ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟY ΠΑΤΡΩΝ ΕΝΖΥΜΟΛΟΓΙΑ Ενότητα στ Κινητική 2 και Αναστολή ΑΛΕΞΙΟΣ ΒΛΑΜΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ
Επίδραση της θερμοκρασίας στην ταχύτητα της αντίδρασης
Επίδραση της θερμοκρασίας στην ταχύτητα αντιδράσεως
Η θερμοκρασία επηρεάζει: Τη στερεοδομή και σταθερότητα του ενζύμου Την ταχύτητα δημιουργίας προϊόντος (k 3 ) από το σύμπλοκο ES Τη συγγένεια υποστρώματος και ενζύμου (k 1 και k 2 ) Τη συγγένεια αδρανοποιητών και ενεργοποιητών και ενζύμου Τη διαλυτότητα των αντιδρόντων συστατικών Την ταχύτητα διαχύσεως Τη διηλεκτρική σταθερά/ιοντική ισχύ Τη διάσταση ομάδων ενεργούς περιοχής και υποστρωμάτων
E S 1 k 2 k ES k3 E P k E 3 ax 0 E ax 0 Ae Ea RT k cat A e Ea RT Α: σταθερά του Arrhenius k cat : σταθερά ταχύτητος αντιδράσεως (s -1 ) E a : ενέργεια ενεργοποιήσεως (kj/ol) (E ή ΔG) R: σταθερά αερίων (J//ol) T : απόλυτη θερμοκρασία ()
Εφαρμογή: υπολογισμός Ε α k cat A e Ea RT k 3 ln E k ax 0 cat ln A Ea RT ln ax ln A Ea E 0 RT Για 2 διαφορετικές θερμοκρασίες Τ 1, Τ 2 έχουμε: ln ax 2 Ea 1 1 ax 1 R T 2 T 1
Επίδραση του ph στην ταχύτητα της αντίδρασης
Ο παράγων ph επηρεάζει To βαθμό ιονισμού αμινοξικών καταλοίπων του ενεργού κέντρου αμινοξικών καταλοίπων που επηρεάζουν τη δέσμευση υποστρώματος αμινοξικών καταλοίπων που επηρεάζουν τη συνολική δομή τη δομή του υποστρώματος (όταν επηρεάζεται) Βέλτιστο ph: το ph με μέγιστη ταχύτητα αντιδράσεως
Επίδραση του χρόνου στην ταχύτητα της αντίδρασης
Δεν αναφερόμαστε στην αρχική ταχύτητα u 0 Αν υποθέσουμε ότι το υπόστρωμα μειώνεται από μια αρχική συγκέντρωση [S 0 ] κατά ποσότητα ψ μετά από χρόνο t, τότε το εναπομείνον υπόστρωμα θα είναι [S 0 - ψ] Αν η ελλάτωση της ταχύτητας οφείλεται μόνο στον ελαττωμένο κορεσμό του υποστρώματος τότε η ταχύτητα ανά πάσα στιγμή δίνεται από την εξίσωση u 0 S ax S u d dt ax S 0 S 0 ax dt S 0 S 0 d
d S S dt 0 0 0 ax 0 ax ln S S 0 t t S S t 1 log,303 2 ax 0 0 Γενικευμένη εξίσωση Michaelis-Menten
ax Για διάφορες τιμές μείωσης υποστρώματος ψ μετά από χρόνο t Κλίση= 1 μπορούμε να βρούμε και ax ax t 2,303 S 0 ax t log S 0 1 t
6. Αναστολή ενζυμικής αντιδράσεως
Αναστολέας (Ι): ένωση που μειώνει την ταχύτητα ενζυμικής αντίδρασης Το φαινόμενο: αναστολή Εξήγηση φαινομένου: Ο αναστολέας επιφέρει αλλαγές στις σταθερές εξειδικεύσεως (k Α = k cat / ) και την καταλυτική σταθερά (k 3 ή k cat ) Διαμορφώνονται νέες τιμές k cat, k Α, σε σχέση με τη συγκέντρωση του αναστολέα Τύποι αναστολής Αναστρέψιμη και μη αναστρέψιμη Αναστρέψιμη: Συναγωνιστική (k Α ), ανταγωνιστική (k cat ), μικτή (k cat και k Α )
Παρουσία αναστολέα, οι κλασσικές σταθερές παίρνουν νέες τιμές τις φαινομενικές τιμές (app), πχ: η k A γίνεται k A app, η γίνεται app, η ax γίνεται ax app
6.1 Συναγωνιστική αναστολή
Συναγωνιστική αναστολή (k Α ) I + E S 1 k 2 k ES k3 E P EI ic Ο αναστολέας I και το υπόστρωμα S συναγωνίζονται για την ίδια θέση δέσμευσης στο Ένζυμο Ε ic : σταθερά αναστολής
Συναγωνιστική αναστολή (k Α )
ic EI EI E ES EI Eo E E 0 ES I 1 ic ES S u k 3 E 0 ES S I 1 ic ES ES u S k 3 k 2 k 1 k E0 1 3 S I ic
u S k 3 E0 1 S I k 3 E0 ax Η ax αναλλοίωτη ic u S u ax S S I 1 ax ic S Αύξηση της φαινομενικής σταθεράς Michaelis ( app ) στήν τιμή Έχουμε αλλαγές στην σταθερά εξειδικεύσεως k A k 3 1 I ic
a 1 I ic
6.2 Ανταγωνιστική αναστολή
Ανταγωνιστική αναστολή (k cat ) I E S 1 k 2 k + ES k3 E P iu ESI Ο αναστολέας δεσμεύεται μόνο στο ένζυμο που έχει δεσμευτεί το υπόστρωμα και όχι στο ελεύθερο ένζυμο
Ανταγωνιστική αναστολή
iu I [ ] ESI ES E E 0 ES I 1 iu E ES ESI Eo 8elei douleia
u ax S S I 1 iu S ax S I 1 iu 1 I iu u ax S S Η ax γίνεται 1 ax I iu app ax ax Έχουμε λοιπόν αλλαγή του k cat k cat k app 3 ax 1 I E 0 E0 iu
Η φαινομενική σταθερά Michaelis ( app ) γίνεται: app 1 I Άρα δεν έχουμε αλλαγές στην σταθερά εξειδικεύσεως k Α iu k app 3 1 E Συναγωνιστική app 1 ax I iu 0 I ic k app k app 3 A app
Η ax app γίνεται 1 ax I iu app 1 I iu
Η ax app γίνεται 1 ax I iu app 1 I iu
6.3 Mικτή αναστολή
Mικτή αναστολή (k cat και k Α ) I I + E S 1 k 2 k + ES k3 E P EI ic ESI iu Είναι συνδιασμός συναγωνιστικής και ανταγωνιστικής αναστολής
Prevents S fro binding, so increases, no effect on ax Decreases and reduces ax by sae factor so slope of 1/o vs. 1/[S] doesn t change binds only to ES coplex (no effect on S binding) reduces ax (reduces kcat)
u 1 3 I k ic E 0 S S 1 I iu 1 1 I I iu iu u S k 3 1 E 0 I iu 1 1 S I I iu ic u ax S S
app ax k 3 1 E 0 I iu 1 ax I iu ax app 1 1 I I iu ic ic iu 1 u ax 1 S 1 ax
Mικτή αναστολή ic iu app app 1 1 I I iu ic ic iu app
6.3.1 Μη συναγωνιστική αναστολή: υποπερίπτωση της μικτής αναστολής με Κ ic = iu
Μη συναγωνιστική αναστολή: Είναι υποπερίπτωση της μικτής αναστολής όπου Κ ic = iu u 1 u 3 I k ic 1 E 0 S I S in ax 1 S S I iu Κ ic = iu u 1 S ax I S in ax S S
app ax 1 ax I in
6.3.2 Αναστολή από το υπόστρωμα: Υποπερίπτωση της μικτής αναστολής με υψηλή [S]
Αναστολή από το υπόστρωμα S + E S 1 k 2 k ES k3 E P is is u S ES SES ax S S SES u ax S S S 1 is
u ax S S S 1 is Σε χαμηλές [S] δεν υπάρχει αναστολή Σε υψηλές η [S], η Κ καθίσταται αμελητέα οπότε έχουμε u 1 ax S is Συμεπώς η u ελλατώνεται καθώς αυξάνεται η [S]
u 1 ax S is
Αναστολή από το υπόστρωμα Ομοτροπική θετική συνεργασιμότητα http://hwaint.jbc.org/cgi/content/full/282/43/31517
6.3.3 Αναστολή από το προϊόν: Υποπερίπτωση της μικτής αναστολής
Αναστολή από το προϊόν P E S 1 k 2 k ES k3 + E P EP ip u S ax S P 1 ip u S ax S Δεν αποτελεί πρόβλημα όταν εξετάζεται η αρχική ταχύτητα Ενδέχεται να αποτελεί πρόβλημα σε ευρείες βιομηχανικές ενζυμικές εφαρμογές
Συνήθως σε αλυσίδα αντιδράσεων με διαδοχικά υποστρώματα (πολυενζυμικές αντιδράσεις) e A e B e C Αναστολή e D e F A B C D E F
6.4 Μη αναστρέψιμη αναστολή
Οι μή αντιστρεπτοί αναστολείς δεσμεύονται εκλεκτικά στο ενεργό κέντρο Στοχοποιημένη δράση και όχι γενική τροποποίηση του ενζύμου E I 1 k 2 k E I k3 E I Παρεμποδίζουν τη δέσμευση του υποστρώματος Τροποποιούν ανεπανόρθωτα (ομοιοπολικός δεσμός) κάποιο κρίσιμο αμινοξικό κατάλοιπο Το αποτέλεσμα στην κινητική του ενζύμου μοιάζει με εκείνο ενός μη συναγωνιστικού αναστολέα Παρουσία υποστρώματος, η παραμένει αμετάβλητη διότι το αδρανοποιημένο ένζυμο (ΕΙ, ΕSΙ, E I) δεν αντιδρά
Μη αναστρέψιμη αναστολή χυμοθρυψίνης από TPC N-τοσύλ-L-φενυλαλάνινο χλωρομεθύλ κετόνη Τροποποιούν ανεπανόρθωτα κάποιο κρίσιμο αμινοξικό κατάλοιπο
Μη αναστρέψιμη αναστολή, αναστολείς αυτοκτονίας Οι αναστολείς αυτοί σχηματίζονται μετά την καταλυτική δράση του ενζύμου σε αδρανή μόρια-υποστρώματα Η μετατροπή γίνεται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου και καταλήγει σε μη αναστρέψιμη αναστολή Παράδειγμα:
Μη αναστρέψιμη αναστολή, αποτελέσματα σε παραμέτρους ax k cat E0 app ax k cat E0 I 0 ax E0 1 ax app Άρα έχουμε ελαττωμένη ax I E 0 0 Μη συναγωνιστική αναστολή: app ax 1 ax I in
Οπότε σε περίπτωση ελλάτωσης του ax, με σταθερή πρέπει να διαπιστωθεί ότι δε συμβαίνει μη αντιστρεπτή αναστολή, προκειμένου να βεβαιωθούμε ότι έχουμε μη συναγωνιστική αναστολή (σταθερή )
Prevents S fro binding, so increases, no effect on ax Decreases and reduces ax by sae factor so slope of 1/o vs. 1/[S] doesn t change binds only to ES coplex (no effect on S binding) reduces ax (reduces kcat)
Περίληψη Αναστολή ax k cat k A =k cat / Όχι 1 1 1 1 Συναγωνιστική > 1 1 < Ανταγωνιστική < < < 1 Μικτή < < (μικτή) Μη συναγωνιστική 1 < < < Μη αναστρέψιμη 1 < < <
Ονοματολογία και μηχανισμοί πολυ υποστρωματικών αντιδράσεων
Πολυ υποστρωματικές αντιδράσεις Οι μονοϋποστρωματικές αντιδράσεις είναι σπάνιες (ισομεράσες, μουτάσες) Οι περισσότερες ενζυμικές αντιδράσεις είναι πολυ υποστρωματικές πολυ υποστρωματικές : Αντιδράσεις με 2, 3, 4 υποστρώματα που δίνουν έως και 4 προϊόντα Συμβολισμοί (κατά Cleland) Υποστρώματα: A, B, C, D Προϊόντα: P, Q, R, S Ένζυμο: E (ελεύθερο), F, G, H Αριθμός υποστρωμάτων ή και προϊόντων: Uni, Bi, Ter, Quad
Αριθμός Χαρακτηρισμός Υπόστρωμα Προϊόν Αντίδραση Υπόστρωμα Προϊόν 1 1 A P Uni Uni 1 2 A P+Q Uni Bi 2 1 A+B P Bi Uni 2 2 A+B P+Q Bi Bi 3 2 A+B+C P+Q Ter Bi 3 4 A+B+C P+Q+R+S Ter Quad
Μηχανισμοί πολυ υποστρωματικών αντιδράσεων Καθορίζονται από τη σειρά με την οποία τα υποστρώματα, ένζυμα και προϊόντα αλληλεπιδρούν Μηχανισμός υποχρεωτικής διαδοχής Τα υποστρώματα προσδένονται με καθορισμένη σειρά στο ένζυμο και τα προϊόντα αποχωρούν επίσης με καθορισμένη σειρά (αφυδρογονάσες) Μηχανισμός τυχαίας διαδοχής Τα υποστρώματα προσδένονται χωρίς καθορισμένη σειρά στο ένζυμο και τα προϊόντα αποχωρούν επίσης χωρίς καθορισμένη σειρά (κινάσες) Μηχανισμός πινγκ-πονγκ Ένα ή περισσότερα προϊόντα αποχωρούν χωρίς να έχει γίνει η προσθήκη όλων των υποστρωμάτων στο ένζυμο Η σειρά προσθήκης των υποστρωμάτων γίνεται σε 2 ή περισσότερα στάδια, οπότε το ένζυμο εμφανίζει 2 ή και περισσότερες μορφές (F, G, H κλπ) (αμινοτρανσφεράσες)
Για τη γενική διμοριακή αντίδραση του τύπου A+B P+Q (χαρακτηρισμός Bi-Bi)
ΤΕΛΟΣ