Παραδείγµαταπροβληµάτων κινητικής ενζυµικώναντιδράσεων Γιαναείναιπιοεύχρησταταδεδοµένα για πρακτικούς λόγους έχουν γίνει κάποιες απλοποιήσεις, όπως οι αριθµητικές τιµές έχουν τροποποιηθεί (χωρίς όµως να είναι µακριά από την πραγµατικότητα), ο αριθµός των σηµείων για τον ορισµό των καµπυλών έχει µερικές φορές περιορισθεί κ.λπ.
Παράδειγµα 1: Η καρβοβενζοξυ-γλυκυλ-d-φαινυλαλανίνη χρησιµοποιείται συνήθως σαν υπόστρωµα για τον καθορισµό της δραστικότητας του ενζύµου παγκρεατική καρβοξυ-πεπτιδάση, που καταλύει την αντίδραση: καρβοβενζοξυ-γλυκυλ-φαινυλαλανίνη καρβοβενζοξυ-γλυκίνη + φαινυλαλανίνη CH2OCONHCH2CO-NHCHCOOH CH2 CH2OCONHCH2COOH NH2CHCOOH CH2
Μελετώντας την κινητική της υδρόλυσης του ανωτέρω υποστρώµατος από το ένζυµο αυτό, µε µέτρηση της αρχικής ταχύτητας παραγωγής της φαινυλαλανίνης (µε τη µέθοδο της νινυδρίνης), προέκυψαν τα ακόλουθα πειραµατικά αποτελέσµατα, απουσία και παρουσία των ακόλουθων πιθανών αναστολέων της ενζυµικής αντίδρασης: βουτυρικούφαινυλεστέρα (0,002Μ), βενζοϊκών (0,05Μ), κυστεϊνης (0,01Μ) και ιόντων Cu 2+ (0,01M).
Συγκέντρωση υποστρώµατος (Μ) Αρχική ταχύτητα v=d[phe]/dt (αυθαίρετες µονάδες) Χωρίς αναστολέα Παρουσία βουτυρικού φαινυλεστέρα (0,002Μ) Παρουσία βενζοϊκών (0,05Μ) Παρουσία κυστεϊνης (0,01Μ) Παρουσία ιόντων Cu 2+ (0,01M) 0,1000 0,0500 0,0333 0,0250 166,6 133,3 117,6 100,0 117,6 83,3 62,5 50,0 50,0 41,6 35,7 30,7 95,2 85,5 76,9 69,0 83,3 60,6 47,6 38,4
Από τις τιµές του προηγούµενου πίνακα: α.υπολογίσατετησταθερά Michaelis-Menten (K M ) του ενζύµου. β.ποιεςαπότιςενώσειςαυτέςείναιαναστολείςκαιτι είδους αναστολή προκαλούν στην αντίδραση; γ.υπολογίσατετηνκ Ι τουενζυµικούσυστήµατοςπου περιέχει βουτυρικό φαινυλεστέρα (υποθέτοντας ότι προκαλεί µια πλήρως αντιστρεπτή αναστολή)
Γίνεται επεξεργασία των πειραµατικών δεδοµένων για την απεικόνιση σε διάγραµµα Lineweaver-Burk Συγκέντρωση υποστρώµατος 1/[S] (x 10-1 Μ) Χωρίς αναστολέα Αρχική ταχύτητα 1/v (αυθαίρετες µονάδες) (x 10-3 ) Παρουσία Παρουσία Παρουσία βουτυρικού βενζοϊκών κυστεϊνης φαινυλεστέρα (0,05Μ) (0,01Μ) (0,002Μ) Παρουσία ιόντων Cu 2+ (0,01M) 0,1000 0,0500 0,0333 0,0250 6,0 7,5 8,5 10,0 8,5 12,5 16,0 32,5 20,0 24,0 28,0 32,5 10,5 11,7 13,0 14,5 12,0 16,5 21,0 26,0
α. Ερώτηµα (Κ Μ ενζύµου) Το σηµείο τοµής της καµπύλης του διαγράµµατος Lineweaver-Burkκαιτουάξονα 1/[S], για [Ι]=0, ορίζειτο -1/Κ Μ. ηλαδή, απότοδιάγραµµα, 1/v x 10-3 -1/Κ Μ = -3,6 x 10-1 ή Κ Μ = 1 / 3,6 x 10-1 = 2,77 Μ 30 Χωρίς αναστολέα 20-1/Κ Μ 10 κλίση = Κ Μ / Vmax 1/Vmax -5 5 10 1/[S] x 10-1 -3,6 x 10-1
β. Ερώτηµα ( είδος αναστολής) Από τις καµπύλες των διαγραµµάτων Lineweaver-Burk προκύπτει το είδος της αναστολής. Μη ανταγωνιστική (βενζοϊκά) Μικτή (ιόντα Cu 2+ ) 1/v x 10-3 30 Ανταγωνιστική (βουτυρικός φαινυλεστέρας) Συναγωνιστική (κυστεϊνη) 20 Χωρίς αναστολέα 10 κλίση = Κ Μ / Vmax -1/Κ Μ 1/Vmax -5 5 10 1/[S] x 10-1
γ. Ερώτηµα (Κ Ι βουτυρικούφαινυλεστέρα) Απότοδιάγραµµα, -1/Κ Ρ = -1,2 x 10-1 καικ Ρ = 8,33 Μ. ΑπότησχέσηΚ Ι = Κ Μ [Ι] / Κ Ρ Κ Μ µεαντικατάστασητων τιµώνπροκύπτει: Κ Ι = 2,77 x 0,002 / 8,33 2,77 = 0,99 x 10-3 M 1/v x 10-3 30 Ανταγωνιστική (βουτυρικός φαινυλεστέρας) 20 Χωρίς αναστολέα 10 κλίση = Κ Μ / Vmax -1/Κ Μ -1/Κ Ρ 1/Vmax -5 5 10-1,2 x 10-1 1/[S] x 10-1
Παράδειγµα 2: Το ένζυµο λυάση της ιστιδίνης (ιστιδάση) που ελευθερώνει αµµωνία από την ιστιδίνη κατά την αντίδραση: ιστιδίνη αµµωνία + ουροκανικό οξύ Ν Ν ΝΗ CH2CH(NH2)COOH ΝΗ CH=CHCOOH χρησιµοποιήθηκε για τη µελέτη της κινητικής της αντίδρασης. Έχοντας αρχική συγκέντρωση ιστιδίνης 6,36 mm και υπολογίζοντας το ποσό της ιστιδίνης που παρέµεινε στις διάφορες χρονικές στιγµές από το ποσό της εκλυόµενης αµµωνίας, έστω ότι προέκυψαν τα ακόλουθα πειραµατικά δεδοµένα, απουσία και παρουσία των ακόλουθων πιθανών αναστολέωντηςενζυµικήςαντίδρασης, ισταµίνης (0,01 mm) καικcn (0,01 mm):
Χρόνος t i (hrs) 1,81 2,04 3,05 15,10 17,30 20,32 Χωρίς αναστολέα - 4,76-0,01 - - Παραµένουσα ποσότητα ιστιδίνης (mm) Παρουσία ισταµίνης (0,01mΜ) 5,00 - - - 0,01 - Παρουσία KCN (0,01mΜ) - - 4,86 - - 0,06
Από τις τιµές του προηγούµενου πίνακα: α. Ναυπολογισθούντα K M και Vmaxπαρουσία ισταµίνης και KCN. β. Οιδύοαυτέςενώσεις (ισταµίνηκαι KCN) αναστέλλουν την ενζυµική αντίδραση και αν ναι, τι είδους αναστολή προκαλούν; γ. ΝαυπολογισθείτοΚ Ι τουενζυµικούσυστήµατοςπου περιέχει ισταµίνη (υποθέτοντας ότι προκαλεί µια πλήρως αντιστρεπτή αναστολή).
α. Ερώτηµα (K M και Vmaxενζύµουπαρουσίαισταµίνης, KCN) Γίνεται επεξεργασία των πειραµατικών δεδοµένων για την απεικόνισησεδιάγραµµα ( 2,303 S 0 ψ log ) = f ( ) t S 0 -ψ t Χωρίς αναστολέα: S 0 =6,36 mm ψ 1 = (6,36-4,76)=1,6mΜ S 0 -ψ 1 = 4,76mM t 1 = 2,04 hrs 0,142 0,780 S 0 =6,36 mm ψ 2 = (6,36-0.01)= 6,35mΜ S 0 -ψ 2 = 0,01mM t 2 = 15,1 hrs 0,427 0,420
α. Ερώτηµα (K M και Vmaxενζύµουπαρουσίαισταµίνης, KCN) Γίνεται επεξεργασία των πειραµατικών δεδοµένων για την απεικόνισησεδιάγραµµα ( 2,303 S 0 ψ log ) = f ( ) t S 0 -ψ t Παρουσία ισταµίνης: S 0 =6,36 mm ψ 1 = (6,36-5,0)=1,36 mμ S 0 -ψ 1 = 5,0 mm t 1 = 1,81 hrs 0,133 0,750 S 0 =6,36 mm ψ 2 = (6,36-0.01)= 6,35mΜ S 0 -ψ 2 = 0,01mM t 2 = 17,3 hrs 0,372 0,367
α. Ερώτηµα (K M και Vmaxενζύµουπαρουσίαισταµίνης, KCN) Γίνεται επεξεργασία των πειραµατικών δεδοµένων για την απεικόνισησεδιάγραµµα ( 2,303 S 0 ψ log ) = f ( ) t S 0 -ψ t Παρουσία KCN : S 0 =6,36 mm ψ 1 = (6,36-4,86)=1,5 mμ S 0 -ψ 1 = 4,86 mm t 1 = 3,05 hrs 0,086 0,490 S 0 =6,36 mm ψ 2 = (6,36-0.06)= 6,3mΜ S 0 -ψ 2 = 0,06mM t 2 = 20,32 hrs 0,230 0,310
α. Ερώτηµα (K M και Vmaxενζύµουπαρουσίαισταµίνης, KCN) Από τις καµπύλες του διαγράµµατος ( 2,303 S 0 ψ log ) = f ( ) t S 0 -ψ t προκύπτουν: 2,303 log S 0 t S 0 -ψ ( ) 0,76 0,6 0,5 0,475 Vmax / K M κλ=-1/κ Μ Vmax = 0,96 Mmin -1 και K M = 0,96 / 0,76 = 1,263 mm V P = Vmax = 0,96 Mmin -1 και Κ P = 0,96 / 0,6 = 1,6 mm V P = 0,6 Mmin -1 και Κ P = 0,6 / 0,475 = 1,263 mm K P = K M αφούοικαµπύλες είναι παράλληλες Vmax 0,5 0,6 1,0 0,96 f ψ ( ) t
β. Ερώτηµα ( είδος αναστολής) Από τις καµπύλες του διαγράµµατος προκύπτει το είδος τηςαναστολής: Ισταµίνη, ανταγωνιστική. ΚCN, µη ανταγωνιστική 2,303 log S 0 t S 0 -ψ ( ) 0,76 Vmax / K M 0,6 0,5 κλ=-1/κ Μ 0,475 Vmax = 0,96 Mmin -1 και K M = 0,96 / 0,76 = 1,263 mm V P = Vmax = 0,96 Mmin -1 και Κ P = 0,96 / 0,6 = 1,6 mm V P = 0,6 Mmin -1 και Κ P = 0,6 / 0,475 = 1,263 mm K P = K M αφούοικαµπύλες είναι παράλληλες Vmax 0,5 0,6 1,0 0,96 f ψ ( ) t
γ. Ερώτηµα (Κ Ι ισταµίνης) Απότοδιάγραµµα, Κ Μ = 1,263 mmκαικ P = 1,6 mm ΑπότησχέσηΚ Ι = Κ Μ [Ι] / Κ Ρ Κ Μ µεαντικατάστασητων τιµώνπροκύπτει: Κ Ι = 1,263 x 0,001 / 1,6 1,263 = 0,037 mm 2,303 log S 0 t S 0 -ψ ( ) 0,76 Vmax / K M 0,6 0,5 κλ=-1/κ Μ 0,475 Vmax = 0,96 Mmin -1 και K M = 0,96 / 0,76 = 1,263 mm V P = Vmax = 0,96 Mmin -1 και Κ P = 0,96 / 0,6 = 1,6 mm Vmax 0,5 0,6 1,0 0,96 f ψ ( ) t
Παράδειγµα 3: Κατά τη µελέτη της κινητικής του ενζύµου αφυδρογονάση της 6-φωσφο-γλυκόζης, µε διάφορες τιµές υποστρώµατος 6- φωσφο-γλυκόζης, κατά την αντίδραση 6-φωσφο-γλυκόζη + NADP + + H 2 O 6-φωσφο-γλυκονο-λακτόνη + NADPH + H + CH2 P O CH2 P O =O προέκυψαν τα ακόλουθα πειραµατικά δεδοµένα:
Συγκέντρωση υποστρώµατος (mm) 0,25 0,50 0,56 0,60 0,75 1,00 1,20 1,60 2,00 2,50 3,00 Αρχική ταχύτητα αναγωγής NADP + v = -d[nadp + ]/dt (nmoles/min) 1,00 2,25 6,50 9,40 14,20 18,70 21,40 24,50 27,00 28,80 29.30
Από τις τιµές του προηγούµενου πίνακα: α. Να διερευνηθεί αν το ένζυµο αφυδρογονάση της 6-φωσφο-γλυκόζης είναι αλλοστερικό. β.ανναι, πόσαείναιτακέντρασύνδεσηςτου υποστρώµατος µε το ένζυµο;
α. Ερώτηµα (είναι αλλοστερικό ένζυµο;) Σχεδιάζεταιτοδιάγραµµα v = f (S). v 30 Vmax = 29,5 20 10 1 2 3 [S] Λόγω της σιγµοειδούς µορφής της καµπύλης διαπιστώνεται ότι πρόκειται για αλλοστερικό ένζυµο.
β. Ερώτηµα (πόσα κέντρα σύνδεσης) Γίνεται επεξεργασία των αποτελεσµάτων για να σχεδιασθεί τοδιάγραµµα Hill, δηλαδήηκαµπύλη log v = f (log S) V-v [S] log [S] v v / V-v log v / V-v 0,25-0,602 1,00 0,0350-1,455 0,56-0,251 6,50 0,2826-0,548 0,6-0,221 9,40 0,4676-0,330 0,75-0,124 14,20 0,9281-0,032 1,00 0,000 18,70 1,7314 0,238 1.20 0,079 21,40 2,6419 0,421 1,60 0,204 24,50 4,9000 0,690 2,00 0,301 27,00 10,800 1,033 2,50 0,397 28,80 41,1428 1,614
β. Ερώτηµα (πόσα κέντρα σύνδεσης) Υπολογίζεταιηκλίσητουδιαγράµµατος Hill, n H = 2,9 Επειδήηεξίσωση Hillδενδίνει πάντα τον πραγµατικό αριθµό log v / V-v σηµείων σύνδεσης ενζύµου υποστρώµατος, αλλά κάποιον µικρότερο, δηλαδή n 2 H n max, γι αυτό στην προκειµένη περίπτωση θα θεωρηθεί ότι ο αριθµός των σηµείων 1 σύνδεσης είναι τουλάχιστο 3. 0-1 β α κλ = α / β = 2,9 = n H -2-1 0 1 log [S]