ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 9 η Ενότητα: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Κατερίνα Κωνσταντίνου, PhD Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστήμιο Πατρών Εαρινό Εξάμηνο Ακαδ. Έτος 2016-2017
Σύνοψη Πειραματικά πρότυπα μελέτης της κινητικής συμπεριφοράς Α) η πειραματική διάταξη του ανοικτού πεδίου, προσδιορίζεται η γενική δραστηριότητα (locomotor activity) ως αντικειμενικό μέτρο που αντανακλά στη αμιγή κινητικότητα (μετακινήσεις στον χώρο), στις ανασηκώσεις (τάση εξερεύνησης) και στην αυτοπεριποίηση (εμπεριέχει και συναισθηματικά στοιχεία) του πειραματοζώου Β) η πειραματική διάταξη του συρμάτινου κλωβού, προσδιορίζεται η στερεοτυπία ( για την μελέτη του υπερκινητικού συνδρόμου). Γ) η πειραματική διάταξη της ράβδου, προσδιορίζεται καταληψία ως χρόνος επαναφοράς σε φυσιολογική στάση Πειραματικά πρότυπα μελέτης του άγχους/φόβου Α) η πειραματική διάταξη ανοικτού πεδίου (προσδιορίζεται ο χρόνος ακινησίας στην περιφέρεια της διάταξης και η προσπάθεια του ζώου να έρχεται σε επαφή με τα τοιχώματα της διάταξης (θιγμοτακτισμός), Β) η πειραματική διάταξη υπερυψωμένου λαβύρινθου (αυξημένος χρόνος παραμονής και αριθμός εισόδων στους κλειστούς βραχίονες υποδηλώνει άγχος/φόβο)
Σύνοψη Πειραματικό πρότυπο μελέτης της κατάθλιψης και αντικαταθλιπτικής αγωγής Η δοκιμασία της εξαναγκασμένης κολύμβησης (προσδιορίζεται η κινητική συμπεριφορά που σχετίζεται με την παραίτηση από την προσπάθεια διαφυγής με κολύμβηση) Πειραματικά πρότυπα μελέτης της μάθησης και μνήμης Α) η πειραματική διάταξη της παθητικής αποφυγής δυσάρεστου ερεθίσματος Β) η πειραματική διάταξης της ενεργητικής αποφυγής δυσάρεστου ερεθίσματος Γ) η πειραματική διάταξη του λαβύρινθου σχήματος Υ και του ακτινωτού λαβύρινθου Δ) ο υδάτινος λαβύρινθος (Morris water maze test)
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της κινητικής συμπεριφοράς Α) η πειραματική διάταξη του ανοικτού πεδίου, προσδιορίζεται η γενική δραστηριότητα/κινητικότητα (locomotor activity) Το πειραματόζωο τοποθετείται στο κέντρο της πειραματικής διάταξης για δεδομένο χρονικό διάστημα (5-15 λεπτά) και ως αντικειμενικά μέτρα της γενικής κινητικής δραστηριότητας αξιολογούνται 1) Η συχνότητα με την οποία το τρωκτικό πέρασε μια γραμμή πλέγματος και με τα τέσσερα πόδια 2) Η συχνότητα των κεντρικών τετράγωνων καταχωρήσεων - Συχνότητα με την οποία το τρωκτικό μπήκε στο κεντρικό τετράγωνο με τα τέσσερα πόδια 3) Η διάρκεια της τετραγωνικής κεντρικής θέσης - Διάρκεια του χρόνου που δαπανάται στην κεντρική πλατεία 4) Η αμιγής κινητικότητα (σύνολο μετακινήσεων στον χώρο = συνολική απόσταση που διανύει) 5) Ο αριθμός των ανασηκώσεων μέσα στη κεντρική πλατεία (τάση εξερεύνησης)
Σύγχρονα συστήματα περιλαμβάνουν είτε κάμερα παρακολούθησης για να αναλυθεί σε δεύτερο χρόνο η συμπεριφορά του πειραματόζωου είτε φωτοκύτταρα και δίνουν περισσότερες πληροφορίες από την άμεση παρατήρηση.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της κινητικής συμπεριφοράς Β) η πειραματική διάταξη του συρμάτινου κλωβού, με την οποία προσδιορίζεται η στερεοτυπία ( για την μελέτη του υπερκινητικού συνδρόμου). Η στεροτυπία είναι ένας όρος που περιγράφει μια ομάδα φαινοτυπικών συμπεριφορών που είναι επαναλαμβανόμενες, μορφολογικά ταυτόσημες και δεν έχουν προφανή στόχο ή λειτουργία. Αυτές οι συμπεριφορές έχουν οριστεί ως «ανώμαλες» καθώς εμφανίζονται μόνο σε ζώα με διαταραχές κίνησης ή αυξημένο άγχος, αλλά δεν εμφανίζονται σε «φυσιολογικά» ζώα στο φυσικό τους περιβάλλον. Στα εργαστηριακά πειραματόζωα στεροτυπικές συμπεριφορές στην αυτοπεριποίηση ή/και στη λήψη και μάσηση της τρόφης χαρακτηρίζουν άτομα με υπερκινητικό σύνδρομο ή/και υψηλό άγχος.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της κινητικής συμπεριφοράς Γ) η πειραματική διάταξη της ράβδου, προσδιορίζεται καταληψία ως χρόνος επαναφοράς σε φυσιολογική στάση Η καταληψία είναι μια νευρική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από μυϊκή ακαμψία και ακινησία ανεξάρτητα από εξωτερικά ερεθίσματα, καθώς και μειωμένη ευαισθησία στον πόνο. Στα πειραματόζωα, η καταληψία χαρακτηρίζεται από ανικανότητα εκδήλωσης εκούσιων κινήσεων και προσδιορίζεται με τη δοκιμασία της ράβδου κατά την οποία το ζώο κρέμεται με τα μπροστινά άκρα σε μία ράβδο και υπολογίζεται ο χρόνος επαναφοράς σε μια φυσιολογικής θέση. Τα φυσιολογικά ζώα χρειάζονται περίπου 5-15 sec.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης του άγχους/φόβου Α) ανοικτό πεδίο (προσδιορίζεται ο χρόνος ακινησίας στην περιφέρεια της διάταξης και η προσπάθεια του ζώου να έρχεται σε επαφή με τα τοιχώματα της διάταξης (χρόνος θιγμοτακτισμού), Τα τρωκτικά (αρουραίοι και ποντίκια) εμφανίζουν μια φυσική αποστροφή στις περιοχές με έντονο φωτισμό. Εμφανίζουν επίσης μια προσπάθεια να εξερευνήσουν ένα αντιληπτό απειλητικό ερέθισμα. Το αποτέλεσμα αυτών των δύο αντικρουόμενων δυνάμεων είναι το άγχος. Η μειωμένη ανησυχία (μειωμένο άγχος) οδηγεί σε αυξημένη εξερευνητική συμπεριφορά όπως αυτή προσδιορίζεται από την συχνότητα εισόδου και ανασηκώσεων στη κεντρική πλατεία. Η αυξημένη ανησυχία (αυξημένο άγχος) θα έχει ως αποτέλεσμα λιγότερη κινητική δραστηριότητα γενικά και προτίμηση για τη περιφέρεια του πεδίου.
Figure 3: 3A & 3B demonstrate an illustrative example of a control and an overstimulated mouse's travel pathway on the Open Field Test. Overstimulated mice spent more time in the center of the open field (3C), had more entries into the center of the open field (3D), and they were more active as measured in distance traveled in the center of the open field field (3E). They also traveled greater distance overall (3F). D. A. Christakis, J. S. B. Ramirez & J. M. Ramirez Overstimulation of newborn mice leads to behavioral differences and deficits in cognitive performance. Scientific Reports 2, Article number: 546 (2012)
Πειραματικά πρότυπα μελέτης του άγχους/φόβου Β1) υπερυψωμένος λαβύρινθος elevated plus maze- ΕΡΜ (αυξημένος χρόνος παραμονής και αριθμός εισόδων στους κλειστούς βραχίονες υποδηλώνει άγχος/φόβο). Το πρότυπο βασίζεται στην αποστροφή των πειραματόζωων στους ανοιχτούς χώρους και στην τάση να είναι θιγξομοταξικά. Το ζώο τοποθετείται στο κέντρο της συσκευής και παρατηρείται για καθορισμένο χρόνο. Οι μετρήσεις συγκρίνουν το συνολικό χρόνο που ξοδεύεται στους ανοιχτούς και κλειστούς βραχίονες (και στην κεντρική πλατφόρμα) καθώς και στις εισόδους στον ανοιχτό και κλειστό βραχίονα.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης του άγχους/φόβου Β2) υπερυψωμένος μηδενικός λαβύρινθος elevated zero maze. Πρόκειται για ένα υπερυψωμένο κυκλικό διάδρομος με εναλλασσόμενες περιοχές ανοιχτού φωτός και κλειστές σκοτεινές περιοχές. Η συνεχής φύση αυτής της συσκευής εξαλείφει το πρόβλημα του υπερυψωμένου λαβύρυνθου όσον αφορά τον τρόπο καταγραφής της παρουσίας του ζώου στην κεντρική περιοχή. Στη δοκιμή EPM, τα ζώα μπορούν να αφιερώνουν έως και το 30% του χρόνου τους στη διφορούμενη κεντρική περιοχή εκκίνησης ή να επιστρέφουν συχνά σε αυτήν, καθιστώντας δύσκολη την αξιολόγηση της βιολογικής σημασίας της συμπεριφοράς που σχετίζεται με το άγχος. Το ζώο θα επιστρέψει στην κεντρική περιοχή επειδή είναι εξοικειωμένο με αυτήν την περιοχή και εκεί νιώθει ότι είναι "ασφαλές". Αυξημένος χρόνος παραμονής στους κλειστούς χώρους του διαδρόμου υποδηλώνει άγχος/φόβο. Το πρότυπο βασίζεται στην αποστροφή των πειραματόζωων στους ανοιχτούς χώρους και στην τάση να είναι θιγξομοταξικά.
Πειραματικό πρότυπο μελέτης της κατάθλιψης και αντικαταθλιπτικής αγωγής Η δοκιμασία της εξαναγκασμένης κολύμβησης (προσδιορίζεται η κινητική συμπεριφορά που σχετίζεται με την παραίτηση από την προσπάθεια διαφυγής με κολύμβηση) μέσω προσδιορισμού του συνολικού χρόνου ακινησίας. Η δοκιμασία πραγματοποιείται για μικρό χρονικό διάστημα, σε σκοτεινό και ήσυχο περιβάλλον ενώ το νερό είναι θερμοουδέτερο.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της μάθησης και μνήμης Α) η πειραματική διάταξη της παθητικής αποφυγής δυσάρεστου ερεθίσματος. Η παθητική αποφυγή είναι μια δοκιμασία επιδείνωσης του φόβου που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της μάθησης και της μνήμης σε μοντέλα τρωκτικών. Σε αυτή τη δοκιμασία, τα πειραματόζωα μαθαίνουν να αποφεύγουν ένα περιβάλλον στο οποίο προηγουμένως έχουν δεχθεί ένα απωθητικό ερέθισμα (όπως electro-shock). Η παθητική αποφυγή είναι χρήσιμη για την αξιολόγηση της επίδρασης των νέων χημικών ουσιών στη μάθηση και τη μνήμη, καθώς και τη μελέτη των μηχανισμών που εμπλέκονται στη γνωστική λειτουργία.
Ο θάλαμος διαιρείται σε ένα φωτεινό και ένα σκοτεινό διαμέρισμα, με μια πύλη μεταξύ των δύο. Τα ζώα επιτρέπεται να εξερευνήσουν και τα δύο διαμερίσματα την πρώτη ημέρα. Την επόμενη ημέρα τους δίνεται ένα ήπιο electro-shock στο πόδι σε ένα από τα διαμερίσματα. Αναμένεται, τα ζώα να μάθουν να συνδέουν αυτό το ερέθισμα με το θάλαμο στον οποίο το δέχτηκαν.
Για τη δοκιμασία της μάθηση και τη μνήμη τους, τα ποντίκια στη συνέχεια τοποθετούνται πίσω στο διαμέρισμα όπου δεν παρασχέθηκε σοκ. Τα ποντίκια με φυσιολογική μάθηση και μνήμη θα αποφύγουν την είσοδο στο θάλαμο όπου είχαν προηγουμένως εκτεθεί στο σοκ. Αυτό μετράται καταγράφοντας την καθυστέρηση (latency time) που παρατηρείται για να διασχίσουν την πύλη μεταξύ των διαμερισμάτων.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της μάθησης και μνήμης Β) η πειραματική διάταξης της ενεργητικής αποφυγής δυσάρεστου ερεθίσματος Η ενεργητική αποφυγή (Fear Conditioning -FC) είναι ένας τύπος συσχετιστικής μαθησιακής δοκιμασίας στην οποία τα ποντίκια μαθαίνουν να συσχετίζουν ένα συγκεκριμένο ουδέτερο ερεθισμό υπό όρους (εξαρτημένο ερέθισμα (συχνά έναν ήχο) με ένα αποτρεπτικό ανεξάρτητο ερέθισμα (συχνά ένα ήπιο ηλεκτρικό σοκ στο πόδι) και παρουσιάζουν μια εξαρτμένη απάντηση (συχνά ως πάγωμα-ακινησία). Μετά από επανειλημμένες αντιστοιχίσεις του εξαρτημένου και ανεξάρτητου ερεθίσματος, το ζώο μαθαίνει να φοβάται τόσο το εξαρτημένο ερέθισμα (ήχος) όσο και το πλαίσιο εκπαίδευσης στο οποίο αυτό εφαρμόζεται. Η ενεργητική μάθηση αποκτάται ταχέως και παράγεται μια πολύ σταθερή και μακροχρόνια αλλαγή συμπεριφοράς η οποία είναι χρήσιμη για μελέτες νευροχημείας, γενετικής και φαρμακολογίας.
Δύο διαφορετικά πλαίσια, το πλαίσιο Α και Β, χρησιμοποιούνται στην ενεργητική αποφυγή. Την πρώτη ημέρα, τα ζώα τοποθετούνται στο Πλαίσιο Α, και μετά από 3 λεπτά, δέχονται πέντε ζεύγη εξαρτημένου-ανεξάρτητου ερεθίσματος. Το ανεξάρτητο ερέθισμα (ηλεκτρικό σοκ 0.5 ma, για 2 δευτερόλεπτα) παρέχεται 18 δευτερόλεπτα μετά το τέλος του ήχου (75dB, 2 khz, 20 sec). Τη δεύτερη ημέρα, τα ποντίκια τοποθετούνται στο πλαίσιο B (οπτική ένδειξη) για 3 λεπτά και στη συνέχεια παρέχονται τρεις παρουσιάσεις ήχου χωρίς ηλεκτρικό σοκ. Την τελευταία ημέρα του πειράματος, τα ποντίκια τοποθετούνται στο πλαίσιο Α για 5 λεπτά χωρίς εξαρτημένο και ανεξάρτητο ερέθισμα. Το πάγωμα-ακινησία ορίζεται ως η πλήρης έλλειψη κίνησης για τουλάχιστον 0,75 δευτερόλεπτα και καταγράφεται το ποσοστό παγώματος-ακινησίας σε κάθε χρονική περίοδο των 5 λεπτών.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της μάθησης και μνήμης Γ1) η πειραματική διάταξη του λαβύρινθου σχήματος Υ και του ακτινωτού λαβύρινθου Ο λαβύρινθος σχήματος Y (Y Maze Spontaneous Alternation) είναι μια δοκιμασία συμπεριφοράς για τη μέτρηση της προθυμίας των τρωκτικών να εξερευνήσουν νέα περιβάλλοντα. Τα τρωκτικά τυπικά προτιμούν να διερευνήσουν ένα νέο βραχίονα του λαβύρινθου και όχι να επιστρέψουν σε ένα άλλο που επισκέφθηκαν προηγουμένως. Πολλά μέρη του εγκεφάλου - συμπεριλαμβανομένου του ιππόκαμπου, του διαφράγματος, του βασικού προσθίου εγκεφάλου και του προμετωπιαίου φλοιού - εμπλέκονται σε αυτό το καθήκον.
Η δοκιμασία πραγματοποιείται σε λαβύρινθο σχήματος Υ με τρεις λευκούς, αδιαφανείς πλαστικούς βραχίονες σε γωνία 120 μεταξύ τους. 1) Μετά την εισαγωγή στο κέντρο του λαβύρινθο, το ζώο επιτρέπεται να εξερευνήσει ελεύθερα τους τρεις βραχίονες. Κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, το ζώο θα δείξει μια τάση να εισέλθει σε ένα βραχίονα που επισκέφθηκε λιγότερο πρόσφατα. 2) Ο αριθμός των καταχωρήσεων στο βραχίονα και ο αριθμός των τριάδων καταχωρήσεων καταγράφονται προκειμένου να υπολογιστεί το ποσοστό εναλλαγής. Μια καταχώρηση προκύπτει όταν και τα τέσσερα άκρα βρίσκονται μέσα στο βραχίονα. 3) Αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό των γνωστικών ελλειμμάτων στα διαγονιδιακά στελέχη ποντικών και την αξιολόγηση νέων χημικών ουσιών για τις επιδράσεις τους στη γνωστική λειτουργία.
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της μάθησης και μνήμης Γ2) η πειραματική διάταξη του ακτινωτού λαβύρινθου Αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιείται κυρίως για τη μέτρηση της χωρικής μάθησης και μνήμης. Ορισμένες εκδόσεις της δοκιμασίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτόχρονη εξέταση τόσο της εργασίας όσο και της μνήμης αναφοράς. Η δοκιμασία αυτή είναι ευαίσθητη στη λειτουργία του ιππόκαμπου.
Τα ζώα τοποθετούνται στο κέντρο ενός ακτινωτού λαβυρίνθου οκτώ βραχιόνων. Τέσσερις τυχαία επιλεγμένοι βραχίονες έχουν σφαιρίδια τροφίμων σε αδιαφανή δοχεία. Στο ζώο δίνεται η ευκαιρία να επισκεφθεί όλους τους βραχίονες και να συλλέξει όλα τα διαθέσιμα σφαιρίδια τροφίμων. Δύο τύποι μνήμης αξιολογούνται κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας: 1) Η μνήμη αναφοράς (reference memory) και 2) Η μνήμη εργασίας (working memory). Η μνήμη αναφοράς αξιολογείται όταν οι αρουραίοι επισκέπτονται μόνο τους βραχίονες του λαβυρίνθου που περιέχουν την ανταμοιβή. Η αποτυχία επίσκεψης σε βραχίονες που εμπεριέχουν τροφή οδηγεί σε σφάλμα μνήμης αναφοράς. Η μνήμη εργασίας αξιολογείται όταν οι αρουραίοι εισέρχονται σε κάθε βραχίονα μία φορά. Η επανεισαγωγή στους βραχίονες που έχει ήδη επισκεφθεί το ζώο θα είχε ως αποτέλεσμα ένα σφάλμα μνήμης εργασίας
Πειραματικά πρότυπα μελέτης της μάθησης και μνήμης Γ3) η πειραματική διάταξη του λαβύρινθου σχήματος Τ 1) Τα ζώα τοποθετούνται αρχικά στον βραχίονα εκκίνησης του λαβύρνθου σχήματος T. 2) Κατά την έξοδο από τον βραχίονα έναρξης, τα άτομα επιλέγουν μεταξύ της εισαγωγής είτε του αριστερού είτε του δεξιού βραχίονα στόχου. 3) Με επαναλαμβανόμενες δοκιμές, τα ζώα θα πρέπει να παρουσιάζουν λιγότερη τάση να εισέλθουν σε έναν βραχίονα που επισκέφθηκαν προηγουμένως. 4) Το ποσοστό εναλλαγής (αριθμός στροφών σε κάθε βραχίονα στόχου) και η συνολική διάρκεια δοκιμής καταγράφονται. Αυτή η δοκιμασία χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό των γνωστικών ελλειμμάτων