Φαρμακευτική Bιοτεχνολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 2-4 EIΣAΓΩΓH ΣΤΗΝ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA ΚΑΙ ΣΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 541 24 Θεσσαλονίκη
Σύγχρονη Βιοτεχνολογία και Γενετική Μηχανική α) Η σύγχρονη Βιοτεχνολογία ξεκίνησε σχεδόν παράλληλα με την ανάπτυξη των τεχνολογιών γενετικής μηχανικής που επέτρεψαν την απομόνωση, τροποποίηση, εισαγωγή και έκφραση τμημάτων γενετικού υλικού. β) Τα «εργαλεία» που έχει αναπτύξει η γενετική μηχανική μας επιτρέπουν: Να ταυτοποιούμε το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος Να κόβουμε την αλληλουχία του DNA που περιέχει αυτήν την αλληλουχία του γονιδίου Να κλωνοποιούμε το γονίδια αυτό σε έναν κατάλληλο φορέα, π.χ. πλασμίδιο ή βακτηριοφάγο Να προσδιορίζουμε την αλληλουχία του γενετικού υλικού Να χρησιμοποιούμε τους φορείς αυτούς για να μεταφέρουμε το γονίδιο του ενδιαφέροντος σε άλλους οργανισμούς, όπως το βακτήριο Escherichia coli ή και σε κύτταρα θηλαστικών που αναπτύσσονται σε κυτταροκαλλιέργειες κλπ. Να επάγουμε (διεγείρουμε) τα κύτταρα αυτά για να ενεργοποιήσουμε την έκφραση του γονιδίου και την παραγωγή της της πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος. Να εκχυλίσουμε και να καθαρίσουμε την πρωτεΐνη για θεραπευτική χρήση.
Παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων πρωτεϊνών με κλωνοποίηση γονιδίων σε φορείς έκφρασης Παράδειγμα: Οι βακτηριακοί φορείς έκφρασης pgex ("Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase (1988) Smith, D. B. and Johnson, K. S., Gene 67, 31-40 ) Ιδιότητες των φορέων pgex 1. Ισχυρός και ρυθμιζόμενις υποκινητής (Tac promoter) 2. Παρουσία γονιδίου lac Iq 3. Ετικέτα (tag) GST (θειοτρανσφεράση της γλουταθειόνης)
DNA μπορεί να απομονωθεί είτε από κύτταρα ή από ιστούς προκειμένου να μελετηθεί ΠΡΟΣΟΧΗ: Το DNA είναι ένα ΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο (ακόμη και το DNA των σχετικά μικρών βακτηριακών γονιδιωμάτων είναι αρκετά μεγάλο) που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο στη μηχανική καταπόνηση, δηλαδή μπορεί πολύ εύκολα να «σπάσει» σε μικρότερα θραύσματα κατά τη διάρκεια των εργαστηριακών χειρισμών. ΕΠΟΜΕΝΩΣ üτο «κόψιμο» του DNA σε μικρότερα θεραύσματα μπορεί να βελτιώσει τη μηχανική του σταθερότητα και να απλοποιήσει το χειρισμό του
Πως μπορούμε να «κόψουμε» το DNA σε μικρότερα θραύσματα; ME TH XPHΣH EIΔIKΩN ENZYMΩN YΠAPXOYN ΠPOΫΠOΘEΣEIΣ; NAI, TA ENZYMA AYTA ΘA ΠPEΠEI NA ΔIAΣΠOYN TO DNA ΠANTA ΣTIΣ IΔIEΣ AΛΛHΛOYXIEΣ OI OΠOIEΣ EINAI EK TΩN ΠPOTEPΩN ΓNΩΣTEΣ
Εργαλεία στην Φαρμακευτικη Βιοτεχνολογία Γενετική Μηχανική Ενδονουκλεάσες περιορισμού: Αυτά τα ένζυμα προέρχονται από βακτήρια όπου χρησιμοποιούνται ως μηχανισμός άμυνας ενάντια στους ιούς (βακτηριοφάγους) που τα προσβάλλουν, αποικοδομώντας το DNA των εισβολέων. Υπάρχουν εκατοντάδες τέτοιες ενδονουκλεάσες περιορισμού που τις χρησιμοποιούμε σαν μοριακά ψαλίδια για να κόψουμε το DNA σε συγκεκριμένες θέσεις και να απομονώσουμε τα γονίδια DNA λιγάση: Το ένζυμο αυτό χρησιμοποιείται φυσιολογικά στην αντιγραφή αλλά και στην επιδιόρθωση «σπασμένου» DNA. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την ενσωμάτωση νέων γονιδίων στο DNA. Πλασμίδια: Είναι κυκλικά DNA. Μπορούν να διαμορφωθούν για να μεταφέρουν τα γονίδια του ενδιαφέροντος ή ανασυνδυασμένο DNA. Βακτηριοφάγοι (ή φάγοι): Είναι ιοί που μολύνουν τα βακτήρια. Οι βακτηριοφάγοι μπορούν να διαμορφωθούν για να μεταφέρουν τα γονίδια του ενδιαφέροντος ή ανασυνδυασμένο DNA.
Τι είναι οι ενδονουκλεάσες περιορισμού; Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριμένες παλινδρομικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις ίδιες προκαθορισμένες θεσεις. Θα δείξουμε μερικά παραδείγματα στις επόμενες δύο διαφάνειες
Τέσσερις δημοφιλείς ενδονουκλεάσες περιορισμού
Περισσότερες ενδονουκλεάσες περιορισμού θέση διάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός HaeIII EcoRI AluI NotI HindIII
Από που προέρχονται οι ενδονουκλεάσες περιορισμού; Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού απομονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός μηχανισμού άμυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από μόλυνση με κάποιον βακτηριοφάγο. Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισμού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τις παράγει;
Χημικές τροποποιήσεις του DNA των βακτηρίων που παράγουν ενδονουκλεάσες περιορισμού το προστατεύουν από ενδονουκλεολυτική πέψη από αυτές Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI EcoRI μεθυλάση Μη μεθυλιωμένο DNA Μη μεθυλιωμένο DNA «κολλώδη» άκρα Διάσπαση του DNA Μεθυλιωμένο DNA Ενδονουκλεάση περιορισμού EcoRI Η EcoRI δε μπορεί να διασπάσει το μεθυλιωμένο DNA
ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΚΟΠΗ ΤΙ; Πως αναλύεται και πως χρησιμοποιείται το DNA μετά την πέψη του με ενδονουκλεάσες περιορισμού;
Hλεκτροφορητική ανάλυση του DNA κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού κοπή με ενδονουκλεάση περιορισμού Δίκλωνο πλασμιδιακό DNA Πέψη με EcoRI Πέψη με HindIII DNA κοντό θραύσμα μεσαίουμεγέθους θραύσμα - Μεγαλύτερο μέγεθος ζεύγη νουκλεοτιδίων (Χ1000) 20 10 8 6 2 + πηκτή αγαρόζης Αρχή Τέλος μικρότερο μέγεθος Εμφάνιση φιλμ φύλλο φωτογραφικού χαρτιού εμφανισμένο αυτοραδιογράφημα
Η σημασία του μάρτυρα μεγέθους θραύσματος DNA στην ηλεκτροφόρηση
Τα στάδια της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης σε πηκτές αγαρόζης καλούπι Γυάλινη επιφάνεια βάση στήριξης διάλυμα αγαρόζης ταινία πηγαδάκια Α) καλούπι σχηματισμού της πηκτής Β) Η αγαρόζη «χύνεται» στο καλούπι σχηματισμού πηκτής τροφοδοτικό Γ) τοποθέτηση πλαστικής «χτένας» για τον σχηματισμό οπών (πηγαδάκια) στην επιφάνεια της πηκτής μικροπιπέτα καλώδια
Προετοιμασία και ενυδάτωση της πηκτής αγαρόζης
Τα στάδια της προετοιμασίας για ηλεκτροφόρηση σε πηκτές αγαρόζης α) Η αγαρόζη «χύνεται» στο καλούπι σχηματισμού πηκτής στο οποίο έχει ήδη τοποθετηθεί και η χτένα σχηματισμού πηγαδιών α) Μετά τη στερεοποίηση της αγαρόζης και την απομάκρυνση της χτένας σχηματισμού πηγαδιών, το κάθε δείγμα DNA τοποθετείται («φορτώνεται») σε ξεχωριστό πηγαδάκι γ) Μετά την τοποθέτηση των δειγμάτων η συσκευή ενώνεται, με χρήση καλωδίων, με το τροφοδοτικό και ξεκινά η ηλεκτροφόρηση με παροχή ρεύματος συγκεκριμένης τάσης.
Χειρισμός του δείγματος που πρόκειται να αναλυθεί με ηλεκτροφόρηση
Χειρισμός της πηκτής αγαρόζης μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης
Ηλεκτροφορητικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται και στον προσδιορισμό των DNA αλληλουχιών
Διαδικασία αλληλούχισης DNA με τη μέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων Διδεοξυαδενοσίνη (ddatp)
Aλληλούχιση DNA με τη μέθοδο του Sanger
Αυτοματοποιημένος προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA
Η πρώτη αλληλούχιση πλήρους γονιδιώματος επιτεύχθηκε το 1995 για το DNA του βακτηρίου Haemophilus influenza Σταθμοί στην αλληλούχιση γονιδιωμάτων 1996: Πρώτη αλληλούχιση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος (ζυμομύκητας Saccharomyces cerevisiae) 1998: Πρώτη αλληλούχιση γονιδιώματος πολυκύτταρου ευκαρυώτη (Caenorhabditis elegans) 2000: Aλληλούχιση γονιδιωμάτων Drosophila melanogaster & Arabidopsis thaliana 2004: Πλήρης αλληλούχιση του ανθρώπινου γονιδιώματος
Η γνώση της αλληλουχίας των βάσεων του DNA επιτρέπει τον προσδιορισμό των περιοχών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της πάνω αλυσίδας του DNA πλαίσια ανάγνωσης DNA πλαίσια ανάγνωσης Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της κάτω αλυσίδας του DNA Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της πάνω αλυσίδας του DNA πλαίσια ανάγνωσης DNA πλαίσια ανάγνωσης Φορά διαβάσματος της αλληλουχίας της κάτω αλυσίδας του DNA
KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA στο εργαστήριο
Πλασμίδια: Οι πιο κοινοί φορείς κλωνοποίησης
Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης
H διαδικασία της κλωνοποίησης δίκλωνο κυκλικό πλασμιδιακό DNA θραύσμα DNA που θα κλωνοποιηθεί ανασυνδυασμένο DNA ΚΟΠΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ DNA ΛΙΓΑΣΗ
Πολλαπλασιασμός των αντιγράφων ενός γονιδίου με κλωνοποίηση Το ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό DNA εισάγεται στο βακτηριακό κύτταρο βακτηριακό κύτταρο καλλιέργεια για τον πολλαπλασιασμό των βακτηριακών κυττάρων Μετά από λύση των βακτηριακών κυττάρων απομονώνονται μεγάλες ποσότητες DNA
Aπαραίτητες ιδιότητες ενός πλασμιδιακού φορέα κλωνοποίησης 1. Aλληλουχίεςέναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή (π.χ. αντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισμού (polylinker) 4. ( Υποκινητής που επιτρέπει ρυθμιζόμενη έκφραση)
Γενωμικές & cdna Bιβλιοθήκες γονίδιο Α χρωμοσωμικό DNA γονίδιο Β γονίδιο Α γονίδιο Β εξόνιο ιντρόνιο μη-μεταγραφόμενο DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΕΨΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ RNA μετάγραφα θραύσματα DNA ΣΥΡΡΑΦΗ (ΜΑΤΙΣΜΑ) ΤΟΥ RNA ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ DNA mrnas ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ & ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ DNA γενωμικοί κλώνοι DNA σε γενωμική βιβλιοθήκη cdna κλώνοι σε βιβλιοθήκη cdna
Τα βήματα της κλωνοποίησης σε πλασμίδιο
Κατασκευή γενωμικών βιβλιοθηκών DNA ανθρώπου ΠΕΨΗ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ εκατομύρια θραύσματα γενωμικού DNA ΤΑ ΘΡΑΥΣΜΑΤΑ ΤΟΥ DNA ΕΝΣΩΜΑΤΩΝΟΝΤΑΙ ΣΕ ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ ανασυνδυασμένα μόρια DNA ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ γενωμική βιβλιοθήκη
Διαδικασία παρασκευής cdna ιστός, π.χ. εγκέφαλος λύση των κυττάρων και απομόνωση mrna mrna υβριδισμός με εκκινητή polydt mrna κατασκευή αντιγράφου DNA με χρήση αντίστροφης μεταγραφάσης κατεργασία με άλκαλι για να αποικοδομηθεί το RNA Το 3 άκρο του cdna σχηματίζει θηλειά σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας DNA με DNA-πολυμεράση, η θηλειά του 3 άκρου δρα ως εκκινητής κατεργασία με νουκλεάση που αποικοδομεί μονόκλωνο DNA για να αποικοδομηθεί η θηλειά δίκλωνο cdna αντίγραφο του αρχικού mrna
Προσανατολισμένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cdna σε πλασμιδιακό φορέα
Bιβλιοθήκες DNA μπορούν να κατασκευασθούν και σε βακτηριοφάγους βακτηριακό χρωμόσωμα βακτηριακό κύτταρο βακτηριφάγος λάμδα πρόσδεση του φάγου στον ξενιστή και «ένεση» του ιικού DNA Ενσωμάτωση του DNA του λ φάγου στο χρωμόσωμα του ξενιστή το DNA του φάγου κυκλοποιείται σύνθεση των ιικών πρωτεϊνών που χρειάζονται για το σχηματισμό νέων ιών κυτταρική διαίρεση βήμα ενεργοποίησης Ταχεία αντιγραφή του DNA του λ φάγου και πακετάρισμα σε πλήρεις ιούς το ενσωματωμένο DNA του λ φάγου αντιγράφεται μαζί με το χρωμόσωμα του ξενιστή σχηματισμός προφάγου (λυσιγονία) λυτική οδός λυτική οδός λύση του κυττάρου και απελευθέρωση μεγάλων ποσοτήτων νέων ιών
Kοσμίδια Τα κοσμίδια είναι πλασμιδιακοί φορείς κλωνοποίησης που περιέχουν μία ή δύο θέσεις cos. (Η θέση cos είναι μία αλληλουχία περίπου 200bp που προέρχεται από τον φάγο λ και η οποία είναι απαραίτητη για το «πακετάρισμα» του DNA σε σωματίδια φάγου). Πως κλωνοποιούμε το DNA σε ένα κοσμίδιο; 1. Χρησιμοποιούμε τη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (polylinker) για να ενθέσουμε θραύσματα DNA που έχουν δημιουργηθεί με πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού. 2. Το DNA πακετάρεται σε φάγους, ακριβώς όπως και το DNA του ίδιου του φάγου. 3. Τα κοσμίδια πολλαπλασιάζονται μέσα στα βακτηριακά κύτταρα όπως και τα πλασμίδια (δηλ. φέρουν γονίδια που προσδίδουν στα κύτταρα αντίσταση σε αντιβιοτικό). 4. Τα κοσμίδια απομονώνονται ακριβώς όπως και τα πλασμίδια. Το πλεονέκτημα τους είναι ότι μπορούν να «πακετάρουν» μέσα στην «κεφαλή» του φάγου μεγαλύτερα σε μέγεθος θραύσματα DNA (40-55 kb of DNA, δηλ. σε κοσμίδια μεγέθους ~5 kb μπορούμε να εισάγουμε ενθέματα 33-50 kb).
Kλωνοποίηση σε κοσμίδια - Παράδειγμα Το κοσμίδιο «κόβεται» με την ενδονουκλεάση BglII σε θέση κοντά στη θέση cos. Το γενωμικό DNA«κόβεται» με την ενδονουκλεάση Sau3A (μερική υδρόλυση), που δημιουργεί συμβατά «κολλώδη» άκρα με την BglII. Τα θραύσματα τα κατεργαζόμαστε με αλκαλική φωσφατάση (ΓΙΑΤΙ;) Το DNA δότης συνδέεται με το DNA δέκτη (κοσμίδιο) με την DNA λιγάση δημιουργώντας εν σειρά συνδέσεις. Το DNA καθαρίζεται με βάση το μέγεθος. Το DNA «πακετάρεται» σε φάγους.
Το DNA των κοσμιδίων «πακετάρεται» σε γραμμική μορφή Θραύσμα προς κλωνοποίηση (35-55bp, κομμένο με BamHI) Προσθήκη λιγάσης και ATP
Κοσμίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ
Πολύπλοκες γενετικές κατασκευές μπορούν να γίνουν με διαδοχικές κλωνοποιήσεις θραυσμάτων DNA πλασμιδιακός φορέας πρώτο ένθεμα δεύτερο ένθεμα τρίτο ένθεμα
ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ» ΦOPEIΣ;
Διάκριση μπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων φορέων
Eντοπισμός ανασυνδυασμένων φορέων με βάση την έκφραση ενός γονιδίου θανάτου Comments for pzero -2.1 3297 nucleotides Lac Promoter/Operator Region: bases 95-216 M13 Reverse Priming Site: bases 205-221 LacZα ORF: bases 217-558 Sp6 Priming Site: bases 239-256 Multiple Cloning Site: bases 269-381 M13 (-20) Forward Priming Site: bases 415-430 M13 (-40) Forward Priming Site: bases 434-450 Fusion Joint: bases 559-567 ccdb Lethal Gene ORF: bases 568-870 f1 origin: bases 895-1307 Kanamycin Resistance ORF: bases 2116-1322 ColE1 origin: bases 2502-3175 Sp6 Nsi I* Hind III Asp718 I Kpn I Ecl136 II Sac I BamH I Spe I EcoR I Pst I EcoR V Not I Xho I Nsi I* Xba I Dra II Apa I BstB I Afl III P lac laczα SnaB I ccdb Stu I ColE1 pzero -2.1 3.3 kb f1 ori Apo I * The two Nsi I sites in the MCS are the only sites in the vector. There are two tandem Apo I sites at this location. Apo I also recognizes the EcoR I site. BspH I Kanamycin A-160319 The sequence of pzero -2.1 has been compiled from information in sequence databases, published sequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an error in the sequence, please contact Invitrogen's Technical Services Department.
Yβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων μονόκλωνοι DNA ανιχνευτές για το γονίδιο Α μίγμα μονόκλωνων μορίων DNA υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιο στους 42 C υβριδισμός σε 50% φορμαμίδιο στους 35 C ο υβριδισμός δεν είναι ακριβής μόνο το Α σχηματίζει σταθερή διπλή έλικα τα Α, C και E σχηματίζουν σταθερές διπλές έλικες
Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς Kλώνους με Yβριδισμό
ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA (πριν την κλωνοποίηση ή και μετά);
Στύπωμα κατά Southern μετά από ανάλυση DNA με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα
Aνίχνευση της μετάλλαξης που προκαλεί δρεπανοκυτταρική αναιμία με υβριδισμό νουκλεϊνικών οξέων φυσιολογική β-σφαιρίνη μετάλλαξη παθολογική β-σφαιρίνη πρωτεΐνη φυσιολογική πρωτεΐνη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ανιχνευτής φυσιολογικού γονιδίου ανιχνευτής μεταλλαγμένου γονιδίου άτομα άτομα ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ Το άτομο 1 έχει δύο φυσιολογικά γονίδια β- σφαιρίνης Το άτομο 2 έχει δύο μεταλλαγμένα γονίδια β-σφαιρίνης Το άτομο 3 έχει ένα φυσιολογικό και ένα μεταλλαγμένο γονίδιο β-σφαιρίνης
Χρήση υβριδισμού νουκλεϊνικών οξέων για τον προσδιορισμό της τοπολογίας των γονιδίων στα χρωμοσώματα
TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)
PCR Η ενίσχυση του DNA in vitro
Η σημασία της θερμικής σταθερότητας της DNA πολυμεράσης στη διαδικασία της PCR Πολυμεράση 3 ->5 εξωνουκλεάση Πηγή και ιδιότητες Taq όχι Προέρχεται από το Thermus aquaticus. Ο χρόνος ημιζωής της στους 95 C είναι 1,6 ώρες Pfu ναι Προέρχεται από το Pyrococcus furiosus. Κάνει τα λιγότερα λάθη σε σχέση µε τις υπόλοιπες θερµοσταθερές DNA πολυµεράσες Vent ναι Προέρχεται από το Thermococcus litoralis (είναι γνωστή και ως Tli πολυµεράση). Ο χρόνος ημιζωής της στους 95 C είναι περίπου 7 ώρες
Ο κύκλος της τεχνικής PCR
Πολλαπλασιασμός του DNA με PCR
Εκθετική αύξηση του DNA κατά την PCR
Μοριακή διαγνωστική με PCR
Μοριακή διαγνωστική με PCR στην ομόλογα χρωμοσώματα ιατροδικαστική εκκινητές PCR Επαναλλαμβανόμενες αλληλουχίες σε θέση VNTR ηλεκτροφορητική ανάλυση πατρικό μητρικό Ηλεκτροφόρηση άτομο A άτομο B άτομο C άτομο F 3 ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων VNTR: Variable Number Tandem Repeat (Μεταβλητός αριθμός ιαδοχικών επαναλήψεων) αριθμός επαναλήψεων Ηλεκτροφόρηση
Aνίχνευση HIV με RT-PCR δείγμα αίματος από μολυσμένο άτομο ελάχιστα ιοσωμάτια HIV στον ορό του μολυσμένου ατόμου Εκχύλιση του ιικού RNA γονιδιώματος Αντίστροφη μεταγραφή/ ενίσχυση με PCR αίμα μη μολυσμένου ατόμου χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή Απομάκρυνση των κυττάρων με φυγοκέντρηση
Xρήση RT-PCR με πολλαπλούς εκκινητές στη μοριακή διαγνωστική μιάς ιογενούς νόσου
H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA κύτταρα απομόνωση DNA απομόνωση RNA mrna που θα κλωνοποιηθεί DNA που θα κλωνοποιηθεί Αποδιάταξη DNA/ προσθήκη εκκινητών Προσθήκη 1 ου εκκινητή, αντίστροφης μεταγραφάσης και νουκλεοτιδίων Αποδιάταξη αλυσίδων & προσθήκη 2 ου εκκινητή Ενίσχυση Ενίσχυση με με PCR PCR Ενίσχυση με με PCR γενωμικοί κλώνοι cdna κλώνοι
Χρήση της PCR πραγματικού χρόνου για ποσοτικές μετρήσεις γενετικού υλικού
Μοριακοί φάροι στην PCR πραγματικού χρόνου
Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση πλασμιδιακός φορέας κλωνοποιημένο φυσιολογικό γονίδιο αποδιάταξη αλυσίδων DNA συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο/ εκκινητής που φέρει την επιθυμητή μετάλλαξη Ολοκλήρωση της σύνθεσης με χρήση DNA πολυμεράσης και DNA λιγάσης Εισαγωγή σε κύτταρα Αντιγραφή και απομόνωση στα θυγατρικά κύτταρα μεταγραφή μετάφραση μεταγραφή μετάφραση τα μισά κύτταρα παράγουν φυσιολογική πρωτεΐνη τα μισά κύτταρα παράγουν μεταλλαγμένη πρωτεΐνη που φέρει αλλαγή σε ένα αμινοξύ
Eισαγωγή κατευθυνόμενων τροποποιήσεων στο γενετικό υλικό Φυσιολογικό γονίδιο Χ Αντικατάσταση γονιδίου Απαλειφή γονιδίου Προσθήκη γονιδίου Μόνο το μεταλλαγμένο γονίδιο εκφράζεται Δεν υπάρχει κανένα ενεργό γονίδιο Εκφράζεται και το φυσιολογικό και το μεταλλαγμένο γονίδιο
Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικών θηλυκό ποντίκι τροποποιημένο γονίδιο με μεθόδους γενετικής μηχανικής εισαγωγή τροποποιημένου γονιδίου στα κύτταρα τα κύτταρα Ένεση κυττάρων ES σχηματίζουν στο πρώιμο αποικίες έμβρυο ζευγάρωμα και αναμονή για 3 μέρες Απομονωμένο πρώιμο έμβρυο αναζήτηση σπάνιων αποικιών που περιέχουν το τροποποιημένο γονίδιο πρώιμο έμβρυο που σχηματίσθηκε μερικώς και από κύτταρα ES εισαγωγή εμβρύου σε ψευδο-εγκύους ποντικούς ES κύτταρα στα οποία ένα από τα δύο αντίγραφα του γονιδίου έχει αντικατασταθεί με την μεταλλαγμένη μορφή Γέννηση ελέγχεται η παρουσία του τροποποιημένου γονιδίου σε σωματικά κύτταρα απογόνων και οι θετικοί απόγονοι διασταυρώνονται Διαγονιδιακός ποντικός με γαμετικά κύτταρα τα οποία περιέχουν και τροποιημένα αντίγραφα του γονιδίου-στόχου
Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας