EΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

EΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Πώς αλλάζουν οι κυτταρικές πληροφορίες q Μεταλλάξεις q Φυσικοί Μηχανισµοί Μεταφοράς Γονιδίων Μετασχηµατισµός Μεταγωγή Επισώµατα και Σύζευξη Εσωτερική Mεταφορά Γονιδίων q Γενετική Μηχανική Κυττάρων qτεχνολογία Ανασυνδυασµένου DNA Eργαλεία: (φορείς DNA, ένζυµα) Τεχνικές Κλωνοποίησης Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) q Γενωµική

Μεταλλάξεις Γενότυπος: γενετικό δυναµικό του κυττάρου <Σταθερός> Φαινότυπος: χαρακτηριστικά που εκφράζονται από το κύτταρο («φαίνονται») <Μεταβλητός ανάλογα µε το περιβάλλον>

Μεταλλάξεις Φαινοτυπική αλλαγή (αντιστρεπτή) O 2 O 2 low O 2 Γενοτυπική αλλαγή (µη αντιστρεπτή) O 2

? q Μετάλλαξη σηµείου: αλλαγή µίας βάσης Ø Μεταβολή ενός αµινοξέος πχ στο ενεργό κέντρο µίας πρωτεΐνης ή δηµιουργία κωδικονίου STOP (πχ CAA->UAA) Ø Σιωπηλές µεταλλάξεις: UCU UCA -> σερίνη q Μετάλλαξη εξάλειψης: Ø εξάλειψη µίας βάσης q Μετάλλαξη προσθήκης: Ø Μεταλλάξεις προσθήκη µίας βάσης q Επαναµεταλλάξεις ή ανακάµψεις: Ø Αποκατάσταση γενότυπου και φαινότυπου Ø Αποκατάσταση µόνο του φαινότυπου Πως δημιουργούνται οι μεταλλάξεις και ποιες οι επιπτώσεις τους;

Μεταλλάξεις Προσθήκης UΑA + Εξάλειψης Χ Πόσα είναι τα πλαίσια ανάγνωσης;

Πλαίσια Ανάγνωσης (Open Reading Frames)

Μεταλλαγμένα κύτταρα Σηµασία µεταλλάξεων στη βιοµηχανία Μελέτη φυσιολογίας των κυττάρων Βιοµηχανικά εργαλεία (µεταβολική ρύθµιση υπερπαραγωγή προϊόντων) Φυσικές µεταλλάξεις: τυπικά 10-6 µεταλλάξεις/γονίδιο Χηµικές µεταλλάξεις: µεταλλαξογόνοι παράγοντες, ακτινοβολία UV Επιλέξιµες (επιβίωση µεταλλαγµένου) και µη επιλέξιµες µεταλλάξεις (ανάγκη επιλογής) o o άµεση επιλογή (πχ αντιβιοτικά) και έµµεση επιλογή (πχ αυξοτροφικές µεταλλάξεις) Εξαρτηµένες µεταλλάξεις (πχ θανατηφόρες)

Έμμεση επιλογή με χρήση διατροφικών μεταλλαγμάτων

Γενετικός ανασυνδυασμός Δημιουργία νέων γενοτύπων από δύο διαφορετικά γονιδιώματα

Βασικά βήµατα γενετικού ανασυνδυασµού Eισαγωγή DNA δότη σε κύτταρο δέκτη

Μηχανισμοί Γενετικός ανασυνδυασμός Μετασχηματισμός: Παραλαβή ελεύθερου DNA από ένα κύτταρο Μεταγωγή: Μεταφορά ελεύθερου DNA από βακτηριοφάγο Σύζευξη: Μεταφορά DNA μεταξύ άθικτων κυττάρων με άμεση επαφή Εσωτερική μεταφορά γονιδίων: Μετακίνηση ενός ή περισσότερων γονιδίων (τρανσποζόνια) από ένα σημείο του DNA σε άλλο.

Μετασχηµατισµός Πλασµίδια: «οχήµατα µεταφοράς» γονιδίων στα κύτταρα του δέκτη (φορείς κλωνοποίησης) Χαρακτηριστικά: Κυκλικά µόρια DNA Μικρό µέγεθος Δυνατότητα αντιγραφής στο κύτταρο-δέκτη Ανάγκη δηµιουργίας «επιδεκτικών» κυττάρων πχ επεξεργασία κυττάρων E. coli µε Ca + Συχνότητα 1:10 6, αύξηση µε χρήση δεικτών

Ιδιότητες φορέων DNA Αντιγράφεται στο βακτήριο Το εισερχόμενο DNA θα είναι σταθερό Συνήθως εξω-χρωμοσωμικό Εύκολη η επιλογή του βακτηρίου που περιέχει το φορέα (αντίσταση στα αντιβιοτικά) Φορείς Πλασμίδια (εξω-χρωμοσωμικό κυκλικό DNA) Βακτηριοφάγοι Κοσμίδια

Ιδιότητες φορέων DNA

Τοποθέτηση του ανασυνδυασµένου DNA στο κύτταρο του δέκτη Εισαγωγή πλασµιδίου στα κύτταρα του φορέα Μετασχηµατισµός HEAT SHOCK 42 O C, 45 sec

Συνθήκες πχ για Pichia pastoris 2000 Volt, 4 ms Ηλεκτροδιάτρηση

Μεταγωγή Βακτηριοφάγοι (ιοί): Ενσωμάτωση του DNA των φάγων από το κύτταρο δέκτη. Είδη μεταγωγής: Ø Γενικευμένη μεταγωγή: Κατάτμηση του βακτηριακού DNA. Τυχαία ενσωμάτωση τμήματος DNA στον φάγο. Συνδυασμός του DNA φάγου με το DNA του κυττάρου δέκτη (βακτηρίου). Ø Εξειδικευμένη μεταγωγή: Ενσωμάτωση συγκεκριμένων τμημάτων DNA στον φάγο (π.χ. φάγος λ).

Σύζευξη (Oριζόντια µεταφορά γονιδίων) Επίσωμα: Μόριο DNA που είτε είναι ενσωματωμένο στο DNA του κυττάρου δέκτη είτε χωρισμένο από αυτό (πλασμίδιο). Μεταφορά επισώματος από κύτταρο δότη στο κύτταρο δέκτη: άμεση επαφή.

Εσωτερική µεταφορά γονιδίων Τρανσποζόνιο: Γονίδιο που έχει τη δυνατότητα να μετακινηθεί από ένα τμήμα DNA σε άλλο (εσωτερικά, στο ίδιο κύτταρο). ΔΕΝ υπάρχει ομολογία με τη νέα θέση. Μπορεί να κωδικεύουν ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά -> επιπτώσεις στην υγεία! Δημιουργία μεταλλάξεων.

Η τεχνολογία που συνεπάγεται όλες τις διεργασίες που μεταβάλλουν το γενετικό υλικό ενός κυττάρου για να το κάνει ικανό να εκτελέσει τις επιθυμητές λειτουργίες, όπως πχ την παραγωγή καινοτόμων ουσιών.

Tεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Aπομόνωση DNA (PCR, περιοριστικές ενδονουκλεάσες) Συνένωση DNA οργανισμού με DNA ενός φορέα π.χ. ενός πλασμιδίου (DNA λιγάση) -> ανασυνδυασμένα πλασμίδια Εισαγωγή πλασμιδίων (ανασυνδυασμένων ή μη) σε ένα ξενιστή (π.χ. βακτήριο, ζύμη) Επιλογή ξενιστών που περιέχουν ανασυνδυασμένα πλασμίδια (π.χ. αντοχή σε αντιβιοτικό) Έκφραση του γονιδίου και παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης

Στρατηγική

Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Νουκλεάσες: αποικοδοµούν το DNA Λιγάσες: ενώνουν τµήµατα DNA Πολυµεράσες: αντιγράφουν µόρια DNA Τροποποιητικά ένζυµα: προσθέτουν ή αφαιρούν χηµικές οµάδες (πχ φωσφατάσες, κινάσες) Τοποϊσοµεράσες

Ένζυμα που χρησιμοποιούνται στην τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA

Νουκλεάσες Εξω-νουκλεάσες: διασπούν φωσφοδιεστερικούς δεσµούς στα άκρα της αλυσίδας DNA. Ενδο-νουκλεάσες: διασπούν φωσφοδιεστερικούς δεσµούς σε εσωτερικά σηµεία της αλυσίδας DNA.

Νουκλεάσες

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Τα ένζυμα που κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες Ανακαλύφθηκαν στις αρχές του 1950 Παράγοντας προστασίας των βακτηρίων κατά των βακτηριοφάγων Ελεγχόμενη υδρόλυση νουκλεοτιδίων Κυρίως βακτηριακής προέλευσης Πάνω από 1200 χαρακτηρισμένες

Ενδονουκλεάσες περιορισμού Τρεις τύποι με τον τύπο II σημαντικό για τη Γενετική Μηχανική λόγο εξειδίκευσης υποστρώματος Στόχευση κυρίως παλινδρομικών αλληλουχιών Αναγνωρίζουν ακολουθίες 4, 6 ή 8 νουκλεοτιδίων

Ενδονουκλεάσες περιορισμού Τυφλά άκρα (blunt ends)

Ενδονουκλεάσες περιορισμού Κολλώδη άκρα (sticky ends)

Ενδονουκλεάσες περιορισμού Ονομασία βάση του μικροοργανισμού π.χ. EcoRI = Escherichia (E) coli (co) στέλεχος R (R). Το I αναφέρεται στο 1 ο ένζυμο που απομονώθηκε από το μικροοργανισμό Γιατί τα βακτηριακά αυτά ένζυμα δεν αποικοδομούν το δικό τους DNA? Τα βακτήρια παράγουν τις αντίστοιχες μεθυλάσες τουdna οι οποίες αναγνωρίζουν τις ίδιες ακολουθίες νουκλεοτιδίων όπως τα ένζυμα περιορισμού. Οι μεθυλάσες στοχεύουν την ακολουθία DNA κάνοντάς τη ανθεκτική στα ένζυμα περιορισμού

Ενδονουκλεάσες περιορισμού και μεθυλάσες του DNA Ξένο DNA GAATTC CTTAAG EcoRI G AATTC CTTAA G DNA Ξενιστή GAATTC CTTAAG CH 3 GAATTC CTTAAG DNA μεθυλάση CH 3 EcoRI CH 3 GAATTC CTTAAG CH 3

Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή Μέθοδος διαχωρισμού κλασμάτων DNA

CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Λιγάσες Διορθώνουν ασυνέχειες σε αλληλουχίες DNA Ενώνουν δύο μόρια DNA

DNA-Πολυµεράσες Συνθέτουν ένα νέο κλώνο DNA ομόλογο μίας υπάρχουσας μήτρας DNA. Εκκινητής (primer): έναρξη πολυμερισμού. Βασική δράση: σύνθεση 5 3 Διορθωτική δράση: 3 5 (εξωνουκλεάση Proofreading) Ποια η διαφορά με τις λιγάσες στην ενέργεια;

Η DNA πολυμεράση ελέγχει την πιστότητα της αντιγραφής Proofreading «διόρθωση δοκιμίων» Συχνότητα λαθών: 1:10 7 βάσεις

Δοµή DNA-Πολυµεράσης Ενεργό Κέντρο Πολυμερισμού Ενεργό Κέντρο Εξωνουκλεάσης DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms (1999) The Journal of Biological Chemistry, 274, 17395-17398.

Proofreading Polymerases

Αποκοπή της μονάδας εξωνουκλεάσης 3 ->5 με πρωτεάσες

Λήψη επιθυµητού γονιδίου από τον δότη q q q q Κλωνοποίηση τυφλής στόχευσης: τυχαίος τεµαχισµός DNA. Εντοπισµός µε χρήση ιχνηθέτηαπαιτείται µερική γνώση της αλληλουχίας του επιθυµητού γονιδίου Oλοκληρωτική χηµική σύνθεση γονιδίου: τεχνητό γονίδιο: απαιτείται η γνώση της σειράς των αµινοξέων της επιθυµητής πρωτεΐνης Ενίσχυση γονιδίου από γενωµικό DNA: χρήση τεχνικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) Αποµόνωση m-rnα: αποµόνωση m-rna από το δότη-σύνθεση µορίου DNA που αντιστοιχεί στο επιθυµητό γονίδιο (αντίστροφη µεταγραφάση)

Τι πρέπει να προσέξουμε για τη λήψη του επιθυμητού γονιδίου μέσω mrna; Πότε είναι αναγκαία η χρήση της 2 ης μεθόδου;

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Ενισχύει DNA δεδομένων αλληλουχιών Διάγνωση l Εντοπισμός της παρουσίας κάποιου γονιδίου l Εντοπισμός της παρουσίας κάποιας μετάλλαξης l Εντοπισμός γονιδιακής έκφρασης Ενισχύει DNA από αρχαία ή σπάνια δείγματα για αναλύσεις Μας δίνει τη δυνατότητα να μεταβάλλουμε την αλληλουχία του DNA Kary B. Mullis βραβείο Nobel Χημείας 1993

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Ενίσχυση του DNA χρησιμοποιώντας τα παρακάτω: l Θερμοσταθερή DNA πολυμεράση π.χ πολυμεράση Taq απομονωμένη από Thermus aquaticus l DNA στόχος l Νουκλεοτίδια l Εκκινητές Ορίζουν την περιοχή του DNA που ενισχύεται l Συσκευή (Thermocycler, μεταβάλει γρήγορα τη θερμοκρασία της αντίδρασης)

Αρχές της PCR 1 ος κύκλος 5 3 Περιοχή του DNA για ενίσχυση 94 C 3 5 3 5 Heat Cool to to 72 C 5 55 C 3

2 ος κύκλος 55 C 94 C 72 C

3 ος κύκλος 94 C 72 C 55 C 2 2

Προϊόντα κατά τη διάρκεια της PCR 3ος 4ος 5ος 6ος 2 3 4 5 2 3 4 5 2 8 22 52 1 1 1 1 1 1 1 1 Η ενίσχυση είναι εκθετική αφού τα σχηματιζόμενα μετάγραφα δρουν ως νέα εκμαγεία. Οι αντιδράσεις PCRs συνήθως τρέχουν για 30 κύκλους όπου παράγονται περίπου 2 28 μόρια ή 268.435.456. Το αρχικό ποσό του DNA εκμαγείου μπορεί να είναι ελάχιστα χιλιάδες μόρια (femto moles). Μία από τις πιο ευαίσθητες αντιδράσεις στη Μοριακή Βιολογιά.

Αλυσιδωτή αντίδραση DNA πολυµεράσης PCR

Θερµόφιλες DNA πολυµεράσες Απομονώνονται από βακτήρια θερμών πηγών Η Taq χρησιμοποιείται για αναλυτικούς κυρίως σκοπούς (μεγάλη συχνότητα λαθών, αδενίνη στα άκρα αλλά φθηνή)

Θερµόφιλες DNA πολυµεράσες

Κλωνοποίηση του cdna cdna: συμπληρωματικό ή αντίγραφο DNA Προέρχεται από το mrna Διπλής έλικας DNA με τον ένα κλώνο του ίδιας αλληλουχίας με το mrna Γιατί να κλωνοποιούμε cdna; Απαραίτητο για την έκφραση ευκαρυωτικών πρωτεϊνών σε βακτήρια Τα ιντρόνια ΔΕΝ απομακρύνονται στα βακτήρια Οπότε δεν παράγεται πρωτεΐνη

Ευκαρυωτικός οργανισμός Βακτήρια Ιντρόνιο Ιντρόνιο Splicing Μεταγραφή RNA mrna Μετάφραση Μετάφραση Λειτουργική πρωτεΐνη Μη λειτουργική πρωτεΐνη

Βακτήρια cdna Μεταγραφή mrna Μετάφραση Μη λειτουργική όταν είναι αναγκαίες µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις (πχ Ν- γλυκοζυλίωση) Λειτουργική πρωτεΐνη

Κλωνοποίηση ενισχυμένων DNA με PCR Ενίσχυση μίας περιοχής DNA αλλά υπάρχει η ανάγκη για τη κλωνοποίηση σε έναν φορέα Τι χρειαζόμαστε στα άκρα; - Περιοχές ενζύμων περιορισμού Πως τις δημιουργούμε; - Ενσωμάτωση περιοχών περιορισμού στους εκκινητές

Εκκινητές PCR για κλωνοποιήσεις Εκκινητής 1 Περιοχή ενδονουκλεάσης περιορισμού Συμπληρωματική περιοχή για τη στόχευση περιοχής του DNA Εκκινητής 2 Περιοχή ενδονουκλεάσης περιορισμού Συμπληρωματική περιοχή για τη στόχευση περιοχής του DNA

Εκκινητές PCR για κλωνοποιήσεις Περιοχή για ενίσχυση 30 κύκλοι PCR Το ενισχυμένο DNA περιέχει περιοχές περιορισμού

Εκκινητές PCR για ανάλυση Περιοχή για ενίσχυση 30 κύκλοι PCR Το ενισχυμένο DNA δεν περιέχει περιοχές περιορισμού

Ανασυνδυασµός DNA δότη και φορέα Τι χρειαζόµαστε Πλασµίδια: «οχήµατα µεταφοράς» γονιδίων στα κύτταρα του δέκτη (φορείς κλωνοποίησης) Περιοριστικές ενδονουκλεάσες: τέμνουν το DNA του φορέα σε συγκεκριμένες θέσεις- Κολλώδη άκρα. Λιγάσες: Ενώνουν τα συμπληρωματικά κολλώδη άκρα.

Πλασμιδιακό DNA

Ένζυμο περιορισμού EcoRI

Ένθεμα DNA

Ένζυμο περιορισμού EcoRI Ένθεμα DNA

Λιγάση

Ανασυνδυασµός DNA δότη και φορέα

Ανασυνδυασµός DNA δότη και φορέα Κατευθυνόμενη ή μη κλωνοποίηση