Μέθοδοι Ανίχνευσης Αντιγόνων Αντισωμάτων

Transcript

1 Μέθοδοι Ανίχνευσης Αντιγόνων Αντισωμάτων Νεφελομετρία Ανοσοφθορισμός

2 ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ Πρόκειται για μέθοδο συγκέντρωσης διάφορων ουσιών στα βιολογικά υγρά κυρίως πρωτεΐνες που αντιδρούν με αντισώματα σχηματίζοντας συμπλέγματα. Μετράει την σκέδαση του φωτός όταν μια δέσμη φωτός από πηγή πέσει σε σωματίδια μακρομόρια (ανοσοσυμπλέγματα) βρίσκονται σε ένα διάλυμα.

3 ΝΕΦΕΛΟΜΕΤΡΙΑ Στηρίζεται δηλαδή η μέθοδος στη σχέση συγκέντρωσης των πρωτεϊνών με την ένταση του σκεδαζόμενου φωτός από τα συμπλέγματα που σχηματίζονται. Συνήθως τα συμπλέγματα αντιγόνου- αντισώματος έχουν μέγεθος nm.

4 Αρχή: Σκέδαση του φωτός Νεφελομετρία Μετρώντας ένα εναιώρημα, την ένταση του φωτός που σκεδάζεται υπό ορισμένη γωνία, υπολογίζεται η συγκέντρωση των σωματιδίων μέσα σε αυτό Σωματίδια= σύμπλεγμα αντιγόνου- αντισώματος Μετρούμενη ουσία= αντιγόνο Αντιδραστήριο= ειδικό αντίσωμα

5

6 Νεφελόμετρα

7 Νεφελομετρία Πλεονεκτήματα Αναλυτική ευαισθησία Ταχεία Εύκολη στη χρήση Απαιτεί μικρούς όγκους δείγματος Αιμολυμένα ή ικτερικά δείγματα δεν επηρεάζουν το αποτέλεσμα Αυτοματισμός

8 Νεφελομετρία Εξετάσεις: πρωτεΐνες οξείας φάσεως (CRP) RF ASTO IgG, IgA, IgM, IgE, αλυσίδες κ/λ Αιμοπηξίνη, Ινωδογόνο Φάρμακα, βιταμίνες κ.ά.

9 Ανοσοφθορισμός Άμεσος: Αναζητείται αντιγόνο (DFA) Αρχή: Κλινικό δείγμα + Αντιδραστήριο (αντίσωμα συνδεδεμένο με φθοριόχρωμα ) Τεχνική: Προετοιμασία δείγματος (κολπικό, πτύελα, κόπρανα, φαρυγγικό επίχρισμα, βρογχικό έκκριμα, περιφερικό αίμα, αρθρικό, ούρα) Φυγοκέντρηση Έκπλυση Ρευστοποίηση Πλεονέκτημα: Υψηλή ειδικότητα (δυσκολία στην ανεύρεση του «ειδικού» αντιγονικού τμήματος για την παρασκευή μονοκλωνικού αντισώματος)

10

11 Ανοσοφθορισμός Έμμεσος: Ανίχνευση αντισωμάτων IgG, IgM, IgA (IFA) Αρχή: Αντιγόνο + ορός (αντίσωμα) + Conjugate (anti-αντίσωμα συνδεδεμένο με φθοριόχρωμα ) Τεχνική: Αραίωση ορού Τοποθέτηση στην πλάκα Επώαση Πλύση Προσθήκη αντι-αντισώματος Επώαση Πλύση Μικροσκόπηση

12 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Μικροβιολογία Ιολογία Σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα Μυκητολογία Αυτοάνοσα νοσήματα Καρκίνος Ορμόνες Αλλεργίες Αιματολογία Παρασιτολογία

13 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Ανίχνευση αντιδιφθεριτικής τοξίνης Βρουκέλλες Λεγεωνέλλες Campylobacter jejuni IgG, IgM Εντεροτοξίνη Δονάκιο της χολέρας ΙΟΛΟΓΙΑ Απλού Έρπητα Ανεμευλογιάς CMV Epstein Barr Γρίππης Ερυθράς, Ιλαράς, Παρωτίτιδας Παραϊνφλουέντζας Εντεροϊούς Αδενοϊούς Rota Ηπατίτιδας

14 ΣΕΞΟΥΑΛΙΚΩΣ ΜΕΤΑΔΙΔΟΜΕΝΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Ναϊσσέρια γονορροϊκή Ιό Απλού Έρπητα Χλαμύδιο τραχώματος (δεσμευτική Ag ELISA) AIDS (screening) Επικουρικά στις εν τω βάθει μυκητιάσεις από Ασπέργιλλο Κρυπτόκοκκο Candida ΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΙΣ IgG: Έμμεση ELISA IgM: Δεσμευτική αντισώματος ELISA

15 ΑΥΤΟΑΝΟΣΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ Αντιπυρηνικά (Αντι-DNA) Ab Αντι-κυτταροπλασματικά Έναντι Ag θυρεοειδούς Αντιφωσφολιπιδικά Αντικαρδιολοπινικά ΜΕΤΡΗΣΗ ΟΡΜΟΝΩΝ Sandwich ELISA Γοναδοτροπίνες Στεροειδείς ορμόνες Κορτιζόλη Θυρεοειδοτρόπος (TSH) T3, T4, Ινσουλίνη ΝΕΟΠΛΑΣΜΑTA Ανίχνευση Ags καρκίνου πνεύμονα με μονοκλωνικά Ab ΑΛΛΕΡΓΙΕΣ Ολική IgE Ειδική IgE Ισταμίνη ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑ Παράγοντες πήξης Ιστικός ενεργοποιητής πλασμινογόνου Αναστολέας ενεργοποιητή πλασμινογόνου

16 Ανίχνευση της πρωτεΐνης Επώαση της μεμβράνης με το 1 ο αντίσωμα

17 Επώαση της μεμβράνης με το 2 ο αντίσωμα (σημασμένο)

18 Επώαση της μεμβράνης με το υπόστρωμα

19

20

21 Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)

22 AΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ ΕLISA Η ELISA είναι μια βιοχημική τεχνική που χρησιμοποιείται κυρίως στην ανοσολογία για την ανίχνευση της παρουσίας ενός αντισώματος ή ενός αντιγόνου σε ένα δείγμα. Χρησιμοποιούνται ευρύτατα ως διαγνωστικά εργαλεία στην ιατρική και στους ποιοτικούς ελέγχους στις βιομηχανίες. Η αρχή των ανοσοενζυμικών μεθόδων στηρίζεται στην ειδικότητα αντιγόνου-αντισώματος και στη δράση ενός ενζύμου προκειμένου να πραγματοποιηθεί η ποσοτικοποίηση της μέτρησης.

23 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ 1. Ευαίσθητη, με δυνατότητες ανίχνευσης πολύ μικρών ποσοτήτων (συνήθως 1-10 ng /ml) αντιγόνου (ιού). 2. Γρήγορη. Τα αποτελέσματα είναι συνήθως διαθέσιμα μέσα σε 6-24 ώρες. 3. Δυνατότητα εφαρμογής σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων. 4. Εξειδίκευση, για τη διαφοροποίηση οροτύπων ενός ιού. Δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του αντιγόνου (ιού). 5. Δυνατότητα αυτοματοποίησης και παραγωγής kit (αυτόματο πλύσιμο των μικροπλακών, ταυτόχρονη διανομή των αντιδραστηρίων σε όλα τα φρεάτια, κ.λ.π.) 6. Χαμηλό κόστος και διατήρηση των αντιδραστηρίων για μεγάλο χρονικό διάστημα. 7. Δεν απαιτείται ακριβός εργαστηριακός εξοπλισμός (το πιο ακριβό όργανο είναι το φωτόμετρο). 8. Χρήση μικρών ποσοτήτων αντισωμάτων και αντιορού.

24 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ΑΜΕΣΗ ELISA Προσρόφηση αντιγόνου στην μικροπλάκα Απομάκρυνση περίσσειας αντιγόνου (πλύση) Επώαση με αντίσωμα (συζευγμένο με ένζυμο) Απομάκρυνση περίσσειας αντισώματος Επώαση με υπόστρωμα/χρωμογόνο

25 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ΕΜΜΕΣΗ ELISA Προσρόφηση αντιγόνου στην μικροπλάκα Απομάκρυνση περίσσειας αντιγόνου (πλύση) Επώαση με αντίσωμα (1ο αντίσωμα) Απομάκρυνση περίσσειας αντισώματος Επώαση με δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με ένζυμο (2ο αντίσωμα) Απομάκρυνση περίσσειας αντισώματος Επώαση με υπόστρωμα/χρωμογόνο

26 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA Sandwich (ΑΜΕΣΗ)

27 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA Sandwich (ΕΜΜΕΣΗ)

28 Ορισμός της ευαισθησίας και της ειδικότητας Ευαισθησία: Ευαισθησία της εξέτασης ορίζεται η αναλογία των γυναικών με νόσο, των οποίων τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα αναγνωρίστηκαν σωστά ως θετικά, προς όλες τις γυναίκες που εξετάστηκαν και έχουν την νόσο. Ειδικότητα: Ειδικότητα της εξέτασης ορίζεται η αναλογία των γυναικών χωρίς νόσο, των οποίων τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα αναγνωρίστηκαν σωστά ως αρνητικά, προς όλες τις γυναίκες που εξετάστηκαν και είναι ελεύθερες νόσου.

29 ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ-ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ ΝΟΣΗΜΑ υπάρχει (+) Δεν υπάρχει (-) ΘΕΤΙΚΟ (+) a= (αληθώς θετικό) b= (ψευδώς θετικό) ΑΡΝΗΤΙΚΟ (+) c= (ψευδώς αρνητικό) d= (αληθώς αρνητικό)

30 ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ-ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Ευαισθησία (sensitivity) a/(a + c) a= (αληθώς θετικό) b=(ψευδώς αρνητικό) C= (ψευδώς αρνητικό) D= ( αληθώς αρνητικό)

31 ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ-ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Ειδικότητα (specificity) d/ (b+ d) b= (ψευδώς αρνητικά ) d= (αληθώς αρνητικά)