QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA 704505 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA είναι μια ημι-ποσοτική ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση για την ανίχνευση αντισωμάτων IgG αντι-ss-a 52 σε ορούς ασθενών. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων, όταν εξετάζεται σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα, αποτελεί ένα βοήθημα στη διάγνωση του συστημικού ερυθηματώδους λύκου (ΣΕΛ), του συνδρόμου Sjögren (SS), της συστημικής σκλήρυνσης (SSC), της πολυμυοσίτιδας (PM) και της δερματομυοσίτιδας (DM). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Αυτοαντισώματα στο αντιγόνο SS-A/Ro εντοπίζονται στο 40-60% των ασθενών με σύνδρομο Sjögren και στο 25-35% των ασθενών με ΣΕΛ. 1-4 Παλαιότερα πιστευόταν ότι ήταν απαραίτητες δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, η SS-A 52 και η SS-A 60, για να τεκμηριωθεί η SS-A αντιγονική αντιδραστικότητα 2-4. Σήμερα είναι γνωστό ότι οι πρωτεΐνες SS-A 52 και SS-A 60 δεν συνδέονται στο ίδιο σωμάτιο. 5 Επιπλέον, τα αντι-ss-a 52 αυτοαντισώματα είναι διαφορετικά 6, και έχουν διαφορετική κλινική χρησιμότητα, 7-11 από τα αντισώματα αντι- SS-A 60. Όπως το αντι-ss-a 60, έτσι και το αντι-ss-a 52 εντοπίζεται συνήθως σε ασθενείς με ΣΕΛ και σύνδρομο Sjögren 1,3,9 και περιστασιακά σε άλλες αυτοάνοσες διαταραχές. Εντούτοις, αυτοαντισώματα αντι-ss-a 52 εντοπίζονται επίσης σε ασθενείς με συστημική σκλήρυνση 8,11 και πολυμυοσίτιδα και δερματομυοσίτιδα. 6-8. Τα αντι-ss-a 52 συνδέονται με αντισώματα σε trna συνθετάσες όπως Jo-1, PL-7 και PL-2 7,8, τα οποία συχνά απαντώνται σε ασθενείς με εμπλοκή διάμεσου πνευμονικού ιστού. 12. Υπάρχει ένα υποσύνολο ασθενών με πολυμυοσίτιδα και δερματομυοσίτιδα με σύνδρομο συνθετάσης οι οποίοι ωφελούνται από θεραπεία διαφορετική από τις περισσότερες άλλες αυτοάνοσες νόσους. 12 Αρχη Μεθοδου Ένα κεκαθαρμένο ανασυνδυασμένο αντιγόνο SS-A δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου, υπό συνθήκες οι οποίες το διατηρούν στην αμιγή του κατάσταση. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντι- SS-A 52 αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο SS-A 52 (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο (έτοιμο για χρήση)1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα IgG αντισώματα SS-A 52) 3. SS-A 52 ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου IgG ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο SS-A 52, προαραιωμένο, (έτοιμο για χρήση) 1.2ml 4. SS-A 52 ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου IgG ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο SS-A 52, προαραιωμένο, (έτοιμο για χρήση) 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 9. HRP Stop Soulution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 13 1
3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI (NCCLS) Document H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 14 Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 SS-A 52 ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος SS-A 52 Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος SS-A 52 High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 2
1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. 3
α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A3 toυ CLSI (NCCLS) για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. 15 Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του SS-A 52 ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του SS-A 52 ELISA Low. Η τιμή του SS-A 52 ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X SS-A 52 oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. SS-A 52 ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων, πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί μετά να ταξινομηθεί σαν αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον πίνακα παρακάτω. Αρνητικό Ασθενώς θετικό Ενδιάμεσο θετικό Ισχυρώς θετικό <20 μονάδων 20-39 μονάδες 40-80 μονάδες >80 μονάδων 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει την παρουσία αντισωμάτων SS-A 52 IgG και υποδεικνύει την πιθανότητα ορισμένων αυτοάνοσων νόσων όπως συστημικός ερυθηματώδης λύκος, σύνδρομο Sjögren, συστημική σκλήρυνση ή PM/DM. Υψηλές τιμές αντι-ss-a 52 συσχετίζονται περισσότερο με την παρουσία αυτοάνοσης νόσου από ό,τι χαμηλές ή μεσαίες τιμές. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων SS-A 52 IgG ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA. Οι τιμές SS-A 52 IgG που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα σε έναν ασθενή δεν αποκλείει την πιθανότητα συστημικού ερυθηματώδους λύκου, συνδρόμου Sjögren, συστημικής σκλήρυνσης ή PM/DM. Τα αρνητικά δείγματα μπορούν να αναλυθούν ξανά για άλλα αντισώματα σχετιζόμενα με αυτοάνοσες νόσους. 2. Ψευδή θετικά αποτελέσματα είναι πιθανά. Σε σπάνιες περιπτώσεις, άτομα χωρίς γνωστή διαταραχή ή με διαταραχή η οποία δεν συνδέεται με αυτοάνοσες νόσους του συνδετικού ιστού μπορεί να έχουν αντίσωμα που αντιδρά με το αντιγόνο SS-A 52. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της επεξεργασίας πρέπει να είναι σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα και ορολογικούς ελέγχους. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η οριακή τιμή μεταξύ θετικού και αρνητικού επιλέχθηκε κατά σειρά ιεραρχίας και ROC εξετάζοντας 595 κλινικά καθορισμένους ασθενείς και επιλέγοντας μια οριακή τιμή που έδωσε ειδικότητα 95.8% και συνολική ευαισθησία 28.8%. 4
Λογοτεχνία* INOVA QUANTA Lite (TM) SS-A 52 Ασθένεια N SS-A 52+ Ευαισθησία N SS-A 52+ Ευαισθησία SEL 2,4 123 41 33% 149 46 31% SS 2,4,9 100 63 63% 71 60 85% PM/DM 7,9 262 98 37% 123 90 73%^^ Jo-1 7,8 64 42 66% 32 25 78% SSC 11 ** 263 31 12% 176 34 19% ελέγχο 2,8,9,10^ 102 1 1% 129 1 1% *Ο πίνακας είναι ένας συνδυασμός δεδομένων από τις μελέτες των Ben-Chetrit 2, Itoh 4, Rutjes 7, Frank 8, McCauliffe 9, Morozzi 10 και Fujimoro 11. **Περιλαμβάνει 11 δείγματα αρνητικά με την ανοσοδιάχυση Ouchterlony. ^Περιλαμβάνει υγιείς εθελοντές και ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα. ^^Αυτός ο πληθυσμός περιλαμβάνει ένα υψηλό ποσοστό ασθενών που είναι θετικοί για αντισώματα ειδικά για μυοσίτιδα. Φυσιολογικές Τιμές Εκατόν εννέα φυσιολογικοί δότες αίματος και 20 ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα εξετάστηκαν για αντισώματα αντι-ss-a 52 με την ανάλυση QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA. Μόνο 1 δείγμα ήταν χαμηλό θετικό στην τιμή των 26 Μονάδων. Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης Μελέτη Aληλεπίδρασης Η ικανότητα του QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA να ανιχνεύει αντισώματα SS-A 52 IgG αξιολογήθηκε σε σύγκριση με τον κόμβο SS-A στο QUANTA Plex TM ENA Προφίλ 6. Εκατόν εννέα δείγματα από δότες αίματος, 20 από ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, 110 με υψηλούς τίτλους έναντι οργανισμών μολυσματικών νόσων, 31 με σύνδρομο Sjogren, 149 με συστημικό ερυθηματώδη λύκο και 176 με συστημική σκλήρυνση αναλύθηκαν εσωτερικά τόσο με το QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA όσο και με τον κόμβο SS-A από το QUANTA Plex ENA Προφίλ 6 που φέρει και τα δύο αντιγόνα SS-A 52 και SS-A 60. Τα αποτελέσματα από αυτήν τη μελέτη παρουσιάζονται παρακάτω. Ποσοστό συμφωνίας θετικών και αρνητικών Όλα τα δείγματα N=595 SS-A 52 ELISA συμφωνίας θετικών (95% CI) συμφωνίας αρνητικών (95% CI) συμφωνίας = 92% + - SS-A Bead + 78 13* 86% (77-92%) 93% (90-95%) - 36** 468 *11 από αυτούς διαγνώστηκαν με ΣΕΛ, SS ή SSC και 10 είναι θετικοί για αντι-ss-a 60. **27 από αυτούς διαγνώστηκαν με ΣΕΛ, SS ή SSC, ενώ 8 είχαν αντισώματα σε οργανισμούς μολυσματικών νόσων. 14 από τα 20 δείγματα που εξετάστηκαν για αντι-ss-a 52 με τη δοκιμασία Western blot ήταν θετικά. Ποσοστό συμφωνίας θετικών: 78/93 (84%) Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών: 468/504 (93%) Κλινικές μελέτες Τα αποτελέσματα από τη δοκιμασία των 595 κλινικά καθορισμένων δειγμάτων παραπάνω, καθώς και 40 επιπλέον ασθενών με σύνδρομο Sjögren, 123 με πολυμυοσίτιδα ή δερματομυοσίτιδα και 5 δοτών αίματος, με SS-A 52 ELISA, παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. Αντι-SS-A 60 αντισώματα εντοπίζονται κυρίως σε ασθενείς με σύνδρομο Sjögren και συστημικό ερυθηματώδη λύκο, ενώ αντι-ss-a 52 αντισώματα εντοπίζονται σε αυτούς τους ασθενείς, καθώς και σε άτομα με συστημική σκλήρυνση και πολυμυοσίτιδα και δερματομυοσίτιδα. Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση SS-A 52 N=763 ELISA Κλινικές Ειδίκευση (95% CI) Κλινικές Ευαισθησία (95% Cl) + - Όλοι οι έλεγχοι N = 244 10 234 96% (93-98%) Όλη η ασθένεια N = 519 230 289 44% (40-49%) Μελέτη Aληλεπίδρασης Για την αξιολόγηση πιθανών προβλημάτων διασταυρωμένης αντιδραστικότητας με άλλα αυτοαντισώματα, αναλύθηκαν με το κιτ QUANTA Lite TM SS-A 52 διάφορα δείγματα υψηλού τίτλου θετικά για αυτοαντισώματα. Ορισμένα δείγματα ήταν θετικά για SS-B, Sm, RNP και Scl-70, αλλά αρνητικά για αντι-ss-a 52. Ομοίως, ορισμένα δείγματα ήταν θετικά για αντι-ss-a 52 αλλά αρνητικά για όλες τις άλλες αντιδραστικότητες αυτοαντισωμάτων που μετρήθηκαν. Συνεπώς, δεν φαίνεται να υπάρχει διασταυρούμενη αντιδραστικότητα άλλων αυτοαντισωμάτων με το αντιγόνο SS-A 52, ή με αντι-ss-a 52 αντισώματα σε άλλα αντιγόνα. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης για το QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA αξιολογήθηκε εξετάζοντας 9 δείγματα 7 φορές το καθένα σε 3 παρτίδες των κιτ. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω: Απόδοση εντός της ανάλυσης του QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA Διακύμανση εντός της ανάλυσης 5
P1 P5 P6 P7 P8 N201 Μέσες Μονάδες 20 U 22 U 42 U 130 U 60 U 6 U Τυπική απόκλιση 0.6 0.8 1.3 2.6 1.3 0.2 Συντελεστής διακύμανσης % 3% 3% 3% 2% 2% 3% I Η διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε εξετάζοντας 13 δείγματα δύο φορές τη μία ημέρα και μία φορά την ημέρα για 3 ημέρες, για ένα σύνολο 5 διαφορετικών εκτελέσεων. Αυτό πραγματοποιήθηκε για 3 παρτίδες των κιτ. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω: Απόδοση ανάμεσα των αναλύσεων για το QUANTA Lite TM SS-A 52 ELISA Διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων P1 P5 P6 P7 P8 N201 Μέσες Μονάδες 22 U 24 U 45 U 134 U 65 U 6 U Τυπική απόκλιση 0.5 1.1 1.1 3.6 0.9 1.3 Συντελεστής διακύμανσης % 2% 5% 2% 3% 1% 21% Βιβλιογραφία 1. Tan EM. Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33:167-239, 1982. 2. Ben-Chetrit E, Fox RI, Tan EM. Dissociation of immune responses to the SS-A (Ro) 52-kd and 60-kd polypeptides in systemic lupus erythematosus and Sjögren's Syndrome. Arthritis Rheum 33:349-355, 1990. 3. Veldhoven CHA, Meilof JF, Huisman JG, Smeenk RJT. The development of a quantitative assay for the detection of anti-ro/ss-a and anti-la/ss-b autoantibodies using purified recombinant proteins. J Immunol Meth 151:177-189, 1992. 4. Itoh Y, Reichlin M. Autoantibodies to the Ro/SSA antigen are conformation dependent. I:Anti-60 kd antibodies are mainly directed to the native protein; anti-52 kd antibodies are mainly directed to the denatured protein. Autoimmunity 14:57-65, 1992. 5. Boire G, Gendron M, Monast N, Bastin B, Menard HA. Purification of antigenically intact Ro ribonucleoproteins; biochemical and immunological evidence that the 52-kd protein is not a Ro protein. Clin Exp Immunol 100:489-498, 1995. 6. Peene I, Meheus L, De Keyser S, Humbel R, Veys EM, De Keyser F. Anti-Ro52 reactivity is an independent and additional serum marker in connective tissue disease. Ann Rheum Dis 61:929-933, 2002. 7. Rutjes SA, Vree WT Egberts, Jongen P, Van Den Hoogen F, Pruijn GJ, Van Venrooij WJ. Anti-Ro52 antibodies frequently co-occur with anti-jo-1 antibodies in sera from patients with idiopathic inflammatory myopathy. Clin Exp Immunol 109:32-40, 1997. 8. Frank MB, McCubbin V, Trieu E, Wu Y, Isenberg DA, Targoff IN. The association of anti-ro52 autoantibodies with myositis and scleroderma autoantibodies. J Autoimmun 12:137-142, 1999. 9. McCauliffe, et al. Recombinant 52KDa Ro (SSA) ELISA detects autoantibodies in Sjögren's Syndrome that go undetected by conventional serologic assays. J. Rheumatology 24: 860-866, 1997. 10. Morozzi G, Bellisai F, Simpatico A, Pucci G, Bacarelli MR, Campanella V, Marcolongo R, Galeazzi M. Comparison of different methods for the detection of anti-ro/ssa antibodies in connective tissue diseases. Clin Exp Rheumatol 18:729-731, 2000. 11. Fujimoto M, Shimozuma M, Yazawa N, et al. Prevalence and clinical relevance of 52kDA and 60-kDA Ro/SS-A autoantibodies in Japanese patients with systemic sclerosis. Ann Rheum Dis 56:667-670, 1997. 12. Wilkes MR, Sereika SM, Fertig N, et al. Treatment of antisynthetase-associated interstitial lung disease with tacrolimus. Arthritis Rheum 52:2439-2446, 2005. 13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007. 14. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline- Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), 2004. 15. CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline-Third Edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26(25), 2006. Technical Service 888-545-9495 Κατασκευαστής: 624505 April 2007 Revision GRC0 INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 6