ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΚΑΡΥΟΤΥΠΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΩΝ & ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΚΑΡΥΟΤΥΠΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΩΝ & ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΔΙΔΑΚΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ Η κατανόηση της μορφής του φυσιολογικού ευκαρυωτικού γονιδιώματος και της οργάνωσής του σε χρωμοσώματα. Η κατανόηση των όρων: ομόλογα χρωμοσώματα, μεταφασικά χρωμοσώματα και η διάκριση των αυτοσωμικών από τα φυλετικά χρωμοσώματα. Η κατανόηση της σημασίας της ταξινόμησης των μεταφασικών χρωμοσωμάτων. Η κατανόηση της διαγνωστικής αξίας του καρυοτύπου μέσω της περιγραφής αυτού, καθώς και της αξιολόγησης και ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Η κατανόηση της γονιδιωματικής αστάθειας των καρκινικών κυττάρων μέσω της παρατήρησης καρυοτύπου καρκινικής κυτταρικής σείρας και σύγκρισής του με φυσιολογικό καρυότυπο. ΣΚΟΠΟΣ της ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Κατασκευή καρυοτύπου φυσιολογικών ανθρώπινων κυττάρων περιφερικού αίματος. Κατασκευή καρυοτύπου καρκινικής κυτταρικής σειράς Κ562. Περιγραφή καρυοτύπου, αξιολόγηση και ερμηνεία αποτελεσμάτων. Προαπαιτούμενες γνώσεις Δομή χρωματίνης. Μιτωτική διαίρεση και μεταβολές του ευκαρυωτικού γονιδιώματος κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες Προτεινόμενη Βιβλιογραφία: 1. Μοριακή Βιολογία του Γονιδίου Τόμος Ι, Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick, Utopia (1η Ελληνική Έκδοση, 6η Αμερικάνικη). 2. Βασικές Αρχές Κυτταρικής Βιολογίας, Alberts 3η Έκδοση. 3. Γενετική από τα γονίδια στα γονδιώματα, Hartwell, Utopia. 1

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ Φυσιολογικό Ευκαρυωτικό Γονιδίωμα Το γονιδίωμα των ευκαρυωτικών κυττάρων αποτελείται από πολυάριθμα γραμμικά και δίκλωνα μόρια DNA, τα οποία αναδιπλώνονται με τη βοήθεια πρωτεϊνών (ιστονών και μη ιστονών) σχηματίζοντας τα χρωμοσώματα. Ο αριθμός και το μήκος των χρωμοσωμάτων είναι χαρακτηριστικά κάθε είδους. Η πλειονότητα των ευκαρυωτικών οργανισμών είναι διπλοειδείς, δηλαδή κάθε χρωμόσωμα βρίσκεται σε δυο αντίγραφα, ένα πατρικής και ένα μητρικής προέλευσης. Τα χρωμοσώματα αυτά θεωρούνται ένα ζεύγος και καλούνται ομόλογα αφού περιέχουν στην ίδια θέση γονίδια που ελέγχουν το ίδιο γνώρισμα με διαφορετικό ενδεχομένως τρόπο (αλληλόμορφα γονίδια). Η οργάνωση του DNA σε χρωμοσώματα εξυπηρετεί σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως: (1) Την αναδίπλωση του γενετικού υλικού προκειμένου να χωρέσει στον περιορισμένο χώρο του πυρήνα, (2) την προστασία του DNA από πιθανές βλάβες, (3) την ακριβοδίκαιη διαίρεση του γενετικού υλικού στα θυγατρικά κύτταρα κατά την μίτωση, (4) την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Η μορφή και η συσπείρωση των χρωμοσωμάτων μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής ενός κυττάρου προκειμένου να εξυπηρετηθούν οι ανάλογες κυτταρικές λειτουργίες. Η αναδίπλωση του DNA επιτυγχάνεται με τον σχηματισμό της χρωματίνης. Η χρωματίνη είναι νουκλεοπρωτεΐνη του ευκαρυωτικού πυρήνα που αποτελείται από DNA, μικρό ποσοστό RNA και πρωτεΐνες σε ποσοστό που ξεπερνά το 50% του βάρους της. Παρατηρούνται δυο βασικές μορφές: η ευχρωματίνη και η ετεροχρωματίνη. Η ευχρωματίνη αποτελεί την λιγότερο συσπειρωμένη μορφή της χρωματίνης και σχετίζεται με μεταγραφικά ενεργά τμήματα του γονιδιώματος. Αντιθέτως, η ετεροχρωματίνη αποτελεί την μέγιστη συσπειρωμένη μορφή του DNA και σχετίζεται με μεταγραφικά ανενεργά τμήματα του γονιδίωματος. Επίπεδα Οργάνωσης της Χρωματίνης Η χρωματίνη παρουσιάζει πολύπλοκη δομή, με πολυάριθμα επίπεδα οργάνωσης. Η συσπείρωση της δίκλωνης έλικας του DNA ξεκινά με την αναδίπλωση του DNA γύρω από θετικά φορτισμένες πρωτεΐνες, τις ιστόνες H2A, H2B, H3, Η4. Δυο αντίγραφα καθεμιάς εξ αυτών συνδέονται σχηματίζοντας ένα οκταμερές ιστονών γύρω από το οποίο αναδιπλώνεται DNA μήκους ~147 ζευγών βάσεων. Η δομή αυτή ονομάζεται νουκλεόσωμα και αποτελεί τη βασική μονάδα οργάνωσης της χρωματίνης. Το μήκος του DNA που αναδιπλώνεται γύρω από το οκταμερές των ιστονών είναι σταθερό χαρακτηριστικό των νουκλεοσωμάτων σε 2

όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Τα νουκλεοσώματα συνδέονται με τμήματα DNA μεταβαλλόμενου μήκους στα διάφορα είδη των οργανισμών (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Αναδίπλωση της δίκλωνης έλικας DNA σε νουκλεοσώματα Εικόνα 2: Σχηματισμός ινιδίων 30nm Μόλις σχηματιστούν τα νουκλεοσώματα, η ιστόνη Η1 προστίθεται στο σχηματισμό. Αλληλεπιδρά με το συνδετικό DNA μεταξύ των νουκλεοσωμάτων, επάγοντας την πιο σφιχτή περιέλιξη του DNA γύρω από το νουκλεόσωμα και αυξάνοντας το μήκος του DNA που είναι τυλιγμένο στενά γύρω από οκταμερές των ιστονών. H ιστόνη Η1 είναι απαραίτητη για τον σχηματισμό του επόμενου επιπέδου οργάνωσης της χρωματίνης που είναι τα ινίδια χρωματίνης ή η ίνα χρωματίνης διαμέτρου 30nm. Τα ινίδια χρωματίνης σχηματίζονται από την αναδίπλωση του συνδετικού DNA με αποτέλεσμα το πακετάρισμα των νουκλεοσωμάτων μεταξύ τους (Εικόνα 2). Αποτελούν το μικρό βαθμό συσπείρωσης του γονιδιώματος και είναι ορατά και in vivo. Σε αυτή την μορφή, η χρωματίνη χαρακτηρίζεται ως ευχρωματίνη. 3

Σε επόμενο στάδιο, τα ινίδια χρωματίνης αναδιπλώνονται ακόμη περισσότερο με τη μορφή θηλειών (βρόγχων) σχηματίζοντας διαδοχικά ίνες διαμέτρου 300nm και εν συνεχεία ίνες πάχους 250nm. Τελικό, αποτέλεσμα της διαδικασίας αυτής είναι να σχηματίζεται η μέγιστη συσπειρωμένη μορφή του DNA, κατά την μετάφαση της μίτωσης. (Εικόνα 3: Επίπεδα Οργάνωσης της Χρωματίνης). Εικόνα 3: Τα επίπεδα οργάνωσης της χρωματίνης Μορφολογικές Μεταβολές των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Η χρωματίνη είναι μια δυναμική δομή και ο βαθμός συσπείρωσης της σχετίζεται άμεσα με την λειτουργικότητα του γενετικού υλικού. Κατά συνέπεια, παρατηρούνται μορφολογικές μεταβολές της χρωματίνης ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκεται ένα παρατηρούμενο κύτταρο. 4

Στη μεσόφαση πριν την αντιγραφή, κάθε ευκαρυωτικό χρωμόσωμα περιλαμβάνει ένα γραμμικό δίκλωνο μόριο DNA, με συσπείρωση ινιδίου χρωματίνης (ευχρωματίνη). Η ευχρωματίνη του μεσοφασικού πυρήνα αποτελείται από πολυάριθμα ινίδια χρωματίνης (διαμέτρου 30nm), τα οποία δεν είναι ορατά σαν μεμονωμένες δομές στο οπτικό μικροσκόπιο, αλλά σχηματίζουν ένα δίκτυο ινιδίων χρωματίνης. Στο στάδιο της αντιγραφής, κάθε ινίδιο χρωματίνης διπλασιάζεται και προκύπτουν δυο πανομοιότυπα αντίγραφα του, οι αδελφές χρωματίδες. Οι αδελφές χρωματίδες συγκρατούνται με μια δομή που ονομάζεται κεντρομερίδιο. Κατά την μιτωτική διαίρεση, τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα συσπειρώνονται σε μεγαλύτερο βαθμό σχηματίζοντας την ετεροχρωματίνη. Η συσπείρωση του γενετικού υλικού κατά την μιτωτική διαίρεση διασφαλίζει την ακριβοδίκαιη διαίρεση του γονιδιώματος στα δυο θυγατρικά κύτταρα. Στην μετάφαση της μίτωσης, τα ευκαρυωτικά χρωμοσώματα έχουν μέγιστο βαθμό συσπείρωσης και είναι ορατά σαν μεμονωμένες δομές στο οπτικό μικροσκόπιο. 5

Εικόνα 4: Μορφολογικές Μεταβολές των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Δομή Μεταφασικών Χρωμοσωμάτων Κάθε φυσιολογικό μεταφασικό χρωμόσωμα αποτελείται από δυο γραμμικά, πανομοιότυπα μόρια DNA με μέγιστη συσπείρωση, τις αδελφές χρωματίδες. Οι αδελφές χρωματίδες συνδέονται στο κεντρομερίδιο. Το κεντρομερίδιο χωρίζει κάθε αδελφή χρωματίδα σε δυο βραχίονες, έναν μεγάλο και ένα μικρό. Τα μεταφασικά χρωμοσώματα ενός κυττάρου διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος, τη θέση του κεντρομεριδίου και το πρότυπο ζωνών που σχηματίζεται ύστερα από χρώση με ειδικές χρωστικές ουσίες πχ χρώση Giemsa (G banding). Στους διπλοειδείς οργανισμούς, τα μεταφασικά χρωμοσώματα είναι ανά δυο όμοια μορφολογικά και αποτελούν ένα ζεύγος ομόλογων χρωμοσωμάτων. Σε κάθε ζεύγος το ένα χρωμόσωμα είναι πατρικής και το άλλο μητρικής προέλευσης. Εικόνα 5: Δομή φυσιολογικού μεταφασικού χρωμοσώματος Εικόνα 6: Ζεύγος Ομόλογων Χρωμοσωμάτων 6

Μελέτη Μεταφασικών Χρωμοσωμάτων Κατασκευή Καρυοτύπου Τα μεταφασικά χρωμοσώματα ενός κυττάρου μπορούν να μελετηθούν με την κατασκευή του καρυοτύπου. Ο καρυότυπος είναι η απεικόνιση των μεταφασικών χρωμοσωμάτων ενός κυττάρου σε ζεύγη κατά ελαττούμενο μέγεθος. Από την μελέτη και την περιγραφή του καρυοτύπου ενός οργανισμού μπορούμε να αντλήσουμε πληροφορίες για: 1. το είδος στο οποίο ανήκει ένας οργανισμός. Ο αριθμός και η μορφολογία των χρωμοσωμάτων είναι χαρακτηριστικά κάθε είδους. 2. το φύλο ενός οργανισμού. Σε ορισμένα είδη συμπεριλαμβανομένου και του ανθρώπου όπου το φύλο ελέγχεται από τα φυλετικά χρωμοσώματα, μέσω της μελέτης του καρυοτύπου είναι δυνατός ο προσδιορισμός του φύλου. 3. την ύπαρξη χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Με τον όρο χρωμοσωμικές ανωμαλίες ονομάζουμε αποκλίσεις που μπορεί να παρατηρηθούν από τον αναμενόμενο φυσιολογικό καρυότυπο ενός είδους και μπορεί να αφορούν α) τον αριθμό των χρωμοσωμάτων (αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες) ή/και β) την δομή των χρωμοσωμάτων (δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες) Η μελέτη των χρωμοσωμάτων είναι δυνατή μόνο σε διαιρούμενα κύτταρα κατά το στάδιο της μετάφασης, όπου τα χρωμοσώματα χαρακτηρίζονται από μέγιστη συσπείρωση και είναι ορατά σαν μεμονωμένες δομές στο οπικό μικροσκόπιο. Η εργαστηριακή διαδικασία κατασκευής καρυοτύπου ξεκινά με τη λήψη του προς εξέταση δείγματος. Ακολουθεί εγκαθίδρυση κυτταροκαλλιεργειών και επώασή τους σε κλίβανο CO 2, θερμοκρασία 37 C και σχετική υγρασία, με την προσθήκη ουσιών με μιτογόνο δράση πχ αιματογλουτινίνη για τα λεμφοκύτταρα. Η ανάπτυξη των κυτταροκαλλιεργειών ελέγχεται στο ανάστροφο μικροσκόπιο και όταν ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων φτάσει το επιθυμητό επίπεδο γίνεται προσθήκη ουσιών σε κάθε καλλιέργεια που σταματούν την κυτταρική διαίρεση στο στάδιο της μετάφασης πχ κολχικίνης. Στόχος είναι τα διαιρούμενα κύτταρα να 7

παραμείνουν στο στάδιο της μετάφασης, οπότε τα χρωμοσώματα να είναι αρκετά συμπυκνωμένα για να είναι ορατά με το οπτικό μικροσκόπιο. Συνοπτικά, μετά την προσθήκη κολχικίνης γίνεται η συγκομιδή των χρωμοσωμάτων (Chromosome harvesting). Τα κύτταρα μεταφέρονται από τη φιάλη καλλιέργειας σε κατάλληλο φιαλίδιο, φυγοκεντρούνται και γίνεται επεξεργασία τους με υπότονο διάλυμα KCl, οπότε απελευθερώνονται τα χρωμοσώματα και μονιμοποιούνται με διάλυμα μεθανόλης και οξικού οξέος. Στη συνέχεια γίνεται επίστρωση των χρωμοσωμάτων σε αντικειμενοφόρους πλάκες και χρώση των παρασκευασμάτων με συγκεκριμένες χρωστικές για τη δημιουργία των ζωνών πχ χρώση Giemsa (G banding). Ακολουθεί παρατήρηση στο μικροσκόπιο και ανάλυση του αριθμού και της δομής των χρωμοσωμάτων για κάθε κύτταρο που ελέγχεται. Μελέτη Περιγραφή Καρυοτύπου Μετά την κατασκευή του καρυοτύπου ακολουθεί η περιγραφή του σύμφωνα με τους κανόνες του συστήματος διεθνούς ονοματολογίας κυτταρογενετικής του ανθρώπου (International System for Human Cytogenetic Nomenclature ISCN) του 2013. Αρχικά, τα μεταφασικά χρωμοσώματα αναγνωρίζονται και ταξινομούνται με βάση τα ακόλουθα μορφολογικά χαρακτηριστικά: 1. Μέγεθος. 2. Θέση κεντρομεριδίου: Με βάση τη θέση του κεντρομεριδίου τα χρωμοσώματα διακρίνονται σε: μετακεντρικά: το κεντρομερίδιο βρίσκεται στη μέση του χρωμοσώματος και χωρίζει το χρωμόσωμα σε δύο σχεδόν ισομεγέθεις βραχίονες (p και q), υπομετακεντρικά: το κεντρομερίδιο χωρίζει το χρωμόσωμα σε δύο ανισομεγέθεις βραχίονες, έναν μικρό (p petit) και έναν μεγάλο (q queue), ακροκεντρικά: τo κεντρομερίδιο βρίσκεται σχεδόν στο ένα άκρο του χρωμοσώματος. 8

Εικόνα 7: Κατηγορίες χρωμοσωμάτων. Με βάση τη θέση του κεντρομεριδίου τα χρωμοσώματα διακρίνονται σε: (α) μετακεντρικά, (β) υπομετακεντρικά και (γ) ακροκεντρικά. Κάθε χρωμόσωμα διακρίνεται επίσης με βάση το δικό του ξεχωριστό πρότυπο εναλλασσόμενων σκουρόχρωμων και ανοιχτόχρωμων ταινιών (πρότυπο ζώνωσης). Φωτογραφία: Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής Πανεπιστημίου Αθηνών, διανέμεται με την άδεια Creative Commons Αναφορά Δημιουργού Μη Εμπορική Χρήση Παρόμοια Διανομή 4.0 (CC BY NC SA). 3. Πρότυπο ζώνωσης. Με την εφαρμογή συγκεκριμένων τεχνικών χρώσης, διαμορφώνεται κατά μήκος κάθε χρωμοσώματος ένα μοναδικό πρότυπο εναλλασσόμενων σκουρόχρωμων και ανοιχτόχρωμων ταινιών (ζωνών), με βάση το οποίο κάθε χρωμόσωμα ξεχωρίζει από τα υπόλοιπα και ταυτοποιείται. Ταινία ή ζώνη (Band) ορίζεται το τμήμα εκείνο του χρωμοσώματος που διακρίνεται καθαρά από τα διπλανά του με κριτήριο τη σκοτεινότερη ή φωτεινότερη έντασή του. Τα επιμέρους πρότυπα ζώνωσης για κάθε χρωμόσωμα είναι καταχωρημένα και απεικονίζονται με ιδεογράμματα στο διεθνώς αποδεκτό σύστημα ονοματολογίας ISCN 2013. Για την ολοκλήρωση της κυτταρογενετικής ανάλυσης ενός δείγματος και την περιγραφή του καρυότυπου απαιτείται η ανάλυση ικανού αριθμού μεταφάσεων. Η καταγραφή του καρυότυπου ξεκινά με τον αριθμό των χρωμοσωμάτων (π.χ. 46). Ακολουθεί σημείο στίξης (κόμμα) και χωρίς διάστημα καταγράφεται η σύνθεση των φυλετικών χρωμοσωμάτων (π.χ. 46,ΧΧ). Ακολουθούν τυχόν αριθμητικές ή δομικές ανωμαλίες (π.χ.+21: υπεράριθμο χρωμόσωμα 21). Σημειώνεται ότι πρέπει να ακολουθούνται όλοι οι κανόνες για την ορθή καταγραφή του καρυότυπου και των χρωμοσωμικών ανωμαλιών, όπως αυτοί υποδεικνύονται από το διεθνώς αποδεκτό σύστημα ονοματολογίας ISCN 2013. Πρότυπο ζώνωσης Τα χρωμοσώματα όταν χρωματίζονται με βασικές χρωστικές που δε δίνουν ζωνώσεις χρωματίζονται ομοιόμορφα, γεγονός που δυσχεραίνει την ταυτοποίηση και ταξινόμησή τους. Η ανακάλυψη τεχνικών χρώσης των χρωμοσωμάτων που δίνουν ζωνώσεις κατέστησε δυνατή την εκτενέστερη μελέτη των μεταφασικών χρωμοσωμάτων. 9

Μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί περισσότερες από 15 τεχνικές χρώσης των χρωμοσωμάτων, που κάθε μία δίνει ιδιαίτερο πρότυπο ζωνώσεων στα μεταφασικά χρωμοσώματα. Το πρότυπο ζωνώσεων που δίνει κάθε χρώση είναι συγκεκριμένο για κάθε χρωμόσωμα ενός είδους. Έτσι, η ανακάλυψη αυτών των τεχνικών επέτρεψε την αξιόπιστη αναγνώριση των μεταφασικών χρωμοσωμάτων και τη διάγνωση δομικών χρωμοσωματικών ανωμαλιών,π.χ. αναστροφές, μετατοπίσεις. Οι τεχνικές χρώσης μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο ομάδες. Σε εκείνες που δίνουν ζωνώσεις κατανεμημένες σε όλο το μήκος του χρωμοσώματος (ζώνες Q, G, R) και σε εκείνες που χρωματίζουν ορισμένες περιοχές του χρωμοσώματος (ζώνες C, NOR). Ζωνώσεις G: Η τεχνική χρώσης G των χρωμοσωμάτων αποτελεί την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Σε αυτήν γίνεται επίδραση με πρωτεολυτικά ένζυμα ή άλλα αντιδραστήρια πάνω σε παρασκευάσματα μεταφασικών χρωμοσωμάτων με σκοπό την μερική πέψη των πρωτεϊνών της χρωματίνης. Ακολουθεί χρώση των χρωμοσωμάτων με χρωστική Giemsa,που δίνει σε κάθε χρωμόσωμα ένα χαρακτηριστικό και επαναλαμβανόμενο πρότυπο ανοιχτόχρωμων και σκουρόχρωμων ζωνών. Οι σκουρόχρωμες περιοχές αντιπροσωπεύουν περιοχές πλούσιες σε ΑΤ που αντιγράφονται αργά και δεν έχουν πολλά γονίδια. Αντίθετα, οι ανοιχτόχρωμες περιοχές αντιπροσωπεύουν περιοχές οι οποίες είναι πλούσιες σε CG, αντιγράφονται νωρίς και είναι πλούσιες σε γονίδια. Ιδεόγραμμα Ονοματολογία 10

Tο πρότυπο ζωνώσεων που δίνει κάθε τεχνική είναι συγκεκριμένο για κάθε είδος. Εξετάζοντας λοιπόν τον καρυότυπο ενός ατόμου μπορούν να διαπιστωθούν δομικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες (αναδιατάξεις) από τις αλλαγές στο πρότυπο ζωνώσεων. Για την εύκολη και ακριβή περιγραφή τέτοιων ανωμαλιών δημιουργήθηκε ένα σύστημα ονοματολογίας που χρησιμοποιείται διεθνώς. Αυτό προτάθηκε από ομάδα κυτταρογενετιστών, σε διεθνή συνδιάσκεψη που πραγματοποιήθηκε στο Παρίσι το 1971. Σύμφωνα με το σύστημα ονοματολογίας του Παρισιού, για να περιγραφεί μία χρωμοσωμική ζώνη πρέπει να δηλωθούν με τη σειρά : 1. Ο αριθμός του χρωμοσώματος 2. Ο χρωμοσωμικός βραχίονας (p ή q) 3. Ο αριθμός της περιοχής 4. Ο αριθμός της ζώνης μέσα στην περιοχή Για παράδειγμα, συμβολίζεται 1p3.2 η ζώνη που βρίσκεται στο πρώτο χρωμόσωμα, στον μικρό βραχίονα, στην τρίτη περιοχή και είναι η 2 ζώνη. Το σύστημα αυτό βελτιώθηκε αργότερα και το 1977 στη Στοκχόλμη συνήλθε διεθνής επιτροπή κυτταρογενετιστών που πρότεινε το «διεθνές σύστημα ονοματολογίας στην κυτταρογενετική του ανθρώπου» ή αλλιώς ISCN 1978. Το σύστημα αυτό περιέχει σύμβολα και συντμήσεις για την περιγραφή των φυσιολογικών ανθρώπινων χρωμοσωμάτων και των χρωμοσωματικών ανωμαλιών. (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 2003). Με τη βελτίωση των τεχνικών και την ανάλυση περισσότερων ζωνών, καθώς και με την ανακάλυψη νέων ανωμαλιών και τεχνικών ανάλυσης το σύστημα ονοματολογίας έχει υποστεί πολλές τροποποιήσεις. Σήμερα, χρησιμοποιείται το «διεθνές σύστημα ονοματολογίας στην κυτταρογενετική του ανθρώπου» που δημοσιεύθηκε το 2005 (ISCN, 2005) (Shaffer & Tommerup, 2005) (Πίνακας 2.1). Κανόνες ονοματολογίας του ISCN συστήματος αρίθμησης 1. Η αρίθμηση των χρωμοσωμάτων ξεκινά από το κεντρομερίδιο. 2. Ο κοντός βραχίονας του χρωμοσώματος χαρακτηρίζεται σαν μικρός (p) και ο μακρύς σαν μεγάλος (q). Έτσι, η αρίθμηση των χρωμοσωμικών περιοχών που βρίσκονται στον μικρό βραχίονα ξεκινά με το πρόθεμα p ενώ αυτών που βρίσκονται στον μεγάλο βραχίονα με το πρόθεμα q. 3. Κατά σύμβαση, ο μικρός βραχίονας απεικονίζεται πάντα στο πάνω μέρος του χρωμοσώματος. 4. Κάθε βραχίονας υποδιαιρείται σε περιοχές, η αρίθμηση των οποίων ξεκινά από το κεντρομερίδιο. 5. Ανάλογα με την χρώση μπορεί να είναι δυνατή η ανίχνευση επιπλέον ζωνών μέσα σε κάθε περιοχή, οι οποίες αριθμούνται με την προσθήκη ενός ψηφίου στον αριθμό της περιοχής. 11

Ιδεόγραμμα ζωνώσεων Giemsa του υπομετακεντρικού μεσαίου μεγέθους χρωμοσώματος 12. Η θέση του κεντρομεριδίου διαχωρίζει το μικρό (p) και το μεγάλο βραχίονα (q) (σκιαγραφημμένη περιοχή). Το συγκεκριμένο ιδεόγραμμα αναπαριστά το πρότυπο των ζωνώσεων G χαμηλής ανάλυσης του χρωμοσώματος 12 (περίπου 400 ζώνες ανα καρυότυπο). Στην συγκεκριμένη ανάλυση ο μεγάλος βραχίονας q υποδιαιρείται σε δυο κύριες περιοχές: την 12q1 και 12q2, Η περιοχή 12q1 υποδιαιρείται περαιτέρω σε πέντε υποπεριοχές: 12q11 έως 12q15, καθεμία από τις οποίες αντιστοιχεί σε μια ζώνη ανιχνεύσιμη από την χρωστική Giemsa. H πιο απομακρυσμένη περιοχή 12q2 υποδιαιρείται στις υποπεριοχές 12q21 έως 12q24. Η υποπεριοχή 12q24 υποδιαιρείται περαιτέρω 12q24.1 έως 12q24.3. Ιδεόγραμμα ζωνώσεων Giemsa του υπομετακεντρικού μεσαίου μεγέθους χρωμοσώματος 12 σε υψηλότερη ανάλυση. Όταν τα χρωμοσώματα βρίσκονται στην προμετάφαση είναι λιγότερο συμπυκνωμένα από τα μεταφασικά χρωμοσώματα. Σε αυτήν την υψηλότερη ανάλυση διακρίνονται περίπου 850 ζώνες ανά καρυότυπο. 12

Είδη χρωμοσωμικών ανωμαλιών Οποιαδήποτε αλλαγή των χρωμοσωμάτων σε σχέση με το φυσιολογικό χαρακτηρίζεται ως χρωμοσωμική ανωμαλία. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες διακρίνονται σε αριθμητικές και δομικές. Αρκετές φορές οι χρωμοσωμικές αλλαγές μπορεί να είναι αρκετά πολύπλοκες και να διαταράσσουν το ισοζύγιο του γενετικού υλικού στο κύτταρο (για παράδειγμα παράγωγα χρωμοσώματα derivative chromosomesκ.ά.). Επίσης, σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να παρατηρηθεί το φαινόμενο του μωσαϊκισμού (Mosaicism). Μωσαϊκισμός είναι το φαινόμενο κατά το οποίο στο ίδιο δείγμα η κυτταρογενετική ανάλυση εντοπίζει δύο ή και περισσότερους κυτταρικούς πληθυσμούς με διαφορετική χρωμοσωμική σύσταση. Οποιαδήποτε απόκλιση από τον φυσιολογικό αριθμό των χρωμοσωμάτων χαρακτηρίζεται αριθμητική ανωμαλία. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών είναι η τρισωμία 21 (σύνδρομο Down), το σύνδρομο Klinefelter (47,ΧΧΥ), το σύνδρομο Turner (45,Χ) κ.ά. Οποιαδήποτε απόκλιση της δομής των χρωμοσωμάτων από το φυσιολογικό πρότυπο χαρακτηρίζεται δομική ανωμαλία. Οι δομικές ανωμαλίες μπορεί να είναι ισοζυγισμένες (όταν δεν διαταράσσουν το ποσοτικό ισοζύγιο του γενετικού υλικού στο κύτταρο) ή μη ισοζυγισμένες (όταν διαταράσσουν το ποσοτικό ισοζύγιο του γενετικού υλικού στο κύτταρο). Διάφοροι τύποι δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών είναι: 1. Μετατόπιση (Translocation t): Είναι η ανταλλαγή χρωμοσωμικών τμημάτων μετξύ μη ομόλογων ή ομόλογων χρωμοσωμάτων. Η μετατόπιση ροβερτιανού τύπου (Robertsonian translocation rob) είναι ένας ειδικός τύπος μετατόπισης που αφορά τα ακροκεντρικά χρωμοσώματα (13,14, 15, 21, 22). Από τη μετατόπιση ροβερτιανού τύπου μεταξύ δυο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων προκύπτει ένα μεγάλο χρωμόσωμα, το οποίο κατά κύριο λόγο αποτελείται από τους δύο μεγάλους βραχίονες των ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων που μέσω της μετατόπισης συνενώθηκαν. 2. Αναστροφή (Inversion inv): Είναι η θραύση ενός τμήματος του χρωμοσώματος σε συγκεκρικμένη θέση και η επανένωσή του μετά από αναστροφή. Οι αναστροφές διακρίνονται σε περικεντρικές (όταν η χρωμοσωμική περιοχή που αναστρέφεται περιλαμβάνει και το κεντρομερίδιο) και παρακεντρικές 13

(όταν η χρωμοσωμική περιοχή που αναστρέφεται δεν περιλαμβάνει το κεντρομερίδιο). 3. Έλλειψη (Deletion del): Συμβαίνει όταν ένα τμήμα του χρωμοσώματος αποκόπτεται και χάνεται (απαλείφεται). 4. Διπλασιασμός (Duplication dup): Συμβαίνει όταν ένα τμήμα του χρωμοσώματος διπλασιάζεται. 5. Ένθεση (Insertion ins): Συμβαίνει όταν σε συγκεκριμένο σημείο του χρωμοσώματος εισέρχεται ένα τμήμα άλλου χρωμοσώματος. Εκτός από τις παραπάνω κατηγορίες χρωμοσωμικών ανωμαλιών, αξίζει επίσης να αναφερθούν τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα (Ring chromosomes), όπου το ανώμαλο χρωμόσωμα έχει μορφή δακτυλίου, καθώς και τα ισοχρωμοσώματα (Isochromosomes), όπου το ανώμαλο χρωμόσωμα αποτελείται από δύο ίδιους βραχίονες. Ανθρώπινο Φυσιολογικό Γονιδίωμα Το φυσιολογικό ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται από 46 χρωμοσώματα συνολικού μήκους 6*10 9 ζευγών βάσεων. Ο ανθρώπινος καρυότυπος περιλαμβάνει 23 ζεύγη χρωμοσωμάτων, εκ των οποίων τα 22 ζεύγη είναι όμοια μορφολογικά σε αρσενικά και θηλυκά άτομα και ονομάζονται αυτοσωμικά. Το 23ο ζεύγος διαφέρει ανάλογα με το φύλο και ονομάζεται φυλετικό. Τα φυλετικά χρωμοσώματα είναι το Χ και το Υ, με το Χ να είναι μεγαλύτερο σε μέγεθος του Υ. Η παρουσία του Υ καθορίζει το αρσενικό φύλο και η απουσία του το θηλυκό. Στα φυσιολογικά θηλυκά άτομα, το ζεύγος των φυλετικών χρωμοσωμάτων αποτελείται από δυο Χ χρωμοσώματα που είναι όμοια μορφολογικά, ενώ στα αρσενικά από ένα Χ και ένα Υ που είναι ανόμοια. Το Υ είναι μικρότερο σε μέγεθος από το Χ. Με βάση το μήκος και τη θέση του κεντρομεριδίου, τα μεταφασικά χρωμοσώματα του ανθρώπου ταξινομούνται σε 7 ομάδες (A, B, C, D, E, F, G). Ομάδα A: Χρωμοσώματα 1 3 είναι μεγαλύτερα και μετακεντρικά. Ομάδα B: Χρωμοσώματα 4 5 είναι μεγάλα και υπομετακεντρικά. Ομάδα C: Χρωμοσώματα 6 12 είναι μεσαίου μεγέθους και υπομετακεντρικά. Ομάδα D: Χρωμοσώματα 13 15 είναι μεσαίου μεγέθους και ακροκεντρικά. Ομάδα E: Χρωμοσώματα 16 18 είναι μικρού μεγέθους μετακεντρικά ή υπομετακεντρικά. Ομάδα F: Χρωμοσώματα 19 20 είναι μικρού μεγέθους και μετακεντρικά. Ομάδα G: Χρωμοσώματα 21 22 είναι πολύ μικρού μεγέθους και ακροκεντρικά. Χρωμόσωμα X προσομοιάζει με τα χρωμοσώματα της ομάδας C. Χρωμόσωμα Y προσομοιάζει με τα χρωμοσώματα της ομάδας G. 14

Καρκινικό Γονιδίωμα Ο καρκίνος είναι μια μη φυσιολογική κατάσταση κατά την οποία τα κύτταρα παρουσιάζουν ανεξέγκτο πολλαπλασιασμό και απορρύθμιση βασικών κυτταρικών λειτουργιών, όπως η απόπτωση και η γονιδιακή ρύθμιση. Η καρκινογένεση αποδίδεται σε συσσώρευση βλαβών στο επίπεδο του DNA και συνδέεται με την εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας. Ο όρος γονιδιωματική αστάθεια χρησιμοποιείται για να περιγράψει την κατάσταση, κατά την οποία εμφανίζεται αυξημένος ρυθμός μεταλλαξιγένεσης στο γονιδίωμα. Ένα τύπος γονιδιωματικής αστάθειας είναι η χρωμοσωμική αστάθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από χρωμοσωμικές ανωμαλίες δηλαδή μεταβολές στον αριθμό και την μορφολογία των χρωμοσωμάτων στον καρυότυπο. Ο καρυότυπος των καρκινικών κυττάρων χαρακτηρίζεται από έντονη χρωμοσωμική αστάθεια, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την εμφάνιση ανευπλοειδειας ή /και πολυπλοειδίας (δηλαδή μεταβολής σε μικρό ή/και μεγάλο αριθμό χρωμοσωμάτων, αντιστοίχως), καθώς και δομικών χρωμοσωμικών μεταλλάξεων. Παρά την μεγάλη ετερογένεια και παρατηρούμενη γονιδιωματική αστάθεια των καρκινικών καρυοτύπων, καθένας παρουσιάζει σχετική σταθερότητα χαρακτηρίζοντας έναν κλώνο καρκινικών κυττάρων. Καρκινική κυτταρική σειρά Κ562 Η καρκινική κυτταρική σειρά Κ562 προέρχεται από πρωτογενή καρκινικά λεμφοκύτταρα ασθενούς με χρόνια μυελογενή λευχαιμία (Cronic Myeloid Leukemia CML). Ο καρυότυπος του πρωτογενούς καρκινικού δείγματος χαρακτηριζόταν από ένα χρωομόσωμα Philadelphia και ένα μακρύ ακροκεντρικό χρωμόσωμα δείκτη σε όλα τα κύτταρα. Η αρχική καρκινική σειρά χαρακτηριζόταν από φυσιολογικό αριθμό μεταφασικών χρωμοσωμάτων δλδ 46, μια μετατόπιση t(15;17)(q21;q24) και ένα χρωμόσωμα Philadelphia, ωστόσο κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας εμφανίστηκαν επιπρόσθετες χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Μετά από 10 ανακαλλιέργειες (passage 10), τα περισσότερα κύτταρα παρουσιάζαν έναν υπερ διπλοειδή καρυότυπο με 50 52 χρωμοσώματα. Μετά από 110 ανακαλλιέργειες (passage 110) προέκυψαν δυο υπότυποι της καρκινικής κυτταρικής σειράς, ένας σχεδόν τριπλοειδής με 69 73 χρωμοσώματα και ένας σχεδόν τετραπλοειδής με 90 96 χρωμοσώματα. Η μελέτη των ζωνών των χρωμοσωμάτων μετά από χρώση αποκάλυψε την ύπαρξη επιπλέον δομικών χρωμοσωμικών αλλοιώσεων οι οποίες αναπτύχθηκαν σταδιακά κάτα την in vitro ανακαλλιέργεια των κυττάρων. 15

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΟΡΓΑΝΑ / ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ 1. Ψυχόμενη φυγόκεντρο 2. Οπτικό μικροσκόπιο 3. Κλίβανος επώασης ΥΛΙΚΑ Κολχικίνη 10μg/ml Giemsa stain (Gurr's, Biomedical Specialties cat. #35086 16

Phosphate buffer ph 6.8 (Gurr's tablets, Biomedical Specialties cat.#33199 ΠΟΡΕΙΑ Διάλυμα Εργασίας : 4mL Giemsa; 96mL phosphate buffer ph 6.8. Προετοιμασία θρεπτικού υλικού καλλιέργειας κυττάρων περιφερικού αίματος Τα κύτταρα περιφερικού αίματος καλλιεργούνται σε RPMI 1640, 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% glutamine(0.2 M) 1% penicillin (500units/ml) streptomycin (500units/ml), 2% PHA. Για την παρασκευή 500ml θρεπτικού υλικού αναμειγνύονται: 450ml RPMI 1640 50ml FBS (Fetal Bovine Serum) 5 ml penicillin (500units/ml) streptomycin (500units/ml) 5 ml glutamine(0.2 M) Καλή ανάδευση και διαχωρισμός σε αποστειρωμένα σωληνάρια (10ml/σωληνάριο). Προσθήκη 0,2 ml PHA σε κάθε σωληνάριο. Αποθήκευση στους 4 ο C μέχρι και 2 εβδομάδες. Λήψη βιολογικού δείγματος Έκλπυση σύρριγγας 10ml με αντιπηκτικό. Λήψη 1 2mL περιφερικού φλεβικού αίματος. Τοποθέτηση σε αποστειρωμένο σωληνάριο με αντιπηκτικό. Καλή ανάδευση του αίματος με το αντιπηκτικό προς αποφυγή θρόμβων. Φύλαξη στους 4 ο C μέχρι και 7 ώρες. Κατασκευή Καρυοτύπου 1. Καλή ανακίνηση του δείγματος αίματος. 2. Προσθήκη 10mL θρεπτικού υλικού. 3. Επώαση σε επωαστικό κλίβανο 5%CO 2, κορεσμό υγρασίας και 37 ο C για 72 ώρες. 4. 70 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας ακολουθεί προσθήκη 120μl κολχικίνης (τελική συγκέντρωση 0,1μg/ml). 5. Επώαση για άλλες 2 ώρες στους 37 ο C. 17

6. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας για 5 10min στις 1200rpm και θερμοκρασία δωματίου. Απόρριψη του υπερκείμενου. 7. Προσθήκη 6ml (0,5V:1V καλλιέργειας) προθερμασμένου υποτονικού διαλύματος KCl (0,075M) και επώαση για 15min στους 37 ο C. 8. Φυγοκέντρηση για 8 10min στις 1200rpm, σε θερμοκρασία δωματίου και αφαίρεση του υπερκείμενου. 9. Μονιμοποίηση του ιζήματος σε παγωμένο μείγμα 20 30ml μεθανόλης οξικού οξέος 3:1. 10. Επώαση σε πάγο για 5min. 11. Επίστρωση των κυττάρων σε αντικειμενοφόρο πλάκα προσεκτικά καθαρισμένη (φύλαξη σε παγωμένη αιθανόλη στους 20 ο C. Η επίστρωση παραγματποιείται με τη ρήψη σταγόνων κυττάρων από κατάλληλο ύψος έτσι ώστε να σπάσουν τα κύτταρα και να απλωθούν τα χρωμοσώματα στην αντικειμενοφόρο πλάκα. 12. Χρώση με χρωστική Giemsa για 6 7min. Περιγραφή καρυότυπου Στο πρακτικό μέρος της άσκησης θα περιγράψουμε τον καρυότυπο που κατασκευάστηκε ακολουθώντας τα παρακάτω βήματα: 1. Επιλογή μιας μετάφασης με ευδιάκριτα χρωμοσώματα. 2. Μετράμε τα χρωμοσώματα που βλέπουμε στη μετάφαση και σημειώνουμε τον αριθμό τους. 3. Για να διευκολυνθούμε στην καταμέτρηση χωρίζουμε τη μετάφαση σε μικρούς κύκλους και μετράμε πόσα χρωμοσώματα περιέχει κάθε κύκλος. Στο τέλος αθροίζουμε τον αριθμό των χρωμοσωμάτων που μετρήσαμε σε κάθε κύκλο, ώστε να προκύψει ο συνολικός αριθμός χρωμοσωμάτων που περιέχει η μετάφαση. Καταγράφουμε τον αριθμό. 4. Αναζητούμε τα φυλετικά χρωμοσώματα Χ και Υ. Ως οδηγός για την αναγνώριση κάθε χρωμοσώματος χρησιμοποιούνται τα αντίστοιχα ιδεογράμματα που είναι καταχωρημένα στο διεθνώς αποδεκτό σύστημα 18

ονοματολογίας ISCN 2013. Σημειώνουμε τη σύνθεση των χρωμοσωμάτων φύλου μετά τον χρωμοσωμικό αριθμό που διαπιστώσαμε στο προηγούμενο βήμα, αφού προηγηθεί ως σημείο στίξης το κόμμα (χωρίς κενό διάστημα). 5. Εντοπίζουμε τα ομόλογα χρωμοσώματα με βάση τα αντίστοιχα ιδεογράμματα και αναζητούμε πιθανές δομικές ανωμαλίες. Για καθένα ελέγχουμε εάν η δομή είναι φυσιολογική ή εάν υπάρχει κάποια απόκλιση από το φυσιολογικό πρότυπο ζώνωσης με βάση το αντίστοιχο ιδεόγραμμα της ISCN (http://atlasgeneticsoncology:org/iscn09/iscn09:html). 6. Κατά την περιγραφή του καρυότυπου, αν υπάρχει αριθμητική ανωμαλία, για παράδειγμα ένα υπεράριθμο χρωμόσωμα 21, αυτή καταγράφεται μετά από τα φυλετικά χρωμοσώματα, αφού μεσολαβήσει κόμμα και χωρίς διάστημα (47,ΧΧ,+21). Αν υπάρχει δομική ανωμαλία, όπως για παράδειγμα μετάθεση, ακολουθούνται οι κανόνες του διεθνούς συστήματος ονοματολογίας ISCN 2013. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΑΥΤΟΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ 1. Στο διάγραμμα απεικονίζονται πέντε μεταφασικά χρωμοσώματα από το γονιδίωμα διαφορετικών ανθρώπων αρσενικού φύλου. Ομόλογα χρωμοσώματα μπορούν να είναι τα: α. 1 και 2 β. 1 και 3 γ. 2 και 4 δ. 2 και 5 Τα χρωμοσώματα 3 και 5 είναι: α. γεννητικά 19

β. αυτοσωμικά γ. φυλετικά δ. σωματικά 2. Κατά την κατασκευή του καρυοτύπου ενός ασθενούς διαπιστώσατε ότι αυτός φέρει τρία χρωμοσώματα 21. Ποιος από τους παρακάτω καρυοτύπους αντιστοιχεί στον παραπάνω ασθενή; 3. Λαμβάνοντας υπόψη τον παρακάτω καρυότυπο να απαντήσετε στις ερωτήσεις που ακολουθούν. 20

α) Ο καρυότυπος αυτός ανήκει σε αρσενικό ή θηλυκό άτομο; Αιτιολογήστε. β) Από τον παραπάνω καρυότυπο απομονώθηκε ένα μόριο DNA και μελετήθηκε. i) Πόσα άλλα μόρια DNA με όμοιο μήκος υπάρχουν στον καρυότυπο. Να αιτιολογήσετε την απάντησή σας. ii) Πόσα από αυτά τα μόρια φέρουν την ίδια ακριβώς ακολουθία βάσεων με το μόριο που απομονώθηκε και μελετήθηκε; 4. Τα νουκλεοσώματα α. είναι ορατά στο οπτικό μικροσκόπιο ύστερα από ειδική επεξεργασία. β. αποτελούνται από 146 ζεύγη βάσεων. γ. αποτελούν τη βασική μονάδα οργάνωσης της χρωματίνης. δ. αναδιπλώνονται με τη βοήθεια πρωτεϊνών που λέγονται ιστόνες. 5. Τα ινίδια χρωματίνης α. είναι ορατά στο οπτικό μικροσκόπιο κατά τη μετάφαση. β. αποτελούνται από DNA και πρωτεΐνες. γ. διπλασιάζονται κατά τη μετάφαση της μιτωτικής διαίρεσης. δ. αποτελούνται πάντα από δύο αδελφές χρωματίδες ενωμένες στο κεντρομερίδιο. 6. Τα ινίδια χρωματίνης α. διπλασιάζονται κατά τη μετάφαση της μιτωτικής διαίρεσης. β. αποτελούν την περισσότερο συσπειρωμένη μορφή του γενετικού υλικού. γ. αποτελούνται από DNA και ιστόνες. δ. σχηματίζονται από το πακετάρισμα των νουκλεοσωμάτων. 7. Υψηλός βαθμός συσπείρωσης του DNA παρατηρείται α. κατά την αντιγραφή του DNA. β. στο τέλος της μίτωσης. γ. στο στάδιο της μετάφασης. δ. στη μεσόφαση. 8. Το γενετικό υλικό ενός ευκαρυωτικού κυττάρου εμφανίζεται με διαφορετικές μορφές ανάλογα: α. Με το αν είναι κύτταρο μονοκύτταρου ή πολυκύτταρου οργανισμού. 21

β. Με το αν βρίσκεται σε σωματικό ή γεννητικό κύτταρο. γ. Με το στάδιο του κυτταρικού κύκλου. δ. Τίποτε από τα παραπάνω. 9. Η μελέτη των χρωμοσωμάτων είναι δυνατή α. Σε οποιοδήποτε κύτταρο. β. Σε κύτταρα που προέρχονται είτε από ιστούς που διαιρούνται φυσιολογικά, είτε από κυτταροκαλλιέργειες όπου γίνεται in vivo επαγωγή της διαίρεσης με χημικές ουσίες που έχουν μιτογόνο δράση. γ. Κατά τη διάρκεια της μεσόφασης. δ. Τίποτε από τα παραπάνω. 10. Από τη μελέτη του καρυοτύπου μπορούμε α. Να μετρήσουμε τον αριθμό των χρωμοσωμάτων. β. Να βρούμε το φύλο του ατόμου. γ. Να ελέγξουμε πόσα πλασμίδια περιέχει ένα βακτήριο. δ. Τα α και β. 11. Να περιγράψετε τους παρακάτω καρυοτύπους (Α Γ). 22

23