Μερικά χαρακτηριστικά του ενεργού κέντρου των ενζύμων Το ενεργό κέντρο καταλαμβάνει σχετικά μικρό τμήμα του ολικού όγκου του ενζύμου Το ενεργό κέντρο είναι μια τρισδιάστατη ολότητα Η ειδικότητα δέσμευσης εξαρτάται από την ακριβώς καθορισμένη διευθέτηση των ατόμων στο ενεργό κέντρο Το υπόστρωμα δεσμεύεται στο ένζυμο με σχετικά ασθενείς δυνάμεις Τα ενεργά κέντρα είναι ρωγμές ή ρήγματα
Ομάδες που απαντούν στο ενεργό κέντρο: Ιστιδίνη φέρει μια ομάδα ιμιδαζόλης. Η ομάδα αυτή παιρνει ένα πρωτόνιο και μετατρέπεται σε ιόν ιμιδαζολίου με pk 6-7, πράγμα που σημαίνει ότι σε ουδέτερο ph παίρνει ή δίνει ηλεκτρόνια εύκολα. Καρβοξυλικά ιόντα γλουταμινικού και ασπαρτικού χρησιμεύουν σαν αποδέκτες πρωτονίων SH ομάδες της κυστεΐνης έχουν ασθενείς όξινες ιδιότητες pk 8-8,5. Είναι ισχυρά νουκλεόφιλες και γι αυτό παίζουν σημαντικό ρόλο. Οι ομάδες αυτές είναι εκείνες οι οποίες μπλοκάρονται εύκολα από αναστολείς. Αργινίνη έχει μια ισχυρή βασική γουανιδινομάδα. Χρησιμεύει σε πολλά ένζυμα για να δεσμεύει αρνητικά φορτισμένες ομάδες. Σερίνη φέρει μια ομάδα ΟΗ που επίσης μπορεί να συμμετέχει στην ομοιοπολική κατάλυση ή και στη δημιουργία υδρογονοδεσμών
Η σχέση μεταξύ της ενζυμικής ενεργότητας και του ph σε ένα ένζυμο εξαρτάται: Από το pk των ιονιζόμενων ομάδων του ενεργού κέντρου του ενζύμου οι οποίες συμμετέχουν στη δέσμευση στο υπόστρωμα. Από το pk των λειτουργικών ομάδων του μορίου του υποστρώματος τα οποία συμμετέχουν στη δέσμευση του ενζύμου. Από το pk των λειτουργικών ομάδων των ενζυμικών μορίων που είναι υπεύθυνα για την καταλυτική δράση. Από το pk των άλλων ομάδων των ενζυμικών μορίων των οποίων η κατάσταση ιονισμού μπορεί να προσδιορίσει την καταλυτικά ενεργό στερεοδομή του μορίου.
Ποσοτικός Έλεγχος Ενζυμικής Ενεργότητας Η ποσότητα ενζύμου σε ένα διάλυμα ή εκχύλισμα ιστού μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά από τα προϊόντα κατάλυσης, αρκεί να γνωρίζουμε: Τη στοιχειομετρία της αντίδρασης που καταλύεται Εάν το ένζυμο απαιτεί την πρόσδεση άλλων παραγόντων όπως μεταλλικά ιόντα, συνένζυμα κ.λπ. Την εξάρτηση από τις συγκεντρώσεις του υποστρώματος και συμπαραγόντων π.χ. Κm του ενζύμου Το άριστο ph Την περιοχή της θερμοκρασίας που το ένζυμο είναι σταθερό και έχει υψηλή ενεργότητα Μια απλή αναλυτική πορεία με την οποία να μπορούμε να προσδιορίσουμε την εξαφάνιση του υποστρώματος ή την εμφάνιση των προϊόντων της αντίδρασης Catal μετατρέπει 1 mol υποστρώματος στο δευτερόλεπτο Unit μετατρέπει 1μmol υποστρώματος στο λεπτό
Οι χημικές αντιδράσεις ταξινομούνται ανάλογα με την τάξη αντίδρασης σε: Αντίδραση μηδενικής τάξης Αντίδραση πρώτης τάξης Αντίδραση δευτέρας τάξης Αντίδραση τρίτης τάξης Η διάκριση γίνεται ανάλογα με το πώς επηρεάζεται η ταχύτητα αντιδράσεως από τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων
Αντίδραση πρώτης τάξης: Η ταχύτητα είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση του ενός από τα αντιδρώντα. Α Ρ dc dt K c Όπου C=C o -ekt Η ολοκληρωμένη μορφή είναι: log C o C kt 2.303 C o : Συγκέντρωση στο χρόνο μηδέν C: Συγκέντρωση στο χρόνο t Στις αντιδράσεις πρώτης τάξης ο χρόνος ημιζωής t 1/2 =0.693/k
Αντίδραση δεύτερης τάξης: Η ταχύτητα είναι ανάλογη προς το γινόμενο των συγκεντρώσεων των δύο αντιδρώντων Α + Β Ρ Η ταχύτητα της αντιδράσεως που μπορεί να συμβολισθεί da db ή + dp dt dt dt Είναι ανάλογη προς το γινόμενο των συγκεντρώσεων Α Β d[a] K.[A][B] dt
Η ολοκληρωμένη μορφή που δίδεται είναι: t = 2.303 K.[(A o )-(B o )] log [B o ] [A] [A o ] [B] Αντίδραση όπου Β<<Α συμπεριφέρεται σαν αντίδραση πρώτης τάξης και είναι οι λεγόμενες ψευδείς αντιδράσεις πρώτης τάξεως.
Η ταχύτητα της αντίδρασης είναι ανάλογη προς το γινόμενο των τριών συγκεντρώσεων K 1 K 3 Ε + S ES E + P K 2 Στην κατάσταση steady state η ταχύτητα σχηματισμού ES ισούται με την ταχύτητα διάσπασης
Έννοιες που θα βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση της κινητικής ανάλυσης Αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι η ταχύτητα που μπορεί να μετρηθεί το νωρίτερο δυνατό μετά την ανάμειξη των αντιδρώντων. Χρησιμοποιείται για όλους τους ενζυμικούς ελέγχους και όλους τους υπολογισμούς που αναφέρονται στην ενζυμική κινητική. Μέγιστη ταχύτητα της ενζυμικής αντιδράσεως είναι η μέγιστη αρχική ταχύτητα, η οποία θεωρητικά μπορεί να επιτευχθεί με μια δεδομένη συγκέντρωση ενζύμου όταν χρησιμοποιείται πάρα πολύ συγκέντρωση υποστρώματος.
Ταχύτητα σχηματισμού = Κ 1 (Ε)(S) Ταχύτητα διάσπασης = Κ 2 (ES) + K 3 (ES) ES (K 2 + K 3 ) = K 1 (E) (S) (ES) K 1 (S) και αντιστρέφοντας: (E) Κ 2 + Κ 3 (ES) Κ 1 (S) Κ m = (E) K 2 + K 3 K 2 + K 3 K 1 (E) (ES) K m (S) (E) T =(E) + (ES) ή (E) = (E) T (ES)
(E) (ES) (E) T (ES) (ES) (E) T (ES) (ES) (E) T (ES) (ES) (ES) (E) T (ES) - 1 (E) (ES) (E) T (ES) - 1 ή (E) T -1 (ES) K m S ή (E) T (ES) K m S +1
V max (E) T v (ES) Άρα ο λόγος V max / v μπορεί να αντικαταστήσει το λόγο (Ε) Τ / (ES) V max v K m S +1 V max v K m + (S) (S) v V max (S) K m + (S) ή v= V max (S) K m + (S)
Αριθμός ανακύκλωσης ενός ενζύμου Κ cat ορίζεται ως ο μέγιστος αριθμός των μορίων του υποστρώματος τα οποία μετατρέπονται σε προϊόντα το κάθε δευτερόλεπτο ανά μόριο ενζύμου ή ανά ενεργό κέντρο. Κ cat είναι μέτρο για το πόσο γρήγορα ένα ένζυμο μπορεί να λειτουργήσει όταν το ενεργό κέντρο του ενζύμου είναι συμπληρωμένο. Κ cat = V max / E T
Τα ένζυμα υπό φυσιολογικές συνθήκες λειτουργούν όταν το υπόστρωμα βρίσκεται σε αναλογία 0,001 έως 1 με το K m v= V max (S) K m και αντικαθιστώντας έχουμε: v= Κ cat (S) K m Εικόνα 9.21 Η αναλογία Κ cat / K m είναι ένα μέτρο για το πόσο γρήγορα μπορεί να εργάζεται ένα ένζυμο σε χαμηλές συγκεντρώσεις (S).
Απο την διερευνηση της Εξίσωσης Michaelis Menten προκύπτουν τα εξής συμπεράσματα Οταν S > Km το υπόστρωμα βρίσκεται σε πολύ μεγάλη συγκέντρωση σε σχεση με το Κm το Κm μπορεί να παραλεφθεί οπότε η ταχυτητα V είναι σταθερη και ιση με την Vmax Οταν S< Km το υπόστρωμα ειναι πολύ μικρό συγκρινόμενο με το Km τότε το S μπορεί να παραλειφθεί από τον παρανομαστή.υπό αυτάς τας συνθήκας η ταχύτητα v είναι ανάλογος πρός την συγκεντρωση του υποστρώματος παρατηρείται δηλαδή κινητικής πρωτης ταξεως Οταν S=Κm τότε v= Vmax/2
Από τον ορισμό του Κ m μπορεί να οδηγηθεί κανείς στα παρακάτω συμπεράσματα: Όταν το Κ 2 >Κ 3 τότε το σύμπλεγμα ES διασπάται σε (Ε) και (S) πολύ γρηγορότερα από ότι διασπάται σε (Ε) και (Ρ) οπότε η σχέση διαμορφώνεται Κ m = Κ 2 /Κ 1 Στη συγκεκριμένη περίπτωση, η Κ m ταυτίζεται με το Κ s και αποτελεί δείκτη για το πόσο ισχυρά είναι δεσμευμένο το ένζυμο στο υπόστρωμα Υψηλό Κ m ==> χαλαρή δέσμευση Χαμηλό Κ m ==> ισχυρή δέσμευση
Η σταθερά Κm εχει δύο σημασίες Αντιστοιχεί στην συγκέντρωση εκείνη του υποστρώματος στη οποία τα μισά από τα ενεργά κέντρα του ενζύμου είναι συμπληρωμένα Το Km συνδέεται με τις σταθερές διαστάσεων που εμπλέκονται στα σταδια της κατάλυσης την Κ1 Κ2 και Κ3
Οι τιμές των Κm ποικίλουν σε αρκετή κλίμακα και κυμαίνονται από 10-1 Μ μεχρι 10-6 Μ Η τιμή του Km για ένα ένζυμο εξαρτάται από την φύση του υποστρώματος αλλά και από περιβαλλοντικές συνθήκες όπως είναι η θερμοκρασία και το ιονικό δυναμικό
Η μελέτη των αναστολέων των ενζύμων παρουσιάζει ιδιαίτερη σημασία για τη Βιοχημεία μια και μπορούν να δώσουν ιδιαίτερα σημαντικές πληροφορίες για μια σειρά παραμέτρους όπως: Ειδικότητα των ενζύμων ως προς το υπόστρωμα Φύση των λειτουργικών ομάδων του ενεργού κέντρου Το μηχανισμό δράσης του ενζύμου Τη διερεύνηση της εμπλοκής των λειτουργικών ομάδων στη διατήρηση της στερεοδομής του ενζυμικού μορίου Στη διερεύνηση του μεταβολισμού
Οι αναστολές των ενζύμων διακρίνονται σε δύο τύπους: α) Αναστρεπτή β) Μη αναστρεπτή Μη αναστρεπτή: Συνήθως γίνεται καταστροφή του μορίου ή τροποποίηση μιας ή περισσότερων λειτουργικών ομάδων του ενζυμικού μορίου. Παράδειγμα η δράση των δηλητηριωδών νευρικών αερίων στην ακετυλχολινεστεράση Αναστρεπτή αναστολή: Έχουμε ανάταξη της ενζυμικής ενεργότητα όταν ο παράγοντας που προκαλεί την αναστολή εξουδετερωθεί. Διακρίνουμε δυο τύπους: τη συναγωνιστική και τη μη συναγωνιστική.