ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ Α2 ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ (DOMAIN) ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VON WILLEBRAND ΓΙΑ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΠΜΣ «ΝΑΝΟΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΙ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ-N&N» ΧΡΙΣΤΟΦΟΡΙΔΟΥ ΘΕΟΔΩΡΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ Α2 ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ (DOMAIN) ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VON WILLEBRAND ΓΙΑ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΧΟΛΗ-ΠΑΠΑΔΟΠΟΥΛΟΥ ΘΕΟΔΩΡΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2

ΧΡΙΣΤΟΦΟΡΙΔΟΥ ΘΕΟΔΩΡΑ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ Α2 ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ (DOMAIN) ΤΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ VON WILLEBRAND ΓΙΑ ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελίου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης με επιβλέπουσα καθηγήτρια την Κα. Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα, Καθηγήτρια Βιοχημείας. Μέλη τριμελούς επιτροπής Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια) Καθηγήτρια Τμήματος Χημείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Λογοθετίδης Στέργιος Καθηγητής τμήματος Φυσικής, Διευθυντής του ΔΠΜΣ «Ναονοεπιστήμες και Νανοτεχνολογίες», Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Καραγκιοζάκη Βαρβάρα Μεταδιδακτορική Ερευνήτρια Τμήματος Φυσικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 3

4

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στην Καθηγήτρια Βιοχημείας κ. Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα η οποία ήταν η επιβλέπουσα της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας. Την ευχαριστώ πολύ για την αποδοχή και υποδοχή στο εργαστήριό της, την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και την ευχάριστη συνεργασία μας. Η βοήθεια και συμπαράσταση της σε δύσκολες στιγμές ήταν ουσιαστική και πολύ σημαντική. Για μένα αποτελέι υπόδειγμα δασκάλας και ανθρώπου. Τις ευχαριστίες μου επίσης στον Καθηγητή Φυσικής και Διευθυντή του ΔΠΜΣ «Νανοεπιστήμες και Νανοτεχνολογίες» κ. Λογοθετίδη Στέργιο που με δέχτηκε στο συγκεκριμένο πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών δίνοντας μου την ευκαιρία να αποκομίσω σημαντικές και επίκαιρες γνώσεις καθώς και να έρθω σε επαφή με επιστήμονες άλλων ειδικοτήτων πέρα από τη δική μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Δρ. Παπαχρήστου Ελένη για την καθοδήγησή της και την εκμάθηση των εργαστηριακών διαδικασιών Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, καθώς και για την υποστήριξη, τη βοήθεια και τις συμβουλές που μου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων στο εργαστήριο Βιοχημείας. Θα ηθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τη Δρ. Τσιτουρούδη Φανή, τον υποφήφιο διδάκτορα Καρούλια Στέλιο καθώς και τους του προπτυχιακούς φοιτητές Φωτόπουλο Ιωάννη και Παπαγρηγοράκη Μαριάνε, διότι χωρίς τη συνεισφορά και την πολύτιμη βοήθειά τους το πειραμάτικό μέρος της διπλωματικής εργασιάς θα ήταν δύσκολο να ολοκληρωθεί. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου και τους φίλους που μου συμπαραστάθηκαν ψυχολογικά σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. 5

6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 11 SUMMARY 13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15 Αιμόσταση 15 Ο παράγοντας von Willebrand 18 Δομικές επικράτειες του vwf 20 Bιοσύνθεση και πολυμερισμός του vwf 24 Αποθήκευση και απελευθέρωση του vwf 26 Ο βιολογικός ρόλος του VWF 29 Προσκόλληση αιμοπεταλίων 29 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ vwf και της υποενδοθηλιακής μήτρας 29 Μεταφορέας του Παράγοντα VIII 30 Σχηματισμός θρόμβου αιμοπεταλίων 30 H μεταλλοπρωτεάση ADAMTS 13 35 Η δομή της επικράτειας Α1 του vwf 43 Λειτουργία Α1 επικράτειας 45 Η δομή της επικράτειας Α2 47 H επικράτεια A2 ως αισθητήρας δύναμης. 49 Σχέσεις λειτουργιών των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf 53 VWF και ασθένειες που σχετίζονται με αυτόν 55 Νόσος von Willebrand (vwd) 55 Θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα 56 Η επίκτητη νόσος von Willebrand 56 VWF και αρτηριακή θρόμβωση 58 Παρεμβάσεις που στοχεύουν στον VWF- O VWF ως αντιθρομβωτικός στόχος 60 Μονοκλωνικά αντισώματα 62 Νανοσώματα 63 7

ALX-0081 και ALX-0681 64 Απταμερή 66 ARC15105 67 GPG-290 68 Ανασυνδυασμένη ADAMTS13 68 Βιολειτουργικότητα- Biofunctionalization 70 Υποστρώματα για την καθήλωση πρωτεϊνών 70 Τεχνικές καθήλωσης πρωτεϊνών 73 Σύστημα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης 73 ΣΚΟΠΟΣ 75 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 77 Υλικά 77 Βιολογικά υλικά 77 Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών 77 Χημικά αντιδραστήρια 77 Υλικά χρωματογραφίας 77 Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας 77 Μέθοδοι Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας 78 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 78 Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR 81 Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης 81 Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς 82 Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού 83 Αντίδραση λιγάσης 85 Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό βακτηρίων (competent cells) 86 Μέθοδος των δυο διαλυμάτων CaCl2 86 Μέθοδος δυο διαλυμάτων CaCl2 (αποθηκεύονται στους -70 ο C) 87 Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E. Coli (μετασχηματισμός) 88 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA 89 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση και καθαρισμός με φαινόλη / χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη 89 Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) 90 Καλλιέργειες βακτηρίων E. coli 90 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 91 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-ηλεκτροφόρηση) 92 Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου. 95 Βαφή με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 95 Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO3 ) 96 Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης 97 8

Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα E. Coli BL21(DE3)-σύστημα έκφρασης pet 99 Ήπια λύση κυττάρων με heat shock 100 Λύση κυττάρων με υπερήχους (sonication) 101 Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 101 Κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο 103 Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών - Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden 105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 107 Ενίσχυση του γονιδίου της Α2 επικράτειας του vwf και κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pet49b(+) 107 Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.Coli TOP10 και BL21 (DE3) με τον ανασυδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pet49b(+)-α2-vwf 108 Υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α2 επικράτειας του vwf 108 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 111 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 117 9

10

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο vwf είναι μια πολυμερής γλυκοπρωτεΐνη, η οποία διαμεσολαβεί το σχηματισμό θρόμβου σε σημεία αγγειακού τραυματισμού και σε συνθήκες υψηλής διατμητικής τάσης, κυρίως μέσω αλληλεπιδράσεων με συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και υποδοχείς των αιμοπεταλίων. Μέχρι στιγμής έχουν διευκρινιστεί οι βιολογικές ιδιότητες του vwf σε επίπεδο γενετικής ρύθμισης, βιοσύνθεσης και μοριακών αλληλεπιδράσεων, έχουν επίσης προσδιοριστεί οι τρισδιάστατες δομές επιλεγμένων επικρατειών του vwf, αλλά δεν έχει ακόμα πλήρως αποσαφηνιστεί η σχέση δομής-δράσης των εν λόγω επικρατειών, λόγω της πολυπλοκότητας και του μεγέθους του μορίου του vwf. Η επικράτεια Α1 διαθέτει την περιοχή πρόσδεσης στον υποδοχέα GPΙbα των αιμοπεταλίων που είναι το κύριο βήμα της προσκόλλησής τους σε εκτεθειμένους ιστούς και η επικράτεια Α2 είναι σημαντική για τη φυσιολογική ανακύκληση του vwf και την αποφυγή θρομβώσεων, μιας και διαθέτει μια περιοχή πρωτεολυτικής πέψης που αναγνωρίζεται από τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13. Η πρόσδεση της επικράτειας Α1 στον υποδοχέα GPIbα αναστέλλει την πρωτεόλυση της Α2, η οποία παρεμποδίζει το σχηματισμό του συμπλόκου Α1-GPIbα. Πρόσφατες μελέτες πρότειναν την αλληλεπίδραση των επικρατειών Α1 και Α2 ως υπεύθυνη για την αναστολή της προσκόλλησης των αιμοπεταλίων. Συνεπώς, η μελέτη του μηχανισμού σχηματισμού του συμπλόκου Α1-Α2 θα μπορούσε να συμβάλει στο σχεδιασμό αντιθρομβωτικών φαρμάκων. Το ανθρώπινο γονίδιο που κωδικοποιεί την επικράτεια Α2 του vwf κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε σε βακτηριακό σύστημα και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη της επικράτειας Α2 υπερεκφράστηκε και απομονώθηκε, απουσία μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων που πραγματοποιούνται in vivo, και καθαρίστηκε επιτυχώς. Η ανασυνδυασμένη Α2 επικράτεια είναι πλέον διαθέσιμη σε μεγάλη ποσότητα και με υψηλή καθαρότητα, έτοιμη να χρησιμοποιηθεί. Σε δεύτερο χρόνο θα μπορούσε να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf πάνω σε βιοσυμβατές νανοεπιφάνειες, καθώς και η πιθανή αντιθρομβωτική δράση του συμπλόκου αυτού. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα όσον αφορά την ανάπτυξη νέων αντιθρομβωτικών παραγόντων. 11

12

SUMMARY The vwf is a multimeric glycoprotein which mediates the formation of thrombus at the sites of vascular injury and under high shear stress conditions, primarily through interactions with components of the extracellular matrix and receptors of platelets. So far the biological properties of vwf have been elucidated in terms of genetic regulation, biosynthesis and molecular interactions. Also the three-dimensional structures of selected domains of vwf have been determined, but the structure-activity relationship of these domains has not been fully clarified yet, due to the complexity and the size of the molecule of vwf. The A1 vwf domain contains the binding region of platelet GPIba receptor which is the key step in the adhesion of the platelets on exposed tissues. The A2 domain contains a proteolytic digestion site recognized by the metalloprotease ADAMTS13 and is important for proper recycling of vwf and to avoid thrombosis. The binding of the A1 domain to the GPIbα receptor inhibits proteolysis of the A2 domain, which prevents the formation of complex A1-GPIbα. Recent studies suggested that interaction between domains A1 and A2 can be responsible for the inhibition of platelet adhesion. Therefore, studying the mechanism of formation of the A1- A2 complex could help in the design of novel antithrombotic drugs. The human gene encoding the A2 domain of vwf was cloned and expressed in a bacterial system and the recombinant protein of the A2 domain was isolated and overexpressed in the absence of post-translational modifications that take place in vivo, and then it was successfully purified. The recombinant A2 domain is now available in large quantity and with high purity, ready to be used. Later on, the interaction between A1 and A2 domains of vwf on biocompatible nano-surfaces could be studied, and the possible antithrombotic activity of this complex could be assessed. The results of these experiments could be useful in the development of new antithrombotic agents. 13

14

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αιμόσταση Αιμόσταση είναι η φυσιολογική διαδικασία που βοηθάει στη διατήρηση του αίματος σε υγρή φάση και στην πρόληψη της διαφυγής αίματος από τα αγγεία διαμέσου του σχηματισμού θρόμβου. Αποτελείται από ένα σύνθετα ρυθμιζόμενο σύστημα το οποίο εξαρτάται σε μια λεπτή ισορροπία μεταξύ διαφόρων συστημάτων. Τα συστήματα που εμπλέκονται στην αιμοστατική διαδικασία περιλαμβάνουν το αγγειακό σύστημα, το σύστημα πήξης, το σύστημα ινωδόλυσης, τα αιμοπετάλια, το σύστημα κινίνης, τους αναστολείς πρωτεάσης σερίνης, και το σύστημα συμπληρώματος. Τα συστήματα συνεργάζονται όταν το ενδοθήλιο ενός αγγείου διαταραχθεί, ώστε να παράγουν θρόμβους. Οι θρόμβοι σταματούν την αιμορραγία και τελικά διαλύονται μέσω της ινωδολυτικής διαδικασίας. Η διαδικασία κατηγοριοποιείται ως πρωτογενής και δευτερογενής αιμόσταση. Η πρωτογενής αιμόσταση περιλαμβάνει τον ακαριαίο σχηματισμό αιμοστατικού βύσματος με την απόκριση του αγγειακού συστήματος και των αιμοπεταλίων, όταν υπάρξει τραυματισμός αγγείου. Λαμβάνει χώρα όταν υπάρχουν τραυματισμοί σε μικρά αγγεία όπου τα προσβεβλημένα αγγεία συσπώνται για να καλύψουν το τραύμα και τα αιμοπετάλια κινητοποιούνται, συσσωρεύονται και αλληλεπιδρούν με συστατικά του υποενδοθηλίου του αγγειακού συστήματος. Η πρωτογενής αιμόσταση ωστόσο είναι προσωρινά αποτελεσματική και για να μην γίνει υποτροπή της αιμορραγίας, απαιτείται η δευτερογενής αιμόσταση, η οποία ενισχύει το αιμοπεταλιακό βύσμα με το σχηματισμό θρόμβου. Η δευτερογενής αιμόσταση αποτελεί συνέχεια της πρωτογενούς και απαιτείται για τον έλεγχο της αιμορραγίας από μεγάλες πληγές. Το αποτέλεσμα της πρωτογενούς αιμόστασης είναι ο σχηματισμός βύσματος αιμοπεταλίων, ενώ το αποτέλεσμα της δευτερογενούς αιμόστασης είναι ο σχηματισμός θρόμβου (Henry O. Ogedegbe, 2002)( Erhard Hiller, 2007). Όταν το ενδοθήλιο υποστεί βλάβη, το αίμα εκτίθεται στο υπενδοθηλιακό κολλαγόνο και τα μικροϊνίδια. Τα αιμοπετάλια προσδένονται στο κολλαγόνο και περαιτέρω δέσμευση και σταθεροποίηση διευκολύνεται από τον παράγοντα von Willebrand (vwf). O vwf αποτελεί μια γέφυρα μεταξύ των υποενδοθηλιακών μικροϊνιδίων και των αιμοπεταλίων και επιτρέπει στα αιμοπετάλια να παραμείνουν προσκολλημένα στο αγγειακό τοίχωμα. Μετά από αυτήν την προσκόλληση, τα αιμοπετάλια ενεργοποιούνται, γίνεται αλλαγή στο σχήμα τους και απελευθέρωση των κοκκίων. Τα εκκρινόμενα προϊόντα συσσωρεύουν πρόσθετα αιμοπετάλια με 15

αποτέλεσμα το σχηματισμό στρώματος αιμοπεταλίων, που αποτελεί το αιμοστατικό βύσμα (David S Minors, 2004). Κατά τη δευτερογενή αιμόσταση η θεμελιώδης αντίδραση στο σχηματισμό του θρόμβου αίματος είναι η μετατροπή του διαλυτού ινωδογόνου του πλάσματος σε αδιάλυτο ινώδες κάτω από τη δράση της θρομβίνης. Η θρομβίνη διασπά το ινωδογόνο για να σχηματίσει μόριο μονομερούς ινώδους, το οποίο πολυμερίζεται για να σχηματίσει ένα πλέγμα αλυσίδων. Αρχικά, οι αλυσίδες συγκρατούνται μαζί ασθενώς με δεσμούς υδρογόνου, αλλά η ενεργοποίηση του παράγοντα XIII από τη θρομβίνη οδηγεί στον σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ των αλυσίδων ινώδους και με τον τρόπο αυτό τις σταθεροποιεί. Η μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη περιλαμβάνει μια σειρά πρωτεασών σερίνης του πλάσματος (συλλογικά αναφέρονται ως παράγοντες πήξης) που συνήθως υπάρχουν σε μια ανενεργή, προενζύμου μορφή, και ενεργοποιούνται σε μια διαδοχική ακολουθία. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1, η ενεργοποίηση των παραγόντων πήξης προχωρά σε δύο πορείες που συγκλίνουν στον παράγοντα Χ σε ένα κοινό μονοπάτι. Η ενδογενής οδός (ή αλλιώς μονοπάτι ενεργοποίησης επαφής) μπορεί να ενεργοποιηθεί in vivo με έκθεση του αίματος στο κολλαγόνο του υποενδοθηλίου και έτσι ενεργοποιείται ο πρώτος παράγοντας σε αυτή την οδό, ο παράγοντας XII. Η εξωγενής οδός (ή αλλιώς μονοπάτι του ιστικού παράγοντα) ενεργοποιείται από την απελευθέρωση του ιστικού παράγοντα (tissue factor, TF). Οι δύο οδοί αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και έτσι, όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα, ο δραστικός παράγοντας VII που σχηματίζεται στην εξωγενή οδό μπορεί άμεσα να ενεργοποιήσει τον παράγοντα IX, παρακάμπτοντας έτσι τα πρώτα στάδια στην ενδογενή οδό. Επίσης οι δύο οδοί συγκλίνουν στην ενεργοποίηση του παράγοντα Χ σε Χα. Επιπλέον, η θρομβίνη έχει θετικά αποτελέσματα ανάδρασης, εφόσον ενεργοποιεί τους παράγοντες V και VIII, οι οποίοι δρουν ως συν-παράγοντες στο σχηματισμό της θρομβίνης και του παράγοντα Χα, αντίστοιχα, καθώς και τον παράγοντα XI. Τα αιμοπετάλια παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην πήξη εφόσον παρέχουν φωσφολιπίδια PL και έτσι γίνεται ενεργοποίηση του παράγοντα Χ από τον παράγοντα ΙΧ και μετατροπή της προθρομβίνης σε θρομβίνη από τον παράγοντα Χ. Σε αυτή την αντίδραση ο σχετικός συν-παράγοντας (V ή VIII) ενώνεται με τα PL μαζί με τα ιόντα ασβεστίου, και σε μεγάλο βαθμό αυξάνει την δραστικότητα του συνπαράγοντα. 16

Εικόνα 1. Σχηματικό διάγραμμα της δευτερογενούς αιμόστασης. Διακρίνονται η ενδογενής και η εξωγενής οδοί. Με πράσινο βέλος απεικονίζονται οι αντιδράσεις θετικής ανάδρασης. Michael W King, PhD 1996 2013 themedicalbiochemistrypage.org, LLC Εικόνα 2. Συνοπτική απεικόνιση της πρωτογενούς αιμόστασης και του σχηματισμού θρόμβου. (Henry O. Ogedegbe, 2002) 17

Ο παράγοντας von Willebrand Ο παράγοντας von Willebrand (vwf) είναι μια μεγάλου μοριακού βάρους πολυμερής γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος που παίζει σημαντικό ρόλο στην πρωτογενή αιμόσταση (Ruggeri et al. 2001). Η πρώτη υπόνοια για την ύπαρξη του τέθηκε το 1926, όταν ο Δρ Erik von Willebrand, ένας Φιλανδός γιατρός, περιέγραψε μια κληρονομική αιμορραγική διαταραχή αυτοσωμικού χαρακτήρα που παρουσιάζει τάση για αιμορραγία από την επιδερμίδα και τους βλεννογόνους και πρότεινε ότι είναι διακριτή από την αιμοφιλία, οπότε χαρακτηρίστηκε ψευδοαιμορροφιλία (von Willebrand, 1926)( D Lillicrap, 2009). Γύρω στο 1950 με την ανάπτυξη τεχνικών μέτρησης του παράγοντα VIII έγινε αντιληπτή η διαφορά μεταξύ των παραγόντων VIII και vwf. Παρά τα στοιχεία αυτά, η μειωμένη δραστικότητα του FVIII σε ασθενείς με νόσο von Willebrand προκάλεσε σύγχυση σχετικά με τους αντίστοιχους ρόλους του FVIII και του vwf στην κυκλοφορία και η ξεχωριστή φύση της αιμορροφιλίας Α και της νόσου von Willebrand. Tη δεκαετία του 1970, η φύση της σχέσης στην κυκλοφορία μεταξύ των FVIII και vwf άρχισε να γίνεται κατανοητή. Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1980 η απομόνωση των πρωτεϊνών του FVIII και του vwf καθώς και η έλευση σύγχρονων μοριακών τεχνικών, οδήγησε στην κλωνοποίηση των γονιδίων για τον παράγοντα VIII και τον παράγοντα vwf, όπως επίσης προσδιορίστηκε η πεπτιδική αλληλουχία του vwf (Keeney, 2001). Έτσι υπήρχε πλέον η δυνατότητα ελέγχου της δομής και της λειτουργίας του vwf, έχουν εντοπιστεί λειτουργικές θέσεις του γονιδίου του vwf και ο ρόλος του vwf στην πρωτογενή αιμόσταση έχει ορισθεί, ενώ υπάρχει και το δυναμικό για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων των νόσων που σχετίζονται με τον παράγοντα. Ο vwf συντίθεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και μεγακαρυωκύτταρα. Έχει κεντρικό ρόλο στην πρωτογενή αιμόσταση, όπου διαμεσολαβεί στην προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο κατεστραμμένο αγγειακό υποενδοθήλιο και την επακόλουθη συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων. Η προσκολλητική λειτουργία του vwf είναι ιδιαίτερα σημαντική κάτω από συνθήκες υψηλής διατμητικής, δηλαδή στα μικρά αιμοφόρα αγγεία, όπου προσκόλληση αιμοπεταλίων και ως εκ τούτου η φυσιολογική πρωτογενής αιμόσταση εξαρτάται απόλυτα από τον vwf. Η δεύτερη σημαντική λειτουργία του είναι ότι δρα ως σταθεροποιητής του FVIII στην κυκλοφορία. Αυτό επιτυγχάνεται με το σχηματισμό ενός μη ομοιοπολικά συνδεδεμένου vwf-fviii συμπλόκου που προστατεύει την αποδόμηση του FVIII από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C (Keeney, 2001). Το γονίδιο που κωδικοποιεί τον vwf, εντοπίζεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 12, αποτελείται από 178 kb DNA και περιέχει 52 εξώνια (Budde, 18

2001). Το γονίδιο του vwf μεταγράφεται σε ένα 9-kb mrna το οποίο μεταφράζεται για να παράγει μια πρωτεΐνη 2813 αμινοξέων, που ορίζεται προ-προ-von Willebrand παράγοντας. Αυτό το πρόδρομο πολυπεπτίδιο αποτελείται από ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο 22 αμινοξέων, από ένα προπεπτίδιο 741 αμινοξέων και την ώριμη υπομονάδα μήκους 2050 αμινοξέων (Εικόνα 3) (Keeney, 2001). Ένα υψηλά ομόλογο ψευδογονίδιο του vwf εντοπίζεται επί του χρωμοσώματος 22, το οποίο καλύπτει τα εξώνια 23-34 του λειτουργικού γονιδίου και έχει 97% ομολογία αλληλουχίας με το αυθεντικό γονίδιο vwf, δείχνοντας μια πρόσφατη εξελικτική προέλευση του ψευδογονιδίου (Mancuso, 1991). Εικόνα 3. Γονίδιο του vwf. Διακρίνονται οι θέσεις των εξωνίων. Προ-προ-vWF πεπτίδιο. Διακρίνονται το σηματοδοτικό πεπτίδιο (signal peptide), το προπεπτίδιο (propeptide) και η ώριμη υπομονάδα (mature monomer). 2012 Hemobase-vWF. http://vwf.hemobase.com/vwf/vwf.htm 19

Δομικές επικράτειες του vwf Η ανάλυση της αλληλουχίας αμινοξέων δείχνει εκτεταμένη επανάληψη η οποία ορίζει τέσσερις διακριτές περιοχές που επαναλαμβάνονται από δύο έως τέσσερις φορές η καθεμία. Υπάρχουν τρεις A επικράτειες, τρεις Β επικράτειες, δύο C επικράτειες και τέσσερις D επικράτειες. Οι Β επικράτειες είναι μικρές και περιέχουν 25 έως 35 κατάλοιπα αμινοξέων, ενώ η διπλές C επικράτειες περιέχουν 116 έως 119 κατάλοιπα και οι τέσσερις D επικράτειες περιέχουν 351-376 κατάλοιπα αμνοξέων σε τέσσερα αντίγραφα. Οι επικράτειες είναι διευθετημένες με την ακόλουθη διάταξη: D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Η πρωτεΐνη είναι εξαιρετικά πλούσια σε κυστεΐνη, η οποία περιλαμβάνει 234 από τα 2813 κατάλοιπα αμινοξέων στον προ-προ-vwf. Στην εκκρινόμενη πρωτεΐνη, όλα τα υπολείμματα κυστεΐνης φαίνεται να αντιστοιχιστούν σε δισουλφιδικούς δεσμούς(peyvandi, 2011). Η κάθε μία από τις περιοχές στον ώριμο vwf εκτελεί συγκεκριμένες λειτουργίες. Οι επαναλαμβανόμενες επικράτειες Α διακρίνονται στις Α1, Α2 και Α3 και παρουσιάζουν ομοιότητες στην πρωτοταγή και δευτεροταγή τους δομή (Εικόνα 4)(Zhang et al. 2009). Εικόνα 4. Σύγκριση της πρωτοταγούς και της δευτεροταγούς δομής των επικρατειών Α του vwf. Διακρίνονται τα β ελάσματα (ροζ) και οι α έλικες (γαλάζιες). Συμβολίζονται οι δεκάδες (τελείες), το σημείο πέψης της πρωτεάσης ADAMTS13 (μαύρο βέλος), οι περιοχές γλυκοζυλίωσης (αστερίσκοι), τα κατάλοιπα που σχετίζονται με μεταλλάξεις στις περιπτώσεις vwd (κίτρινο), τα κατάλοιπα που δεν παρουσιάζουν ομοιότητες (μικρά γράμματα) και τα κατάλοιπα που απουσιάζουν (παύλες) (Zhang et al. 2009). Η επικράτεια Α1 διαθέτει τη μοναδική θέση πρόσδεσης για τη γλυκοπρωτεΐνη GPIbα των αιμοπεταλίων και επιπλέον διαθέτει θέσεις πρόσδεσης για την ηπαρίνη, σουλφουρωμένα γλυκολιπίδια, και την πρωτεΐνη βοτροσετίνη (botrocetin), που 20

αποτελεί δηλητήριο φιδιών γένους Bothrops (Peyvandi, 2011). Φαίνεται να έχει σύνδεσης για το κολλαγόνο και συγκεκριμένα για το κολλαγόνο τύπου VI (Hoylaerts et al, 1997). Επίσης υπάρχουν θέσεις σύνδεσης για το αντιβιοτικό ριστοσετίνη και τη βιτισετίνη (Emsley, 1998). Η επικράτεια Α2 διαθέτει τη θέση κοπής για τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13, που βρίσκεται φυσιολογικά στην κυκλοφορία και μετατρέπει τα μεγάλα πολυμερή του vwf σε μικρότερα, καθορίζοντας το μέγεθος των πολυμερών (Dong et al, 2002, Tao et al, 2005). Η επικράτεια Α3 διαθέτει περιοχές πρόσδεσης για το ινώδες κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ (Lisman et al, 2006). Τα κατάλοιπα Cys509-Cys695 του αμινοτελικού και καρβοξυτελικού άκρου της επικράτειας Α1 του vwf συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό σχηματίζοντας ένα βρόχο 185 καταλοίπων. Ίδιου μήκους δισουλφιδικός βρόχος σχηματίζεται μεταξύ των καταλοίπων Cys923-Cys1109 της επικράτειας Α3, αλλά δεν παρατηρείται στην Α2 (Καρούλια, 2011). Εικόνα 5. Οι επικράτειες Α1 και η Α3 του vwf διαθέτουν από έναν ενδομοριακό δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ των αμινοτελικών και καρβοξυτελικών τους άκρων και δημιουργούνται βρόχοι μεταξύ των καταλοίπων Cys509-Cys695 και Cys923-Cys1109. Η Α2 επικράτεια στερείται του δισουλφιδικού βρόχου. http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/proteoglycan/pgb07e.html 21

Όσον αφορά τις Β επικράτειες Β1, Β2 και Β3 υπάρχουν λίγες πληροφορίες. Η μετάλλαξη του καταλοίπου Cys1599 της επικράτειας Β2 σε Phe σχετίζεται με σημαντικές μεταβολές των πολυμερών του vwf και μη φυσιολογική πρωτεόλυση από την μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13 (De Marco et al, 2006). Οι επικράτειες C του vwf είναι οι C1, C2 και CK. Η C1 επικράτεια περιλαμβάνει την αλληλουχία RGD (Arg-Gly-Asp), που είναι η θέση πρόσδεσης για την ιντεγκρίνη αiibβiii (Peyvandi, 2011). Η περιοχή CK που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο είναι πλούσια σε κυστεΐνες και συμμετέχει στο σχηματισμό των διμερών του vwf (Zhou et al, 2012, Dong et al,1994). Στις επικράτειες D του πρόδρομου vwf περιλαμβάνονται οι D1, D2, D, D3 και D4 που παρουσιάζουν ομοιότητες στην αμινοξική τους αλληλουχία και διαθέτουν 32 έως 36 κατάλοιπα κυστεΐνης η καθεμία (Καρούλια, 2011). Οι D1 και D2 επικράτειες περιλαμβάνουν το προ-πεπτίδιο και διασπώνται κατά τη διάρκεια της πρωτεολυτικής επεξεργασίας για την παραγωγή του ώριμου vwf (Luo et al, 2012). Η επικράτεια D3 συμμετέχει στον πολυμερισμό του vwf με τη δημιουργία διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών των καταλοίπων κυστεϊνης της (Schneppenheim 2011), ενώ τα κατάλοιπα κυστεϊνης των D1, D, D2 και D4 εμπλέκονται αποκλειστικά σε ενδομοριακούς δεσμούς (Ruggeri et al. 1993). Στην επικράτεια D2 εντοπίζεται η αλληλουχία RGD (Arg-Gly-Asp) η οποία αποτελεί περιοχή πρόσδεσης της ιντεγκρίνης αiibβiii, και η περιοχή πρόσδεσης του κολλαγόνου. Στις επικράτειες D και D3 εντοπίζονται οι περιοχές δέσμευσης της ηπαρίνης και του παράγοντα FVIII (Peyvandi, 2011). Επιπλέον, οι D και D3 επικράτειες αποτελούν πιθανές περιοχές πρόσδεσης για την Ρ-σελεκτίνη, η οποία έχει βρεθεί ότι προσδένει τα προσφάτως απελευθερωμένα στην κυκλοφορία υπερμεγέθη πολυμερή του vwf (Sadler, 1998). Η επικράτεια D4 δεν φαίνεται να αντιστοιχεί σε μια συγκεκριμένη λειτουργία ακόμη, εκτός από το ότι ένα κάβουτελικό κομμάτι του vwf που περιλαμβάνει την περιοχή D4 έχει θεωρηθεί ως πρόσθετη θέση δέσμευσης για την ADAMTS13 (Zanardelli et al, 2009). 22

Εικόνα 6. Σχηματική απεικόνιση των επικρατειών του vwf. Παρουσιάζονται οι θέσεις πρόσδεσης των επικρατειών με διάφορα μόρια (Peyvandi, 2011). 23

Βιοσύνθεση και πολυμερισμός του vwf Η σύνθεση του vwf γίνεται στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα και στα μεγακαρυοκύτταρα (Jaffe et al, 1974, Sporn et al, 1985) και επιτελείται η ίδια υψηλής τάξης διαδοχή των σταδίων επεξεργασίας της πρωτεΐνης και στους δυο τύπους κυττάρων. Ο vwf συντίθεται ως προ-προ-vwf που αποτελείται, όπως ειπώθηκε πριν, από 2813 αμινοξέα με ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο 22 αμινοξέων, το οποίο κατευθύνει τη μεταφορά στο ενδοπλασματικό δίκτυο, όπου δύο μονομερή προ-vwf διμερίζονται στις καρβοξυ-τελικές επικράτειες CK (Schneppenheim, 2011). Μετά από τη διάσπαση του σηματοδοτικού πεπτιδίου και τη μετατόπιση στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το πρωτογενές προϊόν της μετάφρασης υποβάλλεται σε Ν- γλυκοζυλίωση και διμερισμό (Romani de Wit, 2001). Ο διμερισμός γίνεται μέσω δισουλφιδικών δεσμών των καρβοξυ-τελικών αμινοξέων της CK υπομονάδας του προ-vwf. Τα διμερή στη συνέχεια μεταφέρονται από το ενδοπλασματικό δίκτυο στη συσκευή Golgi, όπου γίνεται σουλφούρωση και Ο-γλυκοζυλίωση. Ταυτόχρονα με αυτές τις μετα-μεταφραστικές διεργασίες, τα μεταποιημένα διμερή υφίστανται πολυμερισμό κατά τη μεταφορά μέσω των διαμερισμάτων της συσκευής Golgi. Τα πολυμερή που σχηματίζονται μπορεί να αποτελούνται μέχρι και από 100 υπομονάδες. Ο προ-vwf στη συνέχεια μεταφέρεται στο trans-golgi δίκτυο, όπου συμβαίνουν περαιτέρω πολυμερισμοί και πρωτεολυτική διάσπαση, αποδίδοντας ώριμα vwf πολυμερή και διμερή του προπεπτιδίου. Η αποκοπή του προπεπτιδίου γίνεται στη θέση 763, από μια ανδοπρωτεάση. Μετά τη διάσπαση, ο vwf και το vwf προπεπτίδιο παραμένουν μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένα, τουλάχιστον εντός του κυττάρου (Romani de Wit, 2001). Εικόνα 7. Σχημτική αναπαράσταση της διαδοχικής μεταφοράς του vwf στα ενδοκυτταρικά διαμερίσματα κατά τη μετα-μεταφραστική τροποποίησή του. Cécile Denis. INSERM U770. University of Ferrara. October 19th, 2012 24

Στη διαδικασία του πολυμερισμού σχηματίζονται κυρίως δισουλφιδικοί δεσμοί μεταξύ των καταλοίπων D3 των διμερών του vwf, τα οποία εντοπίζονται στο αμινοτελικό άκρο του μορίου (Sadler, 1998). Τα μεγαλύτερα σε μέγεθος πολυμερή που προκύπτουν χαρακτηρίζονται ως ultra large vwf (ULvWF)και αποτελούν τις πιο δραστικές μορφές του παράγοντα (Savage et al, 2002). Τα ώριμα πολυμερή του vwf περιέχουν έως και 22 πλευρικές αλυσίδες υδατανθράκων, οι οποίες αποτελούν το 10-19% του συνολικού βάρους του μορίου. Τα διμερή έχουν μάζα περίπου 500 kilodaltons, και μετατρέπονται σε πολυμερή τα οποία μπορεί να έχουν μάζα έως και 20000 kda (Ruggeri, 2007). Τα πολυμερή σχηματίζουν ινώδεις δομές με διάμετρο 2-3 nm και μήκος μέχρι 1300 nm, (περίπου ίσα με τη διάμετρο των αιμοπεταλίων) ενώ τα ελικωμένα μόρια έχουν διάμετρο 2-300 nm(ruggeri,2003). Εικόνα 8. Σχηματική αναπαράσταση των σταδίων επεξεργασίας που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση του vwf. Η διαγραμμισμένη περιοχή αντιπροσωπεύει το τμήμα του προπεπτιδίου του vwf και η σκοτεινή περιοχή τον ώριμο vwf. Τα διαμερίσματα στα οποία τα στάδια επεξεργασίας λαμβάνουν χώρα υποδεικνύονται στα αριστερά. (Romani de Wit, 2001) Σύμφωνα με τη δημοσίευση του Purvis et al. το 2004 παρόλο που το περιβάλλον στο σύστημα Golgi είναι όξινο μη ευνοώντας τη δημιουργία των δισουλφιδικών δεσμών, σε περίπτωση μεταβολής των συνθηκών, δεν επιτυγχάνεται ο πολυμερισμός του vwf. Μια εκδοχή που προτάθηκε είναι πως το προπεπτίδιο μπορεί να λειτουργεί ως ενδογενής οξειδοαναγωγάση ευαίσθητη στο ph και να 25

καταλύει το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών για το σχηματισμό των ULvWF. Το προπεπτίδιο του vwf φαίνεται ότι απαιτείται για τη φυσιολογική δημιουργία των ULvWF, αλλά ο τρόπος με τον οποίο μετέχει στο σχηματισμό τους παραμένει ένα ενδιαφέρον ερώτημα (Purvis et al. 2004). Αποθήκευση και απελευθέρωση του vwf Μετά την σύνθεση, ο vwf που παράγεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνεται μέσω ενός εκ των δύο διακριτών οδών: ένα συστατικό μονοπάτι που συνδέεται άμεσα με τη σύνθεση και γίνεται μια σταθερή έκκριση στον εξωκυττάριο χώρο και την κυκλοφορία, και ένα ρυθμιζόμενο μονοπάτι που περιλαμβάνει την αποθήκευση των ώριμων μορίων για την αποδέσμευση μετά από διέγερση με εκκριταγωγά ερεθίσματα. Επειδή ο ελεύθερος vwf υποβάλλεται σε μια διαδικασία ρυθμιζόμενης μείωσης του μεγέθους του, η διαθεσιμότητα μιας πηγής αδιάσπαστων μεγαλύτερων πολυμερών από θέσεις κυτταρικής αποθήκευσης επιτρέπει τη μέγιστη λειτουργία του παράγοντα σε περιοχές όπου απαιτείται ταχεία συγκόλληση και συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων. Τα οργανίδια αποθήκευσης για τον vwf που βρίσκονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μεγακαρυοκύτταρα είναι τα ραβδόμορφα σώματα Weibel-Palade και τα α-κοκκία, αντιστοίχως (Ruggeri, 2007). Στα μεγακαρυοκύτταρα μόνο το ρυθμιζόμενο μονοπάτι είναι ενεργό, συνεπώς ο VWF που κυκλοφορεί στο πλάσμα προέρχεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο vwf που εκκρίνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε μέσω του συστατικού ή του ρυθμιζόμενου μονοπατιού, κατευθύνεται προς τον αυλό και την υποενδοθηλιακή μήτρα. 26

Εικόνα 9. Κατάτμηση του παράγοντα von Willebrand και του προ-πεπτιδίου και του προ-vwf μεταξύ του συστατικού και ρυθμιζόμενου εκκριτικού μονοπατιού από αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Το μόριο προ-vwf επεξεργάζεται στο δίκτυο trans- Golgi και σχηματίζονται ετερογενείς μορφές vwf, που κυμαίνονται από διμερή σε μεγάλα πολυμερή. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ειδών vwf εκκρίνεται μέσα από το συστατικό μονοπάτι. Το υπόλοιπο, πλήρως επεξεργασμένο και λειτουργικό vwf, ταξινομείται στα σωμάτια Weibel-Palade και εκκρίνεται μέσω της ρυθμιζόμενης οδού. Αυτό το μοντέλο προτείνει ότι η πλειοψηφία των vwf εκκρίνεται μέσω του συστατικού μονοπατιού (Romani de Wit, 2001). Τα σωμάτια Weibel-Palade στα οποία αποθηκεύεται ο παράγοντας VWF εντός των ενδοθηλιακών κυττάρων, είναι ραβδόμορφα οργανίδια με 0,1-0,2 μm πλάτος και μέχρι 4 μm μήκος (Weibel ER, Palade GE, 1964). Έχουν διαμήκεις ραβδώσεις και σε εγκάρσια τομή αποτελoύνται από στενά συσκευασμένα σωληνάρια μήκους 150 A έως 200 A, που φαίνεται να αποτελούνται από vwf πολυμερή. Εκτός από την αποθήκευση του vwf, τα σωμάτια Weibel- Palade έχει αποδειχθεί να περιέχουν και ένα υποσύνολο άλλων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων της Ρ-σελεκτίνης και ενδοθηλίνης (Romani de Wit, 2001). Η μεταφορά του VWF στα σωμάτια θεωρείται ότι οφείλεται στη δράση του προπεπτιδίου, το οποίο φαίνεται να λειτουργεί ως ενδοκυττάριο σηματοδοτικό πεπτίδιο, είτε στη συσσωμάτωση των πολυμερών του VWF, ωστόσο λίγα είναι γνωστά για την ακριβή διαδικασία μέσω της οποίας επιτελείται η μεταφορά και αποθήκευση (Hannah et al. 2002). O VWF αποθηκεύεται στα WPBs με τη μορφή των ULvWF, τα οποία υπο φυσιολογικές συνθήκες δεν ανευρίσκονται στο πλάσμα. Ο VWF εκκρίνεται από τα σωμάτια σε απόκριση σε διάφορα φυσιολογικά ερεθίσματα, όπως η θρομβίνη (Wagner, 1990). Η διαδικασία της έκκρισης από τα σωμάτια πυροδοτείται από την αύξηση του ενδοκυττάριου Ca2 (Denis, 2002). Η ρυθμιζόμενη έκκριση του vwf περιλαμβάνει τη μετατόπιση των οργάνων Weibel- Palade από το κυτταρόπλασμα 27

προς την κυτταρική επιφάνεια και τη σύντηξη με την κυτταρική μεμβράνη (Romani de Wit, 2001). Τα πολυμερή vwf και το προπεπτίδιο vwf εκκρίνονται μαζί σε 1:1 στοιχειομετρική αναλογία, αλλά μετά από την έκκριση, το προπεπτίδιο αποκόπτεται από τα vwf πολυμερή και κυκλοφορεί ανεξάρτητα ως ένα μηομοιοπολικό ομοδιμερές με ένα πολύ σύντομο χρόνο ημιζωής, περίπου 2 h. Τα επίπεδα του προπεπτιδίου στο πλάσμα είναι περίπου 1 μg/ml. Τα πολυμερή vwf απομακρύνονται πιο αργά, με μία ημίσεια ζωή από περίπου 12 ώρες και έχουν μέσο όρο συγκέντρωσης στο πλάσμα 10 g / ml. Το προπεπτίδιο δεν είναι γνωστό να έχει μια ανεξάρτητη φυσιολογική λειτουργία αφού εκκρίνεται (Sadler, 1998). Εικόνα 10. Εγκάρσια και κατά μήκος τομή ενός σώματος Weibel-Palade σε ενδοθήλιο ανθρώπινης ομφάλιας φλέβας. Δείκτης Κλίμακας: 0,1 μm ( E. R. WEIBEL, 2012). 28

Ο βιολογικός ρόλος του VWF O VWF εκτελεί αιμοστατικές λειτουργίες μέσω σύνδεσης σε γλυκοπρωτεΐνες στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, στα συστατικά του συνδετικού ιστού και στον παράγοντα VIII. Θέσεις σύνδεσης για πολλούς από αυτούς τους φυσιολογικά σημαντικούς συνδέτες έχουν εντοπιστεί στην αλληλουχία του VWF. Η πρόσδεση του VWF σε αιμοπετάλια φαίνεται να ρυθμίζεται από την αρχική αλληλεπίδραση του με το συνδετικό ιστό, καθώς επίσης και από τη διατμητική τάση στο ρέον αίμα. Ο vwf είναι παράγοντας κλειδί στη διαδικασία πήξης του αίματος, ιδιαίτερα σε αγγεία μικρής διαμέτρου, όπου επικρατούν συνθήκες υψηλής διατμητικής τάσης. Προσκόλληση αιμοπεταλίων Όταν το τοίχωμα ενός αγγείου τραυματίζεται, ο vwf του πλάσματος αλληλεπιδρά με τα κυκλοφορούντα αιμοπετάλια μέσω δύο μεμβρανικών υποδοχέων: της γλυκοπρωτεΐνης Ib (GPIb) και του συμπλόκου γλυκοπρωτεΐνης IIb-IIIa (GPllb-ΙΙΙα). Ο GPIb συμμετέχει κυρίως στην προσκόλληση αιμοπεταλίων τοιχώματος αγγείου, ενώ το σύμπλοκο GPllb-llla συμμετέχει στην προσκόλληση αιμοπεταλίων τοιχώματος αγγείου και στην αλληλεπίδραση μεταξύ των αιμοπεταλίων. Ο vwf είναι ο μόνος ligand που προάγει την προσκόλληση των αιμοπεταλίων με την προσκόλληση στους δύο από αυτούς τους υποδοχείς (Luo, 2012). Αλληλεπιδράσεις μεταξύ vwf και της υποενδοθηλιακής μήτρας Τραυματισμός του ενδοθηλίου εκθέτει την αγγειακή υποενδοθηλιακή μήτρα σε περιεχόμενα του αγγείου. Όταν οι υποενδοθηλιακές πρωτεΐνες μήτρας στην περιοχή της κάκωσης συντηχθούν με παράγοντες πήξης, ξεκινάει ο σχηματισμός θρόμβου. Η υψηλή διατμητική τάση επιτρέπει διαμορφωτικές αλλαγές εντός του vwf, οι οποίες οδηγούν σε έκθεση περιοχών πρόσδεσης για τα αιμοπετάλια ή το κολλαγόνο. Ο vwf παίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη της προσκόλλησης αιμοπεταλίων πάνω στην εξωκυτταρική μήτρα, κυρίως στο κολλαγόνο. Υπάρχουν δύο μηχανισμοί που μεσολαβούν αυτό το είδος της πρόσφυσης: άμεσος μηχανισμός, με τον οποίο το ινώδες συνδέεται προς τον υποδοχέα GΡΙΙβ-ΙΙΙα άμεσα και ένας έμμεσος μηχανισμός, με τον οποίο ο vwf χρησιμεύει ως παράγοντας γεφύρωσης μεταξύ ινικής και του GPIb αιμοπεταλίων. Η περιοχή Α1 του vwf αλληλεπιδρά κυρίως με κολλαγόνο τύπου VI, αλλά μπορεί επίσης να συνδεθεί, με λιγότερη συγγένεια, στους τύπους I και III κολλαγόνου. Η περιοχή Α3 μπορεί επίσης να συνδέεται με κολλαγόνο, κυρίως τους τύπους κολλαγόνου Ι και ΙΙΙ. 29

Μεταφορέας του Παράγοντα VIII Ο FVIII κυκλοφορεί στο πλάσμα στο μεγαλύτερο ποσοστό ως ανενεργός συμπαράγοντας σχηματίζοντας ένα μη ομοιοπολικό σύμπλοκο με τον vwf. Η αλληλεπίδραση αυτή τον προστατεύει από την προτεόλυση, αυξάνοντας έτσι τον χρόνο ημιζωής του από 2 σε 8-10 ώρες (Sadler, 2008). O vwf και ο VIII σχηματίζουν σύμπλοκο, με ένα μόριο VIII να αντιστοιχεί σε κάθε μονομερές του vwf. Όταν το σύστημα πήξης ενεργοποιείται, η θρομβίνη αποσυμπλέκει τους δυο παράγοντες, με αποτέλεσμα τη μετατροπή του παράγοντα VIII στην ενεργοποιημένη του μορφή (VIIIα). Ο vwf αναστέλλει την αλληλεπίδραση του VIII με τις πρωτεάσες του πηκτικού μηχανισμού όπως ο παράγοντας ΙΧ, ο παράγοντας Χ και η πρωτεΐνη C, με αποτέλεσμα να αποτρέπει την ενεργοποίηση του συστήματος πήξης (Rauch et al. 2013). Συνοπτικά, ο παράγοντας vwf συμμετέχει στις παρακάτω λειτουργίες: Προκαλεί προσκόλληση των αιμοπεταλίων σε περιοχές αγγειακής βλάβης, μέσω της σύνδεσής του με τον υποδοχέα των αιμοπεταλίων GpIb/IX (με την επικράτεια Α1) και με το κολλαγόνο του αγγειακού τοιχώματος (μέσω της επικράτειας Α3) Διευκολύνει τη συσσώρευση αιμοπεταλίων, εξαιτίας της δέσμευσής του με τον υποδοχέα GpIIb/IIa των αιμοπεταλίων Προσδένεται με τον παράγοντα VIΙI και τον προστατεύει από πρωτεολυτική διάσπαση Πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι ο vwf μπορεί να έχει άλλες μη αιμοστατικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης, του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων, να συμμετέχει στη μετάσταση κυτταρικών όγκων και στην ανοσολογική κυτταρική ρύθμιση. Σχηματισμός θρόμβου αιμοπεταλίων Διατμητική τάση Οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις που περιλαμβάνουν κύτταρα, το τοίχωμα του αγγείου και τα διαλυτά μόρια κατά τη διάρκεια μιας κανονικής αιμοστατική απόκρισης επηρεάζονται από τη ροή του αίματος. Η ταχύτητα του αίματος κοντά στο τοίχωμα είναι χαμηλότερη από ότι στο κέντρο του αγγείου, και αυτή η διαφορά δημιουργεί ένα φαινόμενο διάτμησης μεταξύ γειτονικών στρωμάτων του υγρού, που είναι μεγαλύτερη στην επιφάνεια του αυλού και μειώνεται προοδευτικά προς το κέντρο του αγγείου. Το αποτέλεσμα αυτό είναι εντονότερο κοντά στο τοίχωμα του αγγείου. 30

Εικόνα 11. Σχηματική αναπαράσταση της ροής του αίματος εντός του αυλού ενός αγγείου και του φαινομένου της διατμητικής τάσης. Ο ρυθμός διάτμησης είναι η ματαβολή της ταχύτητας σε συνάρτηση με την απόσταση μετρούμενη κάθετα προς την κατεύθυνση ροής (Mendolicchio, Ruggeri, 2004). Ο ρυθμός διάτμησης, μια διαφορά στην ταχύτητα ροής ως συνάρτηση της απόστασης από το τοίχωμα του αγγείου, εκφράζεται σε cm/s ανά cm ή sec -1. Η διατμητική τάση είναι μια δύναμη ανά μονάδα επιφάνειας και εκφράζεται σε Pascal (Pa), που ισοδυναμεί με 1 N/m 2 ή dynes/cm 2 (1 Pa= 10 dynes/cm 2 ). Ο ρυθμός διάτμησης είναι ευθέως ανάλογος προς τη διατμητική τάση και αντιστρόφως ανάλογος προς το ιξώδες του ρευστού. Στο αίμα, όπου το ιξώδες είναι περίπου 0,004 Pa s (ή 0,04 dynes/cm 2 s), διατμηματική τάση 1 dyne/cm 2 αντιστοιχεί σε ρυθμό διάτμησης 25 s -1. Η δύναμη (drag) που αντιτίθεται στην σταθερή προσκόλληση των αιμοπεταλίων και τη συσσωμάτωση αυξάνεται με το ρυθμό διάτμησης. Κατά συνέπεια, τα φαινόμενα διάτμησης είναι περισσότερο έντονα σε εκείνες τις περιοχές των αγγείων όπου οι δυνάμεις διάτμησης είναι μεγαλύτερες (δηλαδή, περισσότερο σε αρτηρίες από ότι στις φλέβες) και, ειδικότερα, σε αρτηρίδια. Ο υψηλότερος ρυθμός τοιχωματικής διάτμησης στην κανονική κυκλοφορία συμβαίνει σε μικρά αρτηρίδια διαμέτρου 10 έως 50 μm όπου τα επίπεδα εκτιμάται ότι κυμαίνονται μεταξύ 500 και 5.000 s -1. Ρυθμοί διάτμησης από 3.000 έως 10.000 s -1 έχουν αποτιμηθεί στην κορυφή πλακών που προκαλούν 50% απόφραξη των στεφανιαίων αρτηριών, και τιμές άνω των 50.000 s -1 έχουν υπολογιστεί στην κορυφή μιας πιο σοβαρής στένωσης. Έτσι, το διατμητικό στρες είναι μεγαλύτερης παθογενικής σημασίας σε καταστάσεις που προδιαθέτουν οξεία αρτηριακή απόφραξη από ό, τι είναι κατά τη διάρκεια της κανονικής αιμόστασης (Mendolicchio, Ruggeri, 2004). Η θρομβογέννεση αρχίζει σε περιοχές αγγειακού τραυματισμού λόγω αλληλεπιδράσεων του τύπου συνδέτη-υποδοχέα, οι οποίες εξαρτώνται από την 31

ταχύτητα του ρέοντος αίματος. Σε ρυθμούς διάτμησης μεγαλύτερους από ~ 1000 sec -1 η όλη διαδικασία εξαρτάται αποκλειστικά από τον vwf και τον υποδοχέα GPIba, ακόμα και σε υποστρώματα στα οποία η προσκόλληση των αιμοπεταλίων μπορεί να πραγματοποιηθεί σε χαμηλότερους ρυθμούς διάτμησης (Savage et al, 1998). Σε αγγεία με χαμηλότερη διατμητική τάση, παράγοντες (όπως οι ιντεγκρίνες) που συμμετέχουν στη διαδικασία της πήξεως, είναι ικανοί να σχηματίσουν δεσμούς με το κολλαγόνο του τραυματισμένου αγγείου και να εκκινήσουν τη διαδικασία της πήξεως χωρίς τη συμμετοχή του VWF, οπότε σε περιπτώσεις χαμηλής διατμητικής τάσης ο ρόλος του VWF είναι λιγότερο κρίσιμος (Denis et al, 2002). Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της αλληλεπίδρασης μεταξύ της Α1 επικράτειας του vwf και του υποδοχέα GPIba είναι η ικανότητα πρόσδεσης των αιμοπεταλίων σε θρομβογόνες επιφάνειες, ακόμα και όταν η ταχύτητα ροής του αίματος κοντά το τοίχωμα του αγγείου είναι αυξημένη. Η μοριακή αρχιτεκτονική του vwf είναι τέτοια που επιτρέπει στο αναδιπλωμένο σφαιροειδές μόριο του vwf να εκπτύσσεται στο ρέον πλάσμα σε περιοχές υψηλής διατμητικής τάσης και με αυτόν τον τρόπο να αποκαλύπτει περισσότερες θέσεις σύνδεσης τόσο για το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο, όσο και για τον GPIba έτσι ώστε να ενισχύεται το αιμοστατικό αποτέλεσμα (Savage et al, 2002). Εντούτοις η αλληλεπίδραση αυτή χαρακτηρίζεται επίσης από έναν ταχύ ρυθμό αποδέσμευσης με αποτέλεσμα τα αιμοπετάλια να μην ακινητοποιούνται πλήρως αλλά να κινούνται διαρκώς με πιο αργό ρυθμό κατά τη ροή του αίματος. Τα αιμοπετάλια διατηρούνται σε συνεχή επαφή με το αγγειακό τοίχωμα, ουσιαστικά «κυλίονται» επί του αγγειακού τοιχώματος και διατηρούνται σε συνεχή μετατόπιση προς την κατεύθυνση ροής του αίματος, διατηρούμενα σε αλληλοδιάδοχη επαφή με την επικράτεια Α1 (de Wit et al, 2001). Ο δεσμός μεταξύ Α1 και GPIba έχει περιορισμένο χρόνο ημίσειας ζωής, ωστόσο είναι αρκετός ώστε να επιβραδύνει συνεχώς τα αιμοπετάλια, με αποτέλεσμα το σχηματισμό περισσότερων δεσμών Α1- GPIba (Lenting et al, 2010). Αυτή η διαδικασία ενισχύεται συνεχώς, μέχρι η συνεχής επαφή των αιμοπεταλίων με το αγγειακό ενδοθήλιο οδηγήσει στην ενεργοποίησή τους και την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών αιιbβ3, που βρίσκονται στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Έτσι, η θέση πρόσδεσης του vwf για την αιιbβ3 εμπλέκεται στην διαμεσολάβηση της αρχικής προσκόλλησης αιμοπεταλίων στο εκτεθειμένο υποενδοθήλιο, αλλά μόνο σε συνεργιστική λειτουργία με την επικράτεια Α1 και τον υποδοχέα GpIba (Ruggeri, 2001). Η τελική σταθερή προσκόλληση των αιμοπεταλίων στην επιφάνεια του ενδοθηλίου γίνεται μέσω σύνδεσης της ιντεγκρίνης αιιbβ3 με την ακολουθία RGD της επικράτειας C1 του vwf (Reininger et al. 2008). 32

Εικόνα 12. Μεταφορά μηνυμάτων που ξεκινούν από την πρόσδεση του vwf στον υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων και προκαλούν την ενεργοποίηση του υποδοχέα GPIIb-IIIa των αιμοπεταλίων (Berndt et al. 2001). Η ενεργοποίηση του υποδοχέα GPIIb-IIIa και ο σχηματισμός δεσμού με την επικράτεια C1 οδηγεί στην αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου των αιμοπεταλίων με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ενδοκυτταρικού μονοπατιού της κινάσης 3 της φωσφατιδυλοινοσιτόλης και της απελευθέρωσης ADP. Η διαδικασία αυτή οδηγεί στην ενεργοποίηση των διερχόμενων αιμοπεταλίων και στη σύνδεσή τους με την αρχική πρώτη στοιβάδα των προσκολλημένων στο αγγειακό ενδοθήλιο αιμοπεταλίων μέσω των ιντεγκρινών της επιφάνειάς τους (Ruggeri et al, 2007). Στη διαδικασία αυτή σημαντικό ρόλο διαδραματίζει το ινωδογόνο και ο VWF, που μεσολαβούν ως γέφυρες συνδεόμενα μεταξύ των παρακείμενων αιμοπεταλίων με αποτέλεσμα την ανάπτυξη επάλληλων στρωμάτων αιμοπεταλίων και την ανάπτυξη αιμοστατικού θρόμβου. 33

Εικόνα 13. Α. Σχηματική αναπαράσταση του μηχανισμού προσκόλλησης των αιμοπεταλίων στον ακινητοποιημένο vwf. Η σύνδεση της GpIba με την επικράτεια A1 προκαλεί την πρώτη επαφή ανάμεσα στα αιμοπετάλια και στον ακινητοποιημένο vwf, που προσδένεται πάνω στα ινίδια κολλαγόνου μέσω της Α3. Ο δεσμός σχηματίζεται ταχύτατα, αλλά έχει περιορισμένο χρόνο ημιζωής, επομένως τα αιμοπετάλια κινούνται κατά μήκος της ροής κυλιόμενα καθώς σχηματίζονται νέοι δεσμοί σε διαφορετικές περιοχές της μεμβράνης τους. Σιγά σιγά η μετατόπιση των αιμοπεταλίων επιβραδύνεται και συνεχίζεται μέχρι που η ιντεγκρίνη αιιbβ3 ενεργοποιείται και προσδένεται στην αλληλουχία RGD της επικράτειας C1. Η σταθερή προσκόλληση που ακολουθεί προάγεται από υποδοχείς αιμοπεταλίων για το κολλαγόνο. Β. Σχηματική αναπαράσταση των μηχανισμών προσκόλλησης των αιμοπεταλίων σε περιοχή που επικρατεί υψηλή διατμητική τάση. Η προσκόλληση του vwf και του ινοδογόνου στην ενεργοποιημένη αιιbβ3 οδηγεί στην επιπλέον επιστράτευση μη ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Η αλληλεπίδραση της GpIba με τον vwf προκαλεί την έναρξη της πρόσδεσης των κυκλοφορούντων αιμοπεταλίων σε αυτά που ήταν ήδη προσκολλημένα. Αυτοί οι δεσμοί είναι προσωρινοί, όπως απεικονίζεται από την αποκόλληση και κύλιση των δυο αιμοπεταλίων στην εικόνα Α, ωστόσο η προσκόλληση σταθεροποιείται μετά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και την έκφραση στην επιφάνειά τους της αιιbβ3. Η τελική σταθεροποίηση της προσκόλλησης επιτυγχάνεται μόνο μετά την πρόσδεση του ινωδογόνου στην ιντεγκρίνη, το οποίο με τον τρόπο αυτό δρα ως η ισχυρότερη γέφυρα για την επάλληλη προσκόλληση των διερχόμενων αιμοπεταλίων στα ήδη προσκολλημένα στο αγγειακό ενδοθήλιο (Ruggeri,2007). 34

H μεταλλοπρωτεάση ADAMTS 13 Η ADAMTS13 αποτελείται απο 1427 αμινοξέα και συντίθεται στα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα και στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα ως γλυκοπρωτεΐνη μοριακού βάρους 180 kda-. Το γονίδιό της βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9q34, έχει μήκος 37 kb και περιέχει 29 εξώνια (Nishio et al 2004). Η δομή της απεικονίζεται στην Εικόνα 14. H ADAMTS13 είναι μέλος της ADAMTS (A Disintegrin And Metalloprotessae with Thrombospondin type-1 motif) οικογένειας των Zn2 εξαρτώμενων μεταλλοπρωτεασών, που σχετίζονται συνήθως με την αποικοδόμηση πρωτεϊνών της εξωκυττάριας μήτρας και όλες περιέχουν (από το ώριμο Ν-τελικό άκρο) μια περιοχή μεταλλοπρωτεάσης (MP), περιοχή που μοιάζει με δισιντεγκρίνη (disintegrin-like, Dis), μια επανάληψη θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (TSP1), μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη (Cys) και μια ενδιάμεση περιοχή (spacer domain) (Levy et al 2005, Zheng et al 2001). Στη συνέχεια, διάφορα μέλη της οικογένειας περιλαμβάνουν διαφορετικούς αριθμούς και τύπους τομέων. Συγκεκριμένα δηλαδή μετά την ενδιάμεση περιοχή η ADAMTS13 περιέχει επτά επιπλέον TSP1 επαναλήψεις και δυο περιοχές CUB στο καρβοξυτελικό άκρο της (Zheng et al, 2001). Οι τομείς μεταλλοπρωτεάσης της οικογένειας ADAMTS χαρακτηρίζονται από ένα μοτίβο σύνδεσης Zn 2+ τύπου ρεπρολυσίνης (HEXXHXXGXXHD) που περιλαμβάνει 3 τέλεια συντηρημένα κατάλοιπα His και συνορεύει με μια «στροφή» μεθειονίνης (Met-turn) που σχηματίζει την τσέπη σύνδεσης του Zn 2+. Επίσης περιέχουν μια ενεργή περιοχή Glu (στην ADAMTS13 βρίσκεται στη θέση 225) η οποία σε συνδυασμό με το Zn 2+ συνεργάζονται με ένα μόριο νερού, που οδηγεί στην υδρόλυση του σχάσιμου δεσμού (Crawley et al 2011). Στην ADAMTS13, μία θέση δεσμεύσεως Ca 2+ υψηλής συγγένειας κοντά στην ενεργή περιοχή είναι επίσης απαραίτητη για να συμβεί αποτελεσματική πρωτεόλυση του vwf (Gardner et al 2009). 35

Εικόνα 14. Η πρωτεάση, ADAMTS13. (Α) Η οργάνωση των επικρατειών της ADAMTS13. Από το Ν-τελικό άκρο είναι η περιοχή μεταλλοπρωτεάσης (ΜΡ:κόκκινο), η επικράτεια disintegrin-like (Dis: κίτρινο), οι TSP επαναλήψεις (1-8: πράσινο), η επικράτεια πλούσια σε κυστεΐνη (Cys: μπλε), ο spacer τομέας (μωβ) και οι CUB επικράτειες (πορτοκαλί). Θέσεις συνδέσεως και λειτουργία συγκεκριμένων τομέων επισημαίνονται παρακάτω. (Β) Δομή των ADAMTS13 Ν-τελικών περιοχών (MDTCS) με βάση την κρυσταλλική δομή του DTCS και μοντελοποίηση ομολογίας της ΜΡ επικράτειας. Οι περιοχές χρωματίζονται ανάλογα με την εικόνα Α. Αναπαράσταση της θέσης υψηλής συγγένειας δέσμευσης ασβεστίου και των συνεργαζόμενων καταλοίπων (πράσινο) στην MP επικράτεια, το ενεργό κέντρο που περιέχει 3 υπολείμματα His (κόκκινο) και καταλυτική Glu225 (μωβ), η disintegrin-like εξωθέση και εξωθέση spacer (Crawley et al 2011). O VWF είναι το μόνο γνωστό υπόστρωμα της ADAMTS13, η οποία διασπά σε μία και μόνη θέση (Tyr1605-Met1606) την επικράτεια Α2. Σε αντίθεση με πολλές πρωτεάσες του πλάσματος, η ADAMTS13 είναι ιδιοσυστατικά δραστική (δηλαδή, ούτε απελευθερώνεται ειδικά ή ενεργοποιείται ειδικά από μία λανθάνουσα μορφή όταν χρειάζεται) και επίσης έχει ένα πολύ μεγάλο χρόνο ημιζωής στο πλάσμα (εκτιμάται σε 2-3 ημέρες) (Furlan et al 1999). Για τους λόγους αυτούς, είναι σημαντικό η ADAMTS13 να είναι εξαιρετικά ειδική για να εξασφαλιστεί ότι δεν πρωτεολύει άλλους στόχους μη ειδικά. Η ADAMTS13 μπορεί να συνδεθεί με τον σφαιρικό VWF, αλλά δεν συμβαίνει πρωτεόλυση στην περίπτωση αυτή (Feys et al 2009). Η πρωτεόλυση του VWF πραγματοποιείται αφού έχει ξεδιπλωθεί από διατμητική τάση, επειδή η θέση κοπής παραμένει κανονικά θαμμένη όσο ο VWF 36

βρίσκεται στη σφαιρική διαμόρφωση. Μόλις VWF εκτυλιχθεί, απαιτούνται εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ VWF και των τομέων της ADAMTS13 για την αποτελεσματική διάσπαση. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις εμφανίζονται, τουλάχιστον εν μέρει, για να προσδώσουν υψηλή εξειδίκευση υποστρώματος (Zanardelli et al 2009). Εικόνα 15. Το ενεργό κέντρο της ADAMTS13 και η θέση διάσπασης του VWF. (Α) Μοριακό μοντέλο της ADAMTS13 μεταλλοπρωτεάσης (MP) και δισιντεγκρίνης (Dis). Η σχισμή ενεργού κέντρου. Ενεργό κέντρο (Zn 2+, οι 3 συνεργαζόμενες His224, His228, και His234, καθώς και το καταλυτικό κατάλοιπο Glu225) και οι εξωθέσεις της επικράτειας δισιντεγκρίνης. Σημειώνεται επίσης ο υψηλής συγγένειας λειτουργικός Ca 2+ βρόχος δέσμευσης. Οι περιοχές του τομέα μεταλλοπρωτεάσης που είναι προβλέπεται να συμμετέχουν στη σύνδεση είναι οι S3, S2, S1, S1; και S2; επισημαίνονται με διαφορετικά χρώματα. (Β) Τα υπολείμματα τομέα VWF Α2 Leu1603-Asp1614. Το Ρ3, Ρ2, Ρ1, Ρ1;, Ρ2;, και P9; κατάλοιπα του VWF που είναι σημαντικά για την πρωτεόλυση επισημαίνονται και είναι χρωματισμένα σύμφωνα με τις προβλεπόμενες συμπληρωματικές τοποθεσίες τους (S) στη μεταλλοπρωτεάση. Για την κοπή της Α2 είναι απαραίτητη η σύνδεση με Zn ή Ca καθώς και η εκπτύχωσή της είτε εντός του ρέοντος πλάσματος είτε επί του τοιχώματος του αγγείου κάτω από συνθήκες υψηλής διατμητικής τάσης (Majerus et al 2003). Η ADAMTS13 συνδέεται με τον εκδιπλωμένο VWF με υψηλή συγγένεια (KD ~ 10-20 nm). Ένα σημαντικό βήμα τόσο στη σύνδεση με τον vwf όσο και στην πρωτεόλυση είναι η 37

σύνδεση της διαχωριστικής περιοχής (spacer domain) (η οποία περιλαμβάνει τα κατάλοιπα Arg568, Arg660, Tyr661, και Tyr665) επάνω στο καρβοξυτελικό άκρο της επικράτειας Α2 (υπολείμματα 1659-1668). φαίνεται ότι αυτή η αλληλεπίδραση διαμεσολαβεί αρκετά στην σφικτή σύνδεση μεταξύ VWF και ADAMTS13. Ωστόσο, αν και αυτό προσεγγίζει τα 2 μόρια κοντά, αυτές οι αλληλεπιδράσεις λαμβάνουν χώρα σε κάποια απόσταση (~ 110 A ) από τη θέση κοπής και το ενεργό κέντρο, αντίστοιχα. Μόλις ξεδιπλώνεται η επικράτεια Α2 του VWF, αποκαλύπτονται επιπλέον θέσεις δέσμευσης για την ADAMTS13. Για να διερευνηθεί πού βρίσκονται αυτές οι θέσεις δέσμευσης εντός της A2 επικράτειας, έχουν χρησιμοποιηθεί ως υποστρώματα μικρά θραύσματα του VWFA2, όπως τα VWF115 και VWF73. Μεταλλάγματα αυτών των θραυσμάτων έδειξαν ότι κατάλοιπα Glu1660-Arg1668 της Α2 συμβάλλουν αισθητά στην διάσπαση του δεσμού Tyr1605-Met1606 (Kokame et al 2004). Οι Gao et al διαπίστωσαν ότι η διάμεση περιοχή της ADAMTS13 δεσμεύεται σε αυτή την αλληλουχία, που αναφέρεται ως εξωθέση της Α2, και ότι η διαγραφή του, είτε από την διάμεση περιοχή της ADAMTS13, ή της εξωθέσης της επικράτειας Α2, μείωσαν τη διάσπαση του VWF73 περίπου 20 φορές (Gao et al 2006). Οι Wu et al απομόνωσαν βραχέα πεπτίδια που περιέχουν την εξωθέση της επικράτειας Α2 που ήταν ικανά να αναστέλλουν τη διάσπαση των μικρών υποστρωμάτων και του πλήρους μήκους πολυμερικού VWF (Wu et al 2006). Αυτή η εξωθέση της Α2 είναι κρυμμένη καθόσον δεν εκτίθεται στην απομονωμένη διπλωμένη επικράτεια Α2 ή σε σφαιρικά VWF. Η έκθεση αυτής της μυστικής εξωθέσης απαιτεί την εξαγωγή του γειτονικού μοριακού βύσματος που σχηματίζεται από το γειτονικό δισουλφιδικό δεσμό, Cys1669-Cys1670 και την απόζευξη της καρβοξυτελικής α-έλικας στην οποία υπάρχουν τα υπολείμματα Glu1660-Arg1668. Καθώς αυτή η περιοχή προβλέπεται να ξεδιπλώνεται πρώτη, ακόμη και μερικό ξεδίπλωμα της επικράτειας A2 θα μπορούσε να είναι επαρκές για την δέσμευση της διάμεσης περιοχής (spacer domain) (James et al 2011). Ο τομέας Dis παίζει επίσης καθοριστικό ρόλο επιτρέποντας συγκεκριμένη πρωτεόλυση μέσω αλληλεπίδρασης με υπολείμματα κοντά (~ 26 A ) στη θέση κοπής περιλαμβάνοντας ιοντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ Asp1614 στον VWF και Arg349 που βοηθά την τοποθέτηση του Tyr1605-Met1606 μέσα στη δραστική θέση στη σχισμή του τομέα ΜΡ. Χωρίς την παρουσία αυτών των βοηθητικών τομέων, ο τομέας ΜΡ δεσμεύει τον vwf με πολύ χαμηλή συγγένεια και επίσης χάνει κάποια εξειδίκευση στη θέση διάσπασης. Ωστόσο, παρά τη σημασία αυτών των θέσεων συνδέσεως για την πρωτεόλυση, η περιοχή ΜΡ πρέπει επίσης οπωσδήποτε να αλληλεπιδρά με το υπόστρωμα κοντά στο σημείο διάσπασης και να συνδέεται σε περιοχές που συμβάλλουν στην εξειδίκευση κοπής του συγκεκριμένου δεσμού. 38

Σημαντική για την ενζυματική κοπή του VWF είναι η σύνδεση της ADAMTS13 και προς το αμινοτελικό άκρο της θέσης κοπής. Βρέθηκε ότι το κατάλοιπο Ρ3 του vwf, η Leu1603, παίζει σημαντικό ρόλο στην πρωτεόλυση της θέσης κοπής αλληλεπιδρώντας με την αντίστοιχη θέση S3 της ADAMTS13, που αποτελείται από τα κατάλοιπα Leu198, Leu232, and Leu274 (Xiang et al 2011). Αναμφισβήτητα, οι Ρ1(Tyr1605) και Ρ1 (Met1606) περιοχές πρέπει να έχουν ειδική συμπληρωματικότητα με τις αντίστοιχες περιοχές S1 και S1 στην ADAMTS13. H S1 περιοχή, που συνδέεται με το υπόλειμμα Ρ1, περιλαμβάνει κατά πάσα πιθανότητα τα υδρόφοβα κατάλοιπα Leu151 και Val195 (Xiang et al 2011). Αντίστοιχα τα κατάλοιπα Asp252-Pro256 της ADAMTS13 αποτελούν την S2 περιοχή και έχουν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της θέσης πρόσδεσης της P2 (Met). Εικόνα 16. Πρωτεόλυση του vwf από την ADAMTS13. Ο vwf κυκλοφορεί στο πλάσμα ως πολυμερές (Α) που υιοθετεί μια σφαιρική διάταξη. Κάθε πολυμερές αποτελείται από δισουλφιδικά συνδεμένα μονομερή vwf(β). Στη σφαιρική διαμόρφωσή της, η θέση σύνδεσης του κολλαγόνου με την Α3 είναι εκτεθειμένη. Η ADAMTS13 μπορεί να συνδεθεί με το σφαιρικό vwf μέσω των TSP (5-8) και CUB τομέων (C), στάδιο 1. Αυτό επιτρέπει να σχηματιστούν σύμπλοκα vwf και ADAMTS13 και να κυκλοφορούν στο πλάσμα. Υπό αυξημένες δυνάμεις διάτμησης, ο 39

vwf μπορεί να εκδιπλωθεί να εκτεθεί η θέση πρόσδεσης της Α1 για τη GPIbα. Αυτές οι δυνάμεις διάτμησης αφαιρούν επίσης το μοριακό βύσμα που σχηματίζεται από το γειτονικό δισουλφιδικό δεσμό στην επικράτεια Α2, προκαλείται ξεδίπλωμα της Α2 (D), στάδιο 2. Αυτό το ξεδίπλωμα αποκαλύπτει εξωθέσεις που επιτρέπουν τη διάμεση περιοχή της ADAMTS13 να δεσμεύεται στην ξεδιπλωμένη Α2 (Ε), στάδιο 3. Στη συνέχεια, μια κρίσιμη αλληλεπίδραση μεταξύ D1614 και του τομέα Dis βοηθά προσέγγιση και τοποθέτηση της θέσης κοπής (F), στάδιο 4. Αυτό επιτρέπει περαιτέρω αλληλεπιδράσεις με τη μεταλοπρωτεάση, συμπεριλαμβανομένης μιας ουσιαστικής αλληλεπίδρασης μεταξύτης περιοχής S3 με την L1603 στον vwf (G), βήμα 5. Μαζί, αυτές οι αλληλεπιδράσεις επιτρέπουν τη MP να συνδεθεί μέσω των S1 και S1 με τη θέση διάσπασης, βήμα 6, και να συμβεί η πρωτεόλυση, βήμα 7.(James et al 2011) Το μέγεθος των πολυμερών του vwf παίζει καθοριστικό ρόλο στη λειτουργία του, καθώς τα μεγαλύτερα πολυμερή όχι μόνο διαθέτουν περισσότερες θέσεις σύνδεσης με το κολλαγόνο και τα αιμοπετάλια, αλλά επιπλέον ξεδιπλώνονται γρηγορότερα αποκαλύπτοντας με τον τρόπο αυτό τις περιοχές δέσμευσης των αιμοπεταλίων. Το μέγεθος των πολυμερών (και συνεπώς η ικανότητα του vwf να προσδένει τα αιμοπετάλια) ρυθμίζεται από την ADAMTS13. Δηλαδή η ADAMTS13 περιορίζει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων στη μικροκυκλοφορία και το σχηματισμό μικροθρόμβων μέσω της κοπής της εκπτυχωμένης επικράτειας Α2 του ακινητοποιημένου στο αγγειακό τοίχωμα vwf (Dong et al 2002). Συγκεκριμένα η ADAMTS13 υδρολύει τον πεπτιδικό δεσμό μεταξύ των αμινοξέων Tyr1605-Met1606 στην επικράτεια Α2, διασπώντας τον vwf σε μικρότερα πολυμερή, όπως ειπώθηκε και πιο πριν. Μπορεί να θεωρηθούν τρεις ξεχωριστές τοποθεσίες πρωτεόλυσης του vwf από την ADAMST13: (1) οι νεο-εκκρινόμενες χορδές του vwf από την ενδοθηλιακή επιφάνεια των κυττάρων, (2) οι UL-vWF στην ελεύθερη κυκλοφορία, και (3) ο εκδιπλωμένος vwf σε θέσεις σχηματισμού αιμοπεταλιακού βύσματος. Παρόλο που η πρωτεόλυση σε κάθε μία από αυτές τις περιπτώσεις θα μπορούσε να εκπληρώσει διαφορετικούς σκοπούς, η αντίδραση διάσπασης οδηγείται από τοπικές δυνάμεις διάτμησης που αποκαλύπτουν τις εξωθέσεις της Α2 που επιτρέπουν την παραγωγική δέσμευση της ADAMTS13. Καταστροφή του αγγείου εκθέτει το κολλαγόνο, στο οποίο προσδένεται ο vwf και ξετυλίγεται συνέχεια σε απόκριση προς δυνάμεις διάτμησης. Αυτό, με τη σειρά του, επιτρέπει να δεσμευτούν τα κυκλοφορούντα αιμοπετάλια. Η δέσμευση της GPIbα στον vwf λαμβάνει χώρα με ταχείς ρυθμούς, με ποσοστά που υπερβαίνουν το ποσοστό πρωτεόλυσης του vwf 40

από την ADAMTS13. Επιπλέον, στις θέσεις της βλάβης του αγγείου, η παρουσία του κολλαγόνου και της θρομβίνης που παράγεται με ενεργοποίηση του μηχανισμού της πήξης του μπορεί να λειτουργήσει ως ισχυρός τοπικός παράγοντας πρόσληψης των αιμοπεταλίων, που παρακινούν περαιτέρω πρόσφυση και συσσώρευση ανεξάρτητα από τον vwf. Αυτά τα συσσωρευμένα αιμοπετάλια μπορεί να γίνουν ανθεκτικά στις συνέπειες της πρωτεόλυσης του vwf από την ADAMTS13. Καθώς αναπτύσσεται το αιμοπεταλιακό βύσμα, ωστόσο, μεγαλώνει πέρα από την περιοχή του τραυματισμού. Σε αυτές τις περιοχές, αν και ο ξεδιπλωμένος vwf μπορεί να προσδέσει αιμοπετάλια μέσω GPIbα, η δέσμευση δεν γίνεται τόσο αποτελεσματικά όσο υπό τις επιδράσεις του κολλαγόνου και της θρομβίνης. Αυτό κατά πάσα πιθανότητα παρέχει περισσότερο χρόνο στην ADAMTS13 να διασπάσει τον vwf, και έτσι ρυθμίζει την ανάπτυξη αιμοπεταλιακού βύσματος, περιορίζοντάς το στην περιοχή της βλάβης του αγγείου (James et al 2011). Το σενάριο είναι διαφορετικό για τον vwf που είτε εκκρίνεται πρόσφατα από το ενδοθήλιο, ή όταν υπάρχουν μεγαλύτερα πολυμερή vwf σε ελεύθερη κυκλοφορία, που μπορεί φυσικά να εκδιπλωθούν και να εκθέσουν τη θέση πρόσδεσης GPIbα. Σε αυτές τις περιπτώσεις, το ξεδίπλωμα λαμβάνει χώρα απουσία κολλαγόνου ή θρομβίνης που θα μπορούσαν διαφορετικά να ενεργοποιήσουν τα δεσμευμένα αιμοπετάλια. Καθώς η πρόσδεση των αιμοπεταλίων σε αυτές τις περιπτώσεις δεν πραγματοποιείται υπό τις επιδράσεις τέτοιων αγωνιστών, και, επιπλέον, καθώς η διαδικασία αυτή προωθεί επίσης το ξεδίπλωμα της επικράτειας Α2, μπορεί να συμβεί η πρωτεόλυση του vwf από την ADAMTS13, αν και σχετικά αργά (James et al 2011). Η επακόλουθη μείωση στο μέγεθος των vwf πολυμερών μειώνει τις διατμητικές δυνάμεις που ασκούνται επί των πρωτεολυθέντων μορίων, επιτρέποντάς τα να υιοθετήσουν μια ήρεμη σφαιρική διάταξη. Η πρωτεόλυση στο πλάσμα έτσι εξουδετερώνει το σχηματισμό ανεπιθύμητων πλούσιων σε αιμοπετάλια θρόμβων σε μικροαγγεία. 41

Εικόνα 17. Θέσεις της διάσπασης vwf από την ADAMTS13. vwf πολυμερή διαφόρων μεγεθών, συμπεριλαμβανομένων των UL-vWF, μπορεί να εκκρίνονται απευθείας στην κυκλοφορία. (1) Εναλλακτικά, ένα ποσοστό των UL-vWF μπορεί να συνδεθεί στην επιφάνεια του ενδοθηλίου κατά τη διάρκεια της εξωκύττωσης και να εκδιπλωθεί σε απόκριση δυνάμεων διάτμησης. Υπό αυτές τις συνθήκες, ο τομέας vwf Α2 ξετυλίγεται και ενεργοποιείται η ADAMTS13 (κόκκινο ψαλίδι). Kατά τη διάρκεια της διέλευσης μέσω μικρών αγγείων, ο σφαιρικός UL-vWF σε ελεύθερη κυκλοφορία μπορεί να εκδιπλωθεί (τουλάχιστον εν μέρει / παροδικά). (2) Αυτό το ξεδίπλωμα επιτρέπει την επεξεργασία των μεγαλύτερων και πιο ενεργών αιμοστατικά μορφών του vwf, με αποτέλεσμα τη μετατροπή τους σε μικρότερα πολυμερή στο πλάσμα. Σε σημεία βλάβης των αγγείων, η ενδοθηλιακή βλάβη έχει ως αποτελέσματα την έκθεση υποενδοθηλιακού κολλαγόνου. Ο vwf του πλάσματος συνδέεται με αυτό, ξετυλίγεται, και, με τη σειρά του, στρατολογεί αιμοπετάλια. Η παρουσία του κολλαγόνου και της θρομβίνης προκαλεί ταχεία ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, η οποία ενοποιεί το βύσμα των αιμοπεταλίων. Η θρομβίνη σταθεροποιείται περαιτέρω μέσω της εναπόθεσης του ινώδους και τη πρωτεολυτικής απενεργοποίησης της ADAMTS13. (3) Λίγο πιο πέρα από την περιοχή του τραυματισμού (δηλαδή, εν απουσία του κολλαγόνου και της θρομβίνης), τα συμπλέγματα vwf-αιμοπεταλίων δύνανται να πρωτεολυθεί από την ADAMTS13, η οποία με τη σειρά της ρυθμίζει το σχηματισμό του αιμοπεταλιακού βύσματος. Η σημασία της ADAMTS13 καταδεικνύεται στους ασθενείς με ανεπάρκεια της μεταλλοπρωτεάσης, οι οποίοι αναπτύσσουν θρομβωτική μικροαγγειοπάθεια (Levy et al 2001). Ο σχηματισμός θρόμβων πλούσιων σε αιμοπετάλια οφείλεται στην παραμονή στο πλάσμα των ασθενών αυτών των ULvWF σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από τις φυσιολογικές, λόγω απουσίας της ADAMTS13. 42

Η δομή της επικράτειας Α1 του vwf Η επικράτεια Α1 αντιστοιχεί στα αμινοξέα 497 έως 716 του ώριμου vwf. Η δομή της επικράτειας Α1 παρουσιάζει πολλές ομοιότητες με την επικράτεια Α3 του vwf (Εικόνα 18) και την περιοχή Ι της ιντεγκρίνης και διαθέτει την τυπική αναδίπλωση που συναντάται στις πρωτεΐνες που διαθέτουν επαναλήψεις πλούσιες σε λευκίνες (Kobe et al. 2001). Έχει μοριακό βάρος περίπου 20 kda. Αποτελείται από ένα κεντρικό υδρόφοβο β-πτυχωτό φύλλο με 6 ελάσματα (A-F) που περιβάλλεται από 7 πλευρικές αμφιπαθείς α-έλικες (1-7)(Celikel et al. 1998). Εικόνα 18. Σχηματική αναπαράσταση της επικράτειας Α1. Διακρίνεται ο δισουλφιδικός δεσμός Cys 509 Cys 695. (Springer 2014) Το συνολικό σχήμα είναι κυβοειδές με έξι κατά προσέγγιση επίπεδες επιφάνειες. Οι διαστάσεις της επικράτειας είναι 40 Å σε ύψος, 30 Å πλάτος και 40 Å μήκος. Η συνολική κατανομή του φορτίου στην επιφάνεια είναι ανομοιογενής με τόσο θετικές όσο και αρνητικά φορτισμένες περιοχές. Ένας μεγάλος αριθμός φορτισμένων αμινοξέων σχηματίζουν ένα εκτεταμένο δίκτυο ιοντικών γεφυρών, το οποίο εξηγεί σε σημαντικό βαθμό και τη μεγάλη σταθερότητα της επικράτειας (Mohri et al. 1988). Στην κάτω επιφάνεια εντοπίζεται ένας ενδομοριακός δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ των Cys 509 Cys 695, ενώ στις πλάγιες επιφάνειες συγκεντρώνονται θετικά και αρνητικά φορτισμένα κατάλοιπα αμινοξέων. Η κάτω επιφάνεια επίσης περιλαμβάνει το αμινο- και καρβοξυ- τελικό άκρο και τους βρόγχους που συνδέουν τις α- έλικες με το αμινοτελικό άκρο του β-πτυχωτού φύλλου. Η πρόσθια επιφάνεια εντοπίζεται στη μια άκρη του β-πτυχωτού φύλλου 43

και περιλαμβάνει τις πλάγιες αλυσίδες από τις έλικες α3 και α4, την αλυσίδα βc και τους βρόγχους που τις συνδέουν. Περιλαμβάνει επίσης τμήμα του δικτύου ιοντικών γεφυρών. Η πάνω επιφάνεια εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο του β-πτυχωτού φύλλου και αποτελείται από βρόγχους που συνδέουν το πτυχωτό φύλλο με τις συνορεύουσες έλικες. Η δεξιά επιφάνεια περιλαμβάνει τις έλικες α4, α5 και α6 που εντοπίζονται στη μια πλευρά του β-πτυχωτού φύλλου και είναι βασική. Η αριστερή πλευρά περιλαμβάνει τις έλικες α1, α3 και α7 που εντοπίζονται στην απέναντι πλευρά του β-πτυχωτού φύλλου και είναι όξινη. Η πίσω επιφάνεια περιλαμβάνει τις έλικες α6 και α7 και την αλυσίδα βf. (βλ. Εικόνα 19) (Emsley et al. 1998). Εικόνα 19. Χωροπληρωτκό μοντέλο των τεσσάρων επιφανειών της επικράτειας Α1. Όλα τα κατάλοιπα αμινοξέων χρωματίζονται γκρίζα, εκτός από τις λυσίνες και τις αργινίνες που είναι μπλε, ασπαρτικά και γλουτμινικά οξέα που είναι κόκκινα και τις ιστιδίνες που είναι πράσινες. Διακρίνεται και η πιθανή περιοχή πρόσδεσης της ηπαρίνης (κυκλωμένη). 44

Λειτουργία Α1 επικράτειας Η κύρια λειτουργία της Α1 επικράτειας είναι η σύνδεση με την γλυκοπρωτεΐνη GPIba της επιφάνειας των αιμοπεταλίων στην περίπτωση αγγειακής βλάβης (και έκθεση υπενδοθηλιακού κολλαγόνου) καθώς και η σύνδεση με το κολλαγόνο τύπου VI (Dumas et al. 2004). Η αλληλεπίδραση του VWF με του υπενδοθηλιακό κολλαγόνο μέσω της επικράτειας Α3 και η αλλαγή της διαμόρφωσής του υπό την επίδραση υδροδυναμικών δυνάμεων προκαλεί την έκθεση του κέντρου πρόσδεσης της Α1 για τον υποδοχέα GPIba (Emsley et sl. 1998). Η πρωτοταγής δομή της ώριμης πρωτεΐνης vwf δείχνει ότι η επικράτεια Α1 συνορεύει με την επικράτεια D3 στην Ν- τελική περιοχή και την επικράτεια Α2 στην C-τελική περιοχή. Μέχρι σήμερα, μόνο οι D και D3 επικράτειες έχουν περιγραφεί ως εμπλεκόμενες στην αλληλεπίδραση του vwf με τον GPIba, θωρακίζοντας την επικράτεια A1 (Ulrichts et al. 2006). Ωστόσο, οι παρατηρήσεις από αρκετές μελέτες έχουν υποδείξει ότι η παρακείμενη επικράτεια Α2 μπορεί επίσης να εμπλέκεται στη ρύθμιση της δραστικότητας πρόσδεσης της επικράτειας Α1 (Martin et al. 2007). Ο υποδοχέας GPIbα είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που αποτελεί το μεγαλύτερο συστατικό του συμπλέγματος των μεμβρανικών υποδοχέων GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων που αποτελείται από τις τέσσερεις υπομονάδες, GPIbα, GPIbβ, GPIbX και GPIbV. Η πρόσδεση στην επικράτεια Α1 διαμεσολαβείται από τα τελευταία 290 αμινοξέα της αμινοτελικής περιοχής της GPIba (Huizinga et al. 2002). Η θέση πρόσδεσης της Α1 με τη γλυκοπρωτεΐνη GPIb/IX/V βρίσκεται μέσα στην περιοχή που ορίζεται από την αμινοξική ακολουθία 480-718. Συγκεκριμένα, τα αμινοξέα που συμμετέχουν αυτή την αλληλεπίδραση είναι τα Leu-480, Val-481, Gly-718. Η περιοχή αυτή περιέχει τον ενδομοριακό δισουλφιδικό δεσμό της Α1 ( Cys 509 Cys 695) και δημιουργεί μια ιδιαίτερα θετικά φορτισμένη περιοχή μέσα στον βρόγχο της Α1 και δυο μη συνεχόμενες ανιοντικές πλευρικές ακολουθίες. Επίσης η αλληλουχία Asp-514-Glu-542, η οποία βρίσκεται μέσα στο βρόγχο που ορίζεται από τον δισουλφιδικό δεσμό, συμμετέχει στην αλληλεπίδραση με την GPIb/IX/V (Cruz et al. 2000). Σε ένα εξαιρετικά ηλεκτροστατικό περιβάλλον, η θετικά φορτισμένη όψη της Α1 συνδέεται με την αρνητικά φορτισμένη, κοίλη όψη του GPIba. Η επικράτεια Α1 είναι η πιο θετικά φορτισμένη περιοχή του vwf με ένα υπολογισμένο ισοηλεκτρικό σημείο 9.4. Ο στατικός ηλεκτρισμός μπορεί, συνεπώς, να συμβάλλει στην επιτάχυνση του ρυθμού της σύνδεσης Α1 και GPIba (Springer, 2014). 45

Εικόνα 20. Τα σύμπλεγμα Α1-GPIba. Δημιουργείται ένα υπερ β-φύλλο στη διεπαφή μεταξύ της αλυσίδας β3 της επικράτειας Α1 και της β14 του υποδοχέα GPIba (Springer, 2014). Άλλες περιοχές μέσα στο βρόγχο της Α1 έχουν ταυτοποιηθεί ως θέσεις που αλληλεπιδρούν με σουλφατίδες της κυτταρικής επιφάνειας, κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ και VI, ηπαρίνη και υπενδοθηλιακές ηπαράνες. Η επικράτεια Α1 αλληλεπιδρά επίσης με πρωτεΐνες που προκαλούν την ενεργοποίηση του vwf, όπως πρωτεΐνες που έχουν απομονωθεί από δηλητήρια φιδιών, όπως είναι η βοτροσετίνη, η βιτισετίνη και η ζαρασετίνη. Παρόμοια ενεργοποίηση προκαλεί και το βακτηριακό γλυκοπεπτίδιο ριστοσετίνη. Ενώ η βοτροσετίνη δεσμεύεται σε ακολουθίες που βρίσκονται εντός του βρόγχου που ορίζεται απο τον ενδομοριακό δισουλφιδικό δεσμό του Α1, η ριστοσετίνη δεσμεύεται σε ακολουθίες πλούσιες σε προλίνη που βρίσκονται στις ανιονικές πλευρικές αλυσίδες (Emsley et al. 1998). 46

Η δομή της επικράτειας Α2 Η δομή της επικράτειας Α2 του vwf έχει προσδιοριστεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ σε ευκρίνεια 1.9 Å. Αποτελείται από έναν υδρόφοβο πυρήνα β πτυχωτού φύλλου με έξι β ελάσματα (σε σειρά β3, β2, β1, β4, β5, β6 με το β3 αντιπαράλληλο) και έξι α έλικες. Οι αμφιπαθείς α έλικες, όπως και στις επικράτειες Α1 και Α3, περιβάλλουν το κεντρικό β-φύλλο. Η επικράτεια Α2 ξεχωρίζει από τις άλλες επικράτειες Α του vwf, καθώς δε διαθέτει την έλικα α4. Στη θέση της υπάρχει ένας επιμήκης βρόχος που εκτείνεται από το καρβοξυτελικό άκρο του ελάσματος β4 μέχρι το αμινοτελικό άκρο του ελάσματος β5 και καλείται βρόχος α4. (Zhang et al. 2009). Εικόνα 21. Η τριτοταγής δομή της επικράτειας Α2 του vwf, όπου διακρίνεται ο βρόχος α4 (ροζ) και η θέση πρωτεόλυσης της ADAMTS13 στο βρόχο α3β4. Στη δεξιά εικόνα παρουσιάζεται υπέρθεση των επικρατειών Α1 και Α3 (Zhang et al. 2009). Μορφολογικά ο α4 βρόγχος βρίσκεται ανάμεσα στις έλικες α3 και α5. Η πλευρική αλυσίδα Asp1614 του βρόγχου καλύπτει το αμινοτελικό άκρο της α3-έλικας με σχηματισμό πολλαπλών δεσμών H με τα άζωτα των πρώτων καταλοίπων αμινοξέων της α3-έλικας (Εικόνα 21 Α,Β). Τα κατάλοιπα 1615-1619 έχουν μια παρόμοια τοπολογικά λειτουργία με την α4-έλικα που λείπει, θάβοντας το υδρόφοβο κεντρικό β-φύλλο. Η πλευρική αλυσίδα του καταλοίπου Ile1616 είναι θαμμένη κάτω από το βρόχο σε μια επαφή με το υπόλειμμα Met1606 της θέσης διάσπασης από την ADAMTS13. Ομοίως, το κατάλοιπο Leu1619 θάβεται σε μια υδρόφοβη επαφή με το κεντρικό β-φύλλο (Εικόνα 21Α). Επιπλέον, το κατάλοιπο Arg1618 του βρόγχου καλύπτει το καρβοξυτελικό άκρο της α5-έλικας με δεσμούς υδρογόνου σε οξυγόνα του καρβονυλίου στο καρβοξυτελικό άκρο της α5 έλικας (Εικόνα 21 Α,C). Έτσι, τα 47

δίπολα των α3 - και α5-έλικων αλληλεπιδρούν με τα φορτισμένα υπολείμματα Asp1614 και Arg1618, αντίστοιχα. Μαζί, τα θαμμένα υδρόφοβα κατάλοιπα και τα κατάλοιπα που καλύπτουν τις έλικες βοηθούν στη σταθεροποίηση της διαμόρφωσης του α4 βρόχου (Zhang et al. 2009). Εικόνα 22. Το περιβάλλον του α4 βρόχου. (Α) Τα δίπολα των α3 και α5 ελίκων (Β) Η αμινοτελική κάλυψη του Asp-1614. (Γ) Η καρβοξυτειλή κάλυψη του Arg1618. Οι δεσμοί υδρογόνου εμφανίζονται με διακεκομμένες γραμμές. Μεταξύ δύο γειτονικών καταλοίπων κυστεϊνών στις θέσεις Cys1669 και Cys1670 στο τέλος της έλικας α6 σχηματίζεται δισουλφιδικός δεσμός που δρα ως φραγμός της αποδιάταξης της επικράτειας Α2 λόγω της δύναμης. Αυτό το εύρημα είναι ασυνήθιστο και αποτελεί σημαντικό στοιχείο του υδρόφοβου χαρακτήρα της επικράτειας Α2. Ανάμεσα στην κύρια αλυσίδα και τις πλευρικές αλυσίδες του δισουλφιδικού δεσμού μεταξύ των γειτονικών κυστεϊνών σχηματίζεται ένας ασυνήθιστος 8-μελής δακτύλιος που προσδίδει ακαμψία, η οποία είναι σημαντική στην αντίσταση της δύναμης (Zhang et al. 2009). Στο εσωτερικό της δομής της επικράτειας Α2 εντοπίζεται ένας αριθμός μορίων ύδατος με κυριότερα ένα μόριο ύδατος στην πιο υδρόφοβη περιοχή του πυρήνα και τρία μόρια ύδατος στην υδρόφιλη περιοχή κοντά στο έλασμα β4. Το έλασμα β4 είναι τοποθετημένο μη συμπαγώς σε σχέση με τα άλλα ελάσματα και χαρακτηρίζεται από στροφόμετρα των πλευρικών αλυσιδών. Ακόμη, το έλασμα β4 είναι κατά ένα κατάλοιπο μικρότερο σε σχέση με τις άλλες επικράτειες Α, διότι το κατάλοιπο Pro1601 σχηματίζει ένα λιγότερο δεσμό υδρογόνου από τα αντίστοιχα κατάλοιπα Ser των περιοχών Α1 και Α3 (Zhang et al. 2009). 48

Εικόνα 23. Ο δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ γειτονικών κυστεϊνών και η υδρόφοβη τσέπη του. Ένα μόριο νερού σε ένα υψηλά υδρόφοβο περιβάλλον.το νερό συμβολίζεται με σφαίρα, εμφανίζονται και τα στροφομερή του Ser1517. Η περιοχή πέψης της μεταλλοπρωτεάσης ADAMTS13 βρίσκεται μεταξύ των καταλοίπων Tyr1605-Met1606 και εντοπίζεται στο κέντρο του β πτυχωτού φύλλου, κοντά στο μέσο του κεντρικού ελάσματος β4, στο εσωτερικό της κοιλότητας του βρόχου α4 (Moriki et al, 2010). Το κατάλοιπο Met1606 βρίσκεται ακριβώς κάτω από τον βρόχο α4. Η θέση της πρωτεόλυσης βρίσκεται βαθιά κρυμμένη στον υδροφοβικό πυρήνα του β-φύλλου και για να αποκαλυφθεί η θέση αυτή και να επιτραπεί η πρόσβαση της ADAMTS13, θα πρέπει να αποδιαταχθεί η επικράτεια A2, τουλάχιστον μέχρι το έλασμα β4, σε συνθήκες διατμητικής τάσης (Zhang et al. 2009, Baldauf et al. 2009). Η αποδιάταξη θα προχωρήσει από το C -τελικό παρά το Ν- τελικό άκρο του Α2, επειδή τα καρβοξυτελικά δομικά στοιχεία μπορούν να κρατηθούν μακριά ένα κάθε φορά από το τέλος του τομέα, ενώ το β1 φύλλο στο Ν άκρο στηρίζεται από τα β φύλλα στον πυρήνα της επικράτειας. Η επικράτεια A2 ως αισθητήρας δύναμης. Η επικράτεια Α2 παρουσιάζει δομικά χαρακτηριστικά που απουσιάζουν από τις άλλες επικράτειες Α και επιτρέπουν την επιμήκυνσή της σε ένα ορισμένο εύρος τάσεων λειτουργώντας έτσι ως αισθητήρας τάσης. Ο τομέας Α2 είναι ο μόνος τομέας εντός vwf που δεν προστατεύεται από ξετύλιγμα από διάμεσους ή μεγάλου βεληνεκούς δισουλφιδικούς δεσμούς. Η δύναμη της επιμήκυνσης των ULvWF σε συνθήκες διατμητικής τάσης μεταδίδεται στην επικράτεια Α2 από τις γειτονικές Α1 και Α3 και η αποδιάταξη πραγματοποιείται από το καρβοξυτελικό άκρο μέχρι τη θηλιά α3β4 μέσω των θέσεων γλυκοζυλίωσης αποκαλύπτοντας την περιοχή πρωτεόλυσης (Zhang et al. 2009). Η δομή της Α2 προβλέπει ότι το ξετύλιγμα θα ξεκινήσει από το C-τελικό άκρο. Η δύναμη επιμήκυνσης στα πολυμερή του vwf 49

εφαρμόζεται εξίσου στο Ν-τελικό άκρο στην αρχή του β1-φύλλουυ και στο C-άκρο στο τέλος της α7-έλικας. Ωστόσο, το β1 φύλλο είναι στη μέση της πτυχής και, ως εκ τούτου, ιδιαίτερα ανθεκτικό στη δύναμη. Σε αντίθεση, η α7-έλικα είναι σχετικά στην περιφέρεια, και θα μπορούσε εύκολα να απομακρυνθεί από το υπόλοιπο της περιοχής για να ξεκινήσει η δίπλωση. Η απουσία του σταθεροποιητικού δικτύου των δεσμών υδρογόνου από το βρόχο α4 μπορεί να συμβάλει στην ικανότητα του να μειώνεται η δύναμη που απαιτείται για την αποδιάταξη της Α2 επικράτειας. Εναλλακτικά ο βρόχος α4 μπορεί να λειτουργεί καθυστερώντας την αναδίπλωση της Α2 επικράτειας και παρέχοντας χρόνο για τη δράση της ADAMTS13. Άλλα χαρακτηριστικά του Α2 μπορεί να συμβάλουν στην λειτουργία του αισθητήρα τάσης, συμπεριλαμβάνουν τη χαλαρή διάταξη του β4- φύλλου και τα θαμμένα μόρια νερού. Στο β 4-φύλλο, τα κατάλοιπα Leu1603, Met1606 και Thr1608 έχουν εναλλακτικά στροφόμετρα πλευρικής αλυσίδας, και τα εναλλακτικά στροφόμετρα πλευρικής αλυσίδας Leu1603 και Met1606 διαφέρουν σημαντικά στη θέση τους ένα από το άλλο. Ένας λόγος για την χαλαρότητα της Met1606 στην Α2 είναι ότι είναι γειτονεύει με μια Val1502 στον β1-κλώνο, αντί του μεγαλύτερου υπολείμματος Leu που βρίσκεται σε αυτή τη θέση στις Α1 και Α3. Στενή συσκευασία άλλων καταλοίπων γύρω από την Leu1603 παρεμποδίζεται από τη μεγάλη πλευρική αλυσίδα της Tyr1605 στην περιοχή διασπάσεως, η οποία είναι μοναδική στην Α2, και εκτείνεται από την Leu1603 προς την α6-έλικα. Επίσης στην Α2 υπάρχει ένα θαμμένο μόριο νερού σε ένα περιβάλλον που είναι σε μεγάλο βαθμό υδρόφοβο, εκτός από την πλευρική αλυσίδα της Ser1517 και τον σκελετό του α1-κλώνου, στον οποίο το νερό σχηματίζει δεσμούς Η (Εικ. 3E). Το θαμμένο κατάλοιπο Ser1517 αντικαθίσταται από υδρόφοβα κατάλοιπα στις Α1 και Α3. Γειτονικοί δισουλφιδικοί δεσμοί δεν βρίσκονται σε άλλες επικράτειες Α του vwff πέρα από την Α2. Ο ασυνήθιστος 8-μελής δακτύλιος που σχηματίζεται από την κύρια αλυσίδα και πλευρικές αλυσίδες των γειτονικών κυστεϊνών που σχηματίζουν το δισουλφιδικό δεσμό προσδίδει ακαμψία, η οποία είναι σημαντική στην αντίσταση τάσης. Επειδή η καρβοξυτελική Ser1671 αλληλεπιδρά μόνο με την Cys1670, όλη η δύναμη επιμήκυνσης που ασκείται στο καρβοξυτελικό άκρο θα διαβιβάζεται στην Cys1670. Οι Cys1669 και Cys1670 είναι τα 2 τελευταία υπολείμματα της α6-έλικας. Λόγω της άκαμπτης σύνδεσης μεταξύ τους, θα φέρουν μαζί την εφαρμοζόμενη δύναμη. Η διεύρυνση της μονάδας αντίστασης της δύναμης επιτρέπει την αντίσταση της δύναμης επιμήκυνσης ταυτόχρονα από του δεσμούς υδρογόνου των Cys1669 και Cys1670 αμιδίων με τα Val1665 και Leu1666 καρβονύλια, αντίστοιχα, και από τις υδρόφοβες και van derwaals αλληλεπιδράσεις των Cys1669-Cys1670 πλευρικών αλυσίδων με την υδροφοβική τσέπη που σχηματίζεται από τις πλευρικές αλυσίδες των Leu1497, Met1528, Ile1535, Leu1603, Tyr1605 και Leu1666. Ο γειτονικός δισουλφιδικός στο καρβοξυτελικό άκρο της α6-50

έλικας προτείνεται να είναι σημαντική εξειδίκευση που λειτουργεί για να παρέχει ένα υψηλό ενεργειακό φράγμα στο αρχικό βήμα του ξεδιπλώματος λόγω διάτμησης της Α2. Επιπλέον, προτείνεται ότι ενεργεί σαν ένα βύσμα για το υδρόφοβο πυρήνα που, όταν τραβιέται έξω, αποσταθεροποιεί τον πυρήνα και ξεκινά το ξεδίπλωμα. Διαγραφή του Cys1669-Cys1670 ενισχύει σημαντικά τη διάσπαση του πολυμερών vwf από την ADAMTS13 (Springer, 2011). Ο α 4 βρόχος και η «φτωχή» συσκευασία γύρω από τον β4 κλώνο μπορεί να λειτουργήσει για να μειώσει το φραγμό στο επαγόμενο ξεδίπλωμα από την τάση, τη στιγμή που το φράγμα των γειτονικών δισουλφιδικών δεσμών έχει παραβιαστεί. Με την απομάκρυνση του δισουλφιδικού δεσμού από την υδρόφοβη τσέπη του, θα εισέλθει νερό στον υδρόφοβο πυρήνα του τομέα, και αυτό αποτελεί ένα κρίσιμο βήμα για το ξεδίπλωμα της πρωτεΐνης. Η Tyr1605 (που αποτελεί το σημείο κοπής) παρέχει μια άμεση διαδρομή μεταξύ του γειτονικού δισουλφιδίου και του β4 - κλώνου. Η πλευρική του αλυσίδα αλληλεπιδρά με τον γειτονικό δισουλφιδικό δεσμό και σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με την Val1665 της α6 έλικας και το διαλύτη. Έτσι, μετά την αρχική παραβίαση, η κίνηση της πλευρικής αλυσίδας της Tyr1605 και επιδιαλύτωση της μπορεί να παρέχει μια οδό για τη μετάδοση της διαταραχής στον β4 κλώνο, η οποία, μαζί με τα ελαττώματα συσκευασίας γύρω από τον β4 κλώνο και τον α4 βρόχο, μπορεί να επιτρέψει συντονισμένη εκδίπλωση καρβοξυτελικού μισού της επικράτειας Α2, εκθέτοντας το σημείο διάσπασης του β4 κλώνου στην ADAMTS13. Υπάρχει ένας Ca 2+ -binding βρόγχος, μοναδικός στην επικράτεια Α2, είναι παρόν στη θηλιά α3-β4, και συμβάλλει στη σταθεροποίηση της Α2 κατά τη διάσπαση από την ADAMTS13 (Zhou et al 2011). 51

Εικόνα 24. Διπλωμένη και εκδιπλωμένη δομή του τομέα vwf Α2. Αποτελείται από ένα κεντρικό β-φύλλο με 6 κλώνους που περιβάλλεται από 5 α-έλικες (Α2 folded). Η θέση κοπής (Tyr-1605-Met-1606) θάβεται εντός του πυρήνα της πρωτεΐνης υπό στατικές συνθήκες. Η καρβοξυτελική περιοχή (κατάλοιπα 1,596-1,668, που αντιστοιχεί σε VWF73) πρέπει να ξεδιπλωθεί για να εκτεθεί η θέση κοπής κάτω από συνθήκες διατμητικού στρες (Α2 unfolded). Η επικράτεια Α2 παρουσιάζει μια Cis-Pro1645 η οποία δύναται να παίζει σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην αναδίπλωση της Α2 στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Η προλίνη αυτή σχηματίζει πεπτιδικό δεσμό με την Trp1644 (δεσμός cis-trans Trp1644- Pro1645). H μετατροπή σε trans-trp1644 Pro1645 πεπτιδικό δεσμό καθυστερεί σε μεγάλο βαθμό την αναδίπλωση της Α2, και χρησιμεύσει ως δείκτης της επικράτειας Α2 στα πολλαπλομερή του vwf που έχουν εκδιπλωθεί για ασυνήθιστα μεγάλο χρονικό διάστημα ή έχουν εκτεθεί σε ασυνήθιστα υψηλές δυνάμεις επιμήκυνσης, οι οποίες μπορεί να επιταχύνουν την cis σε trans μετατροπή του πεπτιδίου. Ο ελεύθερος vwf στο πλάσμα εκτίθεται σύντομα σε μέτριες δυνάμεις, και η αναδίπλωση είναι γρήγορη σε σχέση με τον προβλεπόμενο χρόνο για την διάσπαση από την ADAMTS13 (Zhang Χ et al, 2009). Ωστόσο, στον vwf που είναι καθηλωμένος στο ενδοθήλιο ασκούνται πολύ υψηλότερες δυνάμεις για ουσιαστικά μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα. Έτσι, η μετατροπή σε trans του πεπτιδικού δεσμού Trp1644-Pro1645 θα καθυστερήσει την αναδίπλωση και θα επιταχύνει της διάσπαση της Α2 από την ADAMTS13 κατά τη διάρκεια της επισκευής των αγγείων. 52

Σχέσεις λειτουργιών των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf Όπως έχει ήδη αναφερθεί, το κεντρικό τμήμα της ώριμης υπομονάδας του vwf περιλαμβάνει τις Α επικράτειες. Στην Α1 επικράτεια εντοπίζονται οι περιοχές σύνδεσης για τον υποδοχέα GPIbα, την ηπαρίνη, τα σουλφατίδια και το κολλαγόνο. Η Α3 επικράτεια συνδέεται με το κολλαγόνο τύπου Ι και ΙΙΙ και η επικράτεια Α2 περιέχει τη θέση κοπής για τη μεταλλοπρωτεάση ADAMTS13. Η διαδοχική αυτή οργάνωση των εν λόγω λειτουργικών περιοχών στο τμήμα Α1Α2Α3 υποδεικνύει ότι τουλάχιστον μια από τις επικράτειες αυτές μπορεί να επηρεάζει τη λειτουργία μιας γειτονικής επικράτειας. Υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν μια στενή συσχέτιση των επικρατειών Α1 και Α2 του vwf. Σε μια μελέτη οι Nishio et al θέλοντας να μελετήσουν τυχόν αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των επικρατειών χρησιμοποίησαν ένα ανασυνδυασμένο υπόστρωμα των επικρατειών Α1Α2Α3. Σύμφωνα με τη μελέτη αυτή, η διαγραφή της επικράτειας Α3 δεν επηρέασε καθόλου την πέψη της Α2 από την ADAMTS13, ενώ η διαγραφή της επικράτειας Α1 αύξησε τον ρυθμό της διάσπασης κατά 10 φορές περίπου. Η πέψη του A1A2A3 από την ADAMTS13 πλάσματος ήταν ενισχυμένη σε παρόμοιο βαθμό από ένα ανασυνδυασμένο μεταλλαγμένο θραύσμα του αιμοπεταλιακού GPIbα που συνδέεται με υψηλή συγγένεια με την επικράτεια Α1 ή από την ηπαρίνη. Η ηπαρίνη αύξησε επίσης την πέψη του καθαρισμένου vwf στο πλάσμα. Ούτε ο GPIbα ούτε η ηπαρίνη αύξησαν τη διάσπαση του A2A3 υποστρώματος που στερείται του τομέα Α1. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η περιοχή του vwf Α1 αναστέλλει τη διάσπαση της επικράτειας Α2 και ότι η αναστολή μπορεί να σταματήσει με την αλληλεπίδραση του τομέα Α1 με τον υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων ή με ορισμένες γλυκοζαμινογλυκάνες (Nishio et al 2004). Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η διαγραφή της επικράτειας Α2 στον vwf αύξησε ελαφρώς την επαγόμενη από τη ριστοσετίνη σύνδεση του GPIba, υποδηλώνοντας ότι η Α2 επικράτεια ίσως ρυθμίζει τη σύνδεση της γειτονικής επικράτειας A1 στον αιμοπεταλιακό υποδοχέα GPIba (Lankhof et al 1997). Οι Ying et al μελετώντας το ξεδίπλωμα της επικράτειας Α2 με τη βοήθεια οπτικής παγίδας (optical trap), κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ξεδίπλωμα της Α2 αντιπροσωπεύει τη συμπεριφορά των vwf πολυμερών υπό τάση και ότι η επικράτεια αυτή σταθεροποιείται μηχανικά από τις επικράτειες Α1 και Α3 (Ying et al 2009). Σε μια άλλη μελέτη, οι Auton et al συμπέραναν επίσης ότι η επικράτεια Α2 σταθεροποιείται από τις γειτονικές της, καθώς και ότι η επικράτεια Α2 είναι η λιγότερο σταθερή και η πιο ευάλωτη στο ξεδίπλωμα σε σχέση με τις επικράτειες Α1 και Α3 (Auton et al 2007). Ο Martin και οι συνεργάτες του, μελέτησαν την επίδραση 53

της επικράτειας Α2, στην ικανότητα σύνδεσης της επικράτειας Α1 με τη χρήση ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων των Α επικρατειών, πολυμερικού vwf, και μονοκλωνικών αντισωμάτων. Παρατηρήθηκε ότι το πολυπεπτίδιο της επικράτειας Α2 δεσμεύεται ειδικά με το ακινητοποιημένο πολυπεπτίδιο της επικράτειας Α1 ή τον πλήρους μήκους vwf. Το πολυπεπτίδιο της επικράτειας Α2 μπλόκαρε αποτελεσματικά την GPIba-μεσολαβούμενη προσκόλληση των αιμοπεταλίων κάτω από συνθήκες υψηλής ροής. Επίσης η Α2 επικράτεια αναγνωρίζει ειδικά τη διαμόρφωση της συνδεδεμένης με τον GPIba επικράτειας Α1, καθώς αλληλεπίδρασε μόνο με ενεργοποιημένο vwf υπό την επίδραση ριστοσετίνης ή με ακινητοποιημένο vwf. Έτσι κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η ανασυνδυασμένη επικράτεια Α2 συνδέεται ειδικά με την δραστική διαμόρφωση της επικράτειας Α1 vwf και μπλοκάρει αποτελεσματικά την αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα GPIba των αιμοπεταλίων υπό συνθήκες υψηλής ροής (Martin et al 2007). Παρόλο που δεν αποδείχθηκε η άμεση επαφή των δύο γειτονικών επικρατειών Α1 και Α2 του vwf, παρουσιάστηκε η ειδική αλληλεπίδρασή τους που αναστέλλει την πρόσδεση της επικράτειας Α1 στον υποδοχέα GPIbα των αιμοπεταλίων παρεμποδίζοντας το σχηματισμό θρόμβου (Martin et al. 2007). 54

VWF και ασθένειες που σχετίζονται με αυτόν Νόσος von Willebrand (vwd) Η ανακάλυψη του vwf είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την ιστορία των αιμορραγικών διαταραχών. Η νόσος von Willebrand (VWD), τα οποία προσδιορίστηκε το 1926 από τον Δρ Erik von Willebrand, προκαλείται από κληρονομικές ποσοτικές ή ποιοτικές ελλείψεις του VWF. Η κατάταξη των VWD βασίζεται σε παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς (Sadler et al, 2006, Schneppenheim et al, 2005). Τρεις βασικοί τύποι vwd έχουν αναγνωριστεί, ο τύπος που 1 περιλαμβάνει μερική ποσοτική ανεπάρκεια, ο τύπος 2 που περιλαμβάνει ποιοτικές ατέλειες, και ο τύπος 3 που αντιστοιχεί σε μια πλήρη ανεπάρκεια του vwf. Τύπος 2 VWD διαιρείται περαιτέρω σε διάφορες υποκατηγορίες, συμπεριλαμβανομένων των τύπων 2Α, 2Β, 2Μ και 2Ν, καθένας από τους οποίους συνδέεται με μια συγκεκριμένη λειτουργική ή δομική ατέλεια. Η τύπου 1 vwd είναι η πιο κοινή μορφή της VWD, αντιπροσωπεύοντας ~ 80% όλων των περιπτώσεων. Μεταδίδεται με αυτοσωματικό επικρατούντα χαρακτήρα και χαρακτηρίζεται από ήπια έως μέτρια μείωση των επιπέδων του vwf στο πλάσμα. Ο VWF είναι λειτουργικά φυσιολογικός και το επίπεδο δραστηριότητας του παράγοντα VIII (FVIII: C) μειώνεται ανάλογα με το επίπεδο του VWF. Οι ασθενείς εκδηλώνουν συμπτώματα βλεννογονοδερματικής αιμορραγίας, η σοβαρότητα της οποίας συνήθως συσχετίζεται με το επίπεδο της ανεπάρκειας του VWF τους. Ο τύπος 3 της α κληρονομείται με αυτοσωματικό υπολειπόμενο χαρακτήρα, με τους περισσότερους γονείς του τύπου 3 ασθενών να παρουσιάζουν λίγα, εάν υπάρχουν οποιαδήποτε συμπτώματα της αιμορραγίας. Στην τύπου 3 ασθένεια, τα επίπεδα του vwf ελάχιστα και συχνά μη ανιχνεύσιμα. Αυτοί οι ασθενείς εμφανίζουν σοβαρή υποτροπιάζουσα βλεννογονοδερματική αιμορραγία, καθώς συχνή σκελετική αιμορραγία και αιμορραγία των μαλακών ιστών. Ο τύπος 2Α της VWD σχετίζεται με την έλλειψη των μεγάλων πολυμερών του vwf, η οποία οδηγεί σε αναποτελεσματική δέσμευση των αιμοπεταλίων. Η έλλειψη μεγάλου μοριακού βάρους πολυμερών προέρχεται από μεταλλάξεις αλλοιώνοντας τον ενδοκυτταρικό πολυμερισμό ή από μεταλλάξεις που επιτρέπουν εκτεταμένη πρωτεόλυση από την ADAMTS13. Ο τύπος 2Β της VWD αποτελείται από gain-offunction μεταλλάξεις στην επικράτεια Α1, αυξάνοντας όχι μόνο την συγγένεια για τον υποδοχέα γλυκοπρωτεΐνης αιμοπεταλίων (Gp) Ibα, αλλά και την ευαισθησία για την πρωτεόλυση από ADAMTS13 (Rayes et al, 2007). Η αυξημένη συγγένεια των αιμοπεταλίων μπορεί να προκαλέσει θρομβοπενία, η οποία φαίνεται να είναι ο σημαντικότερος παράγοντας κινδύνου για αιμορραγία στους ασθενείς τύπου 2Β 55

VWD. Η απουσία υψηλού μεγάλου βάρους πολυμερών σε αυτούς τους ασθενείς είναι αποτέλεσμα της ADAMTS μεσολαβούμενης πρωτεόλυσης αντί της προσρόφησης σε αιμοπετάλια (Rayes et al, 2010). Ο τύπος 2Μ της VWD οφείλεται σε μεταλλάξεις στην επικράτεια Α1, αλλά αντίθετα οδηγεί σε έλλειψη ή μειωμένη συγγένεια για τον υποδοχέα GpIbα (Schneppenheim et al, 2011). Ο τύπος 2Ν χαρακτηρίζεται από μεταλλάξεις στην αμινοτελική περιοχή (domains D'-D3) του ώριμου vwf και σχετίζεται με μειωμένη δέσμευση του παράγοντα VIII (Nishino et al, 1989). Κατά συνέπεια, τα επίπεδα FVIII μειώνονται. Πίνακας 1. Οι τύποι των νόσων von Willebrand (VWD). Θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα Η θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα (thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP)) είναι μια διαταραχή που σχετίζεται με τον vwf. Υπάρχουν δυο τύποι, ο ένας σχετίζεται με μειωμένη δραστηριότητα της ADAMTS-13 λόγω αντισωμάτων και δεύτερος τύπος σχετίζεται με κληρονομική ανεπάρκεια της ADAMTS-13 (Moake JL, 2004). Επηρεάζουν το συγκεκριμένο ένζυμο διάσπασης του vwf, ασυνήθιστα μεγάλα vwf πολυμερή με μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης των αιμοπεταλίων έχουν συστημικά ανιχνευθεί στο πλάσμα ασθενών που πάσχουν από ΤΤΡ. Ως εκ τούτου, η TTP συνδέεται με απειλητικές για τη ζωή εναποθέσεις των αιμοπεταλίων- ULVWF θρόμβων σε μικροαγγεία που οδηγεί σε κατανάλωση των αιμοπεταλίων ακολουθούμενη από θρομβοπενία και αιμορραγικά επεισόδια. Η επίκτητη νόσος von Willebrand Η επίκτητη νόσος von Willebrand είναι μια σπάνια αιμορραγική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από δομικές ή λειτουργικές αλλαγές στον παράγοντα von Willebrand (vwf) που προκαλούνται από μια σειρά λεμφοϋπερπλαστικών, μυελοϋπερπλαστικών, καρδιαγγειακών, αυτοάνοσων, και άλλων διαταραχών. Οι 56

παθογόνοι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για τις ανωμαλίες του vwf εξαρτώνται από την υποκείμενη κατάσταση, αλλά περιλαμβάνουν κάθαρση λόγω δέσμευσης παραπρωτεϊνών, αναστολή του vwf, προσρόφηση στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων, αυξημένη διατμητική τάση, και προκύπτουσα πρωτεόλυση ή, σπανιότερα, μειωμένη σύνθεση. Η διάγνωση και η θεραπεία της επίκτητης νόσου von Willebrand περιπλέκονται από την ανάγκη για πολλαπλές εργαστηριακές εξετάσεις και τη διαχείριση του κινδύνου αιμορραγίας σε ένα τυπικό ηλικιωμένο πληθυσμό με σοβαρές υποκείμενες καταστάσεις που προδιαθέτουν θρόμβωση (Tiede et al, 2012). 57

vwf και αρτηριακή θρόμβωση Καθώς ο vwf διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό θρόμβου, αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί για την αξιολόγηση της σχέσης μεταξύ του vwf και του εμφράγματος του μυοκαρδίου και της στεφανιαίας καρδιακής νόσου. Δύο μετααναλύσεις έχουν δημοσιευθεί στο παρελθόν σχετικά με τη σύνδεση μεταξύ vwf και στεφανιαίας νόσου, συμπεριλαμβάνοντας περισσότερες από 15 ομαδικές μελέτες που αποτελούνται από 899 και 6556 περιπτώσεις, αντίστοιχα (Whincup et al, 2002) και (Willeit et al, 2013). Αμφότερες οι αναλύσεις έδειξαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ vwf και στεφανιαίας νόσου. Σε ορισμένες μελέτες οι παρατηρούμενες συσχετίσεις μεταξύ vwf και στεφανιαίας νόσου εξαφανίσθηκαν μετά την προσαρμογή για την C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) ή τον παράγοντα VIII (Woodward et al 2007, Wannamethee et al 2009, Rumley et al 1999). Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι η σύνδεση μεταξύ του vwf και της αρτηριακής θρόμβωσης μπορεί να οδηγείται από άλλες συνθήκες που είναι γνωστό ότι αυξάνουν τα επίπεδα του vwf, όπως η φλεγμονή. Αρκετές μελέτες έχουν μελετήσει τη σχέση μεταξύ των επιπέδων του vwf και του καρδιαγγειακού αποτελέσματος, το οποίο ορίστηκε ως καρδιαγγειακή θνησιμότητα. Τα υψηλά επίπεδα vwf συνδέθηκαν με την καρδιαγγειακή θνησιμότητα (Omicron Hartaigh et al 2003, Wannamethee et al 2009, Kucharska-Newton et al 2009, Jansson et al 1991), αν και κάποιες μελέτες δεν μπορούσαν να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα (van Loon et al 2012, Lee et al 2005). Οι Whincup et al. έχουν δείξει σε μια μετα-ανάλυση ότι σε ασθενείς με προϋπάρχουσα αγγειακή νόσο τα υψηλά επίπεδα vwf συνδέονται με επαναλαμβανόμενη στεφανιαία νόσο και καρδιαγγειακή θνητότητα (Whincup et al, 2002). Αν και οι μελέτες σχετικά με τη σύνδεση μεταξύ του VWF και τη στεφανιαία καρδιακή νόσο ήταν διαφορετικές στο σχεδιασμό και τον πληθυσμό και ως εκ τούτου είναι δύσκολο να συγκριθούν, οι περισσότερες μελέτες έχουν βρει μια θετική συσχέτιση. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία επιτρέπουν το συμπέρασμα ότι τα υψηλά επίπεδα VWF συνδέονται με ένα αυξημένο κίνδυνο στεφανιαίας καρδιακής νόσου (Sonneveld, 2014). Εχει αποδειχθεί ότι ο βαθμός της μετρούμενης αθηροσκλήρωσης στον άνθρωπο συνδέεται στενά με τα επίπεδα του vwf (Sonneveld et al, 2014). Πρόσφατη μελέτη έχει δείξει μια θετική συσχέτιση μεταξύ καλά καθορισμένης αθηροσκλήρωσης, που μετράται από τον όγκο ασβέστωσης στις αρτηρίες της καρωτίδας και το αορτικό τόξο, και του vwf σε ασθενείς με ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο που πιθανώς σχετίζεται με ενδοθηλιακή βλάβη (Sonneveld et al, 2013). Κάποιες μελέτες βρήκαν σύνδεση μεταξύ των υψηλών επιπέδων vwf και της θνησιμότητας λόγω ισχαιμικού 58

εγκεφαλικού επεισοδίου (Wannamethee et al 2012, Pinto et al 2009). Στη μελέτη των Lip et al., τα επίπεδα του vwf βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο που έχασαν τη ζωή τους, σε σύγκριση με τους ασθενείς που ήταν ακόμα ζωντανοί στους 12 μήνες παρακολούθησης (Lip et al 2002). Καθώς ο vwf φαίνεται να παίζει έναν ρόλο τόσο στο ισχαιμικό αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο όσο και στο έμφραγμα του μυοκαρδίου και βρέθηκε να συνδέεται με αθηροσκλήρωση στη μεγάλη αρτηρία, μπορεί να προταθεί ότι ο vwf είναι ένας δείκτης της αθηροσκλήρωσης ή / και της φλεγμονής και όχι ένας παράγοντας κινδύνου από μόνος του. Σε μια μελέτη, αποδείχθηκε ότι τα επίπεδα της ADAMTS13 είναι χαμηλότερα και τα επίπεδα του vwf είναι υψηλότερα σε νέους ασθενείς με καρδιαγγειακή νόσο σε σύγκριση με υγιή άτομα. Επίσης άτομα με χαμηλά επίπεδα ADAMTS13 είχαν πέντε φορές μεγαλύτερο κίνδυνο για καρδιαγγειακή νόσο συγκριτικά με άτομα με φυσιολογικά επίπεδα της ADAMTS13. Η σχέση ήταν ισχυρότερη στην υποομάδα των ασθενών με στεφανιαία νόσο, δείχνοντας έτσι ότι χαμηλά επίπεδα της ADAMTS13 μπορούν να συσχετιστούν με καρδιαγγειακή νόσο (Bongers et al, 2009). Σύμφωνα με άλλες μελέτες έχει αποδειχθεί ότι γενετικές μεταβολές στο γονίδιο του vwf και της ADAMTS13 και άλλα συναφή γονίδια, τα οποία σχετίζονται με τα επίπεδα vwf και ADAMTS13, μερικές φορές συνδέονται με αρτηριακή θρόμβωση (van Schie et al, 2011), αλλά όχι πάντα (van Loon et al, 2012, van Schie et al, 2012). Αυτό υποδεικνύει ότι δεν υπάρχει αιτιώδης ρόλος για τον vwf στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης, αλλά μόλις αθηροσκλήρωση έχει αναπτυχθεί αυτό σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα vwf και τα επίπεδα αυτά μπορούν να συμβάλλουν στο σχηματισμό θρόμβου και την αρτηριακή θρόμβωση. Ο μηχανισμός με τον οποίο ο vwf και η ADAMTS13 μπορεί να οδηγήσουν σε έμφραγμα του μυοκαρδίου και ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο δεν είναι ακόμα γνωστός. 59

Παρεμβάσεις που στοχεύουν στον VWF- O vwf ως αντιθρομβωτικός στόχος Είναι προφανές ότι, λόγω του σημαντικού ρόλου του στο σχηματισμό θρόμβου, ο vwf είναι ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη νέων αντιθρομβωτικών φαρμάκων. Λόγω των ειδικών χαρακτηριστικών που σχετίζονται με τη λειτουργία του vwf, τα νέα αυτά φάρμακα μπορούν ακόμη να βελτιώσουν τους τωρινούς αντιθρομβωτικούς παράγοντες. Πράγματι, δεδομένου ότι ο vwf έχει κυρίαρχο ρόλο στην προσκόλληση αιμοπεταλίων σε υψηλή διατμητική τάση, παρεμβαίνοντας στην vwf-μεσολαβούμενη προσκόλληση των αιμοπεταλίων θα είναι πιο ειδική προσέγγιση για υψηλής διάτμησης παθολογικά (στενωμένα) αρτηριακά συστήματα, και με τον τρόπο αυτό η αιμοστατική κατάσταση στο φλεβικό σύστημα θα επηρεάζεται λιγότερο. Το προκύπτον δυναμικό πλεονέκτημα όσον αφορά τα λιγότερα προβλήματα κλινικής αιμορραγίας θα μπορούσε πράγματι να είναι ένα ελκυστικό ευεργετικό χαρακτηριστικό αυτών των φαρμάκων. Πράγματι, ανταγωνιστές του vwf έχουν προταθεί ως δυνητικά νέα αντιαιμοπεταλιακά φάρμακα. Διάφορες προσεγγίσεις έχουν δοκιμαστεί για να μπλοκάρουν την αλληλεπίδραση του VWF και του υποδοχέα των αιμοπεταλίων GPIb και ως εκ τούτου να παρεμποδιστεί η λειτουργία του VWF στη θρομβογένεση. Οι ηπαρίνες έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν σημαντικά τους εξαρτώμενους από τον vwf αιμοπεταλιακούς αιμοστατικούς μηχανισμούς μέσω σύνδεσης σε μια θέση επί του μορίου vwf η οποία αποτελεί τμήμα της Α1 επικράτειας που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση με τον υποδοχέα GPIb (Sobel et al 1991). H χορήγηση ηπαρίνης ιδίως της χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνης ενοξαπαρίνης, σχετίζεται με την ελάττωση της απελευθέρωσης του vwf και της επανεμφάνισης εμφράγματος του μυοκαρδίου (Montalescot et al 1998). Επίσης έχουν αναπτυχθεί υποείδη ηπαρινών με ενισχυμένη ικανότητα να αναστέλλουν τις αλληλεπιδράσεις vwf και αιμοπεταλίων (Sobel Et al 1996). Μερικές ex vivo μελέτες δείχνουν ότι οι αναστολείς GPIIb/IIIa, κυρίως το μονοκλωνικό αντίσωμα c7e3 Fab (abciximab, ReoPro ), καταστέλλουν τη διαμεσολαβούμενη από τον vwf ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων (Turner et al 1995). Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η abciximab σε σύγκριση με τη τιροφιβάνη και την επτιφιμπατίδη αναστέλλει τις διαμεσολαβούμενες από τον vwf προπηκτικές δραστηριότητες (Goto et al 2003). Έχουν ερευνηθεί πιο συγκεκριμένοι ανταγωνιστές της αλληλεπίδρασης VWF-GPIb, αλλά κανένας δεν έχει ακόμη έγκριση ώστε να διατίθεται στην αγορά ως φάρμακο. 60

Ανασυνδυασμένα θραύσματα του πεπτιδίου του VWF μπορούν να ανταγωνιστούν τον μητρικό VWF για τη δέσμευση στον υποδοχέα GPIb και μπορούν να παρεμβαίνουν στην προσκόλληση των αιμοπεταλίων και την in vitro συσσωμάτωση (Dardik et al 1993). Για παράδειγμα, μια ανασυνδυασμένη και εξανθρωπισμένη έκδοση του 6β4-Fab θραύσματος διατηρεί τις αντιθρομβωτικές ικανότητες 6β4-Fab του ποντικού (ήδη χρησιμοποιήθηκε επιτυχημένα σε δοκιμές σε μπαμπουίνους), χωρίς να προκαλεί τις παρενέργειες της αιμορραγίας ή θρομβοκυτταροπενία (Fontayne et al 2008). Επιπλέον, in vivo μελέτες έδειξαν ότι το 82D6A3, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα το οποίο αναστέλλει την αλληλεπίδραση VWF-κολλαγόνου μέσω της σύνδεσης με την επικράτεια Α3 του vwf, είναι ένας ισχυρός αντιθρομβωτικός παράγοντας (Staelens et al 2006). Πιο πρόσφατα, έχουν σχεδιαστεί υψηλού μοριακού βάρους ανταγωνιστές που συνδέονται με την Α1 επικράτεια του vwf και εμποδίζουν την δέσμευση του στον υποδοχέα GPIb. Παραδείγματα αυτής της προσέγγισης περιλαμβάνουν μονοκλωνικά αντισώματα και ολιγονουκλεοτίδια (Wilson et al 2006) ή απταμερή (Lee et al 2006), μερικά από τα οποία βρίσκονται προς το παρόν σε κλινική δοκιμή. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού AJvW-2, το οποίο ειδικά αναστέλλει την αλληλεπίδραση μεταξύ του vwf του πλάσματος και του GPIb των αιμοπεταλίων, αναστέλλει σημαντικά τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων και μειώνει τη θρόμβωση της στεφανιαίας αρτηρίας, καθώς και εναπόθεση θρόμβου μετά από επέμβαση με μπαλονάκι σε διάφορα είδη ζώων (Yamamoto et al 1998, Kageyama et al 1997, Kageyama et al 2000). Ανάλογα αποτελέσματα έχουν αποδειχθεί και με τη ανθρωποποιημένο μονοκλωνικό αντίσωμα, AJW200 (Kageyama et al 2002). Πρόσφατα, το αντι-vwf απταμερές ARC1779 έχει ολοκληρώσει το πρόγραμμα δοκιμής φάσης Ι (Gilbert et al 2007) και φάσης ΙΙ, και αυτή τη στιγμή αξιολογείται σε δοκιμές αποτελεσματικότητας της φάσης ΙΙΙ (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/nct00991029). 61

Εικόνα 25. Στρατηγικές που στοχεύουν στην αλληλεπίδραση σύνδεσης του VWF με τον GPIba (Gresele et al, 2012). Πίνακας 2. Αναστολείς της σχετιζόμενης με τον vwf προσκόλλησης των αιμοπεταλίων. Μονοκλωνικά αντισώματα Το 82D6A3 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της επικράτειας Α3 του vwf και αναστέλλει την αλληλεπίδραση του vwf με το κολλαγόνο τύπου Ι και III. Προκλινικές μελέτες σε μπαμπουίνους απέδειξαν ότι το 82D6A3 έχει ισχυρή αντιθρομβωτική δράση (Wu et al 2002). Η παρατήρηση αυτή δείχνει ότι η σύνδεση του vwf στο ινώδες κολλαγόνο έχει ένα σημαντικό ρόλο στη μεσολάβηση της 62

θρόμβωσης. Έχει κατασκευαστεί μια ανθρωποποιημένη εκδοχή του 82D6A3 για περαιτέρω προκλινικές και κλινικές μελέτες (Staelens et al 2006). Το AJvW2 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού εναντίον της Α1 επικράτειας του VWF, το οποίο αναστέλλει την επαγόμενη από τη ριστοσετίνη και βοτροσετίνη συγκόλληση των αιμοπεταλίων καθώς και την προσκόλληση και συσσώρευση κάτω από διατμητικό στρες, όπου, όπως ήταν αναμενόμενο, τα ισχυρότερα ανασταλτικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν υπό συνθήκες υψηλής διάτμησης. Σε διάφορα μοντέλα ζώων, το AJvW2 έδειξε ισχυρή αντιθρομβωτική δράση χωρίς καμία ένδειξη για σοβαρές αιμορραγικές επιπλοκές. Το AJvW2 βρέθηκε οτι παρεμποδίζει το σχηματισμό νέου χιτώνα σε αγγεία μετά την αγγειοπλαστική, μέσω της αναστολής του σχηματισμού θρόμβου αιμοπεταλίων (Kageyama et al 2000). Το AJW200 είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα IgG4 που κατευθύνεται εναντίον της επικράτειας Α1 του vwf, το οποίο αναπτύχθηκε με βάση το AJvW-2 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, το οποίο εξανθρωπίστηκε αργότερα για να ελαχιστοποιηθεί η ανοσολογική απόκριση χορηγούμενο σε ανθρώπους (Fontayne et al 2008). Ο εξανθρωπισμός έγινε με ενσωμάτωση των υπερμεταβλητών περιοχών ποντικού σε έναν σκελετό ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης (Kageyama et al 2002). Όπως ήταν αναμενόμενο, η ένωση αυτή έδειξε ένα ευρύ θεραπευτικό παράθυρο μεταξύ της αποτελεσματική δόσης (με βάση την επαγόμενη απο τη ριστοσετίνη συσσωμάτωση αιμοπεταλίων) και του χρόνου πήξης σε πιθήκους (Kageyama et al 2002), μια παρατήρηση που επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ενός μοντέλου σκύλου (Kageyama et al 2002b). Η αποτελεσματικότητα και η ανοχή του AJW200 έχει καταδειχθεί σύμφωνα με μια τυχαιοποιημένη μελέτη φάσης Ι, κατά την οποία σε 24 αρσενικούς υγιείς ανθρώπους η δραστικότητα του συμπαράγοντα ριστοσετίνης (ristocetin cofactor activity) ήταν σημαντικά μειωμένη έως και 12 ώρες μετά την έγχυση 0,01-0,05 mg/kg AJW200, και καμία παράταση του χρόνου πήξης δεν σημειώθηκε (Machin et al 2003). Νανοσώματα Παρά τις σημαντικές κλινικές εφαρμογές, τα μονοκλωνικά αντισώματα έχουν πολλούς περιορισμούς, που έχουν ανοίξει το δρόμο για την ανάπτυξη μικρότερων και πιο ευέλικτων αντισωμάτων. Τα νανοσώματα είναι αντισώματα στερούμενα ελαφρών αλυσίδων, τα οποία αρχικά ανακαλύφθηκαν στον ορό καμήλων και στη συνέχεια στον ορό όλων των καμηλοειδών. Αυτά τα αντισώματα, εκτός από ελαφρές αλυσίδες, στερούνται επίσης την πρώτη σταθερή περιοχή των βαρέων αλυσίδων (CH1). Οι μεταβλητές περιοχές αυτών των αντισωμάτων αποτέλεσαν τη βάση για την ανάπτυξη των νανοσωμάτων, μία νέα κατηγορία θεραπευτικών πρωτεϊνών που αποτελούνται από μία ή περισσότερες θέσεις δέσμευσης 63

αντιγόνου. Έχουν αναπτυχθεί αρκετά νανοσώματα εναντίον διαφόρων στόχων ποικίλου θεραπευτικού ενδιαφέροντος, συμπεριλαμβανομένων των αντιθρομβωτικών νανοσωμάτων (Siller-Matula et al 2011.). Εικόνα 26. Γενική περιγραφή των Νανοσωμάτων και του ALX-0081. Το ALX-0081 αποτελείται από δυο πανομοιότυπα τμήματα κατευθυνόμενα προς τον vwf. (Courtesy of Jan Steyaert et al. VIB Department of Structural Biology) ALX-0081 και ALX-0681 Το ALX-0081 (caplacizumab) είναι ένα δισθενές ανθρωποποιημένο νανόσωμα, το οποίο συνδέεται με υψηλή συγγένεια στην επικράτεια Α1 του VWF, εμποδίζοντας έτσι την αλληλεπίδραση μεταξύ του υποδοχέα GPIba και του VWF υπό συνθήκες υψηλής διάτμησης (Van Bockenstaele et al. 2009). Η δισθενικότητα είναι απαραίτητη για να επιτευχθεί υψηλή συγγένεια με την επικράτεια Α1, με σκοπό την ισχυρή αναστολή της σύνδεσης του vwf στον υποδοχέα GPIba. 64

Εικόνα 27. Αναστολή της προσκόλλησης αιμοπεταλίων απο το anti-vwf Nanobody σε συνθήκες υψηλής διατμητικής τάσης. Σε τραυματισμό του επιθηλίου, η υποενδοθηλιακή δομή εκτείθεται στη ροή του αίματος, οδηγώντας σε ακινητοποίηση του vwf στο ενδοθήλιο. Λόγω της ακινητοποίησης και της υψηλής διατμητικής τάσης ο vwf αλλάζει δομή και ενεργοποιείται η Α1 επικράτεια, η οποία προσδένεται στους υποδοχείς GPIb των αιμοπεταλίων. Χωρίς την αναστολή, η Α1 επικράτεια προσδένει αιμοπετάλια, ενώ με την αναστολή της Α1 επικράτειας με το ALX-0081 προλαμβάνεται η πρόσδεση των αιμοπεταλίων. Μη κλινικές μελέτες με το ALX-0081 (caplacizumab) έδειξαν ότι έχει αυξημένο θεραπευτικό παράθυρο σε σύγκριση με τα ήδη διαθέσιμα θεραπευτικά μέσα. Τα αποτελέσματα από τις πρώιμες κλινικές μελέτες επιβεβαίωσαν ότι ALX-0081 είναι καλά ανεκτό και δεν αυξάνει τον κίνδυνο αιμορραγίας, ακόμη και όταν χορηγείται μαζί με μια πρότυπη αντιθρομβωτική αγωγή. Κατά τη διάρκεια των κλινικών μελετών που πραγματοποιήθηκαν με το ALX-0081, τα φαρμακοδυναμικά του αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν από έναν αριθμό βιοδεικτών, και αναφέρθηκε ένα ευνοϊκό, αυτο-ρυθμιζόμενο προφίλ PK. Αυτό δικαιολογεί και τις περαιτέρω μελέτες φάσης ΙΙ για την επιβεβαίωση της ασφάλειας και αποτελεσματικότητας σε ασθενείς με οξέα στεφανιαία σύνδρομα. Η μελέτη φάσης ΙΙ, είναι τυχαιοποιημένη, ανοικτή κλινική δοκιμή ξεκίνησε με 380 υψηλού κινδύνου ασθενείς οξέος στεφανιαίου συνδρόμου που υποβάλλονται σε αγγειοπλαστική. Ο στόχος της μελέτης είναι να συγκρίνει την ασφάλεια, και πιο συγκεκριμένα τον κίνδυνο αιμορραγίας, του ALX- 0081 έναντι του αναστολέα GPIIb/IIIa αμπσιξιμάμπη (ReoPro ) στους προαναφερθέντες ασθενείς (οι οποίοι λαμβάνουν ήδη αντιθρομβωτική αγωγή με 65

ασπιρίνη, κλοπιδογρέλη και ηπαρίνη), και να εκτιμήσει την ανοχή, καθώς και βιολογική και κλινική αποτελεσματικότητα (Bartunek et al 2013). Το ALX-0681 είναι ένα νανόσωμα πανομοιότυπο με το ALX-0081, με στόχο την επικράτεια Α1 του vwf αλλά είναι ειδικά σχεδιασμένο ώστε να χορηγείται υποδορίως. Τον Ιανουάριο 2014 ολοκληρώθηκε με θετικά αποτελέσματα η μελέτη φάσης ΙΙ (ΤΙΤΑΝ study), μια απλή τυφλή, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο μελέτη, που περιελάμβανε 51 ερευνητικά κέντρα παγκοσμίως, και σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια του ALX-0681 ως συμπληρωματική θεραπεία σε 75 ασθενείς που υποβάλλονταν σε πλασμαφαίρεση με επίκτητη ΤΤΡ. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι η ομάδα των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με ALX-0681, σε συνδυασμό με πλασμαφαίρεση, πέτυχε επιβεβαιωμένη εξομάλυνση των αιμοπεταλίων στα φυσιολογικά επίπεδα σε περισσότερο από το διπλάσιο του ποσοστού της ομάδας που λάμβανε το εικονικό φάρμακο σε οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της περιόδου των 30 ημερών μετά από την έναρξη του φαρμάκου της μελέτης. Το Caplacizumab πέτυχε στατιστικά σημαντική μείωση κατά 39% του χρόνου για την ομαλοποίηση του αριθμού των αιμοπεταλίων σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο για τους ασθενείς που δεν έκαναν πλασμαφαίρεση πριν από την αρχική θεραπεία με caplacizumab. Η πιθανή προστατευτική δράση του caplacizumab στη θεραπεία της ΤΤΡ αποδείχθηκε επίσης από το ότι 73% λιγότεροι ασθενείς εμφάνισαν επιδείνωση στο σκέλος της δραστικής θεραπείας σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Επίσης, το 81% των ασθενών πέτυχαν πλήρη ύφεση σε σύγκριση με το 46% στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου και το φάρμακο ήταν γενικά καλά ανεκτό, με διαχειρίσιμη αύξηση στην τάση για αιμορραγία. (http://www.ablynx.com/wpcontent/uploads/2014/06/webcast-titan-_17-june-2014_final.pdf) Απταμερή Τα απταμερή είναι μόρια νουκλεϊνικού οξέος με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα για ένα συγκεκριμένο μόριο-στόχο, με την ικανότητα να αναδιπλώνονται σε μοναδικές τρισδιάστατες δομές που προάγουν τη σύνδεση με το μόριο-στόχο. Ένα δυνητικό πλεονέκτημα αυτής της κατηγορίας μορίων είναι ότι μπορούν να απενεργοποιηθούν με ένα συμπληρωματικό απταμερές αντίδοτο εάν είναι απαραίτητο. Μέσω σύζευξης με πολυαιθυλένογλυκόλη υψηλού μοριακού βάρους, έχουν σχεδιαστεί απταμερή για να έχουν μερικά από τα χαρακτηριστικά των μονοκλωνικών αντισωμάτων και μερικά από τα χαρακτηριστικά των χαμηλού μοριακού βάρους χημικά συντεθειμένων φαρμάκων. Το ARC1779 είναι ένα DNA/RNA απταμερές 40 νουκλεοτιδίων συζευγμένο σε μια 20 kda PEG για να αυξηθούν οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες του. Το ARC1779 66

συνδέεται με υψηλή συγγένεια με την Α1 επικράτεια του vwf, και αναστέλλει την εξαρτώμενη από τον VWF συσσώρευση των αιμοπεταλίων (Diener et al 2009). Η αποτελεσματικότητα του ARC1779 στην αναστολή των αιμοπεταλίων έχει αποδειχθεί σε αρκετές προκλινικές και κλινικές μελέτες. Το απταμερές ήταν καλά ανεκτό σε υγιείς εθελοντές σε μια μελέτη φάσης Ι (Gilbert et al. 2007). Μια πρόσφατη μελέτη φάσης ΙΙ έδειξε ότι το ARC1779 ήταν σε θέση να μειώσει τις εγκεφαλικές εμβολές σε ασθενείς που υποβάλλονται σε καρωτιδική ενδαρτηρεκτομή (Markus et al., 2011). Η κλινική αποτελεσματικότητα του ARC1779 αξιολογήθηκε εντατικά σε ασθενείς με συγγενείς ανωμαλίες του vwf, παρέχοντας αποδείξεις ότι το ARC1779 είναι ένας ισχυρός αναστολέας του vwf σε ανθρώπους. Θεραπεία με ARC1779 σε ασθενείς με ΤΤΡ ανέστειλε σημαντικά τη δραστικότητα vwf και την vwf-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, και αύξησε τον αριθμό των αιμοπεταλίων (Knöbl et al, 2009; Mayr et al, 2010; Jilma-Stohlawetz et al, 2011a, 2011b). Οι Cataland et al. (2012) ανέφεραν την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της θεραπείας με ARC1779 σε ασθενείς με TTP (Cataland et al 2010; Cataland et al 2012). Ενώ οι ασθενείς στην ομάδα θεραπείας με ARC1779 εμφάνισαν βελτίωση των κλινικών συμπτωμάτων, δεν εμφανίστηκε θέμα ασφάλειας συμπεριλαμβανομένης της αιμορραγίας. Η φαρμακοκινητική και η φαρμακοδυναμική του ARC1779 σε ασθενείς με ΤΤΡ βρέθηκαν να είναι σε συμφωνία με αυτά που παρατηρήθηκαν σε υγιείς εθελοντές (Jilma-Stohlawetz et al., 2011b). Το ARC1779 εμπόδισε επίσης τη θρομβοπενία σε ασθενείς με τύπου 2Β α (Jilma et al, 2010; Jilma-Stohlawetz et al., 2012). Περαιτέρω δοκιμές φάσης ΙΙ και ΙΙΙ θα είναι απαραίτητες για να καθοριστεί η θεραπευτική δυνατότητα του ARC-1779 ως ένας αντι-αιμοπεταλιακός και αντι-θρομβωτικός παράγοντας. ARC15105 Το ARC15105 είναι ένα δεύτερης γενιάς απταμερές που αποκλείει την Α1 του vwf. Ειδικότερα, αποτελείται από 21 νουκλεοτίδια και είναι συζευγμένο με μια 40 kda πολυαιθυλένογλυκόλη, και έχει δραστικότητα και φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά κατάλληλα για χρόνια υποδόρια θεραπεία. Το ARC15105 κατέστειλε πλήρως επαγόμενη από τη ριστοσετίνη συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων σε ολικό αίμα καθώς και ανέστειλε κατά 93% την προσκόλληση των αιμοπεταλίων σε απογυμνωμένες αορτές χοίρων υπό συνθήκες υψηλής διάτμησης με αίμα από υγιείς εθελοντές (Siller-Matula et al. 2011). Το πεγκυλιωμένο ARC15105 απταμερές έχει αναπτυχθεί για να παρέχει μια μακράς διαρκείας αναστολή του vwf μετά από υποδόρια ένεση. Πράγματι, το σκεύασμα παρέχει 98% βιοδιαθεσιμότητα μετά από υποδόρια ένεση, και ο χρόνος ημίσειας ζωής είναι 65 ώρες. Αυτή είναι μια σημαντική αύξηση στη βιοδιαθεσιμότητα και την ημιζωή σε 67

σύγκριση με το ARC1779, το οποίο έχει μικρό χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 2 έως 3 ώρες (Siller-Matula et al. 2012). Το φαρμακοκινητικό του προφίλ και η βιοδιαθεσιμότητά του, καθιστούν το απταμερές αυτό κατάλληλο υποψήφιο φάρμακο, ωστόσο απαιτούνται περαιτέρω μελέτες όσον αφορά την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της ένωσης αυτής για τη θεραπεία θρομβωτικών διαταραχών. GPG-290 Το GPG-290 είναι ένα ομοδιμερές ανασυνδυασμένο θραύσμα ανθρώπινου GPIbα που αποτελείται από τα πρώτα 290 αμινοξέα και είναι συζευγμένο με την ανθρώπινη IgG1Fc για να σχηματίσει ένα ομοδιμερές. Το GPG-290 περιέχει δύο gain-of-function μεταλλάξεις (G233V / M239V) που προσδίδουν ενισχυμένη συγγένεια προς την A1 επικράτεια του VWF (De Meyer et al 2012). Η αντιθρομβωτική δραστικότητα του GPG-290 αποδείχθηκε σε δύο μοντέλα σκύλων με στεφανιαία θρόμβωση αρτηρίας, όπου στο πρώτο μοντέλο επάχθηκε ηλεκτρολυτικά ένα τραύμα στην επιφάνεια του έσω χιτώνα της αρτηρίας και μετρήθηκε ο χρόνος έως την απόφραξη (Hennan et al 2006). Το δεύτερο μοντέλο αποτελούνταν από το μοντέλο Folts, όπου ακολουθήθηκαν κυκλικές μειώσεις ροής στην κατεστραμμένη στενωμένη στεφανιαία αρτηρία. Μόνο σε μια δόση 10 φορές μεγαλύτερη από εκείνη που απαιτείται για μέγιστο αντιθρομβωτικό αποτέλεσμα, παρατηρήθηκε αύξηση στην αιμορραγία (Wadanoli et al. 2007). Ανασυνδυασμένη ADAMTS13 Εκτός από την παρεμπόδιση της δέσμευσης του VWF είτε στο κολλαγόνο ή στον υποδοχέα GPIbα, ένας άλλος τρόπος για τη μείωση της δραστηριότητας του VWF είναι η μείωση του μέγεθός του VWF από την ADAMTS13. Η εμφάνιση μικροαγγειακής θρόμβωσης που οφείλεται σε ανεπάρκεια ADAMTS13 σε ασθενείς με ΤΤΡ αποτελεί ένδειξη για τον έμμεσο ρόλο της ADAMTS13 στην πρόληψη θρομβωτικών επιπλοκών. Η διαθεσιμότητα μιας ανασυνδυασμένης μορφής της ADAMTS13 θα σήμαινε τη δυνατότητα να επιτευχθεί υψηλότερη δραστηριότητα της ADAMTS13 από ό,τι είναι δυνατό με μετάγγιση πλάσματος. Η ανασυνδυασμένη ADAMTS13 αναπτύχθηκε ως ένας νέος θεραπευτικός παράγοντας και, σε ένα προκλινικό μοντέλο ποντικού με ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο αποδείχθηκε η προστατευτική της δράση (Zhao et al 2009). In vitro, η ανασυνδυασμένη ADAMTS13 είναι σε θέση να ξεπεράσει εξουδετέρωση από αυτοαντισώματα και να οδηγήσει στην ανασύσταση της δραστικότητας της ADAMTS13 σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς με TTP (Plaimauer et al 2011). Επιπλέον, η τροποποίηση της ADAMTS13 68

μεταβάλλοντας αμινοξέα στην εξωθέση 3 στον spacer domain μπορεί να οδηγήσει σε μια πρωτεΐνη ADAMTS13 που είναι και ανθεκτική στην πλειοψηφία των αυτοαντισωμάτων από ασθενείς με ΤΤΡ και δείχνει βελτιωμένη ενζυματική δραστηριότητα (Jian et al 2012). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ADAMTS13 έχει λάβει ονομασία ορφανού (orphan designation) για τη θεραπεία της ΤΤΡ (ΕΕ / 3/08/588). 69

Βιολειτουργικότητα- Biofunctionalization Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για την καθήλωση και τον έλεγχο της απελευθέρωσης πεπτιδίων/πρωτεϊνών από διάφορες επιφάνειες. Ο προσδιορισμός και τελικά η χρήση των κατάλληλων τεχνικών για την τροποποίηση συγκεκριμένων υλικών, ώστε να προσδεθούν στην επιφάνειά τους βιολειτουργικά μόρια με τις επιθυμητές ιδιότητες αποτελεί πρόκληση και είναι ιδιαίτερης σημασίας. Κάθε τεχνική καθήλωσης πρωτεϊνών πρέπει να είναι κατάλληλα προσαρμοσμένη, λαμβάνοντας υπόψη το υλικό, το πεπτίδιο/πρωτεΐνη, αλλά και την αναμενόμενη αλληλεπίδραση του τμήματος της πρωτεΐνης που πρόκειται να καθηλωθεί στο υπόστρωμα. Η καθήλωση πρωτεϊνών και ενζύμων στη βιολογικά ενεργή τους κατάσταση σε επιφάνειες είναι απαραίτητη για την παραγωγή βιολειτουργικών επιφανειών για διάφορες βιοεφαρμογές, όπως βιοαισθητήρες, ενζυμικούς αντιδραστήρες, πρωτεϊνικές και πεπτιδικές micro arrays (Katranidis, Choli-Papadopoulou 2012). Οι πρωτεΐνες τείνουν να χάνουν τη λειτουργικότητά τους κατά την καθήλωση σε επιφάνειες, λόγω της διαδικασίας ξεδιπλώματος. Συνεπώς, η γνώση της στερεοδιάταξης, του προσανατολισμού και της ακριβούς λειτουργίας της κάθε πρωτεΐνης που πρόκειται να ακινητοποιηθεί σε κάποια επιφάνεια είναι απαραίτητη για την κατασκευή βέλτιστων, με μεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία νανοσυσκευών. Μέχρι στιγμής έχουν περιγραφεί πολλές τεχνικές καθήλωσης πρωτεϊνών που αφορούν μη ειδική προσρόφηση ή με ειδική ομοιοπολική σύνδεση. Η καθήλωση των πρωτεϊνών μέσω λειτουργικών ομάδων που στερούνται ειδικότητας, όπως είναι οι αμινομάδες και οι καρβοξυλομάδες, έχει ως αποτέλεσμα ακινητοποίηση του μορίου με τυχαίο προσανατολισμό. Επιπλέον, αν το σημείο πρόσδεσης εντοπίζεται κοντά στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, τότε η δραστικότητα του πρωτεϊνικού μορίου μπορεί μερικώς ή πλήρως να χαθεί, λόγω στερικών αλληλεπιδράσεων (Huang et al 1997). 'Έτσι γίνονται προσπάθειες για προσανατολισμένη καθήλωση πρωτεϊνών σε επιφάνειες. Μία τέτοιου είδους στρατηγική ακινητοποίησης έχει ως σκοπό ελαχιστοποίηση των στερικών αλληλεπιδράσεων και την εύκολη πρόσβαση στο ενεργό κέντρο του ενζύμου ή στο σημείο πρόσδεσης των υποδοχέων, όπως επίσης και στη διατήρηση της ολικής σταθερότητας του πρωτεϊνικού μορίου (Turkova 1999). Υποστρώματα για την καθήλωση πρωτεϊνών Πολλά πολυμερή έχουν επιλεγεί ως υποστρώματα για ακινητοποίηση βιομορίων στην επιφάνειά τους και είναι προτεινόμενα για μια πληθώρα εφαρμογών με βάση τις ιδιότητές τους, όπως είναι η ελαστικότητα, η αγωγιμότητα, η αντοχή, οι οπτικές ιδιότητες και η προέλευση (φυσικά ή συνθετικά). 70

Πίνακας 3. Πολυμερικά υποστρώματα για βιολειτουργικότητα Λόγω της αδρανούς φύσης τους, τα περισσότερα πολυμερή που κυκλοφορούν στο εμπόριο πρέπει να υποβληθούν, πριν την προσκόλληση των βιομορίων, σε ενεργοποίηση της επιφάνειάς τους. Το επόμενο βήμα, επομένως, είναι η βελτιστοποίηση των τεχνικών που θα χρησιμοποιηθούν για αυτήν την διαδικασία, έτσι ώστε να επιτευχθεί τόσο η πρόσδεση των κατάλληλων βιομορίων, αλλά και ο επαρκής αριθμός των επιθυμητών λειτουργικών ομάδων. Για τη χρησιμοποίηση των πολυμερικών επιφανειών σε βιοεφαρμογές είναι αναγκαία η μεγιστοποίηση του αριθμού των βιοενεργών συστατικών/λειτουργικών ομάδων ανά μονάδα επιφάνειας, το οποίο μπορεί να επιτευχθεί με την πρόσδεση ενός πολυλειτουργικού παράγοντα επάνω στην επιφάνεια. Η πρόσδεση ενός βιοενεργού συστατικού σε μία στερεή επιφάνεια με τη διαμεσολάβηση ενός άλλου μορίου έχει ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της βιοδραστικότητας, μέσω ελάττωσης των στερεοχημικών περιορισμών, αλλά και προστασίας του συστατικού από υδρόφοβη επιφανειακή αποδιάταξη. Το τελικό βήμα είναι η ομοιοπολική πρόσδεση του βιοενεργού συστατικού. Τα βιοενεργά συστατικά μπορεί να είναι φυσικά ή συνθετικά και δρουν καταλύοντας μια συγκεκριμένη αντίδραση σε ένα βιολογικό σύστημα. Στον πίνακα 4 φαίνονται διάφοροι τύποι βιοενεργών συστατικών, όπως επίσης και διάφορες εφαρμογές τους (Goddard et al. 2007). 71

Πίνακας 4. Τυποι βιοενεργών συστατικών Αν η αρχική τροποποίηση της επιφάνειας δεν έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία πολλών ενεργών λειτουργικών ομάδων ή όταν το βιοενεργό συστατικό χάνει τη δραστικότητά του κατά την απευθείας σύνδεση στην υδρόφοβη πολυμερική επιφάνεια, τότε είναι απαραίτητη η παρεμβολή ενός ενδιάμεσου συστατικού μεταξύ της επιφάνειας και του βιοενεργού μορίου. Άριστο πολυμερές που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για την καθήλωση βιολειτουργικών μορίων είναι η πολυαιθύλενογλυκόλη (PEG), ένα πολυμερές του οξειδίου του αιθυλενίου, η οποία μπορεί να καθηλωθεί σε ικρίωμα πολυμερούς αντιδρώντας με αμινομάδες που έχουν δημιουργηθεί επί του ικριώματος μετά από χημική κατεργασία ή επεξεργασία με ακτινοβολία. Η χρήση ενός υδρόφιλου ενδιάμεσου μορίου, όπως η PEG, έχει ως αποτέλεσμα προστασία του βιοενεργού συστατικού από αποικοδόμηση και ταυτόχρονη βελτίωση της βιοενεργότητάς του. Συνήθως χρησιμοποιείται μίγμα PEG και βιοτινυλιωμένης PEG (biotin-peg-nhs) (Groll et al. 2004). Εικόνα 28. Η αρχή της βιολογικής επιφανειακής τροποποίησης πολυμερούς επιφάνειας. 72

Η εισαγωγή αμινομάδων επί του πολυμερικού ικριώματος μπορεί να γίνει με τη χρήση πολυαιθυλεμοϊμίνης (PEI). Η PEI είναι ένα οργανικό πολυμερές με μεγάλη πυκνότητα αμινομάδων, οι οποίες μπορούν να πρωτοενωθούν. Τεχνικές καθήλωσης πρωτεϊνών Οι πρωτεΐνες συνήθως προσροφώνται στην επιφάνεια ενός στερεού υποστρώματος με τυχαίο προσανατολισμό με αποτέλεσμα να υφίστανται αλλαγές στη διαμόρφωσή τους, γεγονός που καθιστά τις λειτουργικές ομάδες τους μη προσβάσιμες στα αλληλεπιδρώντα μόρια και στα υποστρώματα για ενζυμικές αντιδράσεις. Η έκταση της αλλαγής στη διαμόρφωση της πρωτεΐνης στην προσροφημένη της κατάσταση διαφέρει ανάλογα με τον τύπο της πρωτεΐνης, την υδροφιλικότητα/υδροφοβικότητα της επιφάνειας και τις περιβαλλοντικές συνθήκες ( θερμοκρασία, ιοντική ισχύς διαλύματος, ph) (Kumada et al, 2007). Η καθιέρωση μιας τεχνικής ελεγχόμενης καθήλωσης πρωτεϊνών απαιτεί τα εξής χαρακτηριστικά : 1) μια ισχυρή και ειδική συγγένεια της πρωτεΐνης για την επιφάνεια, 2) τοποκατευθυνόμενη καθήλωση (site-directed) και 3) διατήρηση της φυσιολογικής διαμόρφωσης και της βιολογικής λειτουργίας της πρωτεΐνης στην προσροφημένη της κατάσταση. Συνεπώς, οι περισσότερες τεχνικές καθήλωσης αφορούν τροποποίηση ή επικάλυψη της επιφάνειας με κατάλληλες ουσίες με σκοπό αλλαγή των ιδιοτήτων της επιφάνειας και/ή παροχή λειτουργικών ομάδων για την πρόσδεση της πρωτεΐνης. Κάποιες μέθοδοι ακινητοποίησης πρωτεϊνών είναι: α) φυσική προσρόφηση, β) καθήλωση με χρήση υδρογέλης (hydrogel), γ) καθήλωση με ουρά ιστιδίνης (6xHis-tag), δ) καθήλωση με διαμεσολάβηση σιλανίων, τρανσγλουταμινάσης, ε) καθήλωση με διαμεσολάβηση αντισώματος-πρωτεΐνης (FLAG-tag), στ) καθήλωση διαμεσολαβούμενη από γλουταθειόνη/gst, ζ) καθήλωση με το σύστημα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Σύστημα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες βιοχημικές αντιδράσεις με σκοπό την καθήλωση πρωτεϊνών σε στερεά υποστρώματα με ταυτόχρονη διατήρηση του προσανατολισμού των πρωτεϊνικών μορίων. Μεταξύ των διαφόρων συστημάτων που έχουν μελετηθεί, το σύστημα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης είναι το περισσότερο γνωστό και χρησιμοποιημένο. Η πολύ ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ στρεπταβιδίνης και βιοτίνης είναι ένας από τους ισχυρότερους μη ομοιοπολικούς δεσμούς (Ka=10 15 M -1 ). Η στρεπταβιδίνη είναι μια τετραμερής πρωτεΐνη με τέσσερις θέσεις σύνδεσης, η οποία είναι παρόμοια με την αβιδίνη. Η ισχύς του δεσμού, όπως επίσης και το 73

πολύ μικρό μέγεθος της βιοτίνης (MW 244.3), εξασφαλίζουν ένα ιδανικό σύστημα σύζευξης με πολλαπλές εφαρμογές. Επειδή η στρεπταβιδίνη στερείται υδρογονανθράκων και έχει σχεδόν ουδέτερο pi, εμφανίζει ελάχιστες μη ειδικές συνδέσεις με πρωτεΐνες. Μετά τη σύνδεση στη βιοτινυλιωμένη επιφάνεια, η στρεπταβιδίνη διαθέτει τρείς ακόμα περιοχές σύνδεσης, στις οποίες μπορούν να προσδεθούν βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες με τον ίδιο προσανατολισμό (Katranidis, Choli-Papadopoulou 2012). 74

ΣΚΟΠΟΣ Ο σχηματισμός θρόμβου αιμοπεταλίων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των αθηροθρομβωτικών επεισοδίων. Στη διαδικασία σχηματισμού του θρόμβου συμμετέχουν ποικίλοι παράγοντες μεταξύ των οποίων σημαντικό ρόλο παίζει ο vwf, ο οποίος αποτελεί γέφυρα μεταξύ του τραυματισμένου αγγειακού τοιχώματος και των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, κυρίως σε συνθήκες υψηλής διατμητικής τάσης. Οι γειτονικές επικράτειες Α1 και Α2 του vwf παρουσιάζουν διαφορετικές λειτουργίες στο μηχανισμό της αιμόστασης, με την Α1 να επάγει την πρόσδεση στα αιμοπετάλια και την έναρξη της πήξης του αίματος και την Α2, η οποία αποτελεί υπόστρωμα της μεταλλοπρωτεάσης ADAMTS13, να αναστέλλει τη διαδικασία της αιμόστασης. Τελευταίες μελέτες προτείνουν το σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ των επικρατειών Α1 και Α2 που μπορεί να αναστείλει την αλληλεπίδραση με τα αιμοπετάλια και το σχηματισμό θρόμβου. Στο πειραματικό μέρος της διπλωματικής εργασίας έγινε κλωνοποίηση, υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α2 επικράτειας. Απώτερος σκοπός των πειραμάτων αυτών είναι η λήψη σε μεγάλη ποσότητα της ανασυνδυασμένης Α2 επικράτειας. Χρησιμοποιήθηκε βακτηριακό σύστημα, ώστε να μελετηθεί η δυνατότητα αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών απουσία των μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων. Η επικράτεια Α2 θα χρησιμοποιηθεί σε μελλοντικά πειράματα, στα οποία θα βρίσκεται καθηλωμένη η βιοτυνυλιωμένη επικράτεια Α1 πάνω σε βιοσυμβατές επιφάνειες, με τελικό σκοπό τη μελέτη της αλληλεπίδρασης της επικράτειας Α2 με την Α1 και της πιθανής αντιαιμοπεταλιακής δράσης του συμπλόκου αυτού. 75

76

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά Βιολογικά υλικά Χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη E. coli TOP-10 (Invitrogen Life Technologies) και BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies) για την υπερέκφραση της πρωτεΐνης Α2 του vwf. Υλικά κυτταρικών καλλιεργειών Όλα τα αναλώσιμα των κυτταρικών καλλιεργειών (τρυβλία καλλιέργειας, φλάσκες, τρυβλία, σωλήνες φυγοκέντρησης, σιφώνια, αντικειμενοφόροι πλάκες κ.α), προμηθεύτηκαν από τις εταιρίες Corning (Inc, N.Y, U.S.A) και VWR Int. (Inc, West Chester,U.S.A). Χημικά αντιδραστήρια Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Υλικά χρωματογραφίας Για τον καθαρισμό των πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST), χρησιμοποιήθηκε το υλικό χρωματογραφίας αγχιστείας σεφαρόζη-γλουταθειόνη της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd, (Glutathione Sepharose 4B, 17-0756-01, Buckinghamshire, UK). Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού προμηθεύτηκαν από την NEBiolabs, (Beverly, USA), η T4 DNA λιγάση από την Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan), επίσης, χρησιμοποιήθηκε πολυμεράση από την FΙΝΝΖΥΜΕS. Για την απομόνωση RNA χρησιμοποιήθηκε το Kit NucleoSpin RNA/protein, (50 preps 740933.50) της εταιρίας Macherey-Nagel. 77

Ο πλασμιδιακός φορέας pet49b(+) που χρησιμοποιήθηκε για την υπερέκφραση της επικράτειας Α2 του vwf ήταν της εταιρείας Novagen. Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρίας Applichem Biochemica GmBH (Darmstadt, Germany). Μέθοδοι Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DΝΑ εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Επίσης, χρησιμοποιείται για την εισαγωγή μεταλλάξεων, καθώς και για την ραδιοσήμανση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειμένου να πραγματοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση (sequencing). Η τεχνική αυτή μπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DΝΑ, διαδικασία που γίνεται στα κύτταρα, αφού το αποτέλεσμα είναι το ίδιο, η παραγωγή δηλαδή συμπληρωματικών κλώνων DΝΑ από κάποιον ήδη υπάρχοντα κλώνο. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοάντοχης DΝΑ πολυμεράσης, η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DΝΑ ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DΝΑ. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές), τα οποία είναι συμπληρωματικά μιας περιοχής της επιθυμητής ακολουθίας. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1 : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του DΝΑ αποδιατάσσεται με θέρμανση σε 90 C-95 C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταματούν όλες οι ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Στάδιο 2 : Υβριδισμός Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους 50-75 C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ 78

σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 : Πολυμερισμός Στο στάδιο αυτό η DΝΑ πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη -ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DΝΑ συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DΝΑ. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης αλληλουχίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων. Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται 20-40 φορές και παράγονται 2ν μόρια DΝΑ, όπου ν είναι ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 68-72 C για 5 min ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός (Innis et al, 1990). Τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης φαίνονται παρακάτω. Σύσταση μίγματος και ποσότητες για αντίδραση PCR. DΝΑ εκμαγείο Εκκινητής νοηματικός (up) Εκκινητής αντινοηματικός (low) 10-20 ng 20 pmol 20 pmol Μίγμα (dntps) δεοξυριβονουκλεοτιδίων 3,5 mm Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης 10x Πολυμεράση (Taq) Η2O 5 μl 1 μl Έως 50 μl Στην προκείμενη εργασία ενισχύθηκε με PCR το γονίδιο της Α2 επικράτειας του vwf από τον άνθρωπο. 79

Πρόγραμμα PCR για την ενίσχυση του γονιδίου της επικράτειας Α2 του vwf για κλωνοποίηση στο φορέα έκφρασης pet-49b(+). Στάδιο Θερμοκρασία Διάρκεια Επαναλήψεις Αρχική αποδιάταξη 98ºC 30 sec 1 Αποδιάταξη 98ºC 5 sec 35 Υβριδοποίηση Εκκινητών 65 ºC 30 sec 35 Επιμήκυνση 72 ºC 15 sec 35 Τελική επιμήκυνση 72 ºC 10 min 1 Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, τα ένζυμα περιορισμού και ο πλασμιδιακός φορέας στον οποίο έγινε η κλωνοποίηση αναφέρονται παρακάτω. Εκκινητής Γονίδιο Ένζυμο Περιορισμο ύ Πλασμίδιο 5 - CCAGGATCCCACCCTGGGGCCCAAGAGGAA- 3 5 - CGCAAGCTTCTACTGCAGCACCAGGTCAGG-3 A2 BamHI pet49b(+) A2 HindIII pet49b(+) Η περιοριστική ενδονουκλεάση HindIII κόβει την αλληλουχία 5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5. Η περιοριστική ενδονουκλεάση BamHI κόβει την αλληλουχία 5 G GATCC 3 3 CCTAG G 5. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση DNA πολυμεράσης υψηλής πιστότητας (Phusion High Fidelity) σε συνθήκες που προτείνονται από την 80

κατασκευάστρια εταιρεία (Finnzymes, Finland). Στο στάδιο της τελικής επιμήκυνσης έγινε προσθήκη Taq DNA πολυμεράσης (New England Biolabs, UK), ώστε να εισαχθούν προεξέχουσες αδενίνες στο 3 άκρο των προϊόντων. Μετά την αντίδραση ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% και τα μόρια DNA ανακτήθηκαν με εκτομή (Macherey-Nagel, France). Καθαρισμός τμημάτων DNA μετά από PCR Τα τμήματα DΝΑ που προκύπτουν από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ή μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν σε άλλες αντιδράσεις, θα πρέπει να διαχωριστούν από τους εκκινητές, το εκμαγείο, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια, τα άλατα και την πολυμεράση, ή τα αντίστοιχα ένζυμα. Ο καθαρισμός των τμημάτων αυτών DΝΑ γίνεται με το σύστημα Qiaquick PCR Purification kit της εταιρείας Qiagen. Στο μίγμα της αντίδρασης προστίθενται 5 όγκοι διαλύματος ΡΒ, το οποίο περιέχει έναν χαοτροπικό παράγοντα, ακολουθεί ανάμιξη και διαβίβαση του συνολικού όγκου στη στήλη Qiaquick. Κατόπιν, γίνεται φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για 1 min σε 13000xg. Το DΝΑ δεσμεύεται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα συστατικά απομακρύνονται με τη φυγοκέντρηση. Ακολουθεί πλύσιμο της στήλης με το αιθανολικό διάλυμα ΡΕ και τελικά γίνεται έκλουση του DΝΑ με 20-30μl αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού. Στη συνέχεια, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DΝΑ, προκειμένου να ελεγχθεί για την καθαρότητα του (Qiaquick Spin Handbook, 1996). Καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται όπως και η προηγούμενη, για τον καθαρισμό τμημάτων DΝΑ μετά από πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, όταν η πέψη γίνεται διαδοχικά ή έπειτα από τον πολλαπλασιασμό τους με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (ΡCR). Χρησιμοποιείται το Qiaquick Gel Extraction kit της εταιρείας Qiagen. Η αρχή του συστήματος αυτού στηρίζεται στην ιδιότητα του DΝΑ να προσροφάται σε μικρές στήλες που περιέχουν μεμβράνη από silica gel παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων, ενώ οι προσμίξεις διέρχονται από τις στήλες χωρίς να συγκρατηθούν. Η διαδικασία έχει ως εξής: Το επιθυμητό τμήμα του DΝΑ αποκόπτεται από την πηκτή και τοποθετείται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης (eppendorf). Κατόπιν, προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης της αγαρόζης, QG, σε αναλογία 300μL/100mg πηκτής. Ακολουθεί θέρμανση στους 50 C για 10 min με περιοδική ανάδευση, προκειμένου να διαλυτοποιηθεί η αγαρόζη. Στη συνέχεια, το μίγμα αυτό διαβιβάζεται σε στήλη Qiaquick και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για 1 min σε 12000xg. Το DΝΑ συγκρατείται στη στήλη και ξεπλένεται από τις προσμίξεις με τη διαβίβαση του αιθανολικού διαλύματος ΡΕ. Η 81

έκλουση του DΝΑ γίνεται με 20-30μΙ αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού. Κατόπιν, ηλεκτροφορείται μια μικρή ποσότητα από το εκλουόμενο DΝΑ, προκειμένου να ελεγχθεί για την καθαρότητα του και για να διαπιστωθεί κατ' εκτίμηση η ποσότητα του DΝΑ που απομονώθηκε (Qiaquick Spin Handbook, 1996). Κλωνοποίηση τμημάτων DNA σε πλασμιδιακούς φορείς Κατά την κλωνοποίηση, γίνεται εισαγωγή ενός τμήματος DΝΑ στο γονιδίωμα ενός αυτόνομα πολλαπλασιαζόμενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασμιδίου. Οι πλασμιδιακοί φορείς που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι μικρά κυκλικά μόρια δίκλωνου DΝΑ, που μπορούν να αναπτύσσονται ημι-αυτόνομα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασμιδιακός φορέας, όσο και το ξένο τμήμα του DΝΑ που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν, επωάζονται με τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισμού και στη συνέχεια, επανακυκλοποιούνται συνδεόμενα ομοιοπολικά στα άκρα τους με τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού, αντίδραση που καταλύεται από την Τ4 DΝΑ λιγάση. Ο πλασμιδιακός φορέας pετ49b(+) έχει μέγεθος 5926 ζεύγη βάσεων και περιέχει μία N τελική ουρά GST και μία Ν τελική ουρά ιστιδινών, η οποία ακολουθείται από μία περιοχή αναγνώρισης της 3C πρωτεάσης του ανθρώπινου ιού HRV. Αυτή η πρωτεάση έχει υψηλή ειδίκευση για την αποκοπή της αλληλουχίας LEVLFQ GP και είναι δραστική σε χαμηλές θερμοκρασίες. Το πλασμίδιο pet49b(+) περιέχει επίσης μία προαιρετική C τελική περιοχή αναγνώρισης της θρομβίνης, η οποία ακολουθείται από μία κωδικοποιούσα αλληλουχία, την S ουρά. Οι μοναδικές θέσεις περιορισμού φαίνονται στο χάρτη του πλασμιδίου που βρίσκεται παρακάτω. Περιέχει επίσης έναν Τ7 προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιημένου γονιδίου, μια Τ7 θέση έναρξης της μετάφρασης και το γονίδιο που του προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό καναμυκίνη. Να σημειώσουμε ότι η αλληλουχία αριθμείται με την σύμβαση pbr322, οπότε η περιοχή έκφρασης Τ7 φαίνεται ανεστραμμένη στο χάρτη του pet49b(+). 82

Εικόνα 29. Το πλασμίδιο pετ49b(+) Πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού Προκειμένου να γίνει πέψη με ένζυμα περιορισμού, το μίγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει: το DΝΑ, (που μπορεί να είναι γενωμικό DΝΑ, πλασμιδιακός φορέας, ή το τμήμα του DΝΑ που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα στο οποίο τα ένζυμα περιορισμού εμφανίζουν τη βέλτιστη δράση, τα ένζυμα περιορισμού και σε ορισμένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουμίνη. Ο συνολικός όγκος του μίγματος κυμαίνεται από 20 έως 50μl. Η αντίδραση πραγματοποιείται συνήθως στους 37 C, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύμων που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% ν/ν του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει μη εξειδικευμένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύμων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο μίγμα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δυο ώρες. Μερικές φορές όμως, για τα τμήματα του DΝΑ που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται μεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυμα περιορισμού είναι πολύ κοντά στα άκρα, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνεται η πέψη. Στην προκείμενη εργασία κλωνοποιήθηκε το γονίδιο της Α2 επικράτειας του ανθρώπινου vwf στο πλασμίδιο pet49b(+). 83

Οι συνθήκες της αντίδρασης για το πλασμίδιο και το τμήμα DNA που επρόκειτο να κλωνοποιηθεί φαίνονται παρακάτω: 1η κοπή HindIII (20U/μl) pet49b/τμήμα DNA Ρυθμιστικό διάλυμα 10x BSA (10 x) H2O 20U 10/20μg 2/5μl 2/5μl μέχρι 20/50μl 2η κοπή BamHI (20U/μl) pet49b/τμήμα DNA Ρυθμιστικό διάλυμα 10x BSA (10 x) H2O 20U 10/20μg 2/5μl 2/5μl μέχρι 20/50μl Όταν πρόκειται για πέψη πλασμιδίων, γίνεται επώαση πρώτα με το ένα ένζυμο (1 ώρα και 30 λεπτά στους 37 ο C), ακολουθεί καθαρισμός από την πηκτή αγαρόζης και μετά επώαση με το δεύτερο ένζυμο (1 ώρα στους 37 ο C). Ο λόγος που γίνεται η διαδοχική πέψη, είναι προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι μετά την πέψη με το πρώτο ένζυμο, το πλασμίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραμμικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο μορφές του πλασμιδίου. Διαδοχική επώαση με τα δυο ένζυμα γίνεται, όταν αυτά δεν είναι συμβατά για να γίνει ταυτόχρονη επώαση. 84

Αντίδραση λιγάσης Προκειμένου να γίνει η ενσωμάτωση του τμήματος του DΝΑ που μας ενδιαφέρει στον αντίστοιχο πλασμιδιακό φορέα, χρησιμοποιείται μια DΝΑ λιγάση. Η αναλογία των δυο αντιδρώντων είναι συνήθως 6:1. Στην προκείμενη εργασία χρησιμοποιήθηκε η Τ4 DNA ligase της Takara. Οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: Αντίδραση λιγάσης DNA πλασμιδιακού φορέα DNA insert Ρυθμιστικό διάλυμα 10x T4 DNA ligase (5 U/μl) 10 ng 60 ng 4 μl 1 μl H2O μέχρι τα 40 μl Η επώαση, γίνεται για 45 min, σε θερμοκρασία δωματίου. Η πιο πάνω αντίδραση της λιγάσης γίνεται και απουσία του τμήματος DΝΑ που πρόκειται να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο, προκειμένου να ελεγχθεί το ποσοστό επανακυκλοποίησης του πλασμιδιακού φορέα, χωρίς την παρεμβολή του ξένου DΝΑ. Αν παρατηρηθεί μεγάλο τέτοιο ποσοστό, κρίνεται σκόπιμο να γίνει αποφωσφορυλίωση του πλασμιδίου πριν αυτό χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Στη συγκεκριμένη εργασία, η φωσφατάση που χρησιμοποιήθηκε είναι της εταιρείας Roche. Η αντίδραση αποφωσφορυλίωσης γίνεται ως εξής: Αντίδραση αποφωσφορυλίωσης DNA πλασμιδιακού φορέα Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφατάσης 10x SΑΡ 100 ng 2/3 μl 1 μl Η2Ο μέχρι τα 20/30 μl 85

Επώαση για 30 min στους 37 C. Μετά το τέλος της επώασης, ακολουθεί απενεργοποίηση του ενζύμου στους 65 C για 15 min. Τελικά, το πλασμίδιο καθαρίζεται και μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για την αντίδραση λιγάσης. Προετοιμασία επιδεκτικών για μετασχηματισμό βακτηρίων (competent cells) Σύμφωνα με την τεχνική αυτή τα βακτηριακά κύτταρα καθίστανται ικανά, (επιδεκτικά), προκειμένου να γίνει εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Μέθοδος των δυο διαλυμάτων CaCl2 Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο την επαγωγή της επιδεκτικότητας των βακτηριακών κυττάρων προκειμένου να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια που υπέστησαν κατεργασία με διαλύματα CaCl2 στους 4 ο C μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές (Sambrook, Fritsch et al. 1989). Η συγκεκριμένη τεχνική εφαρμόστηκε στα στελέχη E. coli XL1 και BL21(DE3) και αναλυτικά έχει ως εξής: 3ml θρεπτικού υλικού LB (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1% w/v), που περιέχει το κατάλληλο αντιβιωτικό, εμβολιάζονται με κύτταρα Ε. coli, (XL1 ή BL21), και αφήνονται να αναπτυχθούν με ανακίνηση στους 37 ο C για 12-16 ώρες (over night). Στη συνέχεια, 10ml LB εμβολιάζονται με 100 μl αυτής της καλλιέργειας και ακολουθεί επώαση στους 37 ο C, μέχρις ότου η απορρόφηση φθάσει περίπου στο 0,3, (αρχή της λογαριθμικής φάσης), στα 600 nm. Αμέσως μετά η καλλιέργεια τοποθετείται στον πάγο για 10 λεπτά, προκειμένου να σταματήσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 9000 x g για 10 λεπτά. Κατόπιν, αφού γίνει απόχυση του υπερκειμένου, τα κύτταρα αιωρούνται σε 5 ml CaCl2 100 mm, (1/2 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Τα κύτταρα παραμένουν για 20 λεπτά στον πάγο και ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση σε 9000 x g για άλλα 10 λεπτά, για να απομακρυνθού τυχόν υπολείμματα θρεπτικού υλικού. Τo υπερκείμενο απομακρύνεται προσεκτικά και τελικά τα κύτταρα αιωρούνται σε 1 ml CaCl2 50 mm και παραμένουν στον πάγο για 45 λεπτά, οπότε και είναι έτοιμα να δεχθούν το DNA. Για κάθε δείγμα DNA χρησιμοποιούνται 200 μl επιδεκτικών κυττάρων. Τα κύτταρα χρησιμοποιούνται άμεσα και δεν μπορούν να αποθηκευτούν (Mandel and Higa 1970). 86

Μέθοδος δυο διαλυμάτων CaCl2 (αποθηκεύονται στους -70 ο C) Η μέθοδος αυτή στηρίζεται, όπως και αυτή της προηγούμενης παραγράφου, στην ιδιότητα του CaCl2 να δημιουργεί επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα για την εισαγωγή DNA. Μπορεί να εφαρμοστεί στα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα TFB-I ph 7.0 CH3COOK MnCl2 KCl CaCl2 Γλυκερόλη 30 mm 50 mm 100 mm 10 mm 15% v/v Διάλυμα TFB-II ph 7.0 MOPS CaCl2 KCl Γλυκερόλη 10 mm 75 mm 100 mm 15% v/v Η διαδικασία έχει ως εξής: 3 ml θρεπτικού υλικού LB ή TYM εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, [15μg/ml τετρακυκλίνη (XL1), 20μg/ml στρεπτομυκίνη (TOP 10)]. Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για 12-16 ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml LB, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. 1 ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού LB και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή 0.35-0.4. Η καλλιέργεια στη συνέχεια ψύχεται στον πάγο για 10 λεπτά, και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 20 λεπτά, στους 4 C. Το υπερκείμενο αποχύνεται και τα κύτταρα αιωρούνται σε 25 ml, 87

(που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας), ρυθμιστικού διαλύματος TFB-I και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 4000 x g και τα κύτταρα αιωρούνται τελικά σε 1 ml διαλύματος TFB-II. Το αιώρημα που προκύπτει, χωρίζεται σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), σε κλάσματα των 150-200 μl και αυτά εμβαπτίζονται για μικρό χρονικό διάστημα σε λουτρό, στο οποίο έχει προστεθεί ξηρός πάγος/αιθανόλη. Με τη διαδικασία αυτή, επιτυγχάνεται η άμεση ψύξη των κλασμάτων, τα οποία μπορούν κατόπιν να διατηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα στους -70 C. Εισαγωγή πλασμιδίου σε κύτταρα E. Coli (μετασχηματισμός) Ένα τμήμα DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί σε έναν πλασμιδιακό φορέα και στη συνέχεια να εισαχθεί σε κύτταρα E.Coli (μετασχηματισμός, transformation) ώστε να παραχθούν μέσα σε λίγες ώρες υψηλές ποσότητες του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου. Από το πλασμίδιο αυτό μπορεί στη συνέχεια να απομονωθεί η παργόμενη πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το τμήμα DNA που έχει εισαχθεί. Τα επιδεκτικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασμιδιακού DNA (καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Η διαδικασία έχει ως εξής: Στο αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων, (100μl), προστίθενται 40-80ng πλασμιδιακού DNA ή 7-10μl του μίγματος της αντίδρασης της λιγάσης επώαση για 45 λεπτά στον πάγο θερμικό σοκ (heat shock) του μίγματος των κυττάρων με το DNA στους 42 ο C για 2 λεπτά ψύξη για 1 min στον πάγο προσθήκη 600-800μl LB και επώαση για 30 min στους 37 ο C, προκειμένου να αρχίσει η ανάπτυξη των κυττάρων φυγοκέντρηση σε 6000xg για 2 λεπτά απομάκρυνση του υπερκείμενου (600-800μl), και επαναιώρηση σε 100μl LB. το αιώρημα με τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα, απλώνεται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ και το κατάλληλο αντιβιοτικό τα τρυβλία επωάζονται στους 37 ο C για 12-16 ώρες, ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Τα πλασμίδια προσδίδουν στα κύτταρα ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό, με αποτέλεσμα οι αποικίες που εμφανίζονται στα τρυβλία να αποτελούνται αποκλειστικά και μόνο από κύτταρα που περιέχουν τον πλασμιδιακό φορέα, (μόνο του ή ανασυνδυασμένο). 88

Εικόνα 30. Σχηματική απεικόνιση της επιδεκτικότητας και του μετασχηματισμού βακτηριακών κυττάρων. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση και καθαρισμός με φαινόλη / χλωροφόρμιο/ισοαμυλική αλκοόλη Μια αποικία από τα μετασχηματισμένα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3ml θρεπτικού υλικού, στο οποίο έχει προστεθεί επίσης αντιβιοτικό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί με ανάδευση, για 12-16 ώρες στους 37οC. 1.5ml από την καλλιέργεια μεταφέρονται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 13000xg. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειμένου και στο ίζημα προστίθενται 50μl ψυχρού διαλύματος που περιέχει 50mM γλυκόζη, 25mM Tris-HCl ph 8.0 και 10mM EDTA ph 8.0. Μετά από έντονη ανάδευση, στο ίδιο διάλυμα προστίθενται 100μl πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 0.2Ν NaOH και 1% w/v SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Κατόπιν, ακολουθεί προσθήκη 80μl ψυχρού διαλύματος CH3COOK 5M και έπειτα από έντονη ανάδευση ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε 13000xg. Με τη φυγοκέντρηση απομακρύνονται τα μεμβρανικά συστατικά, οι πρωτεΐνες, το χρωμοσωμικό DNA και το SDS. Στο υπερκείμενο προστίθενται 2.5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και στη συνέχεια αυτό αφήνεται στους -20οC για 30 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η κατακρήμνιση του DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε 13000xg. Το ίζημα αιωρείται σε 50μl διαλύματος ΤΕ, (10mM Tris-ΗCl, 10mM EDTA, ph 8.0), παρουσία 89

RNase A, (20μg/ml), και επωάζεται στους 37 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη 50μl επιπλέον TE και κατόπιν, γίνεται εκχύλιση του DNA με προσθήκη 1 όγκου μίγματος φαινόλης/χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης, σε αναλογία 25:24:1. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται άλλη μια φορά. Στο τέλος γίνεται μια ακόμη εκχύλιση με την προσθήκη 1 όγκου χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης σε αναλογία 24:1, για την απομάκρυνση της εναπομένουσας φαινόλης. Κάθε φορά απομονώνεται η υδατική στοιβάδα έπειτα από φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε 13000xg. Στο τέλος, προστίθενται 1/10 όγκου CH3COONa 3M ph 5.2 και 2.5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και ύστερα από παραμονή στους -20οC για 30 λεπτά και φυγοκέντρηση, το DNA διαλύεται τελικά σε 20μl αποστειρωμένου διςαπεσταγμένου νερού και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του (Sambrook et al., 1989). Απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep, midi prep) Σε 3ml θρεπτικού υλικού LB παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, προστίθεται μια αποικία και η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ανάδευση στους 37 ο C για 12-16 ώρες. 1.5ml της πλήρους ανεπτυγμένης καλλιέργειας, μεταφέρονται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου, (eppendorf), και φυγοκεντρείται στις 13000xg για 1 λεπτό. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειμένου και αιώρηση των κυττάρων σε 250μl διαλύματος P1. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη 250μl διαλύματος P2 και ήπια ανάδευση. Έπειτα από παραμονή 5 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου, προστίθενται 350μl διαλύματος Ν3 και έπειτα από εντονότερη ανάδευση γίνεται φυγοκέντρηση σε 13000xg για 10 λεπτά, για το διαχωρισμό του χρωμοσωμικού από το πλασμιδιακό DNA των βακτηρίων. Το υπερκείμενο διαβιβάζεται στη στήλη Qiagen tip-10 και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε 13000xg. Το DNA συγκρατείται στη στήλη, ενώ οι πρωτεΐνες διέρχονται. Για την απομάκρυνση τυχόν προσμίξεων γίνεται πλύση με αιθανολικό διάλυμα PB. Το διάλυμα απομακρύνεται με διπλή φυγοκέντρηση σε 13000xg, για 1 λεπτό. Η έκλουση του πλασμιδιακού DNA από τη στήλη γίνεται με 30μl αποστειρωμένου δις-απεσταγμένου νερού. Καλλιέργειες βακτηρίων E. coli Τα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10, αναπτύσσονται σε θρεπτικό υπόστρωμα LB, (Luria-Bertani) (Sambrook et al., 1989), του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: 90

Θρεπτικό υλικό LB Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl 0.5 % w/v 1.0 % w/v 1.0 % w/v Η ρύθμιση της οξύτητας γίνεται με τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση μιας Atm, για 30 λεπτά. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου Οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα σωματίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται δια μέσου των πόρων μιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα με την οποία κινούνται οι πρωτεΐνες στην πηκτή, (v), εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου, (Ε) και από το φορτίο της πρωτεΐνης, (q), σχέση που δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: όπου f είναι παράγοντας της εξίσωσης που εκφράζει την εξάρτηση από τη μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης, όπως επίσης και το ιξώδες της πηκτής όπου κινείται η πρωτεΐνη. Το πολυακρυλαμίδιο, που χρησιμοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα, όπως είναι η χημική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερμοκρασία, και τα αποτελέσματα των ηλεκτροφορήσεων με πολυακρυλαμίδιο είναι επαναλήψιμα. Η δημιουργία των πηκτών πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται με τον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου, (CH2=CH- CO-NH2), και του Ν,Ν-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου, (bis-ακρυλαμιδίου) (CH2=CH- CO-NH-CH2-NH-COCH=CH2). Η αναλογία με την οποία χρησιμοποιούνται τα δυο υλικά είναι 30:1 w/w. Το bis-ακρυλαμίδιο, συντελεί στο σχηματισμό γεφυρών μεταξύ των αλυσίδων των πολυμερών του ακρυλαμιδίου. Κατ αυτόν τον τρόπο, δημιουργείται ένα τρισδιάστατο πολυμερές πλέγμα, το μέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της 91

συγκέντρωσης των μονομερών του ακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός πραγματοποιείται με το μηχανισμό των ελευθέρων ριζών. Σαν δότης των ελευθέρων ριζών χρησιμοποιείται το υπερθειϊκό αμμώνιο, (Ammonium PerSulfate, APS, (NH4)2S2O8). Στη συνέχεια προστίθεται ο φωτοχημικός καταλύτης Ν,Ν,- τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη, (TEMED), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν και δίνει μια ελεύθερη ρίζα, (S2O8 2- +e - SO4 2- + SO4 -.), η οποία διαδίδεται σε άλλα μόρια ακρυλαμιδίου προς σχηματισμό του πολυμερούς. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται απουσία ή παρουσία μετουσιωτικών παραγόντων, όπως είναι το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου), ή η ουρία. Στην πρώτη περίπτωση οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους και παραμένουν ενεργές, ενώ στην περίπτωση προσθήκης μετουσιωτικών παραγόντων, οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Επίσης, η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει παρουσία ή απουσία αναγωγικών, όπως είναι η β-μερκαπτοαιθανόλη και το DTT (διθειοθρεϊτόλη) (Stern et al., 1993). Τα αναγωγικά ανάγουν τις σουλφιδρυλικές ομάδες των κυστεϊνών και καταστρέφουν τις δισουλφιδικές γέφυρες. Το σύστημα της ηλεκτροφόρησης μπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστημα, χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα τόσο στην πηκτή, όσο και στα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστημα, χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβαξης, όπου γίνεται συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια λεπτή στοιβάδα, (χαμηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~7), και η πηκτή διαχωρισμού, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος, (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαμιδίου, ph ~9). Το διάλυμα ηλεκτροδίων διαφέρει από τα δυο προηγούμενα, (Andrews, 1968). Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDSηλεκτροφόρηση) Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στο διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το μοριακό τους μέγεθος. Στο συγκεκριμένο είδος ηλεκτροφόρησης ως αποδιατακτικό μέσο χρησιμοποιείται το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου). Το SDS δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και τις αποδιατάσσει. Έτσι, δημιουργούνται επιμήκη μόρια, αρνητικά φορτισμένα, με σαφή και καθορισμένη δομή. Το ποσό του SDS που δεσμεύεται είναι αρκετά σταθερό, (1.4g SDS/g πρωτ.). Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού μεγέθους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των 92

πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, εξαρτάται αποκλειστικά από το μοριακό μέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό γλυκοζυλίωσης, Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσμεύουν μικρότερα ποσά SDS ανά μονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή διαχωρισμού με αποτέλεσμα να παρουσιάζουν φαινόμενο μοριακό βάρος υψηλότερο του πραγματικού. Το σύστημα που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων, αποτελείται από την πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1cm περίπου, πριν εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού, καθώς και την πηκτή διαχωρισμού (separating gel), ύψους 7.5cm και πάχους 1.5mm. Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγματος, δημιουργούνται με τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός της πηκτής επιστοίβαξης. Η αναλογία ακρυλαμίδης εξαρτάται από το μέγεθος της πρωτεΐνης-στόχου. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισμού και επιστοίβαξης είναι η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης (Συνολικός όγκος 5 ml) Ακρυλαμίδιο bis- ακρυλαμίδιο SDS 5% w/v 0.17% w/v 0.50% w/v Tris-HCl ph 6.8 0.125M APS TEMED 0.08% w/v 0.20% v/v 93

Πηκτή διαχωρισμού (Συνολικός όγκος 10 ml) Ακρυλαμίδιο 12% w/v, 15% w/v, 20% w/v bis- ακρυλαμίδιο SDS 0.4% w/v 0.50% w/v Tris-HCl ph 8.9 0.375M APS TEMED 0.08% w/v 0.20% v/v Επίσης χρησιμοποιείται διάλυμα ηλεκτροφόρησης με την παρακάτω σύσταση: Διάλυμα ηλεκτροφόρησης ph 8.9 Tris-HCl 25mM Γλυκίνη 0.192M SDS 0.1% w/v Τα δείγματα πριν εισέλθουν στην πηκτή επιστοίβαξης αναμιγνύονται με το εξής διάλυμα (loading buffer) : Διάλυμα δειγμάτων (loading buffer) SDS Tris-HCl ph 6.8 2% w/v 62.5mM β- μερκαπτοαιθανόλη 1% v/v Γλυκερόλη Κυανούν της βρωμοφαινόλης 10% v/v 0,02% w/v Το αρχικό διάλυμα των ηλεκτροδίων είναι τέσσερις φορές πυκνότερο, (4x). Τα δείγματα, πριν την επιστοίβαξή τους θερμαίνονται στους 100 ο C για 5 λεπτά. Με 94

αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών, καθώς και η δημιουργία συμπλόκων πρωτεΐνης-sds. Η β-μερκαπτοαιθανόλη προστίθεται για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών και το διαχωρισμό των υπομονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Απουσία της β-μερκαπτοαιθανόλης δίνει τη δυνατότητα απεικόνισης πρωτεϊνών που αποτελούνται από παραπάνω από μία υπομονάδες. Αρχικά εφαρμόζεται σταθερή τάση 90V, μέχρι τα δείγματα να εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισμού και κατόπιν εφαρμόζεται σταθερή τάση 100V, μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Για την ηλεκτροφόρηση αυτού του τύπου χρησιμοποιήθηκαν οι επίπεδες συσκευές πάχους 1,5mm και μήκους 7.5cm, που κατασκευάστηκαν στο Ινστιτούτο Max-Panck Μοριακής Γενετικής του Βερολίνου. Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκε σύστημα ασυνεχές (Laemmli, 1970). Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου. Μετά το διαχωρισμό των πρωτεϊνικών ζωνών στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση είναι απαραίτητη η εμφάνιση και ανάγνωσή τους. Για αυτό το σκοπό οι ζώνες μπορούν να γίνουν ορατές με κατάλληλες μεθόδους χρώσης. Η βαφή των πρωτεϊνών έγινε με Coommassie Blue ή με νιτρικό άργυρο. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 Η χρωστική Coomassie είναι το περισσότερο διαδεδομένο αντιδραστήριο για τη χρώση πρωτεϊνικών ζωνών στις πηκτές ηλεκτροφόρησης. Σε συνθήκες όξινου διαλύματος η χρωστική Coomassie συνδέεται σε βασικά και υδρόφοβα κατάλοιπα πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα αλλαγή του χρώματός της από θαμπό κοκκινωπό-καφέ σε έντονο μπλε. Όπως συμβαίνει με όλες τις χρώσεις, τα αντιδραστήρια της χρωστικής Coomassie ανιχνεύουν καλύτερα κάποιες πρωτεΐνες από κάποιες άλλες, λόγω των διαφορετικών χημικών ιδιοτήτων και της σύνθεσής τους. Ωστόσο, για τις περισσότερες πρωτεΐνες, είναι δυνατή η ανίχνευση τους με τη χρωστική αυτή. Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στη δημιουργία συμπλόκου κυανού χρώματος, μεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής R250. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είχαν την εξής σύσταση: 95

Διάλυμα χρώσης CBB R-250 Μεθανόλη Οξικό οξύ 0,1 % w/v 50 % v/v 10 % v/v Διάλυμα αποχρωματισμού Μεθανόλη Οξικό οξύ 50 % v/v 10 % v/v Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών, η πηκτή ξεπλένεται με νερό, ώστε να απομακρυνθούν καλά όλα τα διαλύματα. Ακολουθεί έκπλυση με οξύ ή αλκοόλη, ώστε να στερεωθεί η πηκτή και να αποφευχθεί διάχυση των πρωτεϊνικών ζωνών. Προκειμένου να δημιουργηθεί το σύμπλοκο, η πηκτή εμβαπτίζεται στο διάλυμα χρώσης και αφήνεται για μια ώρα περίπου. Με το διάλυμα αυτό, γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ακολούθως, η πηκτή τοποθετείται στο διάλυμα αποχρωματισμού και ανακινείται για αρκετές ώρες, ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση μέχρι και 0,1 μg πρωτεΐνης. Βαφή με νιτρικό άργυρο (AgNO3 ) Το χαρακτηριστικό της τεχνικής αυτής είναι η μεγαλύτερη ευαισθησία που παρουσιάζει στην ανίχνευση πρωτεϊνών σε σχέση με τη χρώση με Coomasie Blue. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που μπορεί να ανιχνευθεί είναι μέχρι και 0,1 ng. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ιόντων αργύρου να αντιδρούν με πρωτεΐνες και ιδιαίτερα με τις ελεύθερες αμινοομάδες και τις θειούχες ομάδες τους. Η σύσταση των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν είναι η ακόλουθη: Διάλυμα στερέωσης Μεθανόλη Οξικό οξύ 50 % v/v 12 % v/v 96

Διάλυμα θειοθειϊκού νατρίου Na2S2O3 0,02 % w/v Διάλυμα νιτρικού αργύρου AgNO3 Φορμαλδεΰδη 0,2 % w/v 0,028 % v/v Διάλυμα εμφάνισης Na2CO3 Φορμαλδεΰδη Na2S2O3 6 % w/v 0,028 % v/v 0,02 % w/v Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά η πηκτή εμβαπτίζεται στο διάλυμα στερέωσης για τουλάχιστον δυο ώρες, προκειμένου να στερεωθούν οι ζώνες των πρωτεϊνών στην πηκτή. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 15 λεπτών με 50 % v/v αιθανόλη και μία πλύση των 20 λεπτών με 30 % v/v αιθανόλη. Κατόπιν γίνεται μια πλύση του ενός λεπτού με απιονισμένο νερό και στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίζεται για 1 λεπτό στο διάλυμα του θειοθειϊκού νατρίου, (Na2S2O3), το οποίο ακολούθως απομακρύνεται με 3 πλύσεις των 20 δευτερολέπτων με απιονισμένο νερό. Στη συνέχεια η πηκτή εμβαπτίζεται για 20 λεπτά στο διάλυμα του νιτρικού αργύρου, (AgNO3) και ξεπλένεται δύο φορές με απιονισμένο νερό. Ακολουθεί εμβάπτιση της πηκτής στο διάλυμα εμφάνισης, οπότε και εμφανίζονται οι πρωτεϊνικές ζώνες. Η αντίδραση σταματά με την εμβάπτιση της πηκτής στο διάλυμα στερέωσης για 10 λεπτά. Η πηκτή ξεπλένεται και φυλάσσεται σε απιονισμένο νερό (Helmut Blum 1987). Ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην παρασκευή πηκτών με τήξη της αγαρόζης, η οποία είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού μοριακού μεγέθους. Πρόκειται για ένα γραμμικό πολυμερές, με βασική μονάδα τη D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-Lγαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται με θέρμανση, παρουσία κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος. Η ηλεκτροφόρηση τμημάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης, 97

βασίζεται στη μετακίνηση των αρνητικά φορτισμένων μορίων DNA σε ουδέτερο ph, προς την άνοδο. Η ταχύτητα μετακίνησης των τμημάτων DNA εξαρτάται από: το μέγεθός τους, (για γραμμικά δίκλωνα μόρια είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθμου του αριθμού των βάσεών τους), τη διαμόρφωσή τους, (γραμμικά, κυκλικά ή υπερελικωμένα), τη συγκέντρωση της αγαρόζης, το δυναμικό που εφαρμόζεται, και από τη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος που χρησιμοποιείται. Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης από 1-1.5 % w/v και τα εξής διαλύματα: Ρυθμιστικό διάλυμα TBE Tris 89mM Η3ΒΟ3 0.45M EDTA ph 8.0 2mM Ρυθμιστικό διάλυμα TAE Tris-acetate EDTA ph 8.0 40mM 1mM Διάλυμα δειγμάτων 6Χ γλυκερόλη κυανούν του ξυλενίου κυανούν της βρωμοφαινόλης 30% v/v 0.25% w/v 0.25% w/v Αρχικά, γίνεται διάλυση της αγαρόζης στο ρυθμιστικό διάλυμα με θέρμανση στους 100 ο C, ακολουθεί ελάττωση της θερμοκρασίας, (μέχρι τους 60 ο C περίπου), προσθήκη του βρωμιούχου αιθιδίου, (EtBr), σε συγκέντρωση 0.5 μg/ml και απόχυση στην ειδική συσκευή. Το διάλυμα ηλεκτροφόρησης είναι το TBE ή το ΤΑΕ, σε τελική συγκέντρωση 1X. 98

Η εμφάνιση των ζωνών των μορίων του DNA στην αγαρόζη, επιτυγχάνεται με την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου στο διάλυμα της πηκτής ή/και στο διάλυμα των ηλεκτροδίων. Πρόκειται για μια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 και 366 nm και να την επανεκπέμπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσματος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA. Η ένταση φθορισμού του ελεύθερου EtBr είναι πολύ μικρότερη από αυτή του συμπλόκου EtBr-DNA, επομένως είναι δυνατή η ανίχνευση μικρών ποσοτήτων DNA (Sambrook et al., 1989; Sharp et al., 1973). Υπερέκφραση πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα E. Coli BL21(DE3)-σύστημα έκφρασης pet Το σύστημα pet της Novagen αποτελεί ένα από τα καλύτερα συστήματα για την κλωνοποίηση και την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα Ε. coli, εξασφαλίζοντας υψηλά επίπεδα έκφρασης και αυστηρό έλεγχο στο βασικό επίπεδο της μετάφρασης. Το γονίδιο-στόχος κλωνοποιείται στο πλασμίδιο pet κάτω από τον έλεγχο του προαγωγού από Τ7 βακτηριοφάγο, ενώ η επαγωγή της έκφρασης γίνεται από την Τ7 RNA πολυμεράση, η οποία είναι τόσο επιλεκτική και δραστική ώστε το σύνολο σχεδόν των αποθεμάτων του κυττάρου να μετατρέπονται σε προϊόν έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Αρχικά τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια μετασχηματίζονται σε κύτταρα ξενιστές που δεν περιέχουν το γονίδιο της Τ7 πολυμεράσης, έτσι ώστε το γονίδιο στόχος να είναι ανενεργό και επομένως να μην προκαλέσει αστάθεια του πλασμιδίου λόγω της παραγωγής πρωτεϊνών, τοξικών για το κύτταρο. Στη συνέχεια γίνεται μεταφορά του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε βακτηριακά στελέχη τα οποία περιέχουν στο χρωμόσωμα τους ένα αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης (λde3 λυσογόνο) το οποίο βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του lacuv5 προαγωγέα και η έκφρασή του επάγεται με την προσθήκη του ισοπροπυλ-β-dθειογαλακτοπυρανοζιδίου (IPTG). Στην περίπτωση των λde3 λυσογόνων, λόγω της ύπαρξης του lacuv5 προαγωγέα, μπορεί να επιτευχθεί η μεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και η έκφραση γονιδίων που τα προϊόντα τους δεν είναι τοξικά για την ανάπτυξη των κυττάρων, χωρίς την προσθήκη του IPTG. Όταν όμως απαιτείται αυστηρότερος έλεγχος, τότε χρησιμοποιούνται κύτταρα ξενιστές που περιέχουν το πλασμίδιο plyss ή plyse. Τα πλασμίδια αυτά παράγουν σε μικρά και μεγάλα ποσά την Τ7 λυσοζύμη η οποία είναι φυσικός αναστολέας της Τ7 RNA πολυμεράσης. Ακόμη αυστηρότερος έλεγχος της μεταγραφής από την Τ7 RNA πολυμεράση επιτυγχάνεται με τη χρησιμοποίηση του Τ7 lac προαγωγέα ο οποίος περιλαμβάνει μια ακολουθία 25 bp του lac χειριστή μετά από την περιοχή των 17 bp 99

του Τ7 προαγωγέα. Ο lac αναστολέας δεσμεύεται στην περιοχή του χειριστή ελαττώνοντας σημαντικά την μεταγραφή από την Τ7 RNA πολυμεράση. Τα πλασμίδια pet που χρησιμοποιούνται για την έκφραση των γονιδίων στόχων εκτός από τον Τ7 lac προαγωγέα περιέχουν και το γονίδιο του lac αναστολέα εξασφαλίζοντας έτσι ότι υπάρχει αρκετός αναστολέας για την κάλυψη όλων των θέσεων των χειριστών. Εικόνα 31. Στοιχεία ελέγχου του συστήματος pet στα κύτταρα BL21 (DE3). Ένα άλλο πλεονέκτημα των φορέων έκφρασης pet είναι ότι περιέχουν διάφορες ακολουθίες που βρίσκονται δίπλα στις θέσεις κλωνοποίησης και κωδικοποιούνται προς πεπτίδια ουρές που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και καθαρισμό των γονιδίων -στόχων. Τέτοια πεπτίδια ουρές είναι μια ακολουθία 6 ιστιδινών (6xHistag) ή 10 ιστιδινών (10xHis-tag), η S-ακολουθία (S-tag), η Τ7- ακολουθία (Τ7-tag) και η HSV-ακολουθία (HSV-tag). Οι ακολουθίες αυτές μπορεί να βρίσκονται είτε στο άμινο-τελικό άκρο είτε στο κάρβοξυ-τελικό άκρο της πρωτεΐνης. Φυσικά μερικοί φορείς έκφρασης pet μπορούν να εκφράσουν πρωτεΐνες χωρίς τα πεπτίδια ουρές. Ήπια λύση κυττάρων με heat shock Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται για τη λύση μικρής ποσότητας κυττάρων των οποίων το πρωτεϊνικό προφίλ θα θέλαμε να παρατηρήσουμε. Με αυτόν τον τρόπο δεν χάνονται σχεδόν καθόλου πρωτεΐνες, γεγονός που καθιστά τη συγκεκριμένη τεχνική ιδανική για παρατήρηση της υπερέκφρασης ενός γονιδίου. Η 100

λύση των κυττάρων πραγματοποιείται με διαδοχικούς κύκλους ψύξης-απόψυξης. Το διάλυμα λύσης (lysis buffer) αποτελείται από ουρία 6Μ και Tris-HCl 20 mm, ph 7,5. Η ουρία παίζει διπλό ρόλο. Αφενός ως πολικό, μη ιοντιλό αποδιατακτικό διαλυτοποιεί τις μεμβρανικές πρωτεΐνες και τα λιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης και εφετέρου, λόγω της μεγάλης συγκέντρωσής της στο διάλυμα, δημιουργεί ωσμωτική πίεση. Τα κύτταρα, αφού προηγουμένως αιωρηθούν στο διάλυμα, ψύχονται στους -80 ο C για 25 min και στη συνέχεια στους 5 ο C για ίσο χρονικό διάστημα. Ο κύκλος ψύξης-απόψυξης επαναλαμβάνεται άλλες δυο φορές. Όλες οι πρωτεΐνες του κυττάρου βρίσκονται στο υπερκείμενο μετά από φυγοκέντρηση. Λύση κυττάρων με υπερήχους (sonication) Η συγκεκριμένη μέθοδος χρησιμοποιείται για λύση μεγαλύτερης ποσότητας κυττάρων. Τα κύτταρα αιωρούνται σε διάλυμα λύσης που αποτελείται από urea 6M, Tris-HCl 20 mm, ph 8.0. Ο όγκος του διαλύματος λύσης είναι το 1/50 του όγκου της υγρής καλλιέργειας των κυττάρων. Η όλη διαδικασία περιλαμβάνει 6 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων κατά τη διάρκεια των οποίων εφαρμόζονται υπέρηχοι, ενώ μεταξύ των χρονικών διαστημάτων παρεμβάλλεται κάθε φορά μια παύση 40 δευτερολέπτων, κατά τη διάρκεια της οποίας τα δείγματα εμβαπτίζονται σε πάγο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 130 rpm για 5 λεπτά. Οι πρωτεΐνες του κυττάρου βρίσκονται στο υπερκείμενο. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) Η συγκεκριμένη τεχνική επιτρέπει την έκφραση πρωτεϊνών με υψηλή απόδοση σε βακτηριακά κύτταρα και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν, κλωνοποιούνται σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους προαγωγείς τέτοιους, ώστε να επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης μ αυτή. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας στήλη αγχιστείας, που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Κατά συνέπεια, ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα γίνεται εφικτός λόγω της αλληλεπίδρασης της GST με τη γλουταθειόνη που έχει ως αποτέλεσμα την καθήλωση της, στα σφαιρίδια της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη γίνεται με την προσθήκη διαλύματος ανηγμένης γλουταθειόνης, σε περίσσεια. Με αυτόν τον τρόπο, αφενός μεν είναι δυνατή η εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της 101

πρωτεΐνης από τη στήλη, αφετέρου δε οι συνθήκες που χρησιμοποιούνται είναι πολύ ήπιες, έτσι ώστε ο κίνδυνος αλλαγών στη δομή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης να είναι μηδαμινός. Τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι τα εξής: Διάλυμα αιώρησης των κυττάρων PBS Triton X-100 β-μερκαπταιθανόλη PMSF 1X 1 % v/v 0,1 % v/v 1 mm Διάλυμα έκλουσης Ανηγμένη Γλουταθειόνη Tris-Cl ph 8.0 10 mm 50 mm Διάλυμα εξισορρόπησης PBS Triton X-100 1X 1 % v/v Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή για όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα, (BL21(DH3)), που έχουν μετασχηματιστεί με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα, απλώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Ακολουθεί εμβολιασμός 50ml υγρού θρεπτικού υλικού LB, (100 μg/ml αμπικιλλίνη), με μια αποικία η οποία επιλέγεται από το τρυβλίο. Κατόπιν, η καλλιέργεια αυτή επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. 10ml από την καλλιέργεια που προκύπτει, χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό 500ml θρεπτικού υλικού LB που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνης. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται με ήπια ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων να φτάσει στο 0,6. Στην πιο πάνω απορρόφηση, γίνεται προσθήκη 1 mm IPTG και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C, για περιορισμό δράσης πρωτεολυτικών 102

ενζύμων, καθώς επίσης και για την ελαχιστοποίηση της δημιουργίας εγκλείστων σωματιδίων (inclusion bodies). Η προσθήκη του IPTG, ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες κυτταρικές λειτουργίες. Η επώαση συνεχίζεται για 1.5-2 ώρες και τελικά, τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση 15 λεπτών σε 4500 x g. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου, το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 6ml διαλύματος αιώρησης των κυττάρων. Ακολουθεί λύση των κυττάρων με υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, ενώ ενδιάμεσα μεσολαβεί κάθε φορά μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το τελικό αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά σε 10000 x g και λαμβάνεται το υπερκείμενο εκχύλισμα των πρωτεϊνών, το οποίο αναμιγνύεται με το αιώρημα των σφαιριδίων της στήλης. Ακολουθεί ανάδευση για 30 λεπτά στους 4 C, ώστε να επιτευχθεί η δέσμευση της πρωτεΐνης σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Στη συνέχεια, τα σφαιρίδια φυγοκεντρούνται για 2 λεπτά σε 13000 x g και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 λεπτά, στους 4 C υπό ανάδευση. Στο τέλος, μετά από φυγοκέντρηση 2 λεπτών σε 10000 x g, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 λεπτών η κάθε μία, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, με διάλυμα έκλουσης. Τα εκλούσματα που περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης, φυλάσσονται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης, μετά από κάθε χρήση, προκειμένου να επαναχρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό της ίδιας πρωτεΐνης σύντηξης, αναγεννάται με τρεις διαδοχικές πλύσεις στους 4 C, χρησιμοποιώντας για 30 λεπτά όξινο και για άλλα 30 λεπτά βασικό διάλυμα. Τελικά, η στήλη εξισορροπείται με διάλυμα PBST και φυλάσσεται σε αυτό στους 4 C (Sambrook, Fritsch et al. 1989; Frangioni and Neel 1993). Κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο Ο καθαρισμός των πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο στηρίζεται στο διαχωρισμό με προσθήκη άλατος σε υψηλές συγκεντρώσεις (salt out), ο οποίος εξαρτάται από την υδροφοβικότητα των πρωτεϊνών. Όπως είναι γνωστό ένα τυπικό μόριο πρωτεΐνης όταν βρίσκεται μέσα σε διάλυμα έχει στην επιφάνεια του υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες. Όταν αυτές έρθουν σε επαφή με ένα υδατικό διαλύτη, τα μόρια του νερού διευθετούνται γύρω από τις αλυσίδες όπου και παραμένουν (βλέπε σχήμα). Η διευθέτηση αυτή είναι μια θερμοδυναμικά ασταθής κατάσταση εφόσον η εντροπία είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με την αδιάλυτη πρωτεΐνη και τα ελεύθερα μόρια νερού. 103

Εικόνα 32. Διευθέτηση των μορίων του νερού γύρω από τα υδρόφοβα συστατικά της επιφάνειας μιας πρωτεΐνης. Με την προσθήκη άλατος στο διάλυμα, τα ιόντα του άλατος ενυδατώνονταιδηλαδή υπάρχουν πολύ λίγα ελεύθερα μόρια ύδατος- και έτσι υπάρχει μεγαλύτερη τάση απομάκρυνσης των μορίων του νερού από τις πλευρικές αλυσίδες, με αποτέλεσμα αυτές να μένουν εκτεθειμένες και να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Οι πρωτεΐνες που έχουν μεγαλύτερο αριθμό, ή μεγαλύτερου μεγέθους τέτοιων συσσωματωμάτων, θα κατακρημνιστούν γρηγορότερα, ενώ οι πρωτεΐνες με λιγότερες μη πολικές ομάδες στην επιφάνεια τους, θα παραμείνουν στο διάλυμα, ακόμα και σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις άλατος. Εικόνα 33. Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας κατακρήμνισης με θειικό αμμώνιο 104

Για να υπολογιστεί η ποσότητα του θειικού αμμωνίου που πρέπει να προστεθεί σε ένα διάλυμα πρωτεϊνών, συνήθως χρησιμοποιείται ο εκατοστιαίος κορεσμός αντί για τη συγκέντρωση, εφόσον γίνει η υπόθεση ότι το αρχικό διάλυμα είναι ισοδύναμο με το νερό όσον αφορά την ικανότητα διάλυσης του θειικού αμμωνίου. Η σχέση με την οποία υπολογίζονται τα γραμμάρια του θειικού αμμωνίου που προστίθενται σε ένα διάλυμα είναι: Όπου: V: ο όγκος του διαλύματος, S2: το ποσοστό κορεσμού που θέλω να πετύχω και S1: το αρχικό ποσοστό κορεσμού Μέθοδος προσδιορισμού πρωτεϊνών - Χρωματομετρική μέθοδος κατά Bradford, τροποποιημένη από τον Bearden Η αρχή της μεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει η χρωστική ουσία Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσμεύεται στα μόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465nm και το χρώμα της είναι καστανό. Η δημιουργία του συμπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση κυανού χρώματος και τη μεταβολή του μέγιστου απορρόφησης στα 595nm, όπου και μετράται φωτομετρικά. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάστηκε ως εξής: Αντιδραστήριο Bradford CBB G-250 H3PO4 1 mg/ml 200 ml Γίνεται ανάδευση του διαλύματος για 16-20 ώρες, και αραίωση του διαλύματος με απιονισμένο νερό στο 1lt. Το αντιδραστήριο είναι φωτοευαίσθητο και για το λόγο αυτό, φυλάσσεται σε σκουρόχρωμη φιάλη. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα δείγματα προσδιορίστηκε με ανάμιξη του κάθε δείγματος, (αραιωμένου στα 2ml με 105

απιονισμένο νερό), με 2 ml αντιδραστηρίου Bradford και ακολούθησε μέτρηση της απορρόφησης στα 595nm. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη αναφοράς με αλβουμίνη ή σφαιρίνη βόειου ορού (BSA) (Bradford 1976; Bearden 1978). 106

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το πρώτο μέρος της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας περιλαμβάνει πειράματα που αφορούν την κλωνοποίηση και την υπερέκφραση της Α2 επικράτειας του vwf στον πλασμιδιακό φορέα pet49b (+). Η ανασυνδυασμένη πρωτεϊνη που εκφράζεται στον πλασμιδιακό φορέα pet49b (+) διαθέτει στο αμινοτελικό άκρο μια πρωτεϊνη σύντηξης, την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST). Με το τρόπο αυτό μπορεί να γίνει εύκολα απομόνωση και καθαρισμός της πρωτεϊνης με στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Ο καθαρισμός της επικράτειας Α2 έγινε με τη χρήση στήλης γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Ενίσχυση του γονιδίου της Α2 επικράτειας του vwf και κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pet49b(+) Το γονίδιο που κωδικοποιεί την Α2 επικράτεια του vwf ενισχύθηκε με PCR από πλασμίδιο, το οποίο εμπεριέχει το cdna της επικράτειας A2 του ανθρώπινου vwf. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως εκκινητές στην αντίδραση PCR. Ο ένας εκκινητής (5 ), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού BamHI και ο άλλος, (3 ), για το ένζυμο περιορισμού HindIII. Η ακολουθία των εκκινητών ήταν η εξής: νοηματικός εκκινητής (sense primer) 5 - CCAGGATCCCACCCTGGGGCCCAAGAGGAA-3 και αντινοηματικός εκκινητής (antisense primer) 5 -CGCAAGCTTCTACTGCAGCACCAGGTCAGG-3. Μετά το τέλος της αντίδρασης, το μείγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Tο προϊόν που προέκυψε ήταν στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, περίπου 500 bp (A2 domain). Η ζώνη του Α2 γονιδίου υποβλήθηκε σε εκχύλιση από την πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια ακολούθησε καθαρισμός με το σύστημα Gel Extraction Kit. Το DNA τμήμα που απομονώθηκε, επωάστηκε στη συνέχεια με τα ένζυμα περιορισμού BamHI και HindIII. Με τα ίδια ένζυμα επωάστηκε και το πλασμίδιο pet49b(+). Μετά το τέλος της επώασης, τόσο το γονίδιο του Α2 domain, όσο και ο φορέας, καθαρίστηκαν με το PCR Purification Kit. Ο φορέας επωάστηκε με το ένζυμο SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) ώστε να αποφοσφωρυλιωθεί. Ακολούθησε η αντίδραση της DNA λιγάσης, χρησιμοποιώντας το DNA Ligation Kit της Takara Inc. Στη συνέχεια, έγινε εισαγωγή του φορέα pet49b(+) σε επιδεκτικά κύτταρα E. coli TOP10. Τα μετασχηματισμένα πλέον κύτταρα, αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη, στο οποίο 107

παρουσιάζει ανθεκτικότητα το συγκεκριμένο πλασμίδιο, (pet49b(+)). Από τις αποικίες που προέκυψαν, προκειμένου να βρεθούν οι θετικές που φέρουν τον αναμενόμενο ανασυνδυασμένο φορέα, έγινε απομόνωση πλασμιδιακού DNA χρησιμοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep). Το DNA που απομονώθηκε από κάθε αποικία, επωάσθηκε με τα ένζυμα περιορισμού BamHI και HindIII, προκειμένου να διαπιστωθούν οι θετικοί κλώνοι, από την ύπαρξη του αναμενόμενου τμήματος DNA στα 543 bp, που αντιστοιχεί στο DNA του Α2 γονιδίου. Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων E.Coli TOP10 και BL21 (DE3) με τον ανασυδυασμένο πλασμιδιακό φορέα pet49b(+)-α2-vwf Αρχικά τα επιδεκτικά κύτταρα E.Coli TOP10 μετασχηματίστηκαν με τον ανασυνδυασμένο φορέα έκφρασης pet49b(+)-a2-vwf και τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού καναμυκίνη, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το συγκεκριμένο πλασμίδιο. Οι αποικίες που προέκυψαν από τα κύτταρα E.Coli TOP10 χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA, ώστε να χρησιμοποιηθεί στα επόμενα πειράματα. Στη συνέχεια τα κύτταρα E.Coli BL21(DE3) μετασχηματίστηκαν με το pet49b(+)-a2- vwf, το οποίο είχε απομονωθεί προηγουμένως, και αναπτύχθηκαν με τον ίδιο τρόπο, στους 37 C σε στερεό υπόστρωμα LB και άγαρ, παρουσία καναμυκίνης. Οι αποικίες που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν για την υπερέκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης Α2. Υπερέκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης Α2 επικράτειας του vwf Για την υπερέκρφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης Α2, μία αποικία από κάθε τρυβλίο με τα πιο πάνω αναφερθέντα μετασχηματισμένα κύτταρα - ανασυνδυασμένα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό 3 ml υγρού θρεπτικού υποστρώματος LB, παρουσία 100 μg/ml αμπικιλλίνης. Ακολούθησε επώαση στους 37 C για 12-14 ώρες, υπό ανάδευση. Από την αρχική αυτή καλλιέργεια, έγινε ενοφθάλμισμα 1:50 σε κωνική φιάλη των 2 lt που περιείχε 200 ml αποστειρωμένου θρεπτικού υλικού LB και αμπικιλλίνης. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 C, με ανάδευση, μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει στο 0.7 και στην συνέχεια προστέθηκε 1mM IPTG, προκειμένου να 108

ενεργοποιηθεί η μεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και επομένως και του γονιδίου της επικράτειας Α2. Η επώαση μετά την προσθήκη του IPTG, συνεχίστηκε για 2 ώρες στους 37 C. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε άλλες δυο φορές, όπου τα μετασχηματισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να γίνει ~0.8 και 0.9 αντίστοιχα, μέχρι να γίνει να γίνει η προσθήκη του IPTG, ώστε να ελεγχθεί σε ποιά από αυτές τις απορροφήσεις θα επιτευχθεί καλύτερη υπερέκφραση της πρωτεϊνης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση και στη συνέχεια, έγινε λύση των κυττάρων, με χρήση υπερήχων σε διάλυμα urea 6M, Tris-HCl 20 mm, ph 8.0, για 6 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων. Το ολικό εκχύλισμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή SDS-PAGE 12% w/v για να επιβεβαιωθεί η υπερέκφραση και να ελεγχτούν τα επίπεδά της. Στο σχήμα παρακάτω, φαίνεται η υπερέκφραση της ανασυνδυασμένης Α2 πρωτεϊνικής επικράτειας. Μ 1 2 3 4 5 6 75 kda- 63 kda- 48 kda- 49 kda 35 kda- 25 kda- Εικόνα 34. SDS-PAGE 12% w/v ηλεκτροφόρηση των ολικών εκχυλισμάτων κυττάρων BL21(DE3) μετασχηματισμένων με pet49b(+)-a2-vwf. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες (το μέγεθος σε KDa), Διαδρομές 1,3,5: εκχυλίσματα από κύτταρα BL21 πριν την επαγωγή με IPTG, Διαδρομές 2,4,6: εκχυλίσματα από κύτταρα BL21 μετά απο επαγωγή με IPTG στους 37 Cγια 2 ώρες. Η Α2-vWF συζευγμένη με τη GST εμφανίζεται ως μια ζώνη στο αναμενόμενο μοριακό βάρος ~49 KDa. 109

Τα κύτταρα μετά την υπερέκφραση συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και λύθηκαν με υπερήχους. Η ανασυνδυασμένη Α2 επικράτεια του vwf που παράχθηκε είναι συζευγμένη με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) και επομένως απομονώθηκε και καθαρίστηκε με τη χρήση στήλης γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Κατά τη διαδικασία του καθαρισμού με στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης, το εκχύλισμα των κυττάρων επωάστηκε με σφαιρίδια στήλης γλουταθειόνηςσεφαρόζης και η προσδεμένη στη στήλη πρωτεϊνη εκλούστηκε με διάλυμα ανηγμένης γλουταθειόνης 10 mm, Tris-HCl 50mM ph 8,0. Τα εκλούσματα (που περιέχουν την καθαρή Α2 επικράτεια συζευγμένη με την GST) ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE 12% w/v. Η χρώση με Coomasie Blue αποκάλυψε μόνο μία ζώνη με μοριακό βάρος περίπου 49 kda. Η εμφάνιση ζώνης σε αυτό το ΜΒ ήταν αναμενόμενη, καθότι η επικράτεια Α2 (με ΜΒ περίπου 20 kda) είναι συζευγμένη με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, GST με ΜΒ περίπου 19KDa. Μ 1 2 3 3 4 5 6 75 kda- 63 kda- 48 kda- 49 kda 35 kda- 25 kda- Εικόνα 35. Καθαρισμός της Α2 επικράτειας του vwf συζευγμένης με την GST, με στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Μ: πρωτεϊνικοί μάρτυρες (το μέγεθος σε KDa), Διαδρομή 1: το flow through του καθαρισμού, Διαδρομές 2,3:δείγμα που λήφθηκε μετά από πλύσεις της στήλης, Διαδρομές 4,5,6:η καθαρή ανασυνδυασμένη πρωτεϊνη που λήφθηκε μετά από την 1 η, 2 η και 3 η έκλουση αντίστοιχα. Η Α2-vWF συζευγμένη με τη GST εμφανίζεται ως μια ζώνη στο αναμενόμενο μοριακό βάρος ~49 KDa. 110