ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ & ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΥ ΣΕΡΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΙΝΗΣΙΟΛΟΓΙΑ»

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ & ΑΘΛΗΤΙΣΜΟΥ ΣΕΡΡΩΝ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΙΝΗΣΙΟΛΟΓΙΑ» Μεταπτυχιακή Διατριβή «Διατομική διακύμανση των ανταποκρίσεων δεικτών οξειδωτικού στρες μετά από άσκηση» Μαργαριτέλης Νικόλαος Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή 1.Νικολαΐδης Μιχαήλ, Λέκτορας 2.Κυπάρος Αντώνιος, Λέκτορας 3.Βράμπας Ιωάννης, Καθηγητής Σέρρες 2013

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Νικολαΐδης Μιχαήλ (Κύριος επιβλέπων) Λέκτορας Βιολογίας της Άσκησης και των Ελευθέρων Ριζών Τμήμα Επιστήμης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισμού στις Σέρρες Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Κυπάρος Αντώνιος Λέκτορας Φυσιολογίας της Άσκησης Τμήμα Επιστήμης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισμού στις Σέρρες Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Βράμπας Ιωάννης Καθηγητής Εργοφυσιολογίας Τμήμα Επιστήμης Φυσικής Αγωγής και Αθλητισμού στις Σέρρες Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η άσκηση έχει χρησιμοποιηθεί επανειλημμένα ως φυσιολογικό οξειδωτικό ερέθισμα σε μελέτες στο χώρο της οξειδοαναγωγικής βιολογίας. Ωστόσο, οι προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν κυρίως σε διαφορές μεταξύ ομάδων ατόμων χωρίς να εξετάσουν τις όποιες ατομικές διαφορές. Συνεπώς, παραμένει ακόμα άγνωστο αν όλα τα άτομα βιώνουν οξειδωτικό στρες μετά από άσκηση. Κύριος σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το ενδεχόμενο, ορισμένοι συμμετέχοντες να μην εμφανίζουν τις αναμενόμενες ανταποκρίσεις στα επίπεδα δεικτών οξειδωτικού στρες μετά από οξεία άσκησης. Ενενήντα οχτώ (Ν=98) νέοι, ελεύθερα ασκούμενοι άνδρες πραγματοποίησαν μια συνεδρία ισομετρικής έκκεντρης άσκησης με τους εκτείνοντες μύες του γόνατος του προτιμώμενου ποδιού. Δείγματα πλάσματος, ερυθροκυττάρων και ούρων συλλέχτηκαν αμέσως πριν και 2 μέρες μετά την άσκηση. Τρεις ευρέως χρησιμοποιούμενοι οξειδοαναγωγικοί βιοδείκτες (F 2 -ισοπροστάνια, πρωτεϊνικά καρβονύλια και ανηγμένη γλουταθειόνη) υπολογίστηκαν. Οι δύο οξειδωτικοί βιοδείκτες (F 2 -ισοπροστάνια, πρωτεϊνικά καρβονύλια) αυξήθηκαν σημαντικά 2 μέρες μετά την άσκηση (P<0,001), με μία μέση αύξηση ίση με 46% και 61% και έναν συντελεστή διατομικής διακύμανσης ίσο με 71% και 80% αντίστοιχα. Σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στα επίπεδα της ανηγμένης γλουταθειόνης (P<0,001) μετά την άσκηση, με μέση μείωση ίση με 21% και έναν συντελεστή διατομικής διακύμανσης ίσο με 79%. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός πως ένας σημαντικός αριθμός συμμετεχόντων παρουσίασε μεταβολές στα επίπεδα των βιοδεικτών προς μία μη αναμενόμενη και αντίθετη προς τον μέσο όρο κατεύθυνση. Πιο συγκεκριμένα, ένα 13% των συμμετεχόντων παρουσίασε μείωση στα επίπεδα των F 2 -ισοπροστανίων, ένα 13% παρουσίασε μείωση στα επίπεδα των πρωτεϊνικών καρβονυλίων και ένα 10% παρουσίασε αύξηση στα επίπεδα της γλουταθειόνης. Επιπλέον, περισσότεροι 3

από ένας στους τρεις συμμετέχοντες παρουσίασαν μη αναμενόμενες ή αμελητέες (από 0 έως ±5%) μεταβολές σε έναν τουλάχιστον οξειδοαναγωγικό βιοδείκτη μετά την άσκηση. Παράλληλα, βρέθηκε πως τα αρχικά επίπεδα των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών αποτελούν ισχυρούς προγνωστικούς παράγοντες για τις μεταβολές στα επίπεδά τους μετά την άσκηση. Συμπερασματικά, παρόλο που η άσκηση προκαλεί οξειδωτικό στρες στην πλειοψηφία των ανθρώπων, φαίνεται πως μπορεί να προκαλέσει αναγωγικό ή και καθόλου στρες σε έναν σημαντικό αριθμό ατόμων. Λέξεις κλειδιά Αντιοξειδωτικά, ελεύθερες ρίζες, διατομική διακύμανση, οξειδωτικό στρες, οξειδοαναγωγή 4

ABSTRACT Exercise has been consistently used as a physiological oxidant stimulus in redox biology studies. However, previous studies have focused on group differences and did not examine individual differences. As a result, it remains untested whether all individuals experience oxidative stress after acute exercise. Therefore, the main aim of the present study was to investigate whether some individuals exhibit unexpected responses after an acute eccentric (i.e., muscle-damaging) exercise session. Ninety eight (N=98) young men performed an isokinetic eccentric exercise bout with the knee extensors of the preferred leg. Plasma, erythrocytes and urine samples were collected immediately before and 2 days post-exercise. Three commonly used redox biomarkers (F 2 -isoprostanes, protein carbonyls and glutathione) were assayed. As expected, the two oxidant biomarkers (F 2 -isoprostanes and protein carbonyls) significantly increased 2 days after exercise (P<0.001), with an average increase equal to 46% and 61% and an inter-individual coefficient of variation of 71% and 80% respectively; whereas a significant decrease (P<0.001) in glutathione levels by 21% was observed after exercise with an inter-individual coefficient of variation equal to 79%. Noteworthy, a considerable number of the participants exhibited changes in the levels of biomarkers in the opposite, unexpected direction than the group average. More specifically, 13% of the participants exhibited a decrease in F 2 -isoprostanes, 13% exhibited a decrease in protein carbonyls and 10% of the participants exhibited an increase in glutathione levels. Furthermore, more than 1 out of 3 individuals exhibited either unexpected or negligible (from 0% to ±5%) responses to exercise in at least one redox biomarker. Moreover, it was revealed that the initial values of redox biomarkers are important predictors of the responses to exercise. In conclusion, 5

although exercise induces oxidative stress in the majority of individuals, it can induce reductive stress or negligible stress in a considerable number of people. Key words Antioxidants, free radicals, inter-individual variability, oxidative stress, redox 6

Πίνακας περιεχομένων Περίληψη...3 Abstract...5 Πίνακας περιεχομένων...7 Κατάλογος πινάκων...9 Κατάλογος εικόνων...9 Κατάλογος σχημάτων... 10 Επεξήγηση όρων... 11 Συντομογραφίες... 11 1. Εισαγωγή... 12 1.1. Δραστικά είδη... 12 Παραγωγή των δραστικών ειδών... 13 Επίδραση των δραστικών ειδών στα βιομόρια... 17 1.2. Αντιοξειδωτικά... 20 Ενζυμικά... 20 Μη ενζυμικά... 24 1.3. Οξειδωτικό στρες... 28 Προσδιορισμός οξειδωτικού στρες - Βιοδείκτες... 29 1.4. Άσκηση και οξειδωτικό στρες... 34 Άσκηση με ή χωρίς μυϊκό τραυματισμό... 34 Οξεία και χρόνια άσκηση... 36 Διακύμανση οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών μετά από άσκηση... 37 1.5. Σκοπός... 39 7

2. Μεθοδολογία... 40 2.1. Συμμετέχοντες... 40 2.2. Ερευνητικός σχεδιασμός... 42 2.3. Πρωτόκολλο έκκεντρης άσκησης... 42 2.4. Μυϊκή λειτουργία και μυϊκός τραυματισμός... 43 2.5. Συλλογή και χειρισμός δειγμάτων... 44 2.6. Οξειδοαναγωγικοί βιοδείκτες... 44 2.7. Στατιστική ανάλυση... 46 3. Αποτελέσματα... 47 3.1. Μυϊκή λειτουργία και μυϊκός τραυματισμός... 47 3.2. Οξειδοαναγωγική ομοιόσταση... 47 3.3. Συσχέτιση μεταξύ ποσοστιαίων μεταβολών και αρχικών τιμών... 49 3.4. Συσχέτιση μεταξύ βιοδεικτών... 50 4. Συζήτηση... 52 4.1. Αναγωγικό ή καθόλου στρες μετά από άσκηση... 53 4.2. Οι αρχικές τιμές των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών είναι ισχυροί προγνωστικοί παράγοντες των ανταποκρίσεων μετά από άσκηση... 54 4.3. Συσχέτιση μεταξύ βιοδεικτών... 56 5. Συμπεράσματα... 58 Βιβλιογραφία... 59 8

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Τα κυριότερα αντιοξειδωτικά ένζυμα και οι αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν 20 Πίνακας 2: Ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά και ημερήσια ενεργειακή πρόσληψη των συμμετεχόντων 39 Πίνακας 3: Τιμές των βιοδεικτών πριν και 48 ώρες μετά την άσκηση 47 Πίνακας 4: Άτομα με μία, δύο ή τρεις μη αναμενόμενες ανταποκρίσεις 47 Πίνακας 5: Συντελεστές συσχέτισης μεταξύ των βιοδεικτών πριν την άσκηση 49 Πίνακας 6: Συντελεστές συσχέτισης μεταξύ των ποσοστιαίων μεταβολών των βιοδεικτών μετά την άσκηση 50 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Ισοκινητικό δυναμόμετρο Cybex Norm, Ronkonkoma, NY 42 9

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1: Παραγωγή της ρίζας του υπεροξειδικού ανιόντος 13 Σχήμα 2: Η αντίδραση Fenton 14 Σχήμα 3: Η αντίδραση Haber-Weiss 14 Σχήμα 4: Παραγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου 15 Σχήμα 5: Παραγωγή ρίζας περοξυνιτρίτη 15 Σχήμα 6: Βιομόρια-στόχοι των δραστικών ειδών 16 Σχήμα 7: Σχήμα 8: Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των αλυσιδωτών αντιδράσεων της λιπιδικής υπεροξείδωσης 18 Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων των κύριων ενζυμικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών 20 Σχήμα 9: Κατηγοριοποίηση των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών 28 Σχήμα 10: Σχήμα 11: Σχήμα 12: Σχήμα 13: Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των μεταβολών (σε έκταση και χρόνο) και των προσαρμογών της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης μετά από δύο συνεδρίες σύγκεντρης και έκκεντρης άσκησης 35 Μεταβολή της συγκέντρωσης των F 2 -ισοπροστανίων μετά από οξεία και χρόνια άσκηση 36 Ποσοστιαία μεταβολή των επιπέδων των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών μετά την άσκηση σε όλους τους συμμετέχοντες 48 Μη-γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης μεταξύ των ποσοστιαίων μεταβολών καθενός οξειδοαναγωγικού βιοδείκτη μετά την άσκηση και των αρχικών του τιμών 49 10

Επεξήγηση όρων Ελεύθερη ρίζα Ένα μόριο ή άτομο το οποίο περιέχει στην εξωτερική του στοιβάδα ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια Αντιοξειδωτικά Οποιαδήποτε ουσία μπορεί να καθυστερεί, να αποτρέπει ή να περιορίζει την οξειδωτική βλάβη σε ένα μόριο στόχο Οξειδωτικό στρες Μια αύξηση στα επίπεδα των δραστικών ειδών ή/και των οξειδωτικών βιοδεικτών Έκκεντρη συστολή Πραγματοποιείται όταν η τάση που αναπτύσσει ένας μυς δεν μπορεί να υπερνικήσει το εξωτερικό φορτίο με αποτέλεσμα το μήκος του μυός να αυξάνεται. Συντομογραφίες CAT Catalase Καταλάση CK Creatine kinase Κρεατινική κινάση F 2 -IsoPs F 2 -isoprostanes F 2 -ισοπροστάνια GPx Glutathione peroxidase Περοξειδάση της γλουταθειόνης GR Glutathione reductase Αναγωγάση της γλουταθειόνης GSH Reduced glutathione Ανηγμένη γλουταθειόνη GSSG Oxidized glutathione Οξειδωμένη γλουταθειόνη H 2 Ο 2 Hydrogen peroxide Υπεροξείδιο του υδρογόνου MDA Malondialdehyde Μαλονδιαλδεΰδη NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form) Φωσφορικό νικοτιναμινοαδενινο-δινουκλεοτίδιο NO Nitric oxide Νιτρικό οξείδιο - O 2 Superoxide radical Ρίζα υπεροξειδικού ανιόντος OΗ Hydroxyl radical Ρίζα υδροξυλίου PC Protein carbonyls Πρωτεϊνικά καρβονύλια SOD Superoxide dismutase Δισμουτάση του υπεροξειδίου TBARS Thiobarbituric acid reactive substrates Δραστικές ουσίες του θειοβαρβιτουρικού οξέος 11

1. Εισαγωγή 1.1. Δραστικά είδη Ο όρος «δραστικά είδη» ( reactive species ) περιλαμβάνει κυρίως δραστικά είδη οξυγόνου (reactive oxygen species - ROS), αζώτου (reactive nitrogen species - RNS) και χλωρίου (reactive chlorine species - RCS), τα οποία μπορεί να είναι είτε ελεύθερες ρίζες είτε μη ρίζες. Ως «ελεύθερη ρίζα» χαρακτηρίζεται ένα μόριο ή άτομο το οποίο περιέχει στην εξωτερική του στοιβάδα ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια (Halliwell & Gutteridge, 2007). Η ύπαρξη αυτών των ηλεκτρονίων καθιστά τις ελεύθερες ρίζες εξαιρετικά ασταθείς και δραστικές έναντι άλλων βιομορίων (π.χ., πρωτεΐνες, λιπίδια, DNA), από τα οποία προσπαθούν να αποσπάσουν ηλεκτρόνια για τη δημιουργία ζεύγους ηλεκτρονίων (Close & McArdle, 2007; Powers & Jackson, 2008). Στην περίπτωση που οι ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν με βιομόρια, παράγονται νέες ελεύθερες ρίζες οι οποίες με τη σειρά τους μπορούν να αντιδράσουν με άλλα μόρια και η διαδικασία αυτή να συνεχιστεί αλυσιδωτά με δυσμενείς συνέπειες για τον οργανισμό (Halliwell & Gutteridge, 2007). Στην περίπτωση που δύο ελεύθερες ρίζες αντιδράσουν μεταξύ τους, τότε παράγεται μια μη ρίζα, η οποία συνήθως είναι λιγότερο δραστική από εκείνες που οδήγησαν στην παραγωγή της. Τα χαρακτηριστικότερα παραδείγματα των δραστικών ειδών είναι αφενός για τις ελεύθερες ρίζες η ρίζα του υπεροξειδικού ανιόντος (O - 2 ), η ρίζα του υδροξυλίου (OH ), η ρίζα του αλκοξυλίου (RO ) και η ρίζα του νιτρικού οξέος (NO ), και αφετέρου για τις μη ρίζες το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και το ανιόν του νιτρικού υπεροξειδίου (ΟΝΟΟ - ) (Halliwell, 2001). Ωστόσο, η δραστικότητα των δραστικών ειδών ποικίλει σε αρκετά μεγάλο βαθμό. Για παράδειγμα, η ρίζα του 12

υπεροξειδικού ανιόντος (O - 2 ) είναι πολύ λιγότερο δραστική σε σχέση με τη ρίζα του υδροξυλίου (OH ), η οποία οξειδώνει σχεδόν όλα τα μόρια που βρίσκονται κοντά της με χρόνο ημίσειας ζωής ίσο με ένα τρισεκατομμυριοστό του δευτερολέπτου (Halliwell & Gutteridge 2007). Παραγωγή των δραστικών ειδών Οι ελεύθερες ρίζες σε έναν βιολογικό οργανισμό παράγονται από εξωγενείς και από ενδογενείς πηγές. Οι κυριότερες εξωγενείς πηγές παραγωγής ελευθέρων ριζών είναι η έκθεση σε μολυσματικούς περιβαλλοντικούς παράγοντες (π.χ. καπνός τσιγάρου, περιβαλλοντικοί ρύποι, εντομοκτόνα), η ιονίζουσα και υπεριώδης ακτινοβολία, η διαροφή (Powers, et al., 2004) καθώς και τα συντηρητικά των τροφών και πολλά χημειοθεραπευτικά φάρμακα (Kohen & Nyska, 2002). Όσον αφορά τις ενδογενείς πηγές παραγωγής ελευθέρων ριζών, η σημαντικότερη είναι η μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα. Πιο συγκεκριμένα, σε φυσιολογικά επίπεδα οξυγόνου, υπολογίζεται ότι ένα ποσοστό 1-3% του οξυγόνου που ανάγεται στα μιτοχόνδρια μετατρέπεται σε O - 2 (Halliwell, 1994). Επιπλέον, οι οξειδάσες του NADPH και η οξειδάση της ξανθίνης φαίνεται ότι αποτελούν επίσης σημαντικές πηγές ελευθέρων ριζών στους μύες (Powers & Jackson, 2008). Επίσης, η παραγωγή των ελευθέρων ριζών μπορεί να αποτελεί και τμήμα φυσιολογικών λειτουργιών όπως για παράδειγμα σε καταστάσεις φλεγμονής όπου τα ουδετερόφιλα, τα ηωσινόφιλα, τα μακροφάγα, τα υπεροξειδιοσώματα και το σύστημα του κυτοχρώματος P450 αποτελούν εξίσου σημαντικές πηγές δραστικών ειδών (Fang et al., 2002; Valko et al., 2007). Παρακάτω αναλύονται οι τρόποι παραγωγής των σημαντικότερων δραστικών ειδών. 13

- Παραγωγή O 2 Παράγεται κατά κύριο λόγο στα μιτοχόνδρια λόγω διαρροής ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας, από τη δράση της οξειδάση της ξανθίνης, του NADPH και του κυτοχρώματος P450. Παράγεται ενδογενώς με την προσθήκη ενός ηλεκτρονίου στην εξωτερική στοιβάδα ενός μορίου Ο 2 και πιο συγκεκριμένα κατά τη δέσμευση του οξυγόνου από την αίμη στην αιμοσφαιρίνη (Cooper, et al., 2002) (σχήμα 1). Το - O 2 παράγεται επίσης και από τα φαγοκύτταρα με σκοπό την καταστροφή βακτηρίων που έχουν εισέλθει στον οργανισμό, ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι μικρές ποσότητες των ριζών αυτών λειτουργούν και ως διακυτταρικά σηματοδοτικά μόρια (Valko, et - al., 2007). Ο χρόνος ημιζωής του O 2 είναι περίπου 10-6 sec (Close & McArdle, 2007). Σχήμα 1. Παραγωγή της ρίζας του υπεροξειδικού ανιόντος Παραγωγή OH Οι ρίζες του υδροξυλίου (OH ) παράγονται σε βιολογικά υγρά από αντιδράσεις όπως οι αντιδράσεις Fenton και Haber-Weiss (σχήματα 2 και 3). In vivo, οι OH παράγονται κυρίως μέσω της αντίδρασης Fenton. Για να λάβουν χώρα όμως αυτές οι αντιδράσεις είναι απαραίτητη η παρουσία ιόντων ενός μετάλλου μετάπτωσης, το οποίο επιταχύνει την αντίδραση. Τέτοια μέταλλα είναι συνήθως ο σίδηρος (Fe) και ο χαλκός (Cu) (Halliwell & Gutteridge, 2007). Σχήμα 2. Η αντίδραση Fenton 14

Σχήμα 3. Η αντίδραση Haber Weiss Οι OH όπως ήδη αναφέρθηκε είναι πολύ δραστικές με χρόνο ημιζωής 10-12 s και μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές βλάβες στα βιολογικά συστήματα (Close & McArdle, 2007). Παραγωγή NO Οι ρίζες αζώτου ή αλλιώς νιτρικά οξείδια (NO ) παράγονται από το αμινοξύ L- αργινίνη και έχουν χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 30 s (Close & McArdle, 2007). Οι ρίζες αζώτου μπορούν να αντιδράσουν είτε με τις ρίζες O - 2 και να οδηγήσουν στον σχηματισμό του περοξυνιτρίτη (Droge, 2002) είτε με οξυγόνο οπότε και παράγεται διοξείδιο του αζώτου (NO 2 ). Τόσο το NO 2 όσο και ο περοξυνιτρίτης είναι αρκετά πιο δραστικά και επικίνδυνα μόρια. Οι σημαντικότερες λειτουργίες των νιτρικών οξειδίων είναι η κυτταρική σηματοδότηση (Fang et al., 2002) και η συμμετοχή τους στην εξουδετέρωση των παρασίτων από τα μακροφάγα (Fang, et al., 2002; Halliwell & Gutteridge, 2007). Παραγωγή Η 2 Ο 2 Το H 2 O 2 δεν έχει κάποιο ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στην εξωτερική του στιβάδα, οπότε και δεν μπορεί να θεωρηθεί ελεύθερη ρίζα. Παρόλα αυτά συγκαταλέγεται στα δραστικά είδη του οξυγόνου και αποτελεί μάλιστα ένα από τα πιο σημαντικά και ευρέως μελετημένα είδη. Παράγεται παρουσία ριζών Ο2 - μέσω μιας αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) (σχήμα 4). 15

Σχήμα 4. Παραγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου Το H 2 O 2 δεν είναι ιδιαίτερα δραστικό. Συμμετέχει όμως σε ορισμένες αντιδράσεις όπως η Fenton reaction (σχήμα 2) μέσω των οποίων μπορεί να μετατραπεί σε άλλες ιδιαίτερα δραστικές ελεύθερες ρίζες όπως το OH. Για τον λόγο αυτό πολλές φορές το H 2 O 2 αναφέρεται στην βιβλιογραφία και ως «προ-οξειδωτικός» παράγοντας. Το H 2 O 2 έχει χρόνο ημίσειας ζωής μερικών λεπτών (Close & McArdle, 2007), το οποίο σε συνδυασμό με την ιδιότητα του να διαπερνά τις κυτταρικές μεμβράνες και να μεταφέρεται σε σημαντικές αποστάσεις του επιτρέπει να οξειδώνει διάφορα βιομόρια μακριά από το σημείο παραγωγής του (Winterbourn, 2008). Παραγωγή ONOO - To ανιόν του περοξυνιτρίτη είναι ένα ισχυρό οξειδωτικό μέσω, το οποίο δημιουργείται από την αντίδραση του Ο - 2 με το NO (σχήμα 5). Η αντίδραση αυτή γίνεται περίπου τρεις φορές ταχύτερα από την αυτοξειδοαναγωγή του Ο2 - για την παραγωγή H 2 O 2 (σχήμα 5) και είναι ακόμη πιο γρήγορη από την αντίδραση του NO με την αίμη (Powers & Jackson, 2008). Σχήμα 5. Παραγωγή ρίζας περοξυνιτρίτη 16

Επίδραση των δραστικών ειδών στα βιομόρια Η αντίδραση των διάφορων βιομορίων με τα δραστικά είδη οδηγεί σε τροποποίηση της δομής ή/και της λειτουργίας των βιομορίων αυτών. Για πολλά χρόνια υπήρχε η πεποίθηση πως οι αντιδράσεις αυτές επέφεραν μόνο επιβλαβείς συνέπειες στον οργανισμό. Παρόλα αυτά οι σύγχρονες μελέτες (Greenberg et al. 2008) δεν υποστηρίζουν αυτή την άποψη αλλά αντιθέτως γνωρίζουμε πως υπάρχουν και ευεργετικές συνέπειες από την λειτουργία των δραστικών ειδών. Οι τρεις κυριότεροι στόχοι των δραστικών ειδών είναι τα λιπίδια, οι πρωτεΐνες και το DNA. Οι υδατάνθρακες (Benov & Beema 2003) και το RNA (Jorgensen et al. 2013) μπορούν επίσης να οξειδωθούν, όμως μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν αρκετές πληροφορίες για αυτά (σχήμα 6). Βιομόρια - στόχοι των δραστικών ειδών Λιπίδια Πρωτεΐνες DNA RNA Υδατάνθρακες Σχήμα 6. Βιομόρια - στόχοι των δραστικών ειδών Επίδραση στο DNA Οξειδωτικές τροποποιήσεις στο DNA προκαλούμενες από δραστικά είδη και ακολουθούμενες από άμεση επιδιόρθωση, συμβαίνουν συνεχώς μέσα στα κύτταρα (Halliwell & Gutteridge, 2007). Οι ελεύθερες ρίζες έχουν την ικανότητα να προσβάλουν το DNA προκαλώντας μονόκλωνα ή δίκλωνα σπασίματα, τροποποίηση 17

των βάσεων και χιάσματα στο DNA. Διάφορα δραστικά είδη οξυγόνου (OH ) και αζώτου (Ν 2 Ο 3 ) μπορούν να οξειδώσουν βάσεις του DNA, ενώ περισσότερες από 100 οξειδωτικές τροποποιήσεις έχουν ήδη αναγνωριστεί στο DNA μέχρι σήμερα (Klaunig & Kamendulis, 2004; Dizdarglu et al., 2002; Cox et al., 2001). Η πιο γνωστή και εκτενώς μελετημένη οξειδωτική τροποποίηση στις βάσεις του DNA, είναι η 8- υδροξυδεοξυγουανοσίνη (OH8dG), η οποία προκύπτει από την οξείδωση της γουανίνης στη θέση του C8 του πουρινικού δακτυλίου. Όταν η «διαδικασία επιδιόρθωσης» αυτών των τροποποιήσεων δεν επαρκεί, τότε η οξειδωτική αυτή ανισορροπία μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο. Για το λόγο αυτό η οξείδωση του DNA έχει συνδεθεί περισσότερο από κάθε άλλη οξείδωση με διάφορες παθήσεις όπως ο καρκίνος ή οι νευροεκφυλιστικές νόσοι (Halliwell, 2006; 2007b). Επίδραση στις πρωτεΐνες Οξειδωτικές τροποποιήσεις στις πρωτεΐνες μπορούν να προκληθούν από την δράση των ελευθέρων ριζών, από προϊόντα λιπιδικής υπεροξείδωσης όπως η 4 υδροξυνονενάλη και από γλυκοζυλίωση. Στις πρωτεΐνες ορισμένα αμινοξέα, όπως η ιστιδίνη, η αργινίνη, η λυσίνη και η προλίνη είναι πολύ ευπαθή στη δράση των ελευθέρων ριζών και παράγουν προϊόντα με καρβονυλομάδες. Επίσης, οι SH ομάδες της κυστεΐνης οξειδώνονται σε θειολικές ρίζες (RS ) μετά από την επίδραση δραστικών ειδών οξυγόνου και με άμεση αντίδραση με ιόντα μεταβατικών μετάλλων (Valko et al., 2007). Οι πρωτεϊνικές οξειδωτικές τροποποιήσεις επιφέρουν πολύ σημαντικές βιολογικές αλλαγές, διότι επηρεάζουν άμεσα την λειτουργία υποδοχέων, αντισωμάτων ή ενζύμων ενώ μπορούν έμμεσα να οδηγήσουν και σε τροποποιήσεις που σχετίζονται με άλλα βιομόρια όπως για παράδειγμα στην απενεργοποίηση ενζύμων που σχετίζονται με την επιδιόρθωση του DNA (Halliwell & Gutteridge 18

2007). Οι τροποποιήσεις αυτές μπορεί να είναι αναστρέψιμες ή μη. Στην δεύτερη περίπτωση, οι οξειδωμένες πρωτεΐνες πρέπει να απομακρύνονται από το κύτταρο ή να καταστρέφονται από το πρωτεόσωμα και τα λυσοσώματα, διότι σε αντίθετη περίπτωση μπορεί να οδηγήσουν σε κυτταρικό θάνατο (Davies 2001). Επίδραση στα λιπίδια Η αντίδραση των δραστικών ειδών με λιπίδια (π.χ., λιπαρά οξέα, τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια, στερόλες) ονομάζεται λιπιδική υπεροξείδωση και περιλαμβάνει αρκετά σύνθετες και αλυσιδωτές χημικές διαδικασίες (σχήμα 7). Η λιπιδική υπεροξείδωση οδηγεί σε αστάθεια της πλασματικής μεμβράνης των κυττάρων, η οποία στη συνέχεια μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο. Κύρια τοξικά παράγωγα της λιπιδικής υπεροξείδωσης είναι η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) και διάφορες άλλες αλδεΰδες, όπως η 4-υδροξυνονενάλη. Η MDΑ και η 4- υδροξυνονενάλη είναι πολύ δραστικά μόρια, τα οποία προσβάλουν DΝΑ και πρωτεΐνες προκαλώντας ποικίλες οξειδωτικές τροποποιήσεις (Klaunig & Kamendulis, 2004). Αξίζει να σημειωθεί πως για μεγάλο χρονικό διάστημα οι μελέτες εστίαζαν το ενδιαφέρον τους μόνο στην οξείδωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων των κυτταρικών μεμβρανών (Cooper, et al., 2002). Σήμερα ωστόσο γνωρίζουμε ότι και τα λιπίδια που βρίσκονται για παράδειγμα στο κυτταρόπλασμα (π.χ. τριγλυκερίδια) δύναται να οξειδωθούν (Wu et al. 1999). 19

Σχήμα 7. Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των αλυσιδωτών αντιδράσεων της λιπιδικής υπεροξείδωσης 1.2. Αντιοξειδωτικά Ως «αντιοξειδωτικό» ορίζεται οποιαδήποτε ουσία μπορεί να καθυστερεί, να αποτρέπει ή να περιορίζει την οξειδωτική βλάβη σε ένα μόριο στόχο (Halliwell & Gutteridge, 2007). Επειδή όμως οι αντιοξειδωτικές ουσίες σε έναν οργανισμό έχουν πάντα πολλαπλούς ρόλους, ο χαρακτηρισμός μιας ουσίας ως «αντιοξειδωτικό» θα πρέπει να συνοδεύεται από τον οξειδωτικό παράγοντα που αυτή εξουδετερώνει (Azzi et al. 2004). Ο ανθρώπινος οργανισμός έχει αναπτύξει ένα πολύ καλά οργανωμένο αντιοξειδωτικό σύστημα ενάντια στις επιβλαβείς δράσεις των δραστικών ειδών. Πραγματοποιώντας μία «λειτουργική» κατηγοριοποίηση των αντιοξειδωτικών, τα διακρίνουμε στους «καθαριστές» των δραστικών ειδών (reactive species scavengers) (π.χ., βιταμίνη C, καταλάση), σε μόρια που μειώνουν την παραγωγή δραστικών ειδών (π.χ., χηλικές ενώσεις όπως το EDTA) και σε μόρια που οδηγούν έμμεσα σε αύξηση της παραγωγής αντιοξειδωτικών (π.χ. ισοθειοκυανικές ενώσεις). Ο πιο συνήθης ωστόσο διαχωρισμός που πραγματοποιείται μεταξύ των αντιοξειδωτικών, αφορά στο εαν αυτά εμφανίζουν ενζυμική ή μη δραστηριότητα. Παρ όλα αυτά, όλοι αυτοί οι τεχνητοί διαχωρισμοί των αντιοξειδωτικών πραγματοποιούνται απλά για την ευκολότερη περιγραφή τους χωρίς να έχουν κάποια φυσιολογική σημασία, καθώς 20

όλα τα αντιοξειδωτικά λειτουργούν σαν ένα ενιαίο σύμπλεγμα μηχανισμών εντός και εκτός του κυττάρου όπως επίσης και μέσα στα διάφορα κυτταρικά οργανίδια (π.χ., μιτοχόνδρια). Ενζυμικά αντιοξειδωτικά Στους ενζυμικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς ανήκουν διάφορα ένζυμα τα οποία είτε δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες είτε μειώνουν την παραγωγή τους. Τα κυριότερα αντιοξειδωτικά ένζυμα είναι η υπεροξειδική δισμουτάση (SOD), η καταλάση (CAT) η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx). Τα περισσότερα από τα ενζυμικά αντιοξειδωτικά εμφανίζουν την δράση τους κατά κύριο λόγω μέσα στο κύτταρο (Powers & Jackson, 2008) και μάλιστα φαίνεται ότι εμφανίζουν υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση ως προς τα δραστικά ήδη και τις αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν (Murphy et al. 2011) (πίνακας 1, σχήμα 8). Πίνακας 1. Τα κυριότερα αντιοξειδωτικά ένζυμα και οι αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν Ένζυμα Αντίδραση που καταλύουν Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) 2 Ο - 2 + 2 H + H 2 O 2 + O 2 Καταλάση (CAT) 2 H 2 O 2 Ο 2 + Η 2 Ο Yπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) GSH + R GSSG + R GSH: ανηγμένη μορφή γλουταθειόνης, GSSG: οξειδωμένη μορφή γλουταθειόνης, R : ελεύθερη ρίζα, Η 2 Ο 2 : υπεροξείδιο του υδρογόνου 21

Σχήμα 8. Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων των κύριων ενζυμικών αντιοξειδωτικών μηχανισμών (τονίζονται με κόκκινο περίγραμμα). SOD: υπεροξειδική δισμουτάση, CAT: καταλάση, GPx: υπεροξειδάση της γλουταθειόνης, GR: αναγωγάση της γλουταθειόνης, GSH: ανηγμένη μορφή γλουταθειόνης, GSSG: οξειδωμένη μορφή γλουταθειόνης. Υπεροξειδική δισμουτάση Η SOD ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά από τους McCord και Fridovich (McCord & Fridovich, 1969) και θεωρείται ότι είναι από τα αντιοξειδωτικά ένζυμα της πρώτης γραμμής του οργανισμού απέναντι σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες (Michiels et al., 1994). Χαρακτηριστικά αναφέρεται πως κατά την διάρκεια της ηρεμίας, το μεγαλύτερο μέρος του παραγόμενου O 2 - από τα μιτοχόνδρια ανάγεται από τη MnSOD, ενώ το υπόλοιπο διαχέεται στο κυτταρόπλασμα (Powers & Lennon, 1999). Υπάρχει σε τρεις διαφορετικές μορφές, οι οποίες παρουσιάζουν και οι τρεις την ίδια καταλυτική δράση (μετατροπή του O - 2 σε H 2 O 2 ) (πίνακας 1) και όλες απαιτούν την ύπαρξη ενός οξειδοαναγωγικά ενεργού μετάλλου (Powers & Jackson, 2008). Οι τρεις αυτές μορφές είναι η Cu/ZnSOD, η MnSOD, και η εξωκυττάρια Cu/ZnSOD που διαφέρει από την κυτταροπλασματική Cu/ZnSOD. H κυτταροπλασματική μορφή της SOD (Cu/ZnSOD) αποτελεί περίπου το 70% όλων των μορφών της SOD και χρησιμοποιεί ως συμπαράγοντες το χαλκό και τον ψευδάργυρο. Είναι διάχυτη στο 22

κυτταρόπλασμα και σε μικρότερο βαθμό στον πυρήνα και στο χώρο μεταξύ των μιτοχονδριακών μεμβρανών. Η μιτοχονδριακή MnSOD περιέχει ένα άτομο μαγγανίου ανά υπομονάδα (Whittaker, 2000) και ανευρίσκεται στο μιτοχονδριακό χώρο. Τέλος, η εξωκυττάρια SOD (Cu/ZnSOD) είναι το μόνο ένζυμο που εξουδετερώνει τις ρίζες Ο - 2 στον εξωκυττάριο χώρο και ως εκ τούτου ο ρόλος της συγκεκριμένης μορφής SOD είναι πολύ σημαντικός λόγω της εξωκυττάριας κατανομής της στους ιστούς (Oury et al., 1996). Καταλάση Η κύρια αντιοξειδωτική δράση της καταλάση (CAT) είναι η κατάλυση της διάσπαση του H 2 O 2 σε νερό και οξυγόνο (Ji, 1999) (πίνακας 1). Ένα μόριο CAT μπορεί να μετατρέψει 83.000 μόρια Η 2 Ο 2 το δευτερόλεπτο σε νερό και οξυγόνο. Το μεγαλύτερο ποσοστό του ενζύμου εντοπίζεται στα ερυθροκύτταρα, τους νεφρούς και το ήπαρ (Masters et al., 1986) και πιο συγκεκριμένα στα υπεροξειδοσώματα, στα μιτοχόνδρια και στο κυτταρόπλασμα. Πρόκειται για ένα τετραμερές ένζυμο το οποίο αποτελείται από 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες μεγέθους τουλάχιστον 500 αμινοξέων. Στο τετραμερές αυτό υπάρχουν 4 πορφυρινικές ομάδες αίμης, οι οποίες επιτρέπουν στην καταλάση να αντιδρά με το Η 2 Ο 2 (Halliwell & Gutteridge, 1998). Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης Η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) είναι μια σεληνοπρωτεΐνη, η οποία υπάρχει σε πέντε ισομορφές (Brigelius-Flohe, 2006). Η GPx συναντάται στο κυτταρόπλασμα και στα μιτοχόνδρια και συμμετέχει στην αναγωγή λιπιδικών και μη υδροϋπεροξειδίων. Η κυριότερη αντίδρασή της αφορά στη μετατροπή του H 2 O 2 σε 23

H 2 O, για την οποία όμως απαιτείται η προμήθεια ηλεκτρονίων από την ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η οποία οξειδώνεται και παίρνει την οξειδωμένη της μορφή (GSSG). Η GSSG στη συνέχεια ανάγεται σε GSH με την δράση της αναγωγάσης της γλουταθειόνης (GR) έχοντας ως αναγωγικό μέσο το NADPH (Halliwell & Gutteridge, 2007) (σχήμα 8). Παρόλο που η δράση της GPx είναι εξειδικευμένη για τον δέκτη του υδρογόνου (αυστηρά η GSH), δεν είναι εξειδικευμένη για το υπόστρωμα και ως εκ τούτου μπορεί να αλληλεπιδράσει με διάφορες ελεύθερες ρίζες (Michiels et al., 1994). Είδαμε προηγουμένως ότι το H 2 O 2 μετατρέπεται σε νερό και με την δράση της καταλάσης. Από κινητικής όμως απόψεως, η GΡx έχει μεγαλύτερη συγγένεια για το H 2 O 2, και κατά συνέπεια υπό φυσιολογικές συνθήκες η αποικοδόμηση πραγματοποιείται κυρίως από την GPx (Jones et al., 1981; Antunes et al., 2002). Μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά Η κατηγορία αυτή των αντιοξειδωτικών περιλαμβάνει κυρίως ουσίες χαμηλού μοριακού βάρους, όπως το ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C), η α-τοκοφερόλη (βιταμίνη E), η γλουταθειόνη, το ουρικό οξύ, το συνένζυμο Q, το λιποϊκό οξύ, το σελήνιο και τα καροτενοειδή. Παρόλο που υπάρχει αλληλεξάρτηση μεταξύ μερικών από αυτές τις ουσίες [π.χ. το ουρικό οξύ «σταθεροποιεί» τα επίπεδα του ασκορβικού οξέος στο πλάσμα (Sevanian et al. 1985) και το ασκορβικό οξύ με τη σειρά του ανακυκλώνει την α-τοκοφερόλη (Buettner 1993)], πρόκειται για μία ανομοιογενή κατηγορία και το μόνο κοινό στοιχείο μεταξύ των ουσιών είναι η μη ενζυμική τους δράση. Από τις ουσίες αυτής της κατηγορίας, οι εκτενέστερα μελετημένες ουσίες είναι το ασκορβικό οξύ και το ουρικό οξύ ως τα πιο σημαντικά υδρόφιλα αντιοξειδωτικά, η α- 24

τοκοφερόλη ως το πιο σημαντικό λιπόφιλο αντιοξειδωτικό και η γλουταθειόνη ως το πιο σημαντικό ενδοκυτταρικό αντιοξειδωτικό. Ουρικό οξύ Αποτελεί ένα πολύ σημαντικό αντιοξειδωτικό μόριο του πλάσματος και είναι προϊόν του μεταβολισμού των πουρινών (Wayner, 1987). Ο βασικός αντιοξειδωτικό ρόλος του ουρικού οξέος είναι να παρέχει προστασία κυρίως ενάντια στην λιπιδική υπεροξείδωση, αφού αποτελεί σημαντικό «εκκαθαριστή» OH και O2 - (Howell & Wyngaarden, 1960; Wayner, et al., 1987). Επίσης, σχηματίζει σύμπλοκα με το σίδηρο και το χαλκό (μέταλλα μεταπτώσεως που σχετίζονται με οξειδωτικές διαδικασίες) ενισχύοντας με αυτόν τον τρόπο η αντιοξειδωτική του λειτουργία (Halliwell & Gutteridge, 2007; Powers & Jackson, 2008). Ασκορβικό οξύ Αποτελεί ένα μόριο με σημαντική αντιοξειδωτική δράση σε υδάτινα περιβάλλοντα όπως είναι το κυτοσόλιο και ο εξωκυττάριος χώρος αντιδρώντας με HO και H 2 O 2. (Sies & Stahl, 1995). Επίσης, αποτελεί το μοναδικό αντιοξειδωτικό στο πλάσμα που προστατεύει τα λιπίδια και τις λιποπρωτεΐνες από τις LOO που παράγονται σε υδάτινο περιβάλλον (Frei, 1991). Δύο έμμεσα αντιοξειδωτικές αλλά πολύ σημαντικές λειτουργίες του ασκορβικού οξέος είναι αφενός η ανακύκλωση της α-τοκοφερόλης στις μεμβράνες και στις λιποπρωτεΐνες από την οξειδωμένη της μορφή (Bisby & Parker, 1995; Lambelet et al., 1994) και αφετέρου η προστασία των ουδετερόφιλων και των μακροφάγων κατά την διάρκεια της φαγοκυτταρικής διαδικασίας όπου υπάρχει παραγωγή ελευθέρων ριζών. Μετά την οξείδωση του, το ασκορβικό οξύ 25

μετατρέπεται σε ασκορβική ρίζα η οποία όμως δεν είναι ιδιαίτερα δραστική. Η ασκορβική ρίζα μετατρέπεται είτε άμεσα ξανά σε ασκορβικό οξύ [μέσω του NADH ή της γλουταθειόνης (Close & McArdle, 2007)] είτε μετατρέπεται σε οξύ (οξειδωμένη μορφή ασκορβικού οξέος). Σε υψηλές συγκεντρώσεις το ασκορβικό οξύ θεωρητικά μπορεί να παρουσιάσει και προ-οξειδωτική δράση (Close & McArdle, 2007; Halliwell & Gutteridge, 2007; Powers, et al., 2004). Αυτό, πιθανότατα οφείλεται στην ιδιότητα του να μετατρέπει τον τρισθενή σίδηρο (Fe 3+ ) σε δισθενή (Fe 2+ ) (Powers, et al., 2004), ο οποίος δισθενής σίδηρος αντιδρά με το H 2 O 2 μέσω της εξίσωσης Fenton παράγοντας την ιδιαίτερα δραστική ρίζα HO (Halliwell & J. Gutteridge, 2007). α-τοκοφερόλη Αποτελεί μία από τις οχτώ διαφορετικές μορφές της βιταμίνης Ε. Η α-τοκοφερόλη, ως λιπόφιλο μόριο, αποτελεί το πιο σημαντικό αντιοξειδωτικό μόριο στις κυτταρικές και ενδοκυτταρικές μεμβράνες ενώ στο πλάσμα προστατεύει τα φωσφολιπίδια των λιποπρωτεϊνών από υπεροξείδωση. Η οξείδωση ενός λιπιδίου όπως είδαμε οδηγεί στην παραγωγή ελευθέρων ριζών, οι οποίες αντιδρούν με άλλα γειτονικά λιπίδια οδηγώντας σε αλυσιδωτές αντιδράσεις και στην καταστροφή πολλών μορίων. Η α- τοκοφερόλη σταματά αυτές τις αλυσιδωτές αντιδράσεις των λιπιδικών υπεροξειδώσεων μέσω της ταχύτερης αντίδρασής της με τις ελεύθερες ρίζες σε σχέση με τα λιπίδια (Esterbauer et al., 1991; Thomas et al., 1995). Συνεπώς, αντί για οξείδωση των λιπιδίων πραγματοποιείται οξείδωση της α-τοκοφερόλης, σχηματισμός α-τοκοφερο-ρίζας (TO ) και αναγωγή των ριζών υπεροξυλίου (LOO ) σε λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (LOOH). Μετά την οξείδωση της α-τοκοφερόλης, η α-τοκοφερορίζα (η οποία είναι σχετικά σταθερή και χημικά αδρανής) μπορεί είτε να ενωθεί με 26

άλλες ρίζες LOO και να σχηματίζει ανενεργά μόρια είτε να αναχθεί ξανά σε α- τοκοφερόλη από το ασκορβικό οξύ ή το συνένζυμο Q. Τέλος, η α-τοκοφερόλη έχει την ιδιότητα να ενσωματώνεται σε βιολογικές μεμβράνες, όπου σταθεροποιεί τη δομή των λιποπρωτεϊνών. Για την ακρίβεια, το μόριο της προσδένεται στη διπλοστιβάδα των φωσφολιπιδίων μέσω της φυτύλ-πλευρικής αλυσίδας, έτσι ώστε η πολική κεφαλή της, που έχει μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση, να βρίσκεται κοντά στη διασύνδεση μεταξύ λιπιδίων και νερού όπου προστατεύει το ενδοθήλιο (Hennig, Enoch, & Chow, 1987). Γλουταθειόνη Είναι η πιο άφθονη σε ποσότητα χαμηλού μοριακού βάρους θειόλη και αποτελεί ίσως το κυριότερο μη ενζυμικό αντιοξειδωτικό μόριο ενός οργανισμού. Πρόκειται για ένα τριπεπτίδιο, που αποτελείται από τα αμινοξέα γλουταμινικό οξύ, κυστεΐνη και γλυκίνη, και παράγεται φυσιολογικά από τον ανθρώπινο οργανισμό μέσω της σύνθεσης των απαραίτητων αμινοξέων στο ήπαρ. Η κυστεΐνη είναι αυτή που παρέχει την σουλφυδρυλομάδα, η οποία προσδίδει στο μόριο τις αντιοξειδωτικές του ιδιότητες (Halliwell & Gutteridge, 2007). Μέσα στα κύτταρα η γλουταθειόνη υπάρχει στην ανηγμένη (GSH) και στην οξειδωμένη (GSSG) της μορφή. Για την εναλλαγή μεταξύ των δύο μορφών απαιτείται η παρουσία και δράση δύο ενζύμων. Για την οξείδωση της ανηγμένης μορφής απαιτείται η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx), ενώ για την αναγωγή της οξειδωμένης μορφής απαιτείται η αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR), η οποία χρησιμοποιεί το NADPH ως πηγή Η +. Ανάμεσα στις δύο μορφές της γλουταθειόνης επικρατεί μια δυναμική ισορροπία και ο λόγος τους (GSH/GSSG) είναι συχνά ενδεικτικός της οξειδοαναγωγικής κατάστασης 27

του οργανισμού. Πιο συγκεκριμένα, σε κατάσταση ηρεμίας ένας λόγος GSH/GSSG περίπου ίσος με 200-300 είναι συνήθης. 28

1.3. Οξειδωτικό στρες Στους βιολογικούς οργανισμούς, μεταξύ της δράσης των δραστικών ειδών και των αντιοξειδωτικών μηχανισμών, επικρατεί μια ισορροπία. Όταν η ισορροπία αυτή διαταράσσεται υπέρ των δραστικών ειδών επέρχεται το οξειδωτικό στρες. Παρ όλα αυτά, το να δοθεί ένας συγκεκριμένος ορισμός για το οξειδωτικό στρες αποδείχθηκε ιδιαίτερα περίπλοκη υπόθεση. Πρώτος ο Sies (1985) όρισε το οξειδωτικό στρες ως την «διατάραξη της ισορροπίας προοξειδωτικών/αντιοξειδωτικών παραγόντων υπέρ των προοξειδωτικών που οδηγεί σε δυνητική βλάβη», εστιάζοντας ωστόσο με αυτόν τον τρόπο κυρίως σε μακρομοριακές βλάβες. Το 2006 ο Jones παράλλαξε το δεύτερο μισό του παραπάνω ορισμού υποστηρίζοντας ότι η διατάραξη της παραπάνω ισορροπίας μπορεί να οδηγήσει σε «αποδιοργάνωση της οξειδοαναγωγικής σηματοδότησης και ελέγχου», εστιάζοντας εντούτοις μόνο στο κυτταρικό επίπεδο. Την επόμενη χρονιά οι δύο προαναφερθέντες συγγραφείς σε ένα από κοινού άρθρο τους (Sies & Jones, 2007) έδωσαν έναν ορισμό του οξειδωτικού στρες, συνδυάζοντας ουσιαστικά τους δύο παραπάνω ορισμούς. Σύμφωνα λοιπόν με τον αυτόν τον ορισμό, οξειδωτικό στρες είναι «η διατάραξη της ισορροπίας προοξειδωτικών/αντιοξειδωτικών υπέρ των προοξειδωτικών που οδηγεί σε αποδιοργάνωση της οξειδοαναγωγικής σηματοδότησης και ελέγχου ή/και σε βλάβη». Ο ορισμός όμως αυτός περιλαμβάνει κάποιες λέξεις (π.χ. «διατάραξη», «βλάβη») αλλά και ένα γενικότερο νόημα, το οποίο προσδίδει στις ελεύθερες ρίζες και την λειτουργία τους μια πλήρως αρνητική φόρτιση. Η άποψη αυτή τα τελευταία χρόνια τείνει να αναθεωρηθεί, καθώς είναι πλέον αποδεκτό πως το οξειδωτικό στρες είναι συνδεδεμένο και με πολλές ευεργετικές βιολογικές διαδικασίες (Bashan et al., 2009; Valko et al., 2007). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η διαδικασία της φαγοκυττάρωσης (Greenberg et al., 2008), κατά την οποία τα οξειδωμένα λιπίδια της 29

κυτταρικής μεμβράνης του νεκρού κυττάρου, αποτελούν το «σήμα» ώστε το μακροφάγο να πλησιάσει και να φαγοκυτταρώσει το νεκρό κύτταρο. Για το λόγο αυτό στην παρούσα μελέτη, ως οξειδωτικό στρες θα δεχθούμε τον ορισμό που δόθηκε από τον Nikolaidis και τους συνεργάτες του (2012a), σύμφωνα με τον οποίο οξειδωτικό στρες είναι «μια αύξηση στα επίπεδα των δραστικών ειδών ή/και των οξειδωτικών βιοδεικτών». Προσδιορισμός οξειδωτικού στρες Βιοδείκτες Το οξειδωτικό στρες έχει συνδεθεί με ποικίλες φυσιολογικές και κλινικές διαδικασίες όπως η φλεγμονή (Halliwell, 2006b), το γήρας (Sohal & Orr, 2012) και η παθοφυσιολογία διαφόρων νόσων (Dalle-Donne et al., 2006) με χαρακτηριστικότερα παραδείγματα τους διάφορους τύπους καρκίνου (Halliwell, 2007) και τον σακχαρώδη διαβήτη (Yang et al., 2011). Ο προσδιορισμός του οξειδωτικού στρες γίνεται με τη χρήση των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών (redox biomarkers). Οι βιοδείκτες αυτοί μπορούν να διακριθούν σε πέντε επιμέρους κατηγορίες (Σχήμα 9). Στους προοξειδωτικούς παράγοντες, στα δραστικά είδη, στα προϊόντα οξείδωσης βιομορίων, στα αντιοξειδωτικά και στα οξειδοαναγωγικά ζεύγη (redox couples). Οξειδοαναγωγικοί βιοδείκτες Προ-οξειδωτικοί παράγοντες Δραστικά είδη Προϊόντα οξείδωσης Αντιοξειδωτικά Οξειδοαναγωγικά ζεύγη Σχήμα 9. Κατηγοριοποίηση των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών 30

Προ-οξειδωτικοί παράγοντες Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι ουσίες, οι οποίες προάγουν την οξείδωση άλλων βιομορίων είτε παράγοντας δραστικά είδη είτε αναστέλλοντας την δράση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Δύο χαρακτηριστικά παραδείγματα αυτής της κατηγορίας είναι το Η 2 Ο 2 και ο Fe 2+. To Η 2 Ο 2 είναι ίσως το πιο διεξοδικά μελετημένο μόριο αυτής της κατηγορίας. Θεωρητικά ανήκει στην κατηγορία των δραστικών ειδών, αλλά λόγω της μικρής άμεσα οξειδωτικής του δράσης [δεν μπορεί να οξειδώσει μόνο του λιπίδια, DNA και τις περισσότερες πρωτεΐνες (Halliwell & Gutteridge, 2007)] συγκαταλέγεται στην κατηγορία των προ-οξειδωτικών λόγω της συμμετοχής του στην αντίδραση Fenton. Το ίδιο ισχύει και για τον Fe 2+, που αποτελεί την δεύτερη ουσία της παραπάνω αντίδρασης και ο οποίος έχει την ιδιότητα να δίνει και να δέχεται ηλεκτρόνια σχετικά εύκολα (Pantopoulos et al. 2012). Τέλος, σε αυτή την κατηγορία ανήκουν και μερικές αντιοξειδωτικές ουσίες, οι οποίες όταν βρεθούν σε περίσσια ή κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες δύναται να εμφανίσουν προ-οξειδωτική δράση [ασκορβικό οξύ (Bradshaw et al. 2003), α-τοκοφερόλη (Tafazoli et al. 2005), ουρικό οξύ (Sautin & Johnson 2008)]. Δραστικά είδη Η κατηγορία αυτή αναπτύχθηκε διεξοδικά στην ενότητα 1.1. Όπως έχει ήδη αναφερθεί μπορεί να αποτελείται από ελεύθερες ρίζες ή και μη ρίζες. Για τον άμεσο προσδιορισμό των δραστικών ειδών απαιτείται η χρήση της τεχνικής ESR (electron spin resonance) (Buettner 1987; Davies & Hawkins 2004), η οποία ανιχνεύει τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια και ως εκ τούτου είναι εφαρμόσιμη μόνο για την ανεύρεση των ελευθέρων ριζών και όχι των μη ριζών (Halliwell & Gutteridge 2007). Επειδή όμως πολλές ελεύθερες ρίζες αντιδρούν με γειτονικά μόρια σχεδόν ακαριαία, η 31

τεχνική αυτή δεν «προλαβαίνει» να ανιχνεύσει τις πολύ δραστικές ρίζες. Έτσι απαιτείται και η χρήση κάποιων ουσιών (spin traps), οι οποίες αντιδρούν με τις παραπάνω ελεύθερες ρίζες και σχηματίζουν άλλες ελεύθερες ρίζες, οι οποίες είναι λιγότερο δραστικές, πιο σταθερές και ταυτόχρονα ανιχνεύσιμες από την ESR. Προϊόντα οξείδωσης Η κατηγορία αυτή αποτελεί την πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη κατηγορία οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών για τον προσδιορισμό του οξειδωτικού στρες (Halliwell & Whiteman, 2004). Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει τις ουσίες που παράγονται από την αντίδραση των δραστικών ειδών με τα διάφορα βιομόρια. Τα βιομόρια αυτά είναι κυρίως οι πρωτεΐνες, τα λιπίδια και το DNA. Η πρωτεϊνική οξείδωση προσδιορίζεται κυρίως μέσω των πρωτεϊνικών καρβονυλίων (Levine et al. 2000) και μέσω των προϊόντων που παράγονται από την οξείδωση μεμονωμένων αμινοξέων (π.χ. νιτροτυροσίνη) (Hawkins et al. 2009). Όσον αφορά στην λιπιδική υπεροξείδωση, τα προϊόντα που χρησιμοποιούνται συχνότερα ως δείκτες για την εκτίμηση του οξειδωτικού στρες είναι τα συζυγή διένια, τα λιπιδικά υδροπεροξείδια, η μαλονυαλδεΰδη (MDA), τα ισοπροστάνια, η 4-υδροξυνονενάλη και οι ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS) (Therond et al., 2000; Halliwell & Whiteman, 2004). Τέλος, όσον αφορά στην DNA οξείδωση, οι πιο συνηθισμένες μέθοδοι είναι η μέτρηση της συγκέντρωσης της OH8dG (Halliwell & Whiteman, 2004; Collins, 2005; Dizdarοglu et al., 2002) και το Comet assay (Duthie et al. 1996; Fairbarian et al. 1995), το οποίο είναι μια μέθοδος gel ηλεκτροφόρησης, εφαρμόζεται απευθείας σε κύτταρα και εκτιμά τα σπασίματα της αλυσίδας του DNA. 32

Αντιοξειδωτικά H κατηγορία των αντιοξειδωτικών έχει αναπτυχθεί προηγουμένως στη ενότητα 1.2. Κύριοι αντιπρόσωποι αυτής της κατηγορίας είναι το ασκορβικό οξύ, η α-τοκοφερόλη, το ουρικό οξύ, η γλουταθειόνη και τα αντιοξειδωτικά ένζυμα (SOD, CAT, GPx). Όσον αφορά στα τελευταία, στις έρευνες είθισται να προσδιορίζεται η δράση τους (activity) και όχι η συγκέντρωση, η οποία μπορεί να μην έχει ιδιαίτερη σημασία. Λόγω της αυξημένης εξειδίκευσης που εμφανίζουν τα ένζυμα αυτά σχετικα με τις αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν (Murphy et al., 2011), ο προσδιορισμός των δράσης τους φαίνεται πως είναι πιο αντιπροσωπευτικός από τη συγκέτρωση. Οξειδοαναγωγικά ζεύγη Στην περίπτωση ενός οξειδοαναγωγικού ζεύγους, μεταξύ των δύο μορφών μιας ουσίας (ανηγμένη και οξειδωμένη) λαμβάνει χώρα μεταφορά ηλεκτρονίων. Η ανηγμένη μορφή χάνει ηλεκτρόνιο(-α) και μετατρέπεται στην οξειδωμένη και το αντίστροφο. Μέσω των συγκεντρώσεων των δύο μορφών και μέσω της εξίσωσης του Nernst υπολογίζεται το οξειδοαναγωγικό δυναμικό, το οποίο δίνει μια εικόνα της οξειδοαναγωγικής κατάστασης ενός οργανισμού (Dimauro et al. 2012; Go & Jones 2011; Kemp et al. 2008). Έχει μάλιστα προταθεί πως ένας βιολογικός οργανισμός ανταποκρίνεται ανάλογα με τις διαφοροποιήσεις σε αυτό το δυναμικό ( redox hypothesis ) (Schafer & Buettner 2001; Jones 2008).Το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο οξειδοαναγωγικό ζεύγος είναι αυτό της γλουταθειόνης (GSH/GSSG) λόγω της υψηλής συγκέντρωσης της GSH στο κύτταρο. Οι συνήθεις τιμές αυτού του ζεύγους από την εξίσωση του Nernst που ανταποκρίνονται στις αντίστοιχες οξεοδοαναγωγικές καταστάσεις αναγωγής ή οξείδωσης κυμαίνονται μεταξύ του -300mV και του -140mV αντίστοιχα (Kemp et al. 2008). 33

Η εξίσωση του Nernst είναι η παρακάτω Όπου ΔE 0 είναι το πρότυπο δυναμικό αναγωγής, το R είναι η παγκόσμια σταθερά των αερίων, Τ είναι η θερμοκρασία, n είναι ο αριθμός των ηλεκτρονίων που μεταφέρθηκαν, F είναι η σταθερά του Faraday και το Q είναι ο λόγος των συγκεντρώσεων των εταίρων της εξίσωσης υψωμένων σε δύναµη µε εκθέτη το συντελεστή τους στη χηµική εξίσωση. 34

1.4. Άσκηση και οξειδωτικό στρες Η άσκηση αντίθετα με άλλους οξειδωτικούς παράγοντες φαρμακολογικής φύσεως [τετραχλωριούχος άνθρακας (Kadiiska et al., 2005), υπεριώδης ακτινοβολία (Breusing et al., 2010), παρακουάτ (Hassett et al., 1987), έκθεση σε όζον (Morgan & Wenzel, 1985)], αποτελεί πιθανότατα το μοναδικό φυσιολογικό ερέθισμα που μπορεί να οδηγήσει σε μεταβολή της οξειδοαναγωγικής ομοιοστασης (Finkler et al., 2013; Neubauer et al., 2008; Nikolaidis et al., 2013; Radak et al., 2013). Πηγές του οξειδωτικού στρες κατά την άσκηση μπορεί να είναι είτε ο μυϊκός ιστός (Powers & Jackson, 2008) είτε το αίμα (Nikolaidis & Jamurtas, 2009). Tα τελευταία τριάντα χρόνια (Davies et al., 1981) η χρήση της άσκησης ως οξειδωτικό μέσο σε έρευνες με ανθρώπους είναι ιδιαίτερα συχνή. Διάφοροι τύποι άσκησης και πρωτόκολλα έχουν χρησιμοποιηθεί από τους ερευνητές στις διάφορες μελέτες προκειμένου να προκαλέσουν οξειδωτικό στρες με αποτελεσματικό τρόπο. Άσκηση με ή χωρίς μυϊκό τραυματισμό Ένας διαχωρισμός που πρέπει να γίνει ανάμεσα στους τύπους άσκησης είναι αυτός ανάμεσα στα είδη άσκησης που προκαλούν μυϊκό τραυματισμό όπως η έκκεντρη άσκηση και σε αυτά που δεν προκαλούν μυϊκό τραυματισμό όπως η σύγκεντρη. Πρέπει να σημειωθεί πως στην πραγματικότητα όλα τα είδη της άσκησης (ανεξαρτήτως τύπου ή έντασης) προκαλούν μυϊκό τραυματισμό. Ο παραπάνω όμως διαχωρισμός γίνεται με βάση την έκταση του τραυματισμού, ο οποίος στην περίπτωση της έκκεντρης άσκησης είναι εκτεταμένος. Είναι πλέον γνωστό ότι η έκκεντρη άσκηση προκαλεί μεγαλύτερο σε έκταση και διάρκεια οξειδωτικό στρες σε σχέση με την σύγκεντρη. Πιο συγκεκριμένα το 35

οξειδωτικό στρες μετά από έκκεντρη άσκηση διαρκεί περίπου 4 ημέρες και αποτελείται από δύο κύματα στρες, ένα αμέσως μετά την άσκηση για περίπου 6 με 8 ώρες και ένα δεύτερο κύμα που κορυφώνεται την τρίτη μέρα μετά την άσκηση (Close et al., 2004; Kerksick et al., 2013; Nikolaidis et al., 2007, 2008, 2012b; Silva et al. 2011; Theodorou et al., 2011). Η ύπαρξη δύο διαφορετικών κυμάτων οξειδωτικού στρες μας οδηγεί ενδεχομένως στο συμπέρασμα πως σε κάθε μία περίπτωση ο μηχανισμός που οδηγεί στην παραγωγή του στρες είναι διαφορετικός (π.χ. μιτοχονδριακή αναπνοή, οξειδάση της ξανθίνης, λευκοκύτταρα). Αντίθετα, η σύγκεντρη άσκηση προκαλεί ένα μόνο κύμα οξειδωτικού στρες μετά την άσκηση, το οποίο διαρκεί μόνο για λίγες ώρες (Bloomer et al., 2008; Fogarty et al., 2013; Michailidis et al., 2007). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, η έκκεντρη άσκηση να προσφέρει στους ερευνητές ένα μεγαλύτερο χρονικό περιθώριο για να διερευνήσουν τις μεταβολές και τη δυναμική της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης. Ένα δεύτερο πλεονέκτημα της έκκεντρης άσκησης συγκριτικά με την σύγκεντρη είναι ότι μετά από δύο μόλις συνεδρίες έκκεντρης άσκησης εμφανίζονται στον οργανισμό οξειδοαναγωγικές προσαρμογές (Nikolaidis et al., 2007, 2013). Αντίθετα, για να εμφανιστούν παρόμοιες προσαρμογές μετά από σύγκεντρη άσκηση απαιτείται περισσότερος από ένας μήνα προπονήσεων (σχήμα 10). 36

Σχήμα 10. Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα των μεταβολών (σε έκταση και χρόνο) και των προσαρμογών της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης μετά από δύο συνεδρίες σύγκεντρης και έκκεντρης άσκηση Οξεία και χρόνια άσκηση Ενώ όλοι οι τύποι οξείας άσκησης φαίνεται να προκαλούν οξειδωτικό στρες, η χρόνια άσκηση μειώνει αυτό το φαινόμενο (Gomez-Gabrera et al., 2008) και σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να παρατηρηθεί και αναγωγικό στρες. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν τα F 2 -ισοπροστάνια, των οποίων τα επίπεδα μετά από οξεία άσκηση αυξάνονται σημαντικά (Nieman et al., 2003), ενώ μετά από χρόνια άσκηση μπορεί να παρατηρηθεί μικρή μείωση στα επίπεδα τους (Galassetti et al., 2006) ή και καμία απολύτως αλλαγή (Watson et al., 2005). Το πιο σημαντικό όμως όταν διερευνούμε την αποτελεσματικότητα ενός οξειδοαναγωγικού παράγοντα είναι το μέγεθος των αλλαγών που αυτός επιφέρει στην οξειδοαναγωγική ομοιόσταση. Γνωρίζοντας λοιπόν πως η οξεία άσκηση μπορεί να προκαλέσει μέχρι και τριπλάσια μεταβολή στα επίπεδα των ισοπροστανίων σε σχέση με την χρόνια άσκηση (60% 37

αύξηση σε σχέση με 20% μείωση) (Nikolaidis et al., 2011), γίνεται κατανοητό ότι η οξεία άσκηση είναι προτιμότερη ως οξειδοαναγωγικό ερέθισμα (σχήμα 11). Συνοψίζοντας τα παραπάνω καταλήγουμε στο συμπέρασμα πως η οξεία έκκεντρη άσκηση αποτελεί το πιο αποτελεσματικό μοντέλο άσκησης για να διερευνηθούν οι αλλαγές της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας. Σχήμα 11. Μεταβολή της συγκεντρωσης των F 2 -ισοπροστανίων μετά από οξεία και χρόνια άσκηση (βασισμένο σε δεδομένα από Nikolaidis et al. 2011) Διακύμανση οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών μετά από άσκηση Όπως ήδη έχει αναφερθεί μια οξεία συνεδρία άσκησης προκαλεί μεταβολή της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης. Το συμπέρασμα αυτό προέκυψε από μια σειρά μελετών, οι οποίες ωστόσο επικεντρώθηκαν σε διαφορές μεταξύ ομάδων ατόμων, χωρίς να εξετάσουν την διατομική διακύμανση στις ανταποκρίσεις των διάφορων οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών. Η διατομική αυτή διακύμανση θα μπορούσε ενδεχομένως να εξηγήσει και την σημαντική ανομοιογένεια στις ανταποκρίσεις των 38

διάφορων οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών μετά από άσκηση ακόμα και μεταξύ καλά οργανωμένων ερευνών. Για παράδειγμα, τα F 2 -ισοπροστάνια, που θεωρούνται και ο δείκτης αναφοράς στο οξειδωτικό στρες, εμφανίζουν πολύ μεγάλο εύρος μεταβολής (από -27% έως +181%) μετά από οξεία άσκηση (Dreissigacker et al. 2010; McAnulty et al. 2005). Το ίδιο ισχύει και για το κύριο αντιοξειδωτικό των ερυθροκυττάρων, την γλουταθειόνη, η οποία μετά από άσκηση μπορεί να μεταβληθεί από -63% έως και +40% (Ji et al. 1993; Michailidis et al. 2007). Είναι επίσης ιδιαίτερα σημαντικό εδώ να αναφερθεί πως τα ευρήματα που αφορούν σε μια ομάδα ατόμων δεν βρίσκουν πλήρη εφαρμογή σε όλα τα μέλη της ομάδας αυτής (Bouchard & Rankinen 2001). Ως εκ τούτου, δεν είναι γνωστό εάν μετά από μια οξεία συνεδρία άσκησης όλα τα άτομα μιας ομάδας βιώνουν οξειδωτικό στρες. 39

1.5. Σκοπός Κύριος σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνήσει το ενδεχόμενο ορισμένοι από τους συμμετέχοντες να εμφανίσουν μη αναμενόμενες μεταβολές στα επίπεδα τριών συχνά χρησιμοποιούμενων οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών (F 2 -ισοπροστάνια, πρωτεϊνικά καρβονύλια και ανηγμένη γλουταθειόνη), μετά από μια οξεία συνεδρία έκκεντρης άσκησης. Επιμέρους σκοποί της έρευνας είναι: I. Να ποσοτικοποιήσει την διατομική διακύμανση των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών μετά την άσκηση. II. Να διερευνήσει την δυνητική εξάρτηση των μεταβολών των οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών μετά την άσκηση από τις αρχικές τους τιμές. III. Να διερευνήσει τις σχέσεις μεταξύ των τριών οξειδοαναγωγικών βιοδεικτών σε ηρεμία και μετά την άσκηση. IV. Να διερευνήσει το εάν και σε ποιο βαθμό το μέγεθος του μυϊκού τραυματισμού επηρεάζει τον βαθμό του οξειδωτικού στρες. 40

2. Μεθοδολογία 2.1. Συμμετέχοντες Ενενήντα οχτώ (Ν=98) νέοι άνδρες ελεύθερα ασκούμενοι ηλικίας 19 έως 30 ετών συμμετείχαν εθελοντικά στην παρούσα έρευνα. Όλοι οι συμμετέχοντες είχαν σταθερό σωματικό βάρος για τουλάχιστον ένα χρόνο πριν την διεξαγωγή της έρευνας, προϋπόθεση που εξασφαλίστηκε με τη συμπλήρωση ενός ερωτηματολογίου πριν την έναρξη της διαδικασίας. Ένας συμμετέχων εθεωρείτο ότι είχε σταθερό σωματικό βάρος εφόσον αυτό δεν άλλαξε περισσότερο από ±3 kg το χρονικό αυτό διάστημα του ενός έτους. Κριτήριο αποκλεισμού ενός συμμετέχοντα ήταν η ύπαρξη ιστορικού μυοσκελετικού τραυματισμού κάτω άκρου ή κάποιας νευρολογικής πάθησης που θα μείωνε την ικανότητά του να φέρει εις πέρας το πρόγραμμα άσκησης. Όλες οι διαδικασίες που ακολουθήθηκαν ήταν σε πλήρη συμφωνία με τη διακήρυξη του Ελσίνκι του 1975, όπως αυτή αναδιαμορφώθηκε το 2000. Τα ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά και η ημερήσια ενεργειακή πρόσληψη των συμμετεχόντων φαίνονται στον πίνακα 2. 41

Ζητήθηκε η γραπτή συγκατάθεση όλων των συμμετεχόντων αφού πρώτα ενημερώθηκαν για όλες τους κινδύνους, την δυσφορία και τα οφέλη που ενδεχομένως θα προέκυπταν από το πρόγραμμα της έκκεντρης άσκησης. Δόθηκαν επίσης οδηγίες στους συμμετέχοντες ώστε να απέχουν από οποιαδήποτε δραστηριότητα έντονης άσκησης για χρονικό διάστημα 5 ημερών πριν την συνεδρία της παρούσας έρευνας και για δύο ημέρες μετά (2 η λήψη δείγματος αίματος). Τέλος ζητήθηκε από τους συμμετέχοντες να αποφύγουν την λήψη αντιφλεγμονώδους ή αναλγητικής αγωγής κατά την διάρκεια της έρευνας. Οι συμμετέχοντες ανέφεραν την συμμετοχή τους σε ψυχαγωγικές δραστηριότητες μέσω ενός επικυρωμένου ερωτηματολογίου που αποτελείτo από τέσσερεις ερωτήσεις (Wareham et al., 2003). Η πρώτη ερώτηση αφορούσε στις φυσικές απαιτήσεις της εργασίας τους ενώ η δεύτερη στην χρονική διάρκεια (ώρες/εβδομάδα) που αφιερώνουν σε ψυχαγωγικές δραστηριότητες (π.χ. περπάτημα, δουλειές στο σπίτι, ποδήλατο). Στην τρίτη ερώτηση κλήθηκαν να απαντήσουν στο εάν κάποιες από τις δραστηριότητες της δεύτερης ερώτησης τους προκάλεσαν εφίδρωση ή ταχυκαρδία και αν ναι πόσες ώρες την εβδομάδα διήρκησαν οι δραστηριότητες αυτές. Τέλος, στην τέταρτη ερώτηση ανέφεραν την συχνότητα, την ένταση και την ποσότητα των σκαλοπατιών που ανέβηκαν κατά την διάρκεια μιας εβδομάδας. Σε περίπτωση που κάποιος από τους συμμετέχοντες δεν πληρούσε τις παραπάνω προϋποθέσεις (π.χ. έλαβε κάποια αντιφλεγμονώδη αγωγή ή συμμετείχε σε κάποια άλλη έντονη δραστηριότητα) αποκλειόταν από το τελικό δείγμα. 42

2.2. Ερευνητικός σχεδιασμός Όλοι οι συμμετέχοντες πραγματοποίησαν μια οξεία συνεδρία ισοκινητικής έκκεντρης άσκησης με τους εκτείνοντες μύες του γόνατος του προτιμώμενου κάτω άκρου. Δείγματα πλάσματος, ερυθροκυττάρων και ούρων συλλέχτηκαν αμέσως πριν και 48 ώρες μετά το πρόγραμμα άσκησης. Για τις δύο αυτές χρονικές στιγμές αξιολογήθηκαν η μυϊκή λειτουργία (ισομετρική ροπή), ο μυϊκός τραυματισμός (κρεατινική κινάση, CK), δύο οξειδωτικοί βιοδείκτες (F 2 -ισοπροστάνια, F 2 -IsoPs; πρωτεϊνικά καρβονύλια) και ένα μη ενζυμικό αντιοξειδωτικό (ανηγμένη γλουταθειόνη, GSH). Σε κάθε συμμετέχοντα χορηγήθηκαν γραπτώς κατευθυντήριες γραμμές για την παρακολούθηση της διατροφής του και ένα φύλλο καταγραφής, στο οποίο καταγράφηκε η ημερήσια διατροφική του πρόσληψη (πίνακας 2). 2.3. Πρωτόκολλο έκκεντρης άσκησης Η συνεδρία έκκεντρης άσκησης πραγματοποιήθηκε σε ένα ισοκινητικό δυναμόμετρο (Cybex Norm, Ronkonkoma, NY) (εικόνα 1). Το πρωτόκολλο πραγματοποιήθηκε από την καθιστή θέση (120 ο γωνία ισχίου) αφού πρώτα οι συμμετέχοντες σταθεροποιήθηκαν στη σωστή θέση με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συμμετέχοντες ολοκλήρωσαν 5 σετ των 8 έκκεντρων μέγιστων εθελοντικών συστολών [εύρος κίνησης, 0 ο (πλήρης έκταση) προς 90 ο κάμψη] με γωνιακή ταχύτητα ίση με 60 ο /δευτερόλεπτο. Ανάμεσα στα set υπήρχε ένα 2λεπτο διάλειμμα. 43

Εικόνα 1. Ισοκινητικό δυναμόμετρο Cybex Norm, Ronkonkoma, NY 2.4. Μυϊκή λειτουργία και μυϊκός τραυματισμός Το ισοκινητικό δυναμόμετρο χρησιμοποιήθηκε και για την μέτρηση και αξιολόγηση της μέγιστης ισομετρικής ροπής των εκτεινόντων μυών του γόνατος στις 90 ο κάμψη. Πιο συγκεκριμένα υπολογίστηκε από τον μέσο όρο τριών μέγιστων εκούσιων συστολών. Για να εξασφαλιστεί η μέγιστη προσπάθεια από την πλευρά των συμμετεχόντων, η διαδικασία επαναλαμβανόταν σε περίπτωση που η μεγαλύτερη και η μικρότερη επίδοση είχαν διαφορά μεγαλύτερη από 10%. Ανάμεσα στις ισομετρικές προσπάθειες υπήρξε ένα διάλειμμα 2 λεπτών. Η κρεατινική κινάση υπολογίστηκε στο πλάσμα φασματοφωτομετρικά με τη χρήση εμπορικά διαθέσιμου kit της Spinreact (Sant Esteve, Spain). 44