα (κατσίγαρος) και τα στερεά απόβλητα (ελαιοπυρήνας). Η διαδικασία των δύο φάσεων παράγει παρθένο ελαιόλαδο και στερεό απόβλητο (ελαιοπυρήνας) με αυξημένη υγρασία. Σχήμα 1 Τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται στα ελαιοτριβεία της Ευρώπης (IMPEL, 2003).
6. Καθαρισμός του ελαιόλαδου: Τα στερεά σωματίδια (τεμαχίδια σάρκας, φλοιού, θρύμματα πυρηνόξυλου, κλπ) που βρίσκονται διαλυμένα στην υγρή φάση απομακρύνονται με τη χρήση παλινδρομικά κινούμενων κοσκίνων (κόσκινα απολάσπωσης). 7. Τελικός διαχωρισμός: Ο τελικός διαχωρισμός του ελαιόλαδου από τα φυτικά υγρά γίνεται με τη χρήση φυγοκεντρικών ελαιοδιαχωριστήρων Συγκριτικά, η 2-φασική επεξεργασία παρουσιάζει τα εξής πλεονεκτήματα σε σχέση με τα 3- φασικά συστήματα: έχει διαπιστωθεί ότι το ελαιόλαδο που παράγεται από τα 2-φασικά ελαιοτριβεία είναι καλύτερης ποιότητας, έχει υψηλότερη οξειδωτική σταθερότητα και καλύτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. δεν απαιτείται η προσθήκη επιπλέον ποσοτήτων νερού για την παραγωγή της ελαιόπαστας ελαττώνοντας έτσι το λειτουργικό κόστος της εγκατάστασης. Η απαίτηση των 2-φασικών συστημάτων σε ενέργεια είναι μικρότερη, λόγω της μικρότερης ποσότητας ελαιόπαστας που πρέπει να επεξεργαστεί δεν απαιτείται επιπλέον φυγοκεντρωτής για την επεξεργασία των φυτικών υγρών που παράγονται, καθώς αυτά ανακυκλώνονται στα 3-φασικά συστήματα πριν τη δεύτερη φυγοκέντριση απαιτείται η ανάμιξη των φυτικών υγρών και του ελαιόλαδου. Πτητικά συστατικά είναι πιθανόν να δημιουργήσουν κολλώδες ίζημα στον φυγοκεντριτή. η κατασκευή του 2-φασικού φυγοκεντριτή είναι λιγότερο περίπλοκη, κάνοντάς τον πιο αξιόπιστο λειτουργικά και περισσότερο οικονομικό από τον 3- φασικό. Παρόλα αυτά υπάρχουν και μερικά μειονεκτήματα του 2-φασικού συστήματος έναντι των 3- φασικών. Τα κυριότερα είναι τα εξής: η 2-φασική τεχνολογία επεξεργασίας ελαιόλαδου, ουσιαστικά μετατοπίζει το πρόβλημα των αποβλήτων που παράγονται από τα ελαιοτριβεία, στις ραφιναρίες. Η ελαιόπαστα που παράγεται πρέπει να υποστεί επεξεργασία για την εξαγωγή του ελαίου που περιέχει, με συχνά αρκετά δαπανηρές σε ενέργεια και κόστος διαδικασίες. τα απόβλητα των 2-φασικών ελαιοτριβείων (2POMW) είναι μια σχετικά νέα μορφή αποβλήτων η οποία δεν έχει πλήρως χαρακτηρισθεί και μελετηθεί. Γενικά πάντως έχει διαπιστωθεί ότι πρόκειται για απόβλητα με υψηλό COD, υψηλό δείκτη θολότητας, είναι πλούσια σε λίπη, ξηρό περιεχόμενο, και φαινόλες.
τα 2POMW περιέχουν 55-70% υγρασία, ενώ το στερεό υπόλειμμα των παραδοσιακών πιεστηρίων περιέχουν μόλις 20-25% και των 3-φασικών 40-45%. Αυτό το χαρακτηριστικό των αποβλήτων τα καθιστά ασταθή στο χειρισμό, τη μεταφορά και την αποθήκευσή τους. Πίνακας 1 Βασικές διαφορές μεταξύ των συστημάτων εξαγωγής ελαιολάδου (Βολικάκη 2008) Αυτό που παρατηρείται με βάση τον παραπάνω πίνακα, είναι ότι τι 2-φασικό σύστημα παράγει μεγαλύτερες ποσότητες στερεού υπολείμματος, παράγοντας ταυτόχρονα και μικρότερες ποσότητες υγρών αποβλήτων με χαμηλότερο ρυπαντικό φορτίο. Είναι επίσης αξιοσημείωτη η
διαφορά στην περιεκτικότητα των πολυφαινολών, η συγκέντρωση των οποίων είναι σαφώς μικρότερη στο ελαιόλαδο που προέρχεται από την 3-φασική τεχνολογία. Αυτό οφείλεται στις μεγάλες ποσότητες νερού που απαιτείται να προστεθεί σε αυτή την επεξεργασία. Αντιοξειδωτικά στα απόβλητα ελαιοτριβείου Γενικά τα αντιοξειδωτικά είναι ουσίες που εμποδίζουν ή επιβραδύνουν την οξείδωση επειδή έχουν την ικανότητα να απενεργοποιούν την περίσσεια των ελεύθερων ριζών (οι σημαντικότερες είναι μορφές οξυγόνου που έχουν υποστεί μερική αναγωγή) με δύο βασικούς μηχανισμούς που λειτουργούν σχεδόν παράλληλα ή και με κυριαρχία του ενός ή του άλλου: (1) μεταφέροντας και προσφέροντας υδρογόνο και (2) προσφέροντας μονήρες ηλεκτρόνιο. Ως ελεύθερη ρίζα ορίζεται κάθε είδος ατόμου ή χημικής ένωσης που έχει την ικανότητα ανεξάρτητης (ελεύθερης) ύπαρξης και μπορεί να περιέχει ένα ή και περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Οι ελεύθερες ρίζες είναι ασταθείς και ιδιαίτερα δραστικές ενώσεις των οποίων οι αντιδράσεις τείνουν να είναι αλυσιδωτές αναγεννώντας συνέχεια νέα άτομα ή ενώσεις με ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Η αντίδραση θα σταματήσει όταν όλες οι ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν προς προϊόντα που δεν παρέχουν πλέον νέες ελεύθερες ρίζες. Η πλειοψηφία των αντιοξειδωτικών είναι αρωματικές ενώσεις, που διαθέτουν μια τουλάχιστον ελεύθερη υδροξυλική ή αμινική ομάδα και ανάλογα με τον μηχανισμό δράσης τους, διακρίνονται σε πρωτοταγή, τα οποία διακόπτουν τις αντιδράσεις διάδοσης των ελεύθερων ριζών παρέχοντας άτομα υδρογόνου στις ελεύθερες ρίζες και σε δευτεροταγή, των οποίων η αντιοξειδωτική δράση βασίζεται σε ποικίλες διεργασίες (πχ δημιουργία χηλικών συμπλόκων, αναγωγικές δράσεις κ.α.). Ανάλογα με την προέλευσή τους τα αντιοξειδωτικά διακρίνονται σε φυσικά και συνθετικά. Οι φαινολικές ενώσεις ανήκουν στα φυσικά αντιοξειδωτικά και είναι παράγωγα του βενζολίου με ένα ή περισσότερα υδροξύλια στον φαινολικό δακτύλιο και αποτελούν μία από τις κύριες ομάδες δευτερογενών μεταβολιτών. Οι φαινολικές ενώσεις είναι πολύ δραστικές, λόγω του όξινου χαρακτήρα των υδροξυλικών ομάδων και των πυρηνόφιλων ιδιοτήτων των φαινολικών δακτυλίων. Φαινολικά ενώσεις εμφανίζονται στα τρόφιμα με περιεκτικότητα να κυμαίνεται από < 1 mg/kg μέχρι 3000 mg/kg. Τα φρούτα περιέχουν διάφορα επίπεδα φαινολικών, όπως μήλο, σταφύλια, αχλάδι, κεράσι, ροδάκινο, δαμάσκηνο. Επίσης, η ελιά, η τομάτα, το τσάι, ο καφές, το μπρόκολο, η σόγια, η πατάτα. Σημαντικές πηγές φαινολικών συστατικών είναι το κόκκινο κρασί, το τσάι, ο καφές, το ελαιόλαδο, η σόγια. Γενικώς, πολλές πολυφαινόλες έχει αποδειχθεί ότι έχουν και σημαντικές βιολογικές ιδιότητες. Μεταξύ αυτών είναι η εκκαθάριση ελευθέρων ριζών (free radical scavengers). Οι ελεύθερες ρίζες, και ειδικότερα αυτές που σχετίζονται με το
οξυγόνο, εμπλέκονται σε μια σειρά από παθολογικές καταστάσεις, όπως καρδιαγγειακές παθήσεις, παθήσεις του οφθαλμού, του αναπνευστικού συστήματος, των νεύρων, αυτοάνοσα νοσήματα, ενώ επίσης έχει αναφερθεί ότι σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου και την γήρανση [Dal-Ros, 2011]. Η φυσιολογική αντιοξειδωτική προστασία που αναπτύσσει ο οργανισμός αποτελεί έναν από τους αποτελεσματικότερους μηχανισμούς κατά των επιβλαβών αλλοιώσεων που προκαλούν οι ελεύθερες ρίζες [Wu M, 2001]. Έτσι, η επιτυχής λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από το επίπεδο πρόσληψης φυσικών αντιοξειδωτικών μέσω διατροφής. Πιο συγκεκριμένα στο ελαιόλαδο και στα παράγωγα των διεργασιών παραλαβής του έχουν ανιχνευθεί περισσότερες από 30 διαφορετικές φαινολικές ενώσεις με σημαντικότερες εκείνες του Πίνακα 2. Πίνακας 2 Φαινολικές ενώσεις στον καρπό ελιάς και στο ελαιόλαδο [Boskou, 1996]
ΜΕΘΟΔΟΣ FOLIN-CIOCALTEU Είναι μία φωτομετρική τεχνική που εφαρμόζεται για τον προσδιορισμό του ολικού φαινολικού περιεχομένου σε φυσικά προϊόντα και βασίζεται στην αναγωγική δράση παρουσία πολυφαινολικών ομάδων. Η μέθοδος είναι εξαιρετικά χρήσιμη και διεθνώς αποδεκτή αφού επιτρέπει την εκτίμηση του συνόλου των πολυφαινολικών συστατικών ενός φυσικού προϊόντος, συμπεριλαμβανομένων και αυτών που δεν έχουν μέχρι σήμερα ταυτοποιηθεί. Η μέθοδος βασίζεται σε χρωματομετρική οξειδοαναγωγική αντίδραση με την οποία προσδιορίζεται το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο του δείγματος, χωρίς διαχωρισμό μεταξύ μονομερών, διμερών και μεγαλύτερων φαινολικών συστατικών. Το αντιδραστήριο FC είναι διάλυμα σύνθετων πολυμερών ιόντων που σχηματίζονται από Φωσφομολυβδενικά και Φωσφοβολφραμικά ετεροπολυμερή οξέα. Τα φαινολικά ιόντα οξειδώνονται με ταυτόχρονη αναγωγή των ετεροπολυμερών οξέων : Το προϊόν είναι σύμπλεγμα μολυβδαινίου βολφραμίου (Mo-W) χαρακτηριστικής μπλε χρώσης που απορροφά στο ορατό (765nm). Η αλκαλικότητα ρυθμίζεται με κορεσμένο διάλυμα Na 2 CO 3 που δεν διαταράσσει τη σταθερότητα του FC και του προϊόντος της αντίδρασης αφενός, αφετέρου αποτελεί προϋπόθεση παρουσίας των φαινολικών ιόντων. Γενικά, οι φαινόλες που καθορίζονται από τον Δείκτη FC εκφράζονται πολύ συχνά σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Υλικά και εξοπλισμός - Αντιδραστήριο Folin-Ciocalteau - Ανθρακικό νάτριο (Na 2 CO 3 ) 20% (w/v) - Μεθανόλη - Γαλλικό Οξύ - Απιονισμένο Νερό - Ανακινητής Vortex - Πιπέτες ή σιφώνια - Ογκομετρικές φιάλες των 20 ml - Αναλυτικός Ζυγός - Φασματοφωτόμετρο, κυψελίδες
Αρχικά κατασκευάζεται η καμπύλη αναφοράς απορρόφησης ως προς συγκέντρωση σε γαλλικό οξύ. Για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς παρασκευάζεται αρχικό διάλυμα γαλλικού οξέος, συγκέντρωσης 2000 mg/l και από αυτό με διαδοχικές αραιώσεις πρότυπα διαλύματα γαλλικού οξέος συγκέντρωσης 100-2000 mg/l τα οποία φωτομετρώνται. Ως διαλύτης χρησιμοποιείται μίγμα ΜeOH-H2O, 70:30 ν/ν. Ποσότητα 0,2 ml πρότυπου διαλύματος αναμιγνύεται με 4,8 ml νερού σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml. Στη συνέχεια προστίθενται 0,5 ml αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu και μετά από 3 min, 1 ml κορεσμένου διαλύματος Na 2 CO 3. Το μίγμα αναδεύεται και συμπληρώνεται σε όγκο 10 ml με νερό. Μετά 1 h μετριέται η απορρόφηση στα 765 nm. Για κάθε συγκέντρωση πρότυπου διαλύματος η απορρόφηση καταγράφεται τρεις φορές. Το υπό μελέτη εκχύλισμα απόβλητου ελαιοτριβείου σε μεθανόλη (50μL) διαλύεται σε νερό (450μL), προστίθενται σε αυτό 2,5 ml αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteau 0.2N και το μείγμα αναδεύεται για 5min. Στη συνέχεια ακολουθεί προσθήκη Na2CO3 (75 g/l, 2 ml) και ανάδευση για ακόμα 5min. Μετά το πέρας 1.5 h γίνεται μέτρηση της απορρόφησης στα 765 nm (25 ºC). Από την ένδειξη του φασματομέτρου στα 765 nm και με βάση την καμπύλη αναφοράς γίνεται αναγωγή του αποτελέσματος ανά kg δείγματος ελαιολάδου: mg γαλλικού οξέος / kg ελαίου = (5 *C / κ * w ), όπου: C τα μg γαλλικού οξέος / 10 ml διαλύματος εργασίας που προήλθαν από κ ml πολικού κλάσματος, w το βάρος του δείγματος ελαιολάδου που ζυγίστηκε σε g. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Faustino, H., Gil, N., Baptista, C. & Duarte, A. P. Antioxidant activity of lignin phenolic compounds extracted from kraft and sulphite black liquors. Molecules 15, 9308 9322 (2010). Gutfinger, T. Polyphenols in olive oils. J. Am. Oil Chem. Soc. 58, 966 968 (1981). Vlyssides, A.., Loizides, M., Karlis, P.., 2004. Integrated strategic approach for reusing olive oil extraction by-products. J. Clean. Prod. 12, 603 611. doi:10.1016/s0959-6526(03)00078-7 Vlyssides, A.G., Loizides, M., Karlis, P., Simonetis, I.S., 2002. Olive stone oil processing wastes production and their characteristics. Fresenius Environ. Bull. 12b, 1114 1118. IMPEL, 2003. IMPEL Olive Oil Project Report. European Union Network for the implementation and enforcement of Environmental Law. Wu M et al. Mechanism of cardioprotection by resveratrol, a phenolic antioxidant present in red wine, Int. J. Mol. Med, 8, 2001 : 3-17. Dal-Ros S., Zoll J., Lang A, Auger C, Keller N, Bronner C, Geny B, SchiniKerth V. Chronic intake of red wine polyphenols by young rats prevents aginginduced endothelial dysfunction and decline in physical performance: Role of 64 NADPH oxidase, Biochemical and Biophysical Research Communications, 404 (2), 2011: 743-749. Wilfred Vermerris, Ralph Nicholson, Phenolic Compound Biochemistry, Springer 2006 Φουρτουνόπουλος Δ. Επιστήμη τροφίμων II, Τμήμα εκδόσεων Α.Τ.Ε.Ι.. 2004 Βολικάκη Χρυσή, Μέθοδοι επεξεργασίας υγρών και στερεών αποβλήτων ελαιοτριβείων Τμήμα Μηχ. Περιβαλλοντος, Πολυτεχνείο Κρήτης, (2008) Boskou, D. (1996) Olive Oil. Chemistry and Technology, AOCS Press, Champaign,Illinois
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΙ Καμπύλη Αναφοράς ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ C A(765nm) C A(765nm) C A(765nm)
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Ποια τα κυριότερα στάδια παραγωγής ελαιόλαδου; 2. Σύγκριση μεθόδων παραλαβής ελαιόλαδου; Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα 3. Τι είναι οι φαινολικές ενώσεις και ποια τα οφέλη τους στον άνθρωπο. 4. Μέθoδος μέτρησης φαινολικού περιεχομένου Folin-Ciocalteau