1
Στεροειδή σηματοδοτικά μόρια δεσμεύονται σε πυρηνικούς υποδοχείς στεροειδών (Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι μεταγραφικοί παράγοντες) Το στεροειδές προκαλεί δομικές αλλαγές στον πυρηνικό υποδοχέα, και μπορεί να τον καθιστά ικανό να συνδέεται με συνενεργοποιητές και να ενεργοποιεί την μεταγραφή 2 Πολικα μορια -μεμβρανικοί υποδοχείς
Οι Μεμβρανικοί υποδοχείς «αντιλαμβάνονται» σηματοδοτικά μόρια με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες απ ο,τι, οι πυρηνικοί υποδοχείς Πολικό μόριο, ΔΕΝ διαπερνά τη λιπιδική διπλοστιβάδα Λιποδιαλυτό μόριο, διαπερνά τη λιπιδική διπλοστιβάδα Μεμβρανικοί υποδοχείς Ενδοκυττάριοι υποδοχείς fight or flight...... Σεξουαλική ανάπτυξη και λειτουργία Αναπαραγωγή. 3 Σχημα
Σχηματική πορεία από το εξωκυττάριο σήμα στη κυτταρική απόκριση Εξωκυττάριο σήμα Νευροδιαβιβαστής, Ορμόνη*, Φωτόνιο, Μηχανικό ερέθισμα 1 Μεμβρανικός Υποδοχέας Υποδοχείς 7ΤΜ, Κινάσες τυροσίνης Δίαυλοι ιόντων 2 Τριμερείς πρωτείνες G, μικρές G πρωτεΐνες 5 τερματισμός Κυτταρική απόκριση Αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση, στη κυτταρική δομή και μεταβολική συμπεριφορά *Παρακρινής, ενδοκρινής. Κυτταρική επαφή, σύναψη 4 Διαβίβαση και ενίσχυση 3 Μεταγωγή Ενεργοποίηση πρωτεινικών κινασών (PKA, PKC), Mεταγραφικών φ παραγόντων Κυκλάση, φωσφοδιεστεράση νουκλεοτιδίων camp, cgmp Φωσφολιπάση C σύνθεση IP + DAG 4 Αποκλίσεις
Σηματοδότηση μέσω μεμβρανικών υποδοχέων Πολλαπλά βήματα μεταγωγής σήματος με αποκλίνοντα και ποκίλα αποτελέσματα σε κάθε κύτταρο πχ μεταβολική ρύθμιση, αναδιαμόρφωση κυτταροσκελετού, μεταγραφική ενεργοποίηση... Π.χ. επινεφρίνη Μεμβράνη?? Μεταβολικές- -δομικές τροποποιήσεις Πυρήνας Μεταγραφική ενεργοποίηση 5 Yeast -
Η σηματοδότηση μέσω μεμβρανικών υποδοχέων συνήθως αποκλίνει ελέγχοντας ποικίλες κυτταρικές διεργασίες και σε μονοκύτταρους οργανισμούς Tο παράδειγμα της κυτταρικής σύζευξης στο σακχαρομύκητα Μεμβράνη?? Μεταβολικές- -δομικές τροποποιήσεις Πυρήνας Μεταγραφική ενεργοποίηση 6 μορ. Διακόπτες και μικρά μόρια
1) G πρωτείνες - Μοριακοί διακόπτες, 2) πρωτεινικές κινάσες 3) Μικρά ενδιάμεσα-μόρια συμμετέχουν στην ενδοκυττάρια μεταγωγή του σήματος 1) ΟFF ON ΟFF G πρωτείνη GDP Aνταλλαγή GDP με GTP G πρωτείνη GTP Υδρόλυση GTP G πρωτείνη GDP 2) 3) 7 7ΤΜ
Μεμβρανικοί υποδοχείς με 7 διαμεμβρανικές έλικες (7ΤΜ) (Υποδοχείς συζευγμένοι με πρωτεΐνες G, GPCRs* ) πρόσδεμα Εξωκυττάριος χώρος Μεμβράνη 7ΤΜ Κυτταρόπλασμα Η ειδική δέσμευση του προσδέματος στην εξωκυττάρια πλευρά του υποδοχέα προκαλεί αλλαγές στη στερεοδιάταξή του που μεταβιβάζονται στην ενδοκυττάρια πλευρά *G Protein Coupled Receptors 8 Ομολογία ροδοψίνη
Οι Μεμβρανικοί υποδοχείς 7ΤΜ (7 διαμεμβρανικές έλικες) συζευγμένοι με πρωτεΐνες G (GPCRs) συνιστούν μια μεγάλη οικογένεια δομικά ομόλογων υποδοχέων επινεφρίνηεφρί φ Ρετινάλη H ομοιότητα π.χ του β-αδρενεργικού υποδοχέα και της ροδοψίνης είναι αξιοσημείωτη, παρ όλο που η σχέση όρασης και ορμονικής ρύθμισης δεν είναι προφανής 9 Intro G proteins
Οι υποδοχείς με 7 διαμεμβρανικές έλικες (7ΤΜ / GPCRs) είναι συζευγμένοι με ετεροτριμερείς ρ ρ πρωτείνες G (Gα, Gβ, Gγ) Η δέσμευση ενός προσδέματος στον αντίστοιχο υποδοχέα 7ΤΜ (πχ επινεφρίνης στον β αδρενεργικό υποδοχέα) οδηγεί αρχικά σε ενεργοποίηση των πρωτεινών G που βρίσκονται στην ενδοκυττάρια πλευρά της μεμβράνης 10 Structure G proteins
Gβ Gα Gγ GDP Οι Eτεροτριμερείς πρωτείνες G αποτελούνται από τρεις διακριτές υπομονάδες Gα, Gβ και Gγ. Είναι αγκυροβολημένες στη μεμβράνη μέσω ομοιοπολοκών συνδέσεων με λιπιδικές αλυσίδες. Η Gα (GΤΡάση η με θηλιά Ρ) ) δεσμεύει GDP και μόνο σε αυτή τη μορφή συμπλέκεται με τις Gβ και Gγ. 11 Στερεοδομικές αλλαγές της Gα
Η αντικατάσταση του GDP από GTP και αντιστρόφως, η υδρόλυση του GTP προς GDP, συνοδεύεται από στερεοδομικές αλλαγές της Gα που καθορίζουν τη σύνδεση με Gβ-Gγ 12 Step by step Διαβίβαση
Η αλληλεπίδραση του ενεργοποιημένου υποδοχέα με την Gα προκαλεί ανταλλαγή του GDP με GTP και ταυτόχρονη αποδέσμευση των Gβ- Gγ από την Gα. Ο διαχωρισμός της Gα από την Gβ- Gγ μεταδίδει το μήνυμα ότι ο υποδοχέας έχει δεχθεί το πρόσδεμα. Οι επιφάνειες των Gα και Gβ-Gγ, που δομούσαν την επιφάνεια επαφής για το σχηματισμό ετερο-τριμερούς βρίσκονται πλέον εκτεθειμένες και ελεύθερες να αλληλεπιδράσουν με άλλες πρωτεΐνες. 13 Aδενυλική κυκλάση
1 Η ενεργός πρωτείνη Gα (Gα-GTP) αλληλεπιδρά με - και έτσι μεταβιβάζει το σήμα σε - άλλες πρωτεΐνες: Ενεργοποίηση της αδενυλ-κυκλάσης (ΑC) AC 2 ATP 3 AC camp camp Αποτέλεσμα: Η δέσμευση του προσδέματος στην εξωκυττάρια πλευρά του υποδοχέα του πυροδοτεί την ενδοκυττάρια σύνθεση camp Προσοχή!!! : Η Ενεργοποίηση της αδενυλ-κυκλάσης (ΑC) είναι ΕΝΑΣ απο τους μηχανισμούς μεταγωγής σήματος απο GPCRs. Ενας δεύτερος, ενεργοποίηση β-φωσφολιπάσης C θα συζητηθεί πιο κάτω. 14 Δομή AC
Η αδενυλική κυκλάση είναι μεμβρανική πρωτείνη (12 ΤΜ) με δυο μεγάλες κυτταρο- πλασματικές περιοχές που συνιστούν το καταλυτικό κέντρο Ενεργοποίηση από Gα GTP Η επιφάνεια της Gα GTP που συνδέεται και ενεργοποιεί την καταλυτική ενεργότητα της AC είναι εκείνη η επιφάνεια που απελευθερώνεται από τις Gβγ 15 PKA
Το camp διεγείρει την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA), η οποία ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει πολλούς πρωτεινικούς στόχους ΡΚΑ camp Ρυθμιστικές υπομονάδες Αδρανείς καταλυτικές υπομονάδες Ενεργείς καταλυτικές υπομονάδες Στόχοι PKA: Ένζυμα μεταβολισμού γλυκογόνου (υδρόλυση και αναστολή πολυμερισμού) Δίαυλοι Καλίου- συναπτική διαβίβαση (σεροτονίνη) Μεταγραφικοί παράγοντες (CREB) --- --- 16 CREB
Μεταγραφική ενεργοποίηση από CREB AC Cell membrane camp Inactive PKA Activated PKA Activated, phosphorylated CREB Inactive CREB Nucleus Transcription Translation 17 2 πχ Τερματισμού
Τερματισμός της σηματοδότησης A. Μηχανισμοί απευαισθητοποίησης η ηςτου υποδοχέα 7ΤΜ 1. Απομάκρυνση της ορμόνης/προσδέματος (επαναπρόσληψη νευροδιαβιβαστών) 2. Απενεργοποίηση του υποδοχέα (φωσφορυλίωση του C-τελικού άκρου) 3. Δέσμευση παγωνίνης β (arrestin) - στη περίπτωση του υποδοχέα της επινεφρίνης- και παρεμπόδιση της ενεργοποίησης της πρωτείνης G. 18 4. Ενδοκύττωση Τερματισμός Β
Τερματισμός της σηματοδότησης B. Οι πρωτείνες G αναστοιχειοθετούνται αυθόρμητα μέσω της υδρόλυσης GTP 1 2 Η Gα διαθέτει ενδογενή δραστικότητα GTPάσης 4 3 19 χολέρα
Η τοξίνη της χολέρας (vibrio cholerae) προκαλεί ADP-ριβοσυλίωση σε μια Arg της υπομονάδας Gα (Gαs) παγιδεύοντάς την στην ενεργό στερεοδιάταξη (Gα-GTP) Η συνεχής ενεργοποίηση της PKA, που προκαλεί διάνοιξη διαύλου Cl και αναστολή ανταλλάκτη Να-Η, έχει ως αποτέλεσμα τεράστια απώλεια ΝαCl και νερού 1 2 συνεχής ενεργοποίηση της PKA camp ADP-ριβοσυλίωση Οι τοξίνες της διφθερίτιδας και του κοκύτη (pertussis) Είναι επίσης ADP-ριβοσυλ τρανσφεράσες φωσφοινοσιτίδια ADP-ριβόζη 20
Σηματοδότηση μέσω φωσφο-ινοσιτιδίων (φωσφορυλιωμένες μορφές φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης) Η Gα ενεργοποιεί την φωσφολιπάση C(PLC)η οποία υδρολύει διφωσφορική φωσφατιδυλοινοσιτολη (PIP2) και «γεννάει» δύο βραχύβια αγγελιοφόρα μόρια: διαλυτή τρι-φωσφορική ινοσιτόλη (ΙΡ3) και μεμβρανική διακυλο-γλυκερόλη (DAG) π.χ βασοπρεσίνη (ADH) PIP 2 DAG Cell membrane 7ΤΜ Ενεργός Gαq Ενεργός PLC-β IP 3 21 Δομή PLC
Η φωσφολιπάση C(PLC) δρα στη μεμβρανική επιφάνεια Αρθρωτή δομή: Η περιοχή ΡΗ (Plextrin Homology) και η περιοχή C2 αναγνωρίζουν λιπιδικές κεφαλές ( PH-PIP2) PIP2) Οι περιοχές ψευδο- EF(δέσμευση Ca++) Η C-τελική περιοχή αλληλεπιδρά με Gα Η καταλυτική περιοχή υδρολύει το φωσφοδιεστερικό δεσμό της ΡΙΡ2 22 IP3-ασβέστιο
Η 1,4,5 τρι-φωσφο- ινοσιτόλη (ΙΡ3) ανοίγει διαύλους για την απελευθέρωση Ca ++ από ενδοκυττάριες αποθήκες (π.χ. χ ΕΔ στις λείες μ. ίνες) Cell membrane DAG Ενεργός Gαq Activated t PLC-β Αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης Ca++ προκαλεί σύσπαση κάποιων λείων μυικών ινών, σε άλλους κυτταρικούς τύπους, διάσπαση γλυκογόνου, απελευθέρωση κυστιδίων κλπ κλπ PIP 2 IP 3 Ca 2+ Εξαρτώμενος από ΙΡ3 δίαυλος Ca++ Η ΙΡ3 από-φωσφορυλιώνεται σε ινοσιτόλη (φωσφατάσες ινοσιτόλης) IP 3 ΕΔ, ΣΔ Li+, αναστολή ανακύκλωσης ΙΡ3 και Θεραπεία διπολικών συναισθηματικών διαταραχών!!! I Ca 2+ 23 DAG
Η διακυλο-γλυκερόλη (DAG) διεγείρει την πρωτεινική κινάση C (PKC) με αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωση πολλών πρωτεϊνικών στόχων PIP 2 DAG Ενεργός Gαq Activated PLC-β Activated PKC Η PKC στην ανενεργό της μορφή είναι ελεύθερη, αλλά δεσμευμένη στη μεμβράνη αλληλεπιδρά με DAG και σταθεροποιείται παρουσία ιόντων Ca++ IP 3 Ca 2+ Η DAG είναι επίσης βραχύβιος αγγελιοφόρος. Ca 2+ ΕΔ, ΣΔ 24 PKC-ψευδο υπόστρωμα
Τμηματική δομή της πρωτεινικής κινάσης C (PKC) Η ψευδο-υποστρωματική περιοχή της PKC ανταγωνίζεται τα υποστρώματα για το ενεργό κέντρο. Oι περιοχές C1A, C1B δεσμεύουν διακυλ-γλυκερόλη και η περιοχή C2 δεσμεύει Ca++ Ca++ 25
Το ελεύθερο ιόν Ca 2+ είναι πολύ σημαντικός και διαδεδομένος ενδοκυττάριος αγγελιοφόρος -- Η συναρμογή Ca++ με πλευρικές ομάδες πχ αρνητικά φορτισμένα Glu, Asp σταυροσυνδέει διαφορετικά τμήματα πρωτεΐνης επάγοντας αλλαγή στερεοδιάταξης-λειτουργίας -- H ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca2+ πρέπει να διατηρείται χαμηλή (~nm*) γιατί τα σύμπλοκα του Ca2+ με φωσφο- ή καρβοξυ ομάδες είναι ΑΔΙΑΛΥΤΑ. -- Η συγκέντρωση του Ca 2+ διατηρείται χαμηλή από διαμεμβρανικά συστήματα ΕΞΩΘΗΣΗΣ δηλ. την ΑΤΡάση Ca 2+ και τον ανταλλάκτη Na + - Ca 2+ στην πλασματική μεμβράνη, αλλά και στo EΔ * H συγκέντρωση Ca2+ στο αίμα είναι ~2.5mM 3 πχ Ωάριο 26
H αιφνίδια αύξηση στην ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca++ μέσω παροδικής διάνοιξης των διαύλων Ca2+ αποτελεί ισχυρότατο μέσο/μηχανισμό σηματοδότησης 1. Γονιμοποίηση ωαρίου Το ιονοφόρο Fura-2 είναι φθορίζουσα χρωστική που διεγείρεται στα 340 και 380 nm και ο λόγος εκπομπής σε αυτά τα δυο μήκη κύματος είναι ανάλογος της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης Ca++ Fura-2 27 Νευρομυική σύναψη
2. Νευρομυική σύναψη Σε ηρεμία Ενεργοποίηση 28 CaM
3. To Ca++ δεσμεύεται από την ασβεστιοτροποποιητίνη (calmodulin, CaM), η οποία στη συνέχεια μπορεί να διεγείρει άλλες πρωτεΐνες Σε συγκέντρωση >500nM, 4 ιόντα Ca++ δεσμεύονται από δύο ζεύγη μοτίβων EF έλικα Ε Η δέσμευση Ca++ αλλάζει τη στερεο- διάταξη της CaM προκαλώντας έκθεση περιοχών που αλληλεπιδρούνδιεγείρουν άλλες πρωτεΐνες έλικα F Mοτίβο δέσμευσης Ca++ EF έλικα-θηλιά-έλικα 29 CaM kinases, ΑΤΡαση Ca
To σύμπλοκο Ca +2 - καλμοδουλίνης (Ca +2 CaM)διεγείρει α) πρωτεινικές κινάσες (CaM-κινάσες), β) αντλίες και άλλους πρωτεϊνικούς στόχους α) Οι CaM-κινάσες ελέγχουν μεταβολισμό, ιονική διαπερατότητα μεμβρανών, απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών. Το πεπτίδιο-στόχος της CaM Καλύπτει το ενεργό κέντρο της CaM-κινάσης β) Η Αντλία (ΑΤΡάση) Ca +2 διεγείρεται από Ca +2 CaM και μειώνει την ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca +2 τερματίζοντας την σηματοδότηση. 30 Σύζευξη με ένζυμα Αυξητική ορμόνη
Υποδοχείς συζευγμένοι με ένζυμική δραστηριότητα 1. Υποδοχείς που διαμερίζονται μρζ και σηματοδοτούν με αμοιβαία φωσφορυλίωσηφ H αυξητική ορμόνη επάγει διμερισμό του υποδοχέα της 31 jak
Τα ενδοκυττάρια τμήματα του υποδοχέα αυξητικής ορμόνης συνδέονται με JAK τυροσινο-κινάσες, που ενεργοποιούνται με αμοιβαία/σταυρωτή φωσφορυλίωση και Φωσφορυλιώνουν STAT (signal transduceractivator of transcription), οι οποίoi διμερίζονται μέσω (SH2 - P-Tyr) y) και δεσμεύονται άμεσα στο DNA Janus kinase "just another kinase" Tyrosyl kinase 32
2. Υποδοχείς που φέρουν ενεργότητα Τυροσυλ-κινάσης Υποδοχέας ινσουλίνης!!! Υποδοχέας ινσουλίνης!!! Ras GTPases 33
Υποδοχείς Τυροσυλ-κινάσης σηματοδοτούν μέσω παραγόντων ανταλλαγής GDP (GEF) και μονομερών μ G πρωτεινών,, π.χ. RAS GTPases Σηματοδότηση από EGF (Epidermal Growth Factor) Πρωτεΐνη συναρμογής Παράγοντας ανταλλαγής GDP (GEF) 1 2 Ras GTPase Μοριακός διακόπτης 3 Sos GEF 34
Ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων (GTP exchange factor) δεσμεύεται στην Ras επιβάλλοντας την απομάκρυνση της GDP (ανενεργός) και την δέσμευση GTP (ενεργός) Αυτή η ενεργοποίηση είναι πιθανόν ανάλογη με την ενεργοποίηση της Gα από τον 7ΤΜ Οι πρωτείνες GAP (GTPase Activating Proteins) επάγουν την ενεργότητα Ο ρω ε ες G (G ase ct at g ote s) ε άγου η ε εργόηα GTPασης των μονομερών GTPασών που οδηγεί σε υδρόλυση GTP και απενεργοποίηση των μικρών G πρωτεινών. 35 Small GTPases
Μικρές πρωτείνες G (Μονομερείς και μικρές, αλλά πολλές!!!) ΜΑΡ κινάσες 36 Ταχύτητα διαβίβασης
Η ενεργοποιημένη Ras προκαλεί Καταρρακτώδη!!!! ενεργοποίηση κινασών και πολλαπλασιάζει το σήμα προκαλώντας ποικίλες φυσιολογικές αλλαγές Cross talk 37
Σχεδόν πάντα διαφορετικά σήματα συγκλίνουν και αποκλίνουν προς πολλαπλούς αποδέκτες 38 Cross talk
Ασκήσεις Stryer Σελ. 475 1, 2, 5, 7, 8, 9, 10. Lehninger Kεφ. φ 12 2, 3, 4, 9, 12, 14. 39
SRC Bishop and Varmus, Nobel prize 1989 for v-src 40
BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ 41
H λευχαιμία που προκαλείται από ένθεση της c-abl στο γονίδιο bcr ανταποκρίνεται σε αναστολείς κινάσης 42
Η τοξίνη της χολέρας (vibrio cholerae) προκαλεί ADP-ριβοσυλίωση σε μια Arg της υπομονάδας Gα (Gαs), παγιδεύει το μόριο στην ενεργό στερεοδιάταξη. Συνεχής ενεργοποίηση PKA διάνοιξη διαύλου Cl και αναστολή ανταλλάκτη Να-Η με αποτέλεσματεράστια απώλεια ΝαCl και νερού 43
BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ 44
Τρία είδη μεμβρανικών υποδοχέων 1. Υποδοχείς συζευγμένοι με πρωτεΐνες G Υποδοχείς με 7 διαμεμβρανικές έλικες(7tm) 45 Σύζευξη με δίαυλο
2. Υποδοχείς συζευγμένοι με ιονικούς διαύλους 46 Σύζευξη με ένζυμα
3. Υποδοχείς-ένζυμα και υποδοχείς συζευγμένοι με ένζυμα 47 H έννοια του μορ. διακόπτη
Biochemistry 452 1. What are the catalytic activities of bacterial two-component signal transduction systems such as the NRI/NRII system? [Slides 5 and 6] 2. Using a simple diagram, describe the phosphorylation events that occur during signalling of the two-component systems performing osmotic sensing, oxygen sensing, and sporulation control. [Slide 10] 3. Provide an example of how a two-component system works to control a MAP kinase cascade in yeast. [Slide 13] 4. Describe the proteins involved in bacterial chemotaxis, and give a brief description of the role of each protein. [Slide 17] 5. Using cartoon diagrams, describe the role of cholera toxin and pertussis toxin in altering the level of the second messenger, camp. Draw the structure of the chemical modification brought about by these toxins [slides 24, 25]. 6. Provide a complete example of how a signal outside the cell can cause a change in the level of transcription of a gene, naming all the important components that participate in the signal transduction. [Eg. slides 28 and 29, or slide 43] 7. Briefly describe the role of ligand binding in activation of receptor tyrosine kinases, and the roles of autophosphorylation on the activation loops and outside the kinase domain. [slides 37 and 39, among others] 8. Describe the roles of each of the following domains: SH2 SH3 PTB pleckstrin homology domain chromodomain bromodomain 9. Using a simple cartoon, describe the JAK-STAT pathway for relaying cytokine signals. (Slide 43). 10. Using a cartoon diagram, describe how a protein growth factor, acting through a receptor tyrosing kinase, can act through Ras and a MAP kinase cascade to control gene expression. (Slide 44). 48 11. Using a cartoon diagram, show how an external signal, acting through a G-protein coupled receptor can bring about activation of PLC and by so doing bring about activation of PKC and
Μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω οιστρογόνων (ES) Cell membrane ES Inactive ESR Activated ESR Nucleus Transcription 49
50
51
52
53
Υποδοχείς κυτοκινών (cytokines) και σηματοδότηση μέσω JAK και STAT 54
Άμεση σηματοδότηση κυτοκινών μέσω JAK και STAT 55
56
Υποδοχείς που φέρουν ενεργότητα Τυροσυλ-κινάσης 57
58
Φωσφορυλιωμένοι υποδοχείς αποτελούν θέσεις πρόσδεσης για ενδοκυττάριες σηματοδοτικές πρωτείνες 59 Ras GTPases
Υποδοχείς Τυροσυλ-κινάσης σηματοδοτούν μέσω μονομερών G πρωτεινών, π.χ. τις RAS GTPases 60 Ras GTPases
H προέλευση του σηματοδοτικού μορίου ποικίλει 61 υποδοχείς
62
63