Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 Πλακέτα Πλακέτες

Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 Πλακέτα 96 72278 5 Πλακέτες 480 72279 ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΝΤΙ - HIV1 ΚΑΙ ΑΝΤΙ - HIV2 ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΠΛΑΣΜΑ ΜΕΣΩ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ 883666-2014/01 1

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1 - ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ 2 - ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΟΥ ΚΙΤ Genscreen HIV-1/2 Version 2 3 - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΚΙΤ Genscreen HIV-1/2 Version 2 4 - ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ - ΧΡΟΝΟΣ ΙΑΤΗΡΗΣΗΣ 5 - ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ 6 - ΔΕΙΓΜΑΤΑ 7 - ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 9 - ΔΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΔΟΚΙΜΗΣ 10 - ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ 11 - ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 12 - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ 13 - ΕΠΙΔΟΣΕΙΣ 14 - ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 15 - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2

1 - ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Το σύνδροµο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) είναι µια λοιµώδης νόσος ιϊκής προέλευσης που προκαλεί την πλήρη απώλεια ανοσίας των κυττάρων. ύο τύποι ιού, οι οποίοι σχετίζονταν µε την οµάδα Lentivirus, αποµονώθηκαν από λευκοκύτταρα ασθενών µε AIDS ή προδρόµων του AIDS. Ο πρώτος, αποκαλούµενος HIV1, αποµονώθηκε στη Γαλλία και ακολούθως στις ΗΠΑ. Ο δεύτερος, αποκαλούµενος HIV2, αποµονώθηκε σε δύο ασθενείς αφρικανικής προέλευσης και φαίνεται ότι είναι υπεύθυνος για την νέα εστία του AIDS στη υτική Αφρική. Οι γνώσεις επί της γενετικής µεταβλητότητας των στελεχών των ιών HIV αποκτήθηκαν µέσω του προσδιορισµού της ακολουθίας των γονιδίων GAG, POL και ENV των αντιπροσωπευτικών στελεχών του κάθε υποτύπου. Οι ιοί HIV1 διαιρούνται σε 2 οµάδες : την οµάδα Μ που περιλαµβάνει 9 υποτύπους (Α έως Ι) και την οµάδα Ο. Ο ιός HIV2 περιλαµβάνει 5 υποτύπους. Η γεωγραφική κατανοµή των διάφορων υποτύπων είναι πλέον γνωστή σε ικανοποιητικό επίπεδο. Σε ορισµένες παραλλαγές του HIV1, η οµολογία των γονιδίων GAG και POL στα βασικότερα δείγµατα που αποµονώθηκαν δεν υπερβαίνει το 70 % ενώ του γονιδίου ENV µόνο 50 %. Σε αυτές τις διαφορές οφείλεται, µάλλον, η αποτυχία διάγνωσης της µόλυνσης σε ορισµένους ασθενείς. Τα διάφορα στελέχη του ιού HIV2 παρουσιάζουν κοινά αντιγονικά χαρακτηριστικά µε τον πιθηκοειδή ιό SIV για όλες τις πρωτεΐνες (πρωτεΐνες περιβλήµατος και εσωτερικές πρωτεΐνες : ετερολογία = 30 %), αλλά παρουσιάζουν λιγότερο από 40 % οµολογία µε τις πρωτεΐνες περιβλήµατος του ιού HIV1. Το Genscreen HIV-1/2 Version 2 επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωµάτων αντι-hiv1 και αντι-hiv2. 2 - ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΟΥ ΚΙΤ Genscreen HIV-1/2 Version 2 Το Genscreen HIV-1/2 Version 2 είναι µια ενζυµοσύνδετη ανοσοενζυµική τεχνική, (ELISA) δύο φάσεων, (τύπου «σάντουιτς»), για την ανίχνευση των διάφορων αντισωµάτων που είναι συνδυασµένα µε τους ιούς HIV1 και/ή HIV2, στον ανθρώπινο ορό ή πλάσµα. Το Genscreen HIV-1/2 Version 2 βασίζεται στη χρήση µιας στερεάς φάσης η οποία παρασκευάζεται µε κεκαθαρµένα αντιγόνα (ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες gp160 και p25 του ιού HIV1 και ένα πεπτίδιο που µιµείται τον ανοσοκυρίαρχο επίτοπο της γλυκοπρωτεΐνης του περιβλήµατος του ιού HIV2) και ένα συζυγές που αποτελείται από αντιγόνα σηµασµένα µε υπεροξειδάση (ανασυνδυασµένη πρωτεΐνη του νουκλεοκαψιδίου και πεπτίδια που µιµούνται τους ανοσοκυρίαρχους επίτοπους των γλυκοπρωτεϊνών του περιβλήµατος των ιών HIV1 και HIV2). Η διαδικασία της δοκιµής περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια αντιδράσεων: 1. Τα υπό µελέτη δείγµατα ορού καθώς και τα δείγµατα µάρτυρες κατανέµονται εντός των κοιλοτήτων. Εάν υπάρχουν αντισώµατα αντι-hiv1 και/ή HIV2, αυτά ενώνονται µε τα αντιγόνα που είναι ακινητοποιηµένα στη στερεά φάση. Η απόθεση δείγµατος επιβεβαιώνεται µέσω της αλλαγής χρωµατισµού, από µοβ σε µπλε (SDP = Sample Deposition Proof) 2. Τα καθαρά αντιγόνα HIV1 και HIV2 που είναι σηµασµένα µε υπεροξειδάση προστίθενται µετά από έκπλυση. εσµεύονται µε τη σειρά τους στα IgG και/ή IgM και/ή IgA που συνελήφθησαν κατά τη στερεά φάση. 3. Η παρουσία του επικολληµένου στα σύµπλοκα ενζύµου καταδεικνύεται µέσω επώασης, παρουσία υποστρώµατος, µετά την αφαίρεση του ελεύθερου κλάσµατος του συζυγούς. 4. Μετά τη διακοπή της αντίδρασης, καταγράφεται η φασµατοφωτοµετρική τιµή απορρόφησης στα 450/620-700 nm. Η µετρούµενη τιµή απορρόφησης ενός δείγµατος επιτρέπει την εξαγωγή συµπεράσµατος σχετικά µε την παρουσία ή την απουσία αντισωµάτων αντι- HIV1 και/ή HIV2. 3

3 - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΟΥ ΚΙΤ Genscreen HIV-1/2 Version 2 Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται µόνο για διαγνωστική χρήση in-vitro. Σηµανση R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Cut-off control R5 Positive control R6 Sample diluent R7a Conjugate R7b Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Συνθεση αντι ραστηριων Μικροπλακέτα 12 ταινίες των 8 κοιλοτήτων (βοθρία) ευαισθητοποιηµένων µε καθαρά αντιγόνα HIV1 και HIV2 Συµπυκνωµένο διάλυµα έκπλυσης (20X) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris NaCl ph 7,4 Συντηρητικό: ProClin 300 (0,04%) Δείγµα ελέγχου αρνητικού Ανθρώπινος ορός αρνητικός στα αντισώµατα αντι-hiv1 και αντι-hiv2, σε αντιγόνο HBs και σε αντισώµατα αντι-hcv, περιεκτικότητας αζιδίου του νατρίου 0,1 % Ορός µάρτυρας για τον έλεγχο της τιµής κατωφλίου Ανθρώπινος ορός χαµηλής περιεκτικότητας αντισωµάτων αντι-hiv, αρνητικός στο αντιγόνο HBs και στα αντισώµατα αντι-hcv, ανενεργός µέσω θέρµανσης, µε 0,1 % αζίδιο του νατρίου Δείγµα ελέγχου θετικού Ανθρώπινος ορός χαµηλής περιεκτικότητας αντισωµάτων αντι-hiv, αρνητικός στο αντιγόνο HBs και στα αντισώµατα αντι-hcv, ανενεργός µέσω θέρµανσης, µε 0,1 % αζίδιο του νατρίου Αραιωτικό δειγµάτων έτοιµο για χρήση ιάλυµα βοείου ορού (ρυθµιστικό διάλυµα TRIS µε προσθήκη χλωροφορµίου 0,1 %, ProClin 300 και ενός δείκτη χρώµατος ως µάρτυρας της απόθεσης δειγµάτων) Λυοφιλιωµένο συζυγές Καθαρά αντιγόνα HIV1 και HIV2, σηµασµένα µε υπεροξειδάση. Αραιωτικό συζυγούς ιάλυµα αποβουτυρωµένου γάλακτος (ρυθµιστικό διάλυµα TRIS µε προσθήκη 0,1 % χλωροφορµίου και Proclin 300). Υπόστρωµα Διάλυµα κιτρικού οξέως και οξικού νατρίου, ph 4,0, που περιέχει H 2 O 2 (0,015%) και 4% διµεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) Χρωµογόνο: Διάλυµα TMB Διάλυµα που περιέχει 3,3, 5,5 τετραµεθυλική βενζιδίνη (TMB) Ανασχετικό διάλυµα Διάλυµα θειικού οξέος (H 2 SO 4 1N) Παρουσιαση 72278 72279 1 πλακέτα 70 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 14 ml q.s. ad 12,5 ml 12,5 ml 60 ml 5 ml 28 ml 5 πλακέτες 235 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 2 φιαλίδια 2 x 10 ml 2 φιαλίδια q.s. ad 2 x 30 ml 2 φιαλίδια 2 x 30 ml 2 φιαλίδια 2 x 60 ml 2 φιαλίδια 2 x 5 ml 3 φιαλίδια 3 x 28 ml 4

4 - ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ - ΧΡΟΝΟΣ ΙΑΤΗΡΗΣΗΣ Το κιτ πρέπει να φυλάσσεται στους +2 έως 8 C. Κάθε στοιχείο του το κιτ Genscreen HIV-1/2 Version 2 που διατηρείται σε θερµοκρασία µεταξύ +2 και 8 C µπορεί να χρησιµοποιηθεί µετά το πρώτο άνοιγµά του µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται επάνω στο κουτί, εκτός εάν υπάρχουν ειδικές υποδείξεις: R1 : Μετά το άνοιγµα, τα βοθρία διατηρούνται στο αρχικό σακουλάκι τους, το οποίο πρέπει να κλείνετε προσεκτικά και να φυλάοσνται σε θερµοκρασία +2 έως 8 C, ενώ µπορούν να χρησιµοποιηθούν για 4 εβδοµάδες. R2 : Το ανασυσταµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης µπορεί να αποθηκευθεί στούς +2-30 C για 2 εβδοµάδες. Το συµπυκνωµένο διάλυµα πλύσης (R2) µπορεί να αποθηκευθεί στούς +2-30 C. R7α + R7β : Μετά την ανασύσταση, τα αντιδραστήρια που φυλάσσονται στους +2 έως 8 C, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για 4 εβδοµάδες. R8 + R9 : Μετά την ανασύσταση, τα αντιδραστήρια που διατηρούνται στο σκοτάδι παραµένουν σταθερά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (18-30 C) επί 6 ώρες. 5 - ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ Απεσταγµένο νερό. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διτανθρακικό νάτριο. Πιπέτες, αυτόµατες ή ηµιαυτόµατες πιπέτες, ρυθµιζόµενης ή σταθερής χωρητικότητας 25 µl, 50 µl, 75 µl, 80 µl και 100 µl. Βαθµονοµηµένοι κύλινδροι χωρητικότητας 25 ml, 100 ml και 1000 ml. οχείο µολυσµατικών απορριµµάτων. Υδατόλουτρο, ή επωαστήρας µικροπλακετών, µε δυνατότητα ρύθµισης της θερµοκρασίας στους 37 C ± 1 C(*). Χειροκίνητη διάταξη πλυσίµατος, ηµιαυτόµατη διάταξη ή πλυντήριο πλακετών µικροτιτλοδότησης (*). Συσκευή ανάγνωσης µικροπλακετών εξοπλισµένη µε φίλτρα 450 nm και 620-700 nm (*). Απορροφητικό χαρτί. (*) Για εµπεριστατωµένη πληροφόρηση σχετικά µε τις εγκεκριµένες από τις τεχνικές µας υπηρεσίες συσκευές, επικοινωνήστε µαζί µας. 6 - ΔΕΙΓΜΑΤΑ Συλλέξτε δείγµα αίµατος σύµφωνα µε τη συνήθη πρακτική. Οι δοκιµές πραγµατοποιούνται επί µη αραιωµένων δειγµάτων ορού ή πλάσµατος (τα οποία έχουν συλλεχθεί µε αντιπηκτικά όπως τα EDTA, ηπαρίνη, κιτρικό οξύ, ACD). Εξάγετε τον ορό ή το πλάσµα από το πήγµα ή τα ερυθρά αιµοσφαίρια το ταχύτερο δυνατόν για να αποφύγετε την αιµόλυση. Η εκτεταµένη αιµόλυση ενδέχεται να επηρεάσει τις επιδόσεις της δοκιµής. είγµατα τα οποία περιέχουν συσσωµατώµατα πρέπει να καθαρίζονται µε φυγοκέντρηση πριν από τη διεξαγωγή της δοκιµής. Τα αιωρούµενα συσσωµατώµατα ή ινώδη σωµατίδια είναι πιθανόν να προκαλέσουν πλασµατικά θετικά αποτελέσµατα. Μη θερµαίνετε τα δείγµατα. Τα δείγµατα µπορούν να διατηρηθούν στους + 2 έως 8 C εάν η δοκιµή προσδιορισµού διεξάγεται εντός 7 ηµερών ή µπορούν να διατηρούνται στην ατάψυξη στους -20 C. Τα δείγµατα πλάσµατος πρέπει να υποβάλλονται σε ταχεία απόψυξη θερµαίνοντάς τα για µερικά λεπτά στους 40 C (για την αποφυγή ιζηµατοποίησης του ινώδους). Αποφεύγετε επαναλαµβανόµενες καταψύξεις/αποψύξεις. είγµατα τα οποία έχουν υποστεί κατάψυξη και απόψυξη πάνω από 3 φορές δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται. 5

Εάν τα δείγµατα πρόκειται να µεταφερθούν, συσκευάστε τα σύµφωνα µε τους κανονισµούς σχετικά µε τη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων. ΜΗΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΜΟΛΥΣΜΕΝΟΥΣ, ΥΠΕΡΛΙΠΑΙΜΙΚΟΥΣ ΟΡΟΥΣ Ή ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Ή ΟΡΟΥ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΥΠΟΣΤΕΙ ΥΠΕΡΑΙΜΟΛΥΣΗ. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ : είγµατα τα οποία περιέχουν έως 90 g/l αλβουµίνης, 200 mg/l χολυρεθρίνης, λιπαιµικά δείγµατα τα οποία περιέχουν έως και 36 g/l τριελαΐνης, και δείγµατα τα οποία έχουν υποστεί αιµόλυση και τα οποία περιέχουν έως και 20 mg/l αιµοσφαιρίνης, δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα της δοκιµής. 7 - ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από την ορθή τήρηση της ακόλουθης καλής εργαστηριακής πρακτικής : Η ονοµασία της εξέτασης, καθώς επίσης ενας ειδικός κωδικός αναγνώρισης της εξέτασης, είναι γραµµένα στο πλάι κάθε µικροπλάκας. Ο ειδικός κωδικός αναγνώρισης είναι επίσης τυπωµένος σε κάθε ταινία. Genscreen HIV 1/2 Version 2 : Ειδικός ID αριθµός = 05 Πιστοποιήστε τον ειδικό κωδικό αναγνώρισης πρίν την πραγµατοποίηση της εξέτασης. Εάν ο ειδικός κωδικός αναγνώρισης απουσιάζει ή είναι διαφορετικός σε σχέση µε τον προαναφερθείσα αριθµό, η ταινία δέν πρέπει να χρησιµοποιηθεί. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια των οποίων η ηµεροµηνία λήξης έχει παρέλθει. Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες κατά τη διάρκεια της ίδιας δοκιµής. Παρατήρηση : Η χρήση άλλων παρτίδων ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (R2, µε την σήµανση στην ετικέτα 20Χ, πράσινου χρώµατος), ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος (R8 µε τη σήµανση στην ετικέτα TMB buf., µπλε χρώµατος), χρωµογόνου (R9 µε τη σήµανση στην ετικέτα TMB 11X, µοβ χρώµατος) και διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης (R10, µε τη σήµανση στην ετικέτα 1N, κόκκινου χρώµατος) διαφορετικών από αυτές που παρέχονται στο κιτ, είναι εφικτή υπό την προϋπόθεση να χρησιµοποιείται µόνο η ίδια παρτίδα κατά τη διάρκεια της ίδιας δοκιµής. Αυτά τα αντιδραστήρια µπορούν να χρησιµοποιούνται µε άλλα προϊόντα της εταιρείας µας και, για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστε µε τις τεχνικές µας υπηρεσίες. Το διάλυµα ανάπτυξης (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος + χρωµογόνο) πρέπει να λαµβάνει ροζ χρώµα. Η εµφάνιση άλλου χρώµατος λίγα λεπτά µετά από την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν είναι χρησιµοποιήσιµο και πρέπει να αντικατασταθεί. Για το παρασκεύασµα αυτό, χρησιµοποιείτε κατά προτίµηση πλαστικά δοχεία και υλικά κατανοµής µίας χρήσης ή γυαλικά που έχουν πλυθεί προηγουµένως µε υδροχλωρικό οξύ 1 Ν, ξεπλυθεί µε απεσταγµένο νερό και είναι στεγνά. Φυλάξτε το διάλυµα αυτό µακριά από το φως. Πριν από τη χρήση, απαιτείται να περιµένετε 10 λεπτά µέχρις ότου τα αντιδραστήρια σταθεροποιηθούν στη θερµοκρασία του εργαστηρίου. Προβείτε προσεκτικά στην ανασύσταση των αντιδραστηρίων. Επαληθεύστε την ορθότητα λειτουργίας και την ακρίβεια των πιπετών και την καλή λειτουργία των χρησιµοποιούµενων συσκευών. Μην τροποποιείτε τη διαδικασία της δοκιµής. Έκπλυση: για την επίτευξη των µέγιστων επιδόσεων της δοκιµής, η αυστηρή τήρηση των διαδικασιών πλυσίµατος είναι απαραίτητη. Οδηγιες για την υγιεινη και την ασφαλεια Ο θετικός µάρτυρας και ο µάρτυρας ελέγχου της τιµής κατωφλίου κατέστησαν ανενεργοί µέσω θέρµανσης. 6

Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιείται για την προετοιµασία του αρνητικού µάρτυρα, υποβλήθηκε σε δοκιµή και ευρέθηκε αρνητικό στο αντιγόνο HΒs καθώς και στα αντισώµατα αντι-hiv1, αντι-hiv2 και αντι-hcv. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιείται στην παρασκευή του θετικού µάρτυρα και του µάρτυρα ελέγχου της τιµής κατωφλίου υποβλήθηκε σε δοκιµή και βρέθηκε αρνητικό στο αντιγόνο HBs και στα αντισώµατα αντι-hcv. εδοµένου ότι καµία γνωστή µέθοδος δεν µπορεί να εγγυηθεί κατά τρόπον απόλυτο την απουσία ιού HIV, Ηπατίτιδας B ή C ή άλλων λοιµογόνων παραγόντων: Τα εν λόγω αντιδραστήρια καθώς και τα δείγµατα των ασθενών πρέπει να θεωρούνται ως δυνητικά λοιµογόνα και να λαµβάνονται προφυλάξεις κατά τη χρήση τους. Το υλικό που έρχεται σε απευθείας επαφή µε τα δείγµατα και τα αντιδραστήρια, καθώς και τα ρυθµιστικά διαλύµατα, πρέπει να θεωρούνται ως µολυσµένα προϊόντα. Η τοποθέτηση στον αυτόκλειστο κλίβανο σε 121 C επί τουλάχιστον µία ώρα αποτελεί την καλύτερη µέθοδο αδρανοποίησης των ιών HIV και του ιού της ηπατίτιδας Β. ΜΗΝ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΥΠΟΧΛΩΡΙΩΔΕΣ ΝΑΤΡΙΟ ΣΤΟΝ ΚΛΙΒΑΝΟ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗΣ. Το δελτίο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται κατόπιν παραγγελίας. Η επεξεργασία των διαλυµάτων και του µολυσµένου υλικού µε λευκαντικό τελικής συγκέντρωσης 5 % υποχλωριώδους νατρίου επί 30 λεπτά, καθιστά επίσης ανενεργούς τους ιούς HIV και τον ιό της ηπατίτιδας Β. Αποφεύγεται οιαδήποτε επαφή του δέρµατος και των βλεννογόνων µε το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, το χρωµογόνο και το διάλυµα διακοπής της αντίδρασης (κίνδυνοι τοξικότητας, ερεθισµού και εγκαυµάτων). Επιπροσθέτως, ο χειρισµός και η απόρριψη των χηµικών προϊόντων πρέπει να διεξάγονται σύµφωνα µε την καλή εργαστηριακή πρακτική. Για συστάσεις αναφορικά µε τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται µε κάποια χηµικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήµατα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδοµένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση www.bio-rad.com. 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ : Πριν από τη χρήση, αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να σταθεροποιηθούν στη θερµοκρασία περιβάλλοντος (18 έως 30 C). Αντιδραστήριο 1 (R1) : Μικροπλακέτα Κάθε µικροπλάκα που περιέχει 12 ταινίες είναι πακεταρισµένη σε µία συσκευασία αεροστεγώς κλεισµένη. Ανοίξτε την συσκευασία µε ψαλίδι κόβωντας 0,5 εώς 1 εκατοστό πιο πάνω απο τον µηχανισµό zip της συσκευασίας. Ανοίξτε την συσκευασία και αφαιρέστε την µικροπλάκα. Επανατοποθετήστε τις µη χρησιµοποιηµένες ταινίες µέσα στην συσκευασία. Κλείστε προσεκτικά την συσκευασία και τοποθετήστε την στο ψυγείο στους +2-8 C. Αντιδραστήριο 2 (R2) : Συµπυκνωµένο διάλυµα έκπλυσης (20X) Αραιώστε το διάλυµα πλύσης σε αναλογία 1:20 σε απεσταγµένο νερό για να έχετε έτοιµο πρός χρήση ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. Ετοιµάστε 800 ml για µία µικροπλάκα των 12 ταινιών. Αντιδραστήριο 3 (R3) : Δείγµα ελέγχου αρνητικού Ανθρώπινος ορός αρνητικός στα αντισώµατα αντι-hiv1 και αντι-hiv2, σε αντιγόνο HBs και σε αντισώµατα αντι-hcv, περιεκτικότητας αζιδίου του νατρίου 0,1 %. 7

Αντιδραστήριο 4 (R4) : Ορός µάρτυρας για τον έλεγχο της τιµής κατωφλίου Ανθρώπινος ορός χαµηλής περιεκτικότητας αντισωµάτων αντι-hiv, αρνητικός στο αντιγόνο HBs και στα αντισώµατα αντι-hcv, ανενεργός µέσω θέρµανσης, µε 0,1 % αζίδιο του νατρίου. Αντιδραστήριο 5 (R5) : Δείγµα ελέγχου θετικού Ανθρώπινος ορός χαµηλής περιεκτικότητας αντισωµάτων αντι-hiv, αρνητικός στο αντιγόνο HBs και στα αντισώµατα αντι-hcv, ανενεργός µέσω θέρµανσης, µε 0,1 % αζίδιο του νατρίου. Αντιδραστήριο 6 (R6) : Αραιωτικό δειγµάτων έτοιµο για χρήση ιάλυµα βοείου ορού (ρυθµιστικό διάλυµα TRIS µε προσθήκη χλωροφορµίου 0,1 %, Proclin 300 και ενός δείκτη χρώµατος ως µάρτυρας της απόθεσης δειγµάτων). Αντιδραστήριο 7α (R7α) : Λυοφιλιωµένο συζυγές Καθαρά αντιγόνα HIV1 και HIV2, σηµασµένα µε υπεροξειδάση. Περιέχει BSA και ProClin 300 (0,1%). Κτυπήστε ελαφρά στον πάγκο εργασίας τη φιάλη για να αποκολληθούν τα συστατικά που ενδεχοµένως έχουν κολλήσει στο ελαστικό πώµα. Αφαιρέστε το πώµα προσεκτικά και χύστε όλο το περιεχόµενο µιας φιάλης αραιωτικού συζυγούς µέσα στη φιάλη του λυοφιλιωµένου συζυγούς. Κλείστε µε το πώµα και, ανακινώντας κατά διαστήµατα προς διευκόλυνση της διάλυσης, αφήστε το διάλυµα να ηρεµήσει επί 10 λεπτά. Αντιδραστήριο 7β (R7β) : Αραιωτικό συζυγούς ιάλυµα αποβουτυρωµένου γάλακτος (ρυθµιστικό διάλυµα TRIS µε προσθήκη 0,1 % χλωροφορµίου και Proclin 300). Αντιδραστήριο 8 (R8) : Υπόστρωµα ιάλυµα έτοιµο για χρήση κιτρικού οξέως και ανθρακικού νατρίου ph 4,0 µε 0,015 % Η 2 Ο 2 και 4 % διµεθυλοσουλφοξειδίου (DMS0). Αντιδραστήριο 9 (R9) : Χρωµογόνο: Διάλυµα TMB ιάλυµα τετραµεθυλικής βενζιδίνης (TMB). Αραιώστε το διάλυµα 11 φορές στο ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος (π.χ. 1 ml αντιδραστηρίου R9 + 10 ml αντιδραστηρίου R8). Αφήστε να σταθεροποιηθεί επί 6 ώρες. Αντιδραστήριο 10 (R10) : Ανασχετικό διάλυµα ιάλυµα θειικού οξέως 1Ν έτοιµο για χρήση. 9 - ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΟΚΙΜΗΣ Ακολουθήστε αυστηρά το προτεινόµενο πρωτόκολλο. Ακολουθήστε την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Χρησιµοποιήστε αρνητικούς και θετικούς ορούς µάρτυρες καθώς και µάρτυρες για την έλεγχο της τιµής κατωφλίου, σε κάθε δοκιµή προκειµένου να επικυρώσετε την ποιότητά της. 1. Σχεδιάστε µε επιµέλεια τον τρόπο κατανοµής και αναγνώρισης των δειγµάτων 2. Ετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα έκπλυσης 3. Βγάλτε το πλαίσιο στήριξης και τις ταινίες (R1) από την προστατευτική συσκευασία 4. Τοποθετήστε γρήγορα και απευθείας, χωρίς προέκπλυση της πλακέτας, διαδοχικά : 25 µl αραιωτικού µέσα σε κάθε κοιλότητα 75 µl ορού αρνητικού µάρτυρα (R3) στην A1 75 µl ορού µάρτυρα ελέγχου της τιµής κατωφλίου (R4) στην B1, C1 και D1 8

75 µl ορού θετικού µάρτυρα (R5) στην E1 75 µl του πρώτου δείγµατος στην F1, 75 µl του δεύτερου δείγµατος στην G1, κλπ Ανάλογα µε το χρησιµοποιούµενο σύστηµα, η τροποποίηση των θέσεων των µαρτύρων είναι εφικτή. Οµοιογενοποιήστε το µίγµα προβαίνοντας σε τουλάχιστον 3 αναρροφήσεις µε την πιπέτα των 75 µl ή ανακινώντας την µικροπλακέτα µετά από την κατανοµή. Μπορείτε επίσης να αποθέσετε 100 µl ενός δείγµατος αφού το αραιώσετε προηγουµένως κατά 3:4 (π.χ. 150 µl ορού + 50 µl αραιωτικού). N.B. : Η κατανοµή των δειγµάτων µπορεί επίσης να ελεγχθεί οπτικά στο στάδιο αυτό της διαδικασίας αφού, µετά την προσθήκη δειγµάτων, το αραιωτικό που ήταν αρχικά µοβ γίνεται µπλε. (Βλέπε κεφάλαιο 12 για την αυτόµατη επιβεβαίωση ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ). 5. Όταν είναι εφικτό, καλύψτε µε αυτοκόλλητη ταινία πιέζοντας καλά σε όλη την επιφάνεια προκειµένου να εξασφαλισθεί η στεγανότητα. 6. Επωάστε την µικροπλακέτα σε υδατόλουτρο ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας ή σε ξηρό επωαστήρα επί 30 ± 5 λεπτά στους 37 ± 1 C. 7. Αφαιρέστε την κολλητική ταινία. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των κοιλοτήτων σε ένα δοχείο για µολυσµένα απορρίµµατα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο) και προσθέστε αµέσως σε κάθε µια κοιλότητα τουλάχιστον 0,370 ml διαλύµατος έκπλυσης. Τηρήστε ελάχιστο χρόνο εµβάπτισης (χρόνο αναµονής) 30 δευτερολέπτων. Αναρροφήστε εκ νέου. Επαναλάβετε το πλύσιµο τουλάχιστον 2 φορές (ήτοι, συνολικά τουλάχιστον 3 πλυσίµατα). Ο υπολειπόµενος όγκος πρέπει να είναι µικρότερος από 10 µl (εάν είναι απαραίτητο, στεγνώστε την πλακέτα αναποδογυρίζοντάς την επάνω σε ένα φύλλο απορροφητικού χάρτη). Εάν διατίθεται αυτόµατη συσκευή έκπλυσης, τηρήστε τις ίδιες διαδικασίες (βλέπε κεφάλαιο 10: ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ). 8. Κατανείµετε 100 µl διαλύµατος συζυγούς µέσα σε όλες τις κοιλότητες. Το συζυγές, πριν από τη χρήση του πρέπει να αναδεύεται. N.B. :Η κατανοµή του συζυγούς µπορεί να ελέγχεται οπτικά σε αυτό το στάδιο χειρισµού αφού λαµβάνει πράσινο χρώµα, (Βλέπε κεφάλαιο 12 για την αυτόµατη επιβεβαίωση ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ). 9. Εάν είναι εφικτό, καλύψτε εκ νέου την µικροπλακέτα µε νέα ταινία. Επωάστε επί 30 ± 5 λεπτά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (18-30 C). 10. Αφαιρέστε την κολλητική ταινία, αδειάστε όλες τις κοιλότητες µε αναρρόφηση και πλύνετε τουλάχιστον 5 φορές όπως και προηγουµένως. Ο υπολειπόµενος όγκος πρέπει να είναι µικρότερος από 10 µl (εάν είναι απαραίτητο, στεγνώστε την πλακέτα αναποδογυρίζοντάς την επάνω σε ένα φύλλο απορροφητικού χάρτη). 11. Κατανείµετε γρήγορα σε όλες τις κοιλότητες 80 µl διαλύµατος ανάπτυξης της ενζυµικής αντίδρασης (R8 + R9) που ετοιµάσατε εκ των προτέρων. Αφήστε την αντίδραση να εξελιχθεί στο σκοτάδι επί 30 ± 5 λεπτά και σε θερµοκρασία περιβάλλοντος (18 έως 30 C). Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης µη χρησιµοποιείτε συγκολλητική ταινία. N.B. : Η κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης, το οποίο γίνεται ροζ χρώµατος, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά στο στάδιο αυτό της διαδικασίας: Υπάρχει σαφής διαφορά χρωµατισµού µεταξύ µιας κενής κοιλότητας και µιας κοιλότητας που περιέχει διάλυµα ανάπτυξης ροζ χρώµατος. (βλέπε κεφάλαιο 12 για την αυτόµατη επιβεβαίωση - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ). 12. Προσθέστε 100 µl διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης (R10) ακολουθώντας την ίδια αλληλουχία και ρυθµό κατανοµής µε αυτήν του διαλύµατος ανάπτυξης. Οµοιογενοποιήστε το αντιδρών µίγµα. 9

N.B. : Η κατανοµή του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης, το οποίο είναι άχρωµο, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά στο στάδιο αυτό της διαδικασίας. Ο χρωµατισµός του υποστρώµατος, ροζ (για τα αρνητικά δείγµατα) ή µπλε (για τα θετικά δείγµατα), εξαφανίζεται από τις κοιλότητες οι οποίες, µετά από την προσθήκη διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης, γίνονται άχρωµες (για τα αρνητικά δείγµατα) ή κίτρινες (για τα θετικά δείγµατα). 13. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος των πλακετών. Περιµένετε τουλάχιστον 4 λεπτά µετά από την κατανοµή του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης και προβείτε στην ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας στα 450/620-700 nm µέσω της συσκευής ανάγνωσης πλακετών, εντός των 30 λεπτών από την διακοπή της αντίδρασης. 14. Πριν από την καταγραφή των αποτελεσµάτων, βεβαιωθείτε για την συνάφεια µεταξύ ανάγνωσης και σχεδίου κατανοµής και αναγνώρισης των πλακετών των δειγµάτων. 10 - ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΠΡΟΣΟΧΗ : ΑΠΟΦΕΥΓΕΤΑΙ ΤΙΣ ΜΟΛΥΝΣΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ (εκτίναξη δειγµάτων κτλ) Τα µη όξινα σταγονίδια που εκτινάσσονται πρέπει να καθαρίζονται καλά µε διάλυµα 5 % (ελάχιστο) υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Τα σταγονίδια οξέων πρέπει να καθαρίζονται µε στεγνό µέσον. Οι πιτσιλισµένες επιφάνειες πρέπει εν συνεχεία να καθαρίζονται µε διάλυµα 5 % (ελάχιστο) υποχλωριώδους νατρίου. Το υλικό που χρησιµοποιείται για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται στο ειδικό για µολυσµένα υλικά δοχείο και, στη συνέχεια, να αποσύρεται σύµφωνα µε την δέουσα πρακτική (βλέπε προφυλάξεις στο κεφάλαιο 7). ΕΚΠΛΥΣΗ : ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΤΕΥΞΗ ΤΩΝ ΜΕΓΙΣΤΩΝ ΕΠΙΔΟΣΕΩΝ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ, ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ Η ΑΥΣΤΗΡΗ ΤΗΡΗΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΩΝ ΠΛΥΣΙΜΑΤΟΣ. ΠΟΤΕ ΜΗΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΤΟ ΙΔΙΟ ΔΟΧΕΙΟ ΓΙΑ ΝΑ ΚΑΤΑΝΕΙΜΕΤΕ ΤΟ ΣΥΖΥΓΕΣ ΚΑΙ ΤΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ. ΕΛΕΓΧΕΤΕ ΤΟ ΙΑΛΥΜΑ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ (ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ) ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΜΗ. Πρέπει να είναι άχρωµο. Η εµφάνιση άλλου χρωµατισµού εντός µερικών λεπτών µετά από την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί και πρέπει να αντικατασταθεί. Πράγµατι, το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, το χρωµογόνο, το διάλυµα ανάπτυξης και διακοπής της αντίδρασης µπορούν να µολυνθούν από µεταλλικά ιόντα. Για τον λόγο αυτό, χρησιµοποιείτε κατά προτίµηση δοχεία και εξοπλισµό κατανοµής από πλαστικό υλικό ή γυαλικά που έχουν πλυθεί προηγουµένως µε υδροχλωρικό οξύ 1 Ν, ξεπλυθεί µε απεσταγµένο νερό και είναι στεγνά. 11 - ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η παρουσία ή απουσία αντισωµάτων αντι-hiv1 και/ή HIV2 προσδιορίζεται συγκρίνοντας την απορροφητικότητα που καταγράφηκε για κάθε δείγµα µε την υπολογισθείσα τιµή κατωφλίου. 1) Υπολογισµός της µέσης τιµής απορροφητικότητας Για τον ορό ελέγχου της τιµής κατωφλίου (DOR4) DO (B1) + DO (C1) + DO (D1) DOR4 = ---------------------------------------- 3 10

2) Υπολογισµός της τιµής κατωφλίου Η τιµή κατωφλίου προσδιορίζεται από τη σχέση : DOR4 VS = --------- 10 3) Επικύρωση της δοκιµής Η απορροφητικότητα του αρνητικού ορού µάρτυρα πρέπει να είναι µικρότερη από 70 % της τιµής κατωφλίου : DOR3 < 0,7 VS Η µέση τιµή των δειγµάτων του ορού για τον έλεγχο της τιµής κατωφλίου πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,80 : ODR4 > 0,8 Προαιρετικό : ο λόγος : DOR5/DOR4 πρέπει να είναι µεγαλύτερος από ή ίσος µε 1,3 (Αυτή η προαιρετική πρότυπη τιµή εφαρµόζεται µόνον εάν η γραµµικότητα της συσκευής ανάγνωσης είναι µεγαλύτερη από 3,000). 4) Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Τα δείγµατα των οποίων η απορροφητικότητα είναι µικρότερη από την τιµή κατωφλίου, βάσει της δοκιµής Genscreen HIV-1/2 Version 2 θεωρούνται αρνητικά. Ωστόσο, όταν τα αποτελέσµατα κυµαίνονται ακριβώς κάτω από την τιµή κατωφλίου (ΤΚ - 10% < DO< ΤΚ), τότε αυτά πρέπει να ερµηνεύονται µε προσοχή και συνιστάται η εις διπλούν επανάληψη της δοκιµής των αντίστοιχων δειγµάτων, εφόσον το επιτρέπουν οι εργαστηριακές διαδικασίες και τα χρησιµοποιούµενα συστήµατα. Τα δείγµατα των οποίων η απορροφητικότητα είναι ίση ή µεγαλύτερη από την τιµή κατωφλίου, βάσει της δοκιµής Genscreen HIV-1/2 Version 2 θεωρούνται καταρχήν θετικά. Πριν από την τελική ερµηνεία, πρέπει να υποβληθούν σε δοκιµή εκ νέου και εις διπλούν. Εάν µετά από την επανάληψη της δοκιµής ενός δείγµατος η απορροφητικότητα των 2 ανατύπων είναι µικρότερη από την τιµή κατωφλίου, το αρχικό αποτέλεσµα θεωρείται µη αναπαραγώµιµο και το δείγµα, σύµφωνα µε τη δοκιµή Genscreen HIV-1/2 Version 2 δηλώνεται ως αρνητικό. Οι λόγοι για τους οποίους οι αντιδράσεις δεν έχουν αναπαραγωγιµότητα οφείλονται συχνά στα ακόλουθα: ανεπαρκής έκπλυση των µικροπλακετών, µόλυνση των αρνητικών δειγµάτων από ορό που έχει υψηλό τίτλο αντισωµάτων, µόλυνση του διαλύµατος ανάπτυξης από χηµικούς οξειδωτικούς παράγοντες (λευκαντικό, µεταλλικά ιόντα κτλ ). µόλυνση του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης. Εάν µετά την επανάληψη της δοκιµής, η απορροφητικότητα που µετριέται σε ένα εκ των δύο ανατύπων είναι µεγαλύτερη από ή ίση µε την τιµή κατωφλίου, τότε το αρχικό αποτέλεσµα είναι αναπαραγώγιµο και το δείγµα, σύµφωνα µε το Genscreen HIV-1/2 Version 2, δηλώνεται ως θετικό και ερµηνεύεται όπως υποδεικνύεται στο κεφάλαιο 13. 12 - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ ΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΖΥΓΟΥΣ Επιβεβαίωση της κατανοµής δειγµάτων Μετά την διαδοχική κατανοµή του αραιωµένου διαλύµατος δειγµάτων (R6) και στη συνέχεια των δειγµάτων, η παρουσία των προς δοκιµή δειγµάτων µέσα στις κοιλότητες µπορεί να ελεγχθεί µε φασµατοφωτοµετρική ανάγνωση στα 620 nm: η οπτική πυκνότητα 11

µιας κοιλότητας που περιέχει δείγµα πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,150 (µικρότερη οπτική πυκνότητα υποδεικνύει ακατάλληλη κατανοµή δείγµατος). Επιβεβαίωση της παρουσίας συζυγούς εντός της κοιλότητας Μετά από την κατανοµή του συζυγούς ((R7α+ R7β), η παρουσία του µέσα στις κοιλότητες µπορεί να ελεγχθεί µέσω φασµατοφωτοµετρικής ανάγνωσης στα 620 nm : η οπτική πυκνότητα µιας κοιλότητας που περιέχει συζυγές πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,100 (µικρότερη οπτική πυκνότητα υποδεικνύει ακατάλληλη κατανοµή συζυγούς στην εν λόγω κοιλότητα). Επιβεβαίωση της απόθεσης διαλύµατος ανάπτυξης : Η παρουσία του ροζ διαλύµατος ανάπτυξης µπορεί να ελεγχθεί µε αυτόµατη ανάγνωση στα 490nm : η κοιλότητα που περιέχει το διάλυµα ανάπτυξης πρέπει να έχει οπτική πυκνότητα µεγαλύτερη από 0,100 (χαµηλότερη οπτική πυκνότητα σηµαίνει ελλιπή κατανοµή διαλύµατος ανάπτυξης). Υπάρχει εµφανής διαφορά χρωµατισµού µεταξύ µιας κενής κοιλότητας και µιας κοιλότητας που περιέχει ροζ χρώµατος διάλυµα ανάπτυξης. 13 - ΕΠΙ ΟΣΕΙΣ Οι µελέτες ευαισθησίας της δοκιµής Genscreen HIV-1/2 Version 2 έγιναν επί θετικών δειγµάτων ασθενών προσβεβληµένων από AIDS ή σχετικά σύµπλοκα, καθώς και επί πάνελ ευαισθησίας τα οποία αποτελούνται από τεκµηριωµένα δείγµατα προερχόµενα από ασθενείς προσφάτως προσβεβληµένους από τον ιό AIDS. Η ευαισθησία στον HIV-1 που αξιολογήθηκε βάσει 413 δειγµάτων ασθενών προσβεβληµένων από AIDS ή από σχετικό σύµπλοκο (ARC), θετικών στον HIV1 οµάδας Μ και επιβεβαιωµένων µε τη δοκιµή Western-Blot, καθώς και επί 31 δειγµάτων HIV1 οµάδας Ο, οµοίως επιβεβαιωµένων µε τη δοκιµή Western-Blot HIV-1, εκτιµήθηκε στο 100 %. Η ευαισθησία της οµάδας Ο, η οποία δοκιµάσθηκε επίσης σε 4 δείγµατα HIV1 οµάδας Ο, µη προσδιορισµένα µε τη δοκιµή Western-Blot, κρίθηκε ικανοποιητική µε τα 3 δείγµατα που βρέθηκαν θετικά. Η ευαισθησία HIV2, η οποία αξιολογήθηκε επί 119 αραιωµένων και µη αραιωµένων δειγµάτων ορού καθώς και επί επιβεβαιωµένων µε τη δοκιµή Western-Blot θετικών ιστών ασθενών, εκτιµήθηκε στο 100%. Η ευαισθησία HIV1 οµάδας M αξιολογήθηκε επί 29 πάνελ οροµετατροπής του εµπορίου (BBI, NABI, Bioclinicals partners) καθώς επί του πάνελ ευαισθησίας του INTS. Τα αποτελέσµατα είναι σύµφωνα προς τα πρότυπα. Επί του πάνελ του INTS, τα 45 δείγµατα οροµετατροπής καθώς και τα 13 της perοροµετατροπής είναι θετικά. 25 επιπλέον φρέσκα θετικά δείγµατα αναλύθηκαν (εντός 1 ηµέρας µετά την συλλογή του δείγµατος), και βρέθηκαν όλα θετικά. Τουλάχιστον, 42 πρώιµα δείγµατα οροµετατροπής αναλύθηκαν µε το κιτ αντιδραστηρίων Genscreen HIV-1/2 Version 2. Η ειδικότητα της δοκιµής στα 5025 δείγµατα αιµοδοτών εκτιµήθηκε σε 99,98%. Κατά την ανάλυση 212 ασθενών µε παθολογία ή κατάσταση άσχετη προς τον ιό του AIDS (έγκυες γυναίκες, ρευµατοειδής παράγοντας, αντι-πυρηνικό Ig ή άλλες ιικές λοιµώξεις), παρατηρήθηκαν 3 θετικές αντιδράσεις. Η ακρίβεια της δοκιµής Genscreen HIV-1/2 Version 2 προσδιορίσθηκε µε ανάλυση 4 δειγµάτων: 1 αρνητικός ορός (δείγµα 1), 2 οροί ελαφρώς θετικοί στα αντισώµατα αντι- HIV 1 (δείγµατα 2 και 3) και 1 ορός έντονα θετικός στα αντισώµατα αντι- HIV1 (δείγµα 4). Η επαναληψιµότητα (εντός της ίδιας δοκιµής) της τεχνικής αξιολογήθηκε µε την ανάλυση των 4 αυτών δειγµάτων που δοκιµάσθηκαν 30 φορές µε την ίδια δοκιµή ενώ η αναπαραγωγιµότητα (σειρά δοκιµών) αξιολογήθηκε µε την ανάλυση των 4 ίδιων αυτών 12

δειγµάτων που δοκιµάσθηκαν εις τριπλούν επί 5 διαφορετικές ηµέρες, µε δύο ανεξάρτητες δοκιµές ηµερησίως. Τα αποτελέσµατα απεικονίζονται στους 2 ακόλουθους πίνακες: Πίνακας 1: Επαναληψιµότητα κατά την ίδια δοκιµή n = 30 δείγµ α1 δείγµ α2 δείγµ α3 δείγµ α4 µέση τιµή 0,12 3,34 9,05 19,6 λόγων* τυπική 0,04 0,45 0,30 0,73 απόκλιση λόγος* CV (%) 31,5% 13,6% 3,3% 3,7% * λόγος = OD/C.O. Πίνακας 2: Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ δοκιµών n = 30 δείγµ α1 δείγµ α2 δείγµ α3 δείγµ α4 µέση τιµή 0,12 3,43 9,27 19,35 λόγων* τυπική 0,02 0,41 0,89 01,93 απόκλιση λόγος* CV (%) 19,3% 12,1% 39,65% 10,0% * λόγος = OD/C.O. 14 - ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ Οι πολύ µικρές ποσότητες αντισωµάτων ενδέχεται να µην ανιχνευθούν σε περίπτωση πρόσφατης µόλυνσης και, κατά συνέπεια, ένα αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι το δείγµα µάρτυρας δεν περιέχει αντισώµατα ανιχνεύσιµα µε το Genscreen HIV-1/2 Version 2. Ένα τέτοιο αποτέλεσµα δεν αποκλείει την πιθανότητα µόλυνσης από τον HIV1/HIV2. Η µεταβλητότητα των ιών HIV1 (οµάδα M, οµάδα O) και HIV2 δεν επιτρέπει τον αποκλεισµό της ύπαρξης πλασµατικών αρνητικών αντιδράσεων. Καµία γνωστή µέθοδος δεν µπορεί να µας προσφέρει µε απόλυτη βεβαιότηταότι ο ιός HIV είναι απών. Οπιαδήποτε τεχνική ELISA, υψηλής ευαισθησίας, µπορεί να παράγει αντιδράσεις πλασµατικώς θετικές. Για τον έλεγχο της ειδικότητας της αντίδρασης, κάθε δείγµα αναπαραγώγιµο και θετικό (βάσει των κριτηρίων ερµηνείας του Genscreen HIV1/2 version 2) πρέπει να υποβάλλεται σε δοκιµή επιβεβαίωσης (Western-Blot). Η θέρµανση των δειγµάτων επηρεάζει την ποιότητα των αποτελεσµάτων. Η χρωµατοµετρική µέθοδος επαλήθευσης της απόθεσης δείγµατος και/ή συζυγών και/ή διαλύµατος ανάπτυξης, δεν επιτρέπει έλεγχο της ακρίβειας των κατανεµηθέντων όγκων αλλά µόνο την υπόδειξη της ύπαρξης δείγµατος και/ή συζυγούς και/ή διαλύµατος ανάπτυξης. Το ποσοστό εσφαλµένων αποτελεσµάτων που προκύπτουν µέσω της παρούσας µεθόδου έχει σχέση µε την ακρίβεια µέτρησης του χρησιµοποιούµενου συστήµατος (συσσωρευµένοι συντελεστές µεταβολής (CV) στην κατανοµή των υλικών και στην ανάγνωση των αποτελεσµάτων µεγαλύτεροι από 10% µπορεί να υποβαθµίσουν σηµαντικά την ποιότητα της εν λόγω επαλήθευσης). Στην περίπτωση µη αποτελεσµατικής έκπλυσης µετά τη φάση επώασης του συζυγούς, η αυτόµατη επιβεβαίωση της κατανοµής του διαλύµατος ανάπτυξης (µε ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας των κοιλοτήτων στα 490 nm) µπορεί να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα, ήτοι οπτικές πυκνότητες µεγαλύτερες από 0,100 χωρίς να υπάρχει διάλυµα ανάπτυξης. Παρά ταύτα, αυτό το φαινόµενο δεν έχει παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια των αξιολογήσεων που έγιναν σε 939 δοκιµασµένα δείγµατα. 13

15 - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. BARRE-SINOUSSI F., CHERMANN J.C., REY F. et al Isolation of a T. lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Science, 1983, 220, 868-871 2. ALIZON M., SONIGO P., BARRE-SINOUSSI F. et al. Molecular cloning of lymphadenopathy associated virus Nature, 1984, 312, 757-760 3. CLAVEL F., GUETARD D., BRUN-VEZINET F. et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986, 233, 343-346 4. CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, 691-695 5. BRUN-VEZINET F., ROUZIOUX C., BARRE-SIOUSSI F. et al. Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immunodeficiency syndrome or lymphadenopathy syndrome. Lancet. 1984, June, 1253-1256 6. MATHIESEN T., CHIODI F., BROLIDEN P.A., et al. Analysis of a subclass restricted HIV1 gp 41 epitope by omission peptides. Immunology, 1989, 67, 1-7 7. NORRBY E., BIBERFELD G., JOHNSON PR et al. The chemistry of site directed serology for HIV Infections. AIDS Res Human Retroviruses. 1989, 5, 487/493 8. McKEATING J.A., WILLEY R.L. Structure and fonction of the HIV envelope. AIDS, 1989, 3, S35-S41 9. PASQUALI J.L., KIENY M.P., KOLBE H. et al. Immunogenicity and epitope mapping of a recombinant soluble gp 160 of the human immunodeficiency virus type 1 envelop glycoprotein. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, 1107-1113 10. NEURATH A.R., STRICK N., TAYLOR P. et al Search for eptiope specific antibody responses to human immunodeficiency virus (HIV1) envelope glycoproteins signifying resistance to disease development. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, 1183-1192 11. NAIR B.C., FORD G., KALYANARAMAN V.S. et al. Enzyme immunoassay using native envelope glycoprotein (gp 160) for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibodies. J. Clin. Microbio. 1994, 32, 1449-1456 12. ZAAIJER H.L., EXEL-OEHLERS P.V., KRAAIJEVELDT T., et al. Early detection of antibodies to HIV1 by third generation assays. The Lancet, 1992, 340, 770-772 13. CONSTANTINE N.T., VAN DER GROEN G., BELSEY E.M. et al Sensitivity of HIV antibody assays determined by seroconversion panels AIDS, 1994, 8, 1715-1720 14. ENGELBRECHT S., DE JAGER G.J., VAN RENSBURG E.J. Evaluation of commercially available assays for antibodies to HIV1 in serum obtained from south african patients infected with HIV1 subtypes B, C, and D. J. Med. Viroloogy 1994, 44, 223-228 15. COUROUCE A.M. et al. Trousses de dépistage des anticorps anti VIH1 et VIH2. Spectra Biologie, 1994, 6, 43-51 16. DONDERO T.J., HU D.J., GEORGE J.R. HIV1 variants : yet another challenge to public health. The Lancet 1994, 343, 1376 17. SIMON F., LY T.D., BAILLOU-BEAUFILS A., et al Sensitivity of screening kits for anti HIV1 subtypes O antibodies. AIDS, 1994, 8, 1628-1629 18. JANSSENS W., HEYNDRICKX L. FRANSEN et al. Genetic and phylogenetic analysis of ENV subtypes G and H in Central Africa AIDS Res. Hum. Retrovirus 1994, 10, 877-879 19. GAOF., YUE L. ROBERTSON D.L. et al. Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2 : evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. J. Virol. 1994, 68, 7433-7447 14

15

16

17

18

19