Βελτιστοποίηση της σύστασης για την ανάπτυξη προϊόντος τύπου εµβάµµατος σαλάτας εµπλουτισµένου µε προβιοτική καλλιέργεια

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Βελτιστοποίηση της σύστασης για την ανάπτυξη προϊόντος τύπου εµβάµµατος σαλάτας εµπλουτισµένου µε προβιοτική καλλιέργεια ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ ΣΠΑΝΟΥ ΑΝΝΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Β. ΚΙΟΣΕΟΓΛΟΥ (ΚΑΘ.) (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) Φ. ΜΑΝΤΖΟΥΡΙ ΟΥ (ΛΕΚΤ.) Α. ΠΑΡΑΣΚΕΥΟΠΟΥΛΟΥ (ΕΠΙΚ. ΚΑΘ.) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ. στα πλαίσια του Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών υπό την καθοδήγηση του Καθηγητή Β. Κιοσέογλου και της Λεκτόρισσας Φ. Μαντζουρίδου τους οποίους και ευχαριστώ θερµά για την επιστηµονική και ηθική τους υποστήριξη, καθώς και την άριστη συνεργασία κατά την διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης την Επίκουρη Καθηγήτρια Α. Παρασκευοπούλου µέλος της τριµελούς επιτροπής, για τις πολύτιµες συµβουλές και υποδείξεις της. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους εργάστηκαν στον ίδιο χώρο για την άψογη συνεργασία τους. Σπανού Άννα Θεσσαλονίκη 2010

3 Στον πατέρα µου, Νικόλαο

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη... 6 1. Θεωρητικό µέρος.. 9 1.1 Προβιοτικά τρόφιµα.9 1.1.1. Προϊόντα µε βάση το γάλα....11 1.1.2. Άλλα Προιόντα...14 1.2. Οφέλη στην υγεία που προέρχονται από τους προβιοτικούς µικροοργανισµούς..... 16 1.2.1. Πρόληψη διάρροιας που προκαλείται από παθογόνα βακτήρια και ιούς..16 1.2.2. Μόλυνση και επιπλοκές από τοhelicobacter pylori.....17 1.2.3. Φλεγµονώδεις ασθένειες και εντερικό σύνδροµο..17 1.2.4 Καρκίνος...18 1.2.5 Αλλεργίες.18 1.3 Κριτήρια που πρέπει να πληρούν οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί......18 1.4 Γαλακτοβάκιλλοι.....20 1.5 Πρεβιοτικά........23 1.5.1 Ινουλίνη..24 1.6 Συµβιωτικές ενώσει......25 1.7 Γαλακτώµατα...26 1.7.1 Γαλακτωµατοποιητές...27 1.7.2 Ο ρόλος του κρόκου αυγού στα γαλακτώµατα... 28 1.7.3 Ο ρόλος των πολυσακχαριτών στα γαλακτώµατα.....28 1.7.4 Εµβάµµατα Σαλάτας..29 2. Αντικειµενικός σκοπός..... 31 3. Πειραµατικό µέρος....... 32 3.1 Υλικά-Αντιδραστήρια....... 33 3.2 Συσκευές........33 3.3 Πειραµατική διαδικασία.....33 3.3.1 Παρασκευή µικροβιολογικών υποστρωµάτων..33 3.3.2 Παρασκευή γαλακτωµάτων ελαίου σε νερό (o/w)..34

5 3.3.3 Παρασκευή του διαλύµατος πεψίνης.35 3.3.4 Παρασκευή του διαλύµατος παγκρεατίνης και χολικών αλάτων 36 3.3.5 ιατήρηση και aνακαλλιέργεια του µικροοργανισµού......36 3.3.6 Προετοιµασία του µικροοργανισµού για τον εµβολιασµό των γαλακτωµάτων.36 3.3.7 Εµβολιασµός των γαλακτωµάτων µε ελεύθερα κύτταρα του µικροοργανισµού 36 3.3.8 Εγκλεισµός των κυττάρων στα σταγονίδια του ελαίου του γαλακτώµατος 37 3.4 Πειραµατικός σχεδιασµός. 40 3.5. Μελέτη µε τη βοήθεια πολυωνιµικού µοντέλου µε τη µεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης της επίδρασης του χρόνου αποθήκευσης και της σύστασης στη βιωσιµότητα του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 και τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά του γαλακτώµατος...42 3.6 Μικροβιολογικές αναλύσεις.. 42 3.6.1 ειγµατοληψία..42 3.6.2 Καταµέτρηση του βακτηρίου..... 42 3.6.3 Έλεγχος επιµολύνσεων 43 3.6.4 Μελέτη της υδροφοβικότητας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού..43 3.5. Φυσικοχηµικές µετρήσεις διαλυµάτων ινουλίνης και γαλακτωµάτων..44 3.5.1 Μέτρηση του µεγέθους των σταγονιδίων σε διαλύµατα ινουλίνης και σε γαλακτώµατα..44 3.5.2 Πειράµατα αποκορύφωσης. 44 3.5.3 Παρατήρηση των γαλακτωµάτων στο µικροσκόπιο..45 3.5.4 Μέτρηση του ιξώδους των διαλυµάτων ινουλίνης και των γαλακτωµάτων..45 4. Αποτελέσµατα-Συζήτηση..46 4.1 Επίδραση της οµογενοποίησης και το χρόνου αποθήκευσης του γαλακτώµατος στη βιωσιµότητα των κυττάρων..... 46 4.2 Εγκλεισµός των κυττάρων στη φάση του ελαίου του γαλακτώµατος και µελέτη της βιωσιµότητας σε συνάρτηση µε τη φύση του γαλακτωµατοποιητή..... 52

6 4.3 Επίδραση της προσθήκης σακχαρόζης και ινουλίνης στη βιωσιµότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης του γαλακτώµατος.....61 4.4 Μελέτη της επίδρασης του χρόνου αποθήκευσης του γαλακτώµατος σε συνδυασµό µε την συγκέντρωση του κρόου αυγού και της ινουλίνης στη βιωσιµότητα της προβιοτικής καλλιέργειας...66 5. Συµπεράσµατα..... 86 6. Προτάσεις για µελλοντική έρευνα......... 87 7.Βιβλιογραφία.... 88

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια ανάπτυξης ενός νέου προβιοτικού τροφίµου τύπου εµβάµµατος σαλάτας µε την ενσωµάτωση ινουλίνης (µέσος βαθµός πολυµερισµού 22-26) και προβιοτικής καλλιέργειας Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DC 412. Αρχικά µελετήθηκε η επίδραση της οµογενοποίησης (µηχανική διεργασία κατά την διάρκεια παρασκευής του γαλακτώµατος) στη βιωσιµότητα των κυττάρων του µικροοργανισµού. ιαπιστώθηκε ότι ο πληθυσµός των κυττάρων του βακτηρίου που επιβιώνει κατά την οµογενοποίηση είναι σηµαντικά υψηλότερος του αντίστοιχου πληθυσµού που απαιτείται ώστε να χαρακτηριστεί το τρόφιµο προβιοτικό (>10 6 cfu/g τροφίµου). Στη δεύτερη φάση της µελέτης εξετάστηκε η βιωσιµότητα των κυττάρων του Lact. paracasei subsp. paracasei DC412 µετά την ενσωµάτωσή τους στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος τύπου εµβάµµατος σαλάτας που περιείχε κρόκο αυγού κατά την αποθήκευσή του στους 4 ο C για 12 εβδοµάδες. Ο πληθυσµός του προβιοτικού (1,2x10 7 cfu/g) που µετρήθηκε στο γαλάκτωµα µετά από 12 εβδοµάδες συντήρησης στους 4 ο C θεωρήθηκε ικανοποιητικός. Με σκοπό την ενίσχυση της βιωσιµότητας του προβιοτικού µικροοργανισµού ώστε να διατηρηθεί για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα στο τρόφιµο αλλά και για να εξασφαλιστεί η ζωτικότητά του κατά την διέλευση από τον γαστρεντερικό σωλήνα, στις επόµενες φάσεις της µελέτης εξετάστηκε η επίδραση α) του εγκλεισµού των κυττάρων του µικροοργανισµού στα σταγονίδια του ελαίου σε γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας µε διαφορετικούς γαλακτωµατοποιητές, και β) της προσθήκη παραγόντων ανάπτυξης (σακχαρόζη) και πρεβιοτικών (ινουλίνη) στον πληθυσµό της προβιοτικής καλλιέργειας τόσο κατά την αποθήκευση των γαλακτωµάτων όσο και µετά την κατεργασία σε συνθήκες πέψης. ιαπιστώθηκε ότι τα εγκλεισµένα κύτταρα δεν επιβίωσαν µετά από 2 εβδοµάδες αποθήκευσης και κατεργασίας, ενώ µε ενδιαφέρον παρατηρήθηκε ότι ο πληθυσµός του µικροοργανισµού σε όλα τα εµπλουτισµένα γαλακτώµατα µε ινουλίνη παρουσία ή απουσία σακχαρόζης, τόσο κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης (συνολική διάρκεια αποθήκευσης 4 εβδοµάδων) όσο και µετά από κατεργασία σε εργαστηριακές συνθήκες πέψης, ήταν σηµαντικά αυξηµένος. Οι πληροφορίες που συλλέχτηκαν από τις προκαταρκτικές πειραµατικές δοκιµές χρησιµοποιήθηκαν για την ανάπτυξη µαθηµατικών µοντέλων πρόβλεψης του χρόνου διατήρησης του προβιοτικού τροφίµου και των απαιτούµενων

8 συγκεντρώσεων ινουλίνης και κρόκου αυγού ώστε να επιτευχθεί η παρασκευή ενός σταθερού από φυσικοχηµική άποψη προϊόντος µε ικανοποιητικό πληθυσµό προβιοτικής καλλιέργειας µετά την αποθήκευσή του ή/και σε συνδυασµό µε την έκθεσή του σε εργαστηριακές συνθήκες ανάλογες µε αυτές της πέψης.

9 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πολλές µελέτες µέχρι σήµερα έχουν δείξει ότι η υγεία του ανθρώπου είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε τη διατροφή του. Στο πλαίσιο αυτό, η έρευνα και η ανάπτυξη των λειτουργικών τροφίµων µε ευεργετική δράση στην υγεία του ανθρώπου εµφανίζουν ραγδαία εξέλιξη στον ευρωπαϊκό και διεθνή χώρο (Siró et al. 2007). Λόγω του ότι τα λειτουργικά τρόφιµα είναι µια έννοια παρά µια καθορισµένη οµάδα προϊόντων, έχει προταθεί ένας ορισµός «εγκεκριµένος» από την Ευρωπαϊκή Αρχή για τα λειτουργικά Τρόφιµα European Commission Concerted Action on Functional Food Science in Europe (FUFOSE) σύµφωνα µε τον οποίο: «Ένα τρόφιµο µπορεί να θεωρηθεί ως λειτουργικό αν αποδεικνύεται ικανοποιητικά ότι επηρεάζει ευεργετικά µία ή περισσότερες λειτουργίες του σώµατος, πέρα από τα επαρκή θρεπτικά αποτελέσµατα, κατά τέτοιο τρόπο που να έχει σχέση είτε µε βελτίωση της υγείας είτε µε ευηµερία και/ ή τη µείωση κινδύνων από ασθένειες. Ένα λειτουργικό τρόφιµο πρέπει να παραµένει τρόφιµο και να εκδηλώνει τα αποτελέσµατά του σε ποσότητες που αναµένεται ότι θα καταναλωθούν στο πλαίσιο µιας κανονικής διατροφής: δεν είναι δισκίο ή κάψουλα, αλλά µέρος µιας συνηθισµένης διατροφής» (Diplock et all, 1999). Η αποδοχή και η αγορά των λειτουργικών τροφίµων αυξάνονται συνεχώς στις προηγµένες χώρες, ιδιαίτερα εφόσον υπάρχουν επιστηµονικές αποδείξεις σχετικά µε την επίδραση συγκεκριµένων συστατικών των τροφίµων αυτών στην υγεία. Έτσι, τα λειτουργικά τρόφιµα αναδύονται ως ένα νέο τµήµα της αγοράς των τροφίµων σε διεθνές επίπεδο, ενώ στην Ευρώπη η τάση που διαµορφώνεται στην αγορά δείχνει ότι θα αποτελέσουν στο άµεσο µέλλον ένα δυναµικό κλάδο (Τζιά, 2004). 1.1 Προβιοτικά τρόφιµα Τα προβιοτικά τρόφιµα αντιπροσωπεύουν ένα µεγάλο µέρος του εύρους των λειτουργικών τροφίµων. Είναι τρόφιµα εµπλουτισµένα µε καλλιέργειες µικροοργανισµών που έχουν προβιοτικές ιδιότητες (probiotic). Η λέξη προβιοτικό είναι σύνθετη και προκύπτει από τη λέξη «προ» και τη λέξη «βιοτικό» που σηµαίνει «ζωή» (δηλ. προβιοτικό: για την ζωή). Ο όρος χρησιµοποιήθηκε αρχικά από τους Lilly και Stillwell το 1965. Ένας ορισµός που θα µπορούσε να δοθεί για το προβιοτικό είναι ο εξής: «προβιοτικό είναι ένα σκεύασµα ή ένα προϊόν το οποίο

10 περιέχει σε επαρκείς πληθυσµούς, συγκεκριµένους µικροοργανισµούς, που µεταβάλλουν θετικά την µικροχλωρίδα σε ένα τµήµα του ξενιστή, ασκώντας έτσι ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του.» Εναλλακτικά, ως προβιοτικές καλλιέργειες ορίζονται συγκεκριµένα στελέχη ζωντανών µικροοργανισµών, η παρουσία των οποίων στο έντερο, στην δραστική τους µορφή και σε επαρκή πληθυσµό, επιδρά µε θετικό τρόπο στην υγεία του ανθρώπου (ξενιστή) (FAO/WHO, 2001). Τα κύρια γένη βακτηρίων που χρησιµοποιούνται σήµερα ως προβιοτικά για τον εµπλουτισµό διαφορετικών κατηγοριών τροφίµων είναι αυτά του Lactobacillus και του Bifidobacterium. Πίνακας 1: Eίδη µικροοργανισµών που χρησιµοποιούνται ως προβιοτικά (Τζανετάκης, 2003). Γαλακτοβάκιλλοι Γαλακτόκοκκοι Leuconostoc Στρεπτόκοκκοι Εντερόκοκκοι Πεδιόκοκκοι Προπιονικά βακτήρια Bifidobacteria Ζύµες Lactobacillus acidophilus Lact. gasseri. Lact. jonhsonii Lact. delbrueckii subsp. Bulgaricus Lact. helveticus Lact. paracasei subsp. paracasei Lact. casei Lact. plantarum Lact. GG Lact. rhamnosus Lact. curvatus Lact. brevis Lact. fermentum Lact. reuteri Lact. cellobiosus L. lactis subsp. lactis L.lactis subsp. cremoris Leu. mesenteroides. Subsp. Dextranicus Streptococcus Thermophilus Enterococcus faecium E. faecalis Pediococcus acidilactici Propioniobacterium freudenreichii Bifidobacterium bifidum B. infantis B. longum B. breve B. adolescentis Sacccharomyces cerevisiae S. boulardii

11 Εκτιµάται ότι πάνω από 80 προβιοτικά προϊόντα διατίθενται αυτή τη στιγµή στην παγκόσµια αγορά. Μεταξύ των προβιοτικών τροφίµων τα γαλακτοκοµικά προϊόντα είναι αυτά µε την µεγαλύτερη κατανάλωση παγκοσµίως. Οι πωλήσεις τους ανέρχονταν στα 1,35 δισεκατοµµύρια δολάρια το 1999, µε ολοένα αυξανόµενη ζήτηση ώστε να αποτελούν το 56% των πωλήσεων των λειτουργικών τροφίµων το 2004 µε παγκόσµιο τζίρο 31,1 δισεκατοµµύρια δολάρια. Οι χώρες µε την µεγαλύτερη κατανάλωση αυτών των προϊόντων είναι οι Σκανδιναβικές χώρες, η Ολλανδία, η Ελβετία, η Κροατία και η Εσθονία, ενώ αναπτυσσόµενες αγορές αποτελούν η Ελλάδα, η Γαλλία και η Ισπανία (Siro et al., 2008). Ιδιαίτερη θέση στις διατροφικές συνήθειες της Ευρώπης κατέχει µία ευρεία γκάµα γαλακτοκοµικών προϊόντων (γάλα, γιαούρτι και ροφήµατα γιαουρτιού) που έχουν εµπλουτιστεί µε προβιοτική καλλιέργεια Lactobacillus acidophilus ή/και Bifidobacterium spp. (Champagne & Gardner, 2005). Στα προϊόντα αυτά η προσθήκη της προβιοτικής καλλιέργειας βελτιώνει τόσο τη διατροφική αξία όσο και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους. Επίσης, σε πολλά είδη τυριών η προβιοτική καλλιέργεια χρησιµοποιείται µαζί µε την καλλιέργεια εκκίνησης συµµετέχοντας και στην ωρίµανσή τους. Προβιοτικοί µικροοργανισµοί έχουν ενσωµατωθεί και στην σκόνη γάλακτος που αποτελεί βάση για παιδικές τροφές, γλυκά, προϊόντα ζαχαροπλαστικής, παγωτά και σοκολάτες, και σε διάφορους χυµούς φρούτων και λαχανικών (Champagne et al., 2005; Siro et al., 2008; Espinoza & Navarro, 2008). Τέλος, µια άλλη κατηγορία προβιοτικών τροφίµων είναι διάφορα ζυµούµενα τρόφιµα όπως προϊόντα κρέατος, αλλαντικά ωρίµανσης και παραδοσιακά προϊόντα ζύµωσης λαχανικών (kimchi και πίκλες) (Champagne & Gardner, 2005). 1.1.1. Προϊόντα µε βάση το γάλα Τα γαλακτοκοµικά προϊόντα είναι αυτά στα οποία κυρίως ενσωµατώνονται προβιοτικοί µικροοργανισµοί. Η ενσωµάτωση τους µπορεί να γίνει είτε στο γάλα το οποίο θα χρησιµοποιηθεί για την παρασκευή των διαφόρων προϊόντων είτε απευθείας στο προϊόν. Υπάρχει ένα πλήθος προϊόντων γιαουρτιού που διατίθενται αυτή τη στιγµή στην παγκόσµια αγορά και αναφέρονται ως βίο-γιαούρτια. Στο γιαούρτι συνήθως η προβιοτική καλλιέργεια προστίθεται µαζί µε την καλλιέργεια εκκίνησης. Τα στελέχη που χρησιµοποιούνται ως προβιοτικά στελέχη στο βίο-γιαούρτι είναι στελέχη των ειδών S. Thermophilus, Lact. delbrueckii ssp. Bulgaricus, Lact. casei and Lact. acidophilus, B. Bifidum, B. infantis, B. adolescentis και B. Longum. Τα

12 γιαούρτια αυτά θα πρέπει να εξασφαλίζουν ότι κατά τη διάρκεια της συντήρησης του τροφίµου ο πληθυσµός του προβιοτικού µικροοργανισµού θα είναι τουλάχιστον 10 6 cfu/g και οι καταναλωτές θα πρέπει να καταναλώνουν τουλάχιστον 100 g προϊόντος ηµερησίως ώστε να εξασφαλιστεί η ευεργετική τους δράση (Shah 2000). Στα προϊόντα αυτά θα πρέπει να γίνεται προσεκτική επιλογή της καλλιέργειας εκκίνησης ώστε αυτή να µη δρα ανταγωνιστικά προς την προβιοτική καλλιέργεια. Θα πρέπει να µελετηθεί και η επίδραση των προβιοτικών µικροοργανισµών στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος καθώς µπορεί να εµφανιστούν τεχνολογικά προβλήµατα που σχετίζονται µε την εµφάνιση ανεπιθύµητης υφής, οσµής και γεύσης (υπέρ-οξίνιση). Επειδή τα προβιοτικά στελέχη των γαλακτοβακίλλων αναπτύσσονται σε µικρό-αναερόβιες συνθήκες, συστήνεται, επίσης, να χρησιµοποιούνται γυάλινοι περιέκτες ως µέσα συσκευασίας του γιαουρτιού παρά πλαστικοί, καθώς αποκλείουν την επαφή του ατµοσφαιρικού οξυγόνου µε το προϊόν. Τέλος, έχει βρεθεί ότι η διασφάλιση της ζωτικότητας του προβιοτικού µικροοργανισµού, τόσο κατά την διάρκεια της συντήρησης του γιαουρτιού όσο και κατά την διέλευση του από το γαστρεντερικό σωλήνα, ενισχύεται σηµαντικά µε την προσθήκη επιπλέον θρεπτικών συστατικών στο τρόφιµο (εκχύλισµα ζύµης, βιταµίνες, αµινοξέα, πεπτίδια) ή µε την µικροενθυλάκωσή του (Shah 2000). Σε αντίθεση µε τα γιαούρτια και τα φρέσκα προϊόντα γάλακτος, στα τυριά η παρασκευή και η ωρίµανσή τους µπορεί να διαρκέσει από µερικές µέρες έως δύο χρόνια. Στο τέλος του χρονικού αυτού διαστήµατος το φορτίο του προβιοτικού µικροοργανισµού θα πρέπει να διατηρηθεί σε επίπεδα τουλάχιστον 10 6 cfu/g προϊόντος. Ο τύπος του τυριού που έχει χρησιµοποιηθεί από τους περισσότερους ερευνητές για την ενσωµάτωση πρoβιοτικών είναι το τυρί τύπου Τσένταρ, η ωρίµανση του οποίου µπορεί να απαιτήσει χρονικό διάστηµα έως και ενάµιση χρόνο (Ross et al, 2002. Gardiner et al, 1998, Gardiner et al, 1999). Οι Gardiner και συνεργάτες, (1998) ενσωµάτωσαν µε επιτυχία στελέχη του Lact. Paracasei στο συγκεκριµένο τυρί αφού ο αριθµός των ζώντων κυττάρων, µετά την ωρίµανση, έφτανε σε 10 8 cfu/g. Επιπλέον, η προσθήκη της προβιοτικής καλλιέργειας δεν είχε καµία επίδραση στο άρωµα, την υφή και τη γεύση του τυριού. Οι Gardiner και συνεργάτες, (1999) ενσωµάτωσαν στελέχη του Enterococcus faecium σε τυρί τύπου τσένταρ και υποστήριξαν ότι το προϊόν αυτό αποτελούσε έναν πολύ καλύτερο φορέα προβιοτικών σε σχέση µε το γιαούρτι, καθώς προστατεύει πολύ καλύτερα τον

13 µικροοργανισµό κατά την διέλευση του από τον γαστρεντερικό σωλήνα. Σε σύγκριση των δύο µετά την ωρίµανση του τυριού (15 µήνες) ο πληθυσµός του µικροοργανισµού στο τυρί ήταν 4 10 8 cfu/g και µετά από κατεργασία σε συνθήκες πέψης έφτανε σε 2 10 6 cfu/g ενώ στο γιαούρτι µετά από 30 µέρες ο πληθυσµός των κυττάρων µετά την κατεργασία ήταν 5.2 10 5 cfu/g. Η µεγαλύτερη περιεκτικότητα σε λίπος στο τυρί σε σχέση µε το γιαούρτι θεωρήθηκε ότι ήταν ο καθοριστικός παράγοντας για την επιβίωση του µικροοργανισµού. Άλλος τύπος τυριού στο όποιο προστέθηκε προβιοτική καλλιέργεια είναι το σκληρό τυρί αργεντινής στο οποίο ενσωµατώθηκαν στελέχη των ειδών Lactobacillus acidophilus και Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei. Οι καλλιέργειες προστέθηκαν στο γάλα που χρησιµοποιήθηκε για την παρασκευή του τυριού. Μετά από 60 ηµέρες ωρίµανσης ο πληθυσµός των µικροοργανισµών παρέµεινε υψηλός (4 10 6 cfu/g) αλλά στο τυρί που προστέθηκαν τα στελέχη του Lactobacillus acidophilus παρατηρήθηκε µεγάλη πτώση της τιµής του ph (Hynes et al., 2005). Για τυριά τύπου κρέµας ή επαλειφόµενα υπάρχουν στη βιβλιογραφία περιορισµένα δεδοµένα. Τα τυριά αυτού του τύπου έχουν πιο σύντοµο χρονικό διάστηµα ωρίµανσης. Οι Songisepp και συνεργάτες, (2004) ενσωµάτωσαν το στέλεχος Lactobacillus fermentum ME-3 σε παραδοσιακό τυρί κρέµα της χώρας τους. Επέλεξαν το συγκεκριµένο στέλεχος διότι έχει αντιµικροβιακές ιδιότητες έναντι των παθογόνων Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella enteritidis και Shigella sonnei, και αντιοξειδωτικές ιδιότητες καθώς δεσµεύει ρίζες *OH. Ο µικροοργανισµός προστέθηκε µαζί µε την καλλιέργεια εκκίνησης και ο πληθυσµός του µετά από 30 ηµέρες έφτανε σε 5 10 7 cfu/g (Songisepp et al., 2004). Το παγωτό αποτελεί δυνητικά ένα καλό φορέα προβιοτικών καθώς είναι πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά (πρωτεΐνες γάλακτος, λιπίδια, σάκχαρα και άλλα). Η ενσωµάτωση της προβιοτικής καλλιέργειας, όµως, απαιτεί τη βελτιστοποίηση όλων των σταδίων παραγωγής του προϊόντος και κυρίως του σταδίου της κατάψυξης, όπου η διαδικασία της κρυστάλλωσης του νερού δεν θα πρέπει να επηρεάσει τη βιωσιµότητα των µικροοργανισµών. Από την άλλη θα πρέπει να µελετηθούν µε προσοχή και οι τυχόν αλλαγές που µπορεί να επιφέρει η προβιοτική καλλιέργεια στα οργανοληπτικά χαρακτηρίστηκα του παγωτού και κυρίως στην αίσθηση στο στόµα και στον ρυθµό µε τον οποίο τήκεται η δοµή του. Ο µικροοργανισµός συνήθως προστίθεται µετά την παστερίωση του παγωτού µαζί µε την καλλιέργεια εκκίνησης

14 και αυτό κάνει σηµαντική την επιλογή και της καλλιέργειας εκκίνησης που δεν θα πρέπει να δρα ανταγωνιστικά. Ο µικροοργανισµός προστίθεται µετά από αφυδάτωση µε την µέθοδο της κρυοξήρανσης. Το ποσοστό επιβίωσης των προβιοτικών µικροοργανισµών στο παγωτό εξαρτάται από το στέλεχος που θα ενσωµατωθεί, τον ανταγωνισµό µε την καλλιέργεια εκκίνησης και την τελική οξύτητα του προϊόντος ( τα στελέχη του γένους Bifidobacterium είναι πιο ευαίσθητα στις χαµηλές τιµές ph σε σχέση µε του γένους Lact.) (Cruz et al., 2009). Παρόλα αυτά δεν έχουν παρατηρηθεί σηµαντικές µεταβολές στη βιωσιµότητα των µικροοργανισµών όταν το παγωτό αποθηκευτεί στους -20 ο C για διάστηµα 6 µηνών. Οι πληθυσµοί που έχουν καταµετρηθεί µετά από αυτό το χρονικό διάστηµα για τα στελέχη των ειδών Lact. acidophilus, Lact. Agilis, Bifidobacterum bifidu, και Lact. Rhamnosus είναι µεταξύ 1,5 x 10 8 και 2,5 x 10 8 cfu/ml (Basygit et al., 2006). Ερευνητές, επίσης, µελέτησαν την προσθήκη πρεβιοτικών στο παγωτό ταυτόχρονα µε την ενσωµάτωση προβιοτικών. Η προσθήκη ινουλίνης είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση του πληθυσµού και επιπλέον παρατηρήθηκε αύξηση του ιξώδους και της σταθερότητας του παγωτού κατά την διάρκεια της αποθήκευσής του (Akalin & Erisir, 2008). Συµπερασµατικά, το παγωτό είναι ένας πολύ καλός φορέας προβιοτικών ιδιαίτερα επειδή καταναλώνεται από άτοµα κάθε ηλικίας και κυρίως παιδιά, πρόβληµα όµως αποτελεί η περίοδος κατανάλωσης του καθώς αυτή περιορίζεται στους καλοκαιρινούς µήνες. 1.1.2. Άλλα προϊόντα Έχουν γίνει προσπάθειες και για την παρασκευή χυµών και αποξηραµένων φρούτων µε την προσθήκη προβιοτικών καλλιεργειών καθώς πρόκειται για τρόφιµα µε µεγάλη θρεπτική αξία που απευθύνονται σε καταναλωτές κάθε ηλικίας και συντελούν στην διατήρηση της ευεξίας τους. Αν και η έλλειψη θρεπτικών συστατικών και κυρίως αµινοξέων που είναι απαραίτητα για την επιβίωση των βακτηρίων του γένους Lact. αποτέλεσε πρόβληµα αρχικά, η χρήση στελεχών του γένους µε µικρότερες απαιτήσεις σε θρεπτικά συστατικά και ειδικότερα των ειδών Lact. casei, Lact. Rhamnosus και Lact. paracasei αποτέλεσε τη λύση του προβλήµατος. Χυµοί στους οποίους έχουν προστεθεί προβιοτικοί µικροοργανισµοί µε επιτυχία είναι χυµοί πορτοκαλιών, µύρτιλων (επίσης αποκαλούµενα βακκίνια) και ανανά, µε τον πληθυσµό των µικροοργανισµών να φτάνει σε 1 x 10 7 cfu/ml µετά από τουλάχιστον 12 εβδοµάδες. Προβιοτικοί µικροοργανισµοί, όµως, δεν µπορούν να ενσωµατωθούν απευθείας σε ασθενώς όξινους χυµούς αφού η µείωση του ph λόγω

15 της παραγωγής οξέων από τους γαλακτοβάκκιλους αλλοιώνει τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους. Σε χυµούς όπως αυτόν της µπανάνας προβιοτικοί µικροοργανισµοί έχουν προστεθεί µόνο µετά από προηγούµενο εγκλεισµό τους σε σφαιρίδια αλγινικών αλάτων µε χιτοζάνη (Espinoza & Navvaro, 2008). Προβιοτικά στελέχη των ειδών Saccharomyces cerevisiae και Lact. casei spp. Rhamnosus έχουν καθηλωθεί σε αποξηραµένα µήλα µε την µέθοδο της ακινητοποίησης υπό κενό. Πιο συγκεκριµένα, οι µικροοργανισµοί προστέθηκαν σε αρχικό πληθυσµό 10 7 cfu/g στα µήλα και στη συνέχεια τα µήλα αποξηράθηκαν στους 40 ο C µέχρι η περιεκτικότητα του νερού να είναι 0.37 kg νερού/kg. Μετά από αποθήκευση δύο µηνών ο αριθµός ζώντων κυττάρων των µικροοργανισµών ανερχόταν σε 10 6 cfu/g (Betoret et al, 2003). Το κρέας που είναι πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά απαραίτητα για την ανάπτυξη µικροοργανισµών έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας εξαιρετικός φορέας προβιοτικών καλλιεργειών προσφέροντας, επιπλέον, προστασία έναντι των χολικών αλάτων. Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί προστίθενται κυρίως σε ζυµούµενα προϊόντα κρέατος, όπως τα λουκάνικα στα οποία η προβιοτική καλλιέργεια συνήθως αναµιγνύεται µε την καλλιέργεια εκκίνησης. Προβιοτικοί µικροοργανισµοί που έχουν χρησιµοποιηθεί για την παρασκευή λουκάνικων είναι κυρίως του γένους Lactobacillus και, πιο συγκεκριµένα, τα είδη Lact. casei, Lact. curvatus, Lact. pentosus, Lact. plantarum, Lact. sakei, Pediococcus acidilactici και P. pentosaceus. (Espinoza & Navarro, 2008). Ο πληθυσµός της προβιοτικής καλλιέργειας στο προϊόν µπορεί να ανέρχεται µέχρι και 10 10 cfu/g προϊόντος (Erkkilä et al., 2001). Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί προσφέρουν µικροβιακή σταθερότητα στα λουκάνικα αφού δρουν ανταγωνιστικά έναντι των παθογόνων Listeria monocytogenes και Escherichia coli O157:H7 (υπεύθυνα για τροφικές δηλητηριάσεις από προϊόντα κρέατος) (Petäja & Sandholm, 2002), βελτιώνουν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους και µειώνουν τη συγκέντρωση των βιογενών αµινών. Τέλος, επιχειρήθηκε από τους Lavermicocca και συνεργάτες, (2005) η ενσωµάτωση προβιοτικών στελεχών των ειδών Bifidobacterium bifidus, Bifidobacterium longum, Lact. ramnosus και Lact. paracasei σε επιτραπέζιες ελιές. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν µαύρες και πράσινες ελιές. Τα αποτελέσµατα της µελέτης έδειξαν ότι οι ελιές είναι ένα τρόφιµο που µπορεί να εµπλουτιστεί µε προβιοτικά στελέχη καθώς ο πληθυσµός των στελεχών των προβιοτικών καλλιεργειών έφτανε µέχρι και σε 10 7 cfu/g µετά από 3 µήνες αποθήκευσης

16 (συγκεκριµένα για το στέλεχος Lact. paracasei IMPC2.1). Όταν οι ελιές καταναλώθηκαν από έγκυες γυναίκες για διάστηµα 10 ηµερών πριν τον τοκετό ο προβιοτικός µικροοργανισµός ήταν δυνατόν να ανιχνευθεί και στα νεογέννητα. 1.2 Οφέλη στην υγεία που προέρχονται από τους προβιοτικούς µικροοργανισµούς Αν και τα οφέλη των προβιοτικών µικροοργανισµών για την υγεία του καταναλωτή είναι δεδοµένα, δεν είναι πλήρως κατανοητός ο µηχανισµός της ευεργετικής δράσης τους. Γενικά, η ευεργετική δράση των προβιοτικών µικροοργανισµών έχει συσχετιστεί κυρίως µε την αυξηµένη αντοχή τους έναντι παθογόνων µικροοργανισµών και την ικανότητά τους να αναστέλλουν την ανάπτυξη των τελευταίων, λόγω της παραγωγής αντιµικροβιακών ουσιών (βακτηριοσίνες ή οξέα), αλλά και εξαιτίας της ανταγωνιστικής δράσης, και της ενίσχυσης του ανοσοποιητικού συστήµατος (Shah, 2007). Μελέτες καταδεικνύουν τη δράση των προβιοτικών µικροοργανισµών έναντι διαφόρων ασθενειών που σχετίζονται κυρίως µε την διατάραξη της φυσιολογικής µικροχλωρίδας του εντέρου. Παρακάτω, παρατίθεται αναλυτικά ο τρόπος δράσης των προβιοτικών µικροοργανισµών έναντι της διάρροιας, ασθενειών που σχετίζονται µε διατάραξη της µικροχλωρίδας του εντέρου, του καρκίνου του παχέους εντέρου και των αλλεργιών. 1.2.1 Πρόληψη διάρροιας που προκαλείται από παθογόνα βακτήρια και ιούς Η λοιµώδης διάρροια είναι ένα από τα σηµαντικότερα προβλήµατα υγείας στον κόσµο, υπεύθυνη για αρκετά εκατοµµύρια θανάτους το χρόνο. Αν και οι περισσότεροι θάνατοι αφορούν παιδιά στις αναπτυσσόµενες χώρες, εκτιµάται ότι πάνω από το 30% του πληθυσµού ακόµα και στις ανεπτυγµένες χώρες υποφέρουν κάθε χρόνο από διάρροια που προκαλείται από επιµολυσµένη τροφή. Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί µπορούν δυνητικά να περιορίσουν το παραπάνω πρόβληµα. Οι µικροοργανισµοί που έχουν σηµαντικότερη δράση για την πρόληψη της διάρροιας είναι ο Lact. ramnosus GG και ο Bifidobacterium lactis ΒΒ-12. Μελέτες αποδεικνύουν ότι ο τρόπος δράσης των παραπάνω προβιοτικών στελεχών σχετίζεται µε την ανταγωνιστική δράση έναντι των εντεροπαθογόνων µε αποτέλεσµα την παρεµπόδιση της ανάπτυξης και της προσκόλλησής τους στο εντερικό περιβάλλον. Πέραν της λοιµώδους διάρροιας τα προβιοτικά παρεµποδίζουν την ανάπτυξη και παθογόνων στελεχών του γένους Salmonella και Listeria (διάρροια των ταξιδιωτών).

17 Ένα άλλο, επίσης, σηµαντικό πρόβληµα που σχετίζεται µε την χορήγηση αντιβιοτικών, είναι η πρόκληση διάρροιας, που προέρχεται από το παθογόνο βακτήριο Clostridium difficile. Ο µικροοργανισµός αυτός δεν είναι ξένος για τον ανθρώπινο µικροοργανισµό σε φυσιολογική κατάσταση του εντέρου, άλλα σε περίπτωση διαταραχής της ενδογενούς µικροχλωρίδας από τα αντιβιοτικά ο πληθυσµός του Clostridium difficile αυξάνεται και παράγει µια τοξίνη που προκαλεί τα συµπτώµατα της διάρροιας. Οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί συµβάλλουν στην αποκατάσταση και διατήρηση του πληθυσµού της ενδογενούς µικροχλωρίδας κατά την διάρκεια της χορήγησης των αντιβιοτικών, ώστε να µην επιτρέπεται η ανάπτυξη των παθογόνων (Rastall et al. 2005). 1.2.2 Μόλυνση και επιπλοκές από το Helicobacter pylori Μια νέα εξέλιξη στις εφαρµογές των προβιοτικών µικροοργανισµών αποτελεί η ανταγωνιστική δράση τους έναντι του Helicobacter pylorι, ενός Gram αρνητικού παθογόνου βακτηρίου, το οποίο είναι υπεύθυνο για την γαστρίτιδα τύπου Β, το πεπτικό έλκος και τον καρκίνο του στοµάχου. In vitro µελέτες έχουν δείξει ότι τα βακτήρια του γένους Lactobacillus µπορούν να παρεµποδίσουν την ανάπτυξη του Helicobacter pylori κυρίως λόγω µείωσης της δραστικότητας του ενζύµου ουρεάση που είναι απαραίτητο για την επιβίωση του παθογόνου βακτηρίου στο όξινο περιβάλλον του στοµάχου (Midolo et al., 1995; Kabir et al., 1997; Aiba et al.,1998; Coconnier et al., 1998). 1.2.3 Φλεγµονώδεις ασθένειες του εντερικού συστήµατος Οι φλεγµονώδεις παθήσεις του εντέρου, όπως η φλεγµονή του ειλεού και η ασθένεια του Crohn, συνήθως προκαλούνται από κάποια διαταραχή της ενδογενούς µικροχλωρίδας του εντέρου, λόγω λοίµωξης (Shanahan, 2000). Πρόσφατα δεδοµένα έρευνας, αν και σε αρχικό ακόµα στάδιο, αποδεικνύουν δράση των προβιοτικών µικροοργανισµών έναντι αυτών των ασθενειών. Έρευνες υποστηρίζουν τον σηµαντικό ρόλο των προβιοτικών µικροοργανισµών στην θεραπεία αλλά και στην πρόληψη των ασθενειών ιδιαίτερα µε την χρήση µικτής προβιοτικής καλλιέργειας. Περαιτέρω κλινικές και µοριακές µελέτες απαιτούνται ώστε να κατανοήσουµε πλήρως τον τρόπο αλληλεπίδρασης των µικροβίων µεταξύ τους, καθώς και µε τα κύτταρα, τους ιστούς και το ανοσοποιητικό σύστηµα του ξενιστή (Gionchetti et al., 2000, Gupta et al.,2000).

18 1.2.4 Καρκίνος Αν και δεν υπάρχουν σαφείς αποδείξεις, υπάρχουν κάποια στοιχεία που δείχνουν ότι τα προβιοτικά µπορούν να εµποδίσουν ή να καθυστερήσουν την εµφάνιση κάποιων τύπων καρκίνου. Τα στοιχεία αυτά βασίζονται στο γεγονός ότι κάποια στελέχη της χλωρίδας του εντέρου παράγουν καρκινογόνες ουσίες όπως οι νιτροζαµίνες. Η χορήγηση στελεχών του γένους Lactobacillus και Bifidobacterium µπορεί να τροποποιήσει την µικροχλωρίδα ώστε να µειωθεί η παραγωγή β- γλυκουρονιδάσης που είναι το υπεύθυνο ένζυµο για την παραγωγή των νιτροζαµινών (Hosada et al., 1996). Επιπλέον, κάποια στοιχεία δείχνουν ότι η µετάσταση καρκίνων (όπως στην ουροδόχο κύστη) µπορεί να περιοριστεί ή και να παρεµποδιστεί µέσω της έγχυσης στο έντερο προβιοτικών µικροοργανισµών, όπως ο L. casei Shirota (Aso et al., 1995). In vitro µελέτες µε το στέλεχος L. rhamnosus GG και µε στελέχη του γένους Bifidobacterium, καθώς και in vivo µελέτες µε τα στελέχη L. rhamnosus GG και LG-705 και τα στελέχη του γένους Propionibacterium, έδειξαν µείωση της καρκινογένεσης από τη δράση αφλατοξινών. 1.2.5 Αλλεργίες Από µια σειρά πειραµατικών δοκιµών σε επίπεδο placebo στις οποίες χορηγήθηκε το στέλεχος L. rhamnosus GG σε έγκυες γυναίκες 4 εβδοµάδες πριν τον τοκετό και εν συνεχεία στα νεογνά για έξι µήνες (µε κίνδυνο εµφάνισης αλλεργιών), διαπιστώθηκε ότι µειώθηκε σηµαντικά ο κίνδυνος πρώιµων ατοπικών ασθενειών (άσθµα, δερµατίτιδα, ρινίτιδα) (Kalliomaki et al., 2001). Στην έρευνα αυτή φαίνεται ότι οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί δρουν στη διαµόρφωση του ανοσοποιητικού συστήµατος µε αποτέλεσµα να µην εκδηλώνονται αλλεργικές αντιδράσεις. 1.3 Κριτήρια που πρέπει να πληρούν οι προβιοτικοί µικροοργανισµοί Τα βασικά κριτήρια για την επιλογή των προβιοτικών µικροοργανισµών λαµβάνουν υπόψη την ασφάλεια, τη λειτουργικότητα και τις τεχνολογικές ιδιότητές τους (Εικόνα 1). Τα στελέχη θα πρέπει να είναι ικανά να παρέχουν τα οφέλη τους στο ξενιστή µέσω της ενεργοποίησής τους, της ανάπτυξης και της δραστικότητάς τους στον ανθρώπινο οργανισµό. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η διατήρηση της ζωτικότητάς τους µέχρι να φτάσουν στην περιοχή στόχο και να παραµείνουν

19 δραστικά µέχρι και εκείνο το σηµείο (Champagne & Gardner, 2005, Κιοσέογλου & Μπλέκας, 2009). Εικόνα 1. Κριτήρια επιλογής των προβιοτικών µικροοργανισµών. (Πηγή εικόνας: Mattila-Sandholm et al, 2002) Τα κριτήρια που πρέπει να ικανοποιεί ένας µικροοργανισµός ώστε να χαρακτηρίζεται ως προβιοτικό είναι τα παρακάτω (Saarela et al. 2000, Salminel et al, 1998, Κιοσέογλου & Μπλέκας, 2009): Να µην είναι παθογόνος και να µην έχει ιστορικό παθογένειας. Να είναι αποδεκτός ως ασφαλής (GRAS). Να µην έχει ιστορικό σύνδεσης µε ασθένειες όπως η λοιµώδης ενδοκαρδίτιδα. Να µη φέρει µεταβιβάσιµα γονίδια για ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά. Να µη δεσµεύει το ινοδογώνο (πρωτεΐνη του πλάσµατος) και να µην έχει αιµολυτική δράση Να µην αποικοδοµεί τα χολικά άλατα και τις µουκίνες (γλυκοπρωτεΐνες που αποτελούν συστατικά του γαστρικού και του εντερικού υγρού). Να µην ευνοεί τον σχηµατισµό βιογενών αµινών. Να µην ενεργοποιεί προ-καρκινογόνους παράγοντες και να µην αποικοδοµεί θρόµβους µε την δράση των υδρολυτικών του ενζύµων. Για χρήση στα τρόφιµα πρέπει να είναι ανθρώπινης προέλευσης. Να αντέχει σε όξινο περιβάλλον και στο περιβάλλον του ανθρώπινου γαστρικού υγρού.

20 Να προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου του εντέρου του ανθρώπου. Να αποικεί το έντερο του ανθρώπου. Να παρουσιάζει ανταγωνιστική δράση έναντι των παθογόνων µικροοργανισµών (Helicobacter pylori, Salmonella Sp., Listeria monocytogenes, Clostridium difficile). Να έχει αντι-µεταλλαξιγόνες και αντικαρκινογενετικές ιδιότητες. Για τη διατήρηση των διατροφικών πλεονεκτηµάτων των προβιοτικών τροφίµων απαιτείται η βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας του µικροοργανισµού, όπως επίσης και της τεχνολογίας παραγωγής του τροφίµου και ενσωµάτωσης σε αυτό του µικροοργανισµού, ώστε να επιτευχθεί η µέγιστη δυνατή ενίσχυση της βιωσιµότητας του µικροοργανισµού σε υψηλούς πληθυσµούς (10 6-10 7 cfu/g τροφίµου) τόσο κατά την παραγωγή και διατήρηση του προβιοτικού τροφίµου, όσο και κατά την κατανάλωση του (Richardson, 1996; Talwalkar et al. 2004) χωρίς να επηρεαστούν αρνητικά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τροφίµου στόχου. Οι σηµαντικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την επιβίωση του µικροοργανισµού είναι η σύσταση, η τιµή του ph του τροφίµου και η θερµοκρασία αποθήκευσής του. Επίσης, σε τρόφιµα µε τιµή ph χαµηλότερο του 4,4 (π.χ. επιδόρπια γιαουρτιών, αφεψήµατα) ο συνδυασµός του όξινου περιβάλλοντος και της µακράς διάρκειας αποθήκευσης του τροφίµου έχει βρεθεί ότι επηρεάζει αρνητικά την επιβίωση του µεγαλύτερου αριθµού των προβιοτικών στελεχών (Jardine, 2009). 1.4 Οι γαλακτοβάκιλοι Οι γαλακτοβάκιλοι είναι θετικά κατά Gram (+), µη σπορογόνα, ραβδόµορφα βακτήρια διαφόρων µεγεθών, από κοκκοβακίλους έως µεγάλα κύτταρα, που σχηµατίζουν αλυσίδες. Είναι συνήθως ακίνητα, ενώ όταν είναι κινητά φέρουν περίτριχα µαστίγια. Ανάγκες σε θρεπτικές ύλες Οι γαλακτοβάκιλοι χρησιµοποιούν ως πηγή άνθρακα κυρίως τη γλυκόζη και µπορεί να είναι είτε µονοζυµωτικοί (µε κύρια παράγωγη του γαλακτικού οξέος από την γλυκόζη), είτε ετεροζυµωτικοί (µε παραγωγή γαλακτικού οξέος, διοξειδίου του

21 άνθρακα, αιθανόλης και οξικού οξέος). Αν και οι γαλακτοβάκιλοι έχουν ιδιαίτερες θρεπτικές απαιτήσεις (σε αµινοξέα, πεπτίδια, βιταµίνες και άλλα), µπορούν να επιβιώσουν σε µια ευρεία περιοχή συνθηκών µε την προϋπόθεση ότι πάντα θα υπάρχει διαθέσιµη πηγή υδατανθράκων, αζώτου και βιταµινών (Jardine, 2009). Περιβαλλοντικοί παράγοντες που επιδρούν στην ανάπτυξη Οι γαλακτοβάκιλοι έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν σε συνθήκες χαµηλών τιµών ph καθώς και οι ίδιοι παράγουν οργανικά οξέα µε αποτέλεσµα τη µείωση της τιµής του ph του µικροπεριβάλλοντός τους. Αν και η βέλτιστη τιµή ph ανάπτυξής τους είναι µεταξύ 5,5-5,8, µπορούν να αναπτυχθούν εξίσου καλά και σε τιµές ph κάτω του 4. Αυτή τους η ικανότητά τους δίνει ανταγωνιστικό πλεονέκτηµα έναντι των άλλων µικροβίων που θα βρεθούν στις συγκεκριµένες συνθήκες σε αυτό το περιβάλλον. Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, οι γαλακτοβάκιλοι που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για χρήση τους ως προβιοτικά, είναι αυτοί που µπορούν να επιβιώσουν στις συνθήκες του ανθρώπινου γαστρο-εντερικού συστήµατος και µπορούν να αναπτυχθούν στο λεπτό έντερο. Στελέχη γαλακτοβακίλων έχουν αποµονωθεί από την στοµατική κοιλότητα, το στοµάχι, το παχύ και το λεπτό έντερο. Γαλακτοβάκιλοι έχουν, επίσης, ανιχνευθεί και στο τελικό τµήµα του ειλεού καθώς και στο κόλον (Jardine, 2009). Θερµοκρασία Με βάση τη θερµοκρασία ανάπτυξής τους, το γένος Lactobacillus διακρίνεται σε τρεις κατηγορίες: τα thermobacteria, τα streptobacteria και τα betabacteria. Η οµάδα των thermobacterium περιλαµβάνει οµοζυγωτικά είδη που αναπτύσσονται σε υψηλές θερµοκρασίες. Η άριστη θερµοκρασία ανάπτυξής τους είναι µεταξύ 40 και 42 ο C και η µέγιστη µεταξύ 50και 53 ο C. εν αναπτύσσονται σε θερµοκρασίες κάτω από τους 15 ο C. Στην οµάδα των streptobacterium ανήκουν και τα στελέχη της κατηγορίας L. casei. Τα τελευταία χαρακτηρίζονται από τη δυνατότητα ανάπτυξης ακόµα και στους 6 ο C. Η άριστη θερµοκρασία ανάπτυξής τους είναι µεταξύ 25 και 35 ο C ενώ πολλά στελέχη αναπτύσσονται ακόµα και στους 48 ο C. Στην οµάδα Betabacterium ταξινοµούνται 11 είδη γαλακτοβακίλων που έχουν όλοι τη δυνατότητα να αναπτύσσονται σε θερµοκρασία 15 ο C (Λιτοπούλου Τζανετάκη, 2004).

22 Οξυγόνο Οι γαλακτοβάκιλοι είναι, κυρίως, προαιρετικώς αναερόβιοι µικροοργανισµοί. Η παρουσία CO 2 σε ποσοστό 5-10 % και οι µερικώς αναερόβιες συνθήκες διεγείρουν την ανάπτυξή τους (Λιτοπούλου Τζανετάκη, 2004). Υπάρχουν περίπου 120 είδη γαλακτοβακίλων και τα πιο πρόσφατα είδη έχουν αποµονωθεί από πηγές φυτικής προέλευσης, από sourdough, και από το γαστροεντερικό σύστηµα ζώων και ανθρώπου. Οι γαλακτοβάκιλοι µπορούν να χωριστούν σε αρκετές κατηγορίες µε βάση την πηγή αποµόνωσής τους και το εύρος των εφαρµογών τους. Μερικά παραδείγµατα δίνονται στο Πίνακα 2. Πίνακας 2: Κατηγορίες γαλακτοβακίλων. Lactobacillus buchneri Κυρίως σε ζυµώσεις Τρόφιµα σε σήψη τροφίµων. Lactobacillus casei Χρήση ως προβιοτικό και Γαστρεντερικό ανθρώπου σε ζυµώσεις κυρίως και ζώων γαλακτοκοµικών προϊόντων και φυτικών. Lactobacillus Delbrueckeii Κυρίως σε γαλακτοκοµικά Γαστρεντερικό ανθρώπου προϊόντα και ζώων, φυσικά ζυµούµενα προϊόντα. Lactobacillus plantarum Φυτικά ζυµούµενα Φυτικά υλικά από προϊόντα σε αναερόβιες αναερόβιες συνθήκες συνθήκες Lactobacillus reuteri Κυρίως προβιοτική χρήση Γαστρεντερικό ανθρώπου και ζώων. Lactobacillus sakei Ζυµώσεις σε προϊόντα Φρέσκο κρέας και ψάρι κρεάτων και ψαροσκυασµάτων Lactobacillus salivarius Ζωικής και ανθρώπινης προέλευσης Πηγές του πίνακα: Prebiotics and Probiotics 2009, http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/microbewiki, Παπαγεωργίου., 2009.

23 Τα στελέχη του γένους Lactobacillus είναι ιδιαίτερα σηµαντικά για τις προβιοτικές τους ιδιότητες καθώς είναι εξαιρετικά δραστικά στην πρόληψη και αντιµετώπιση ασθενειών του γαστρο-εντερικού συστήµατος. 1.5 Πρεβιοτικά Ο όρος πρεβιοτικό εισήχθη από τους Gibson & Roberfroid (1995) οι οποίοι αντάλλαξαν το πρόθεµα «προ», µε το πρόθεµα «πρε», που σηµαίνει «πριν» αντί «για». Ο ορισµός που θα µπορούσε να δοθεί για το πρεβιοτικό είναι: «πρεβιοτικό είναι ένα άπεπτο συστατικό ενός τροφίµου το οποίο επιδρά ευεργετικά στον ξενιστή, διεγείροντας εκλεκτικά την ανάπτυξη και/ή τη δραστηριότητα ενός περιορισµένου αριθµού βακτηρίων στο έντερο». Η χρήση προβιοτικών συνδυάζεται συχνά µε τη χρήση υλών που έχουν πρεβιοτικές ιδιότητες. Τα πρεβιοτικά είναι µη διασπώµενα από τον οργανισµό συστατικά των τροφίµων που δρουν και ενεργοποιούν την ανάπτυξη και τη δραστηριότητα των βακτηρίων του παχέως εντέρου µε αποτέλεσµα την ευεργετική επίδραση στην υγεία του ξενιστή. Τα πρεβιοτικά φτάνουν στο κόλον χωρίς να διασπαστούν και εκεί λειτουργούν ως υπόστρωµα για τα ενδογενή βακτήρια του ξενιστή. Για να χαρακτηριστεί ένα συστατικό των τροφίµων ως πρεβιοτικό θα πρέπει (Bomba et al, 2002): να µην υδρολύεται και να µην απορροφάται από το άνω τµήµα του γαστροεντερικού συστήµατος. να είναι εκλεκτικό υπόστρωµα για ένα ή για περιορισµένο αριθµό βακτηρίων που παρασιτούν στο έντερο, τα οποία αναπτύσσονται και/ή ενεργοποιούνται µεταβολικά. να είναι σε θέση να ενεργοποιήσει την µικροχλωρίδα του εντέρου ώστε να έχει πιο ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία του ξενιστή να φέρουν συστηµατικές επιδράσεις οι οποίες είναι ευεργετικές για την υγεία του ξενιστή. Στην κατηγορία των πρεβιοτικών ανήκουν µη αφοµοιώσιµοι υδατάνθρακες (ολιγοσακχαρίτες, όπως για παράδειγµα η ραφφινόζη, η ινουλίνη και οι φρούκτοολιγοσακχαρίτες). Τα συστατικά τροφίµων ή τα τρόφιµα που περιέχουν ποσότητα προβιοτικών και πρεβιοτικών και δρουν µαζί ονοµάζονται συµβιωτικά.

24 1.5.1 Ινουλίνη Η ινουλίνη είναι ένα φυσικό συστατικό πολλών φρούτων και λαχανικών και παραλαµβάνεται από αυτά µε εκχύλιση µε ζεστό νερό (Villegas & Costell,2006). Το µόριο της ινουλίνης αποτελείται από µία αλυσίδα µορίων φρουκτόζης ( ο αριθµός των οποίων είναι µεταξύ 2 και 60) που συνδέονται µεταξύ τους µε β-(2 1) δεσµό και ένα τελικό µόριο γλυκόζης που συνδέεται µε την υπόλοιπη αλυσίδα µε δεσµό α-(1 2). Εικόνα 2. οµή ινουλίνης. Ο βαθµός πολυµερισµού της ινουλίνης εξαρτάται από την πηγή προέλευσης, το χρόνο συγκοµιδής του φυτού και τη διαδικασία παραλαβής της, για αυτό και συνήθως απαντάται ως µίγµα ολιγοµερών (µε µέσο βαθµό πολυµερισµού < 10 ) και πολυµερών (µε µέσο βαθµό πολυµερισµού 22-25) (Kim et al, 2000). Η ινουλίνη δρα ως πρεβιοτικό καθώς δεν µεταβολίζεται από τον ανθρώπινο οργανισµό και φτάνει στο κόλον όπου και µεταβολίζεται από τη βιογενή µικροχλωρίδα του εντέρου (Dahl et al,, 2004). Τα βακτήρια που έχουν την δυνατότητα να µεταβολίσουν την ινουλίνη είναι κυρίως προβιοτικά στελέχη που ανήκουν στα γένη Lactobacillus και Bifidobacterium. Τα στελέχη αυτά παράγουν τα ένζυµα β-φρουκτοσιδάσες, που είναι απαραίτητα για τον µεταβολισµό της ινουλίνης. Ανάλογα µε τον βαθµό πολυµερισµού της, τα ολιγοµερή της ινουλίνης µεταβολίζονται κυρίως στο αρχικό τµήµα του κόλον, ενώ οι µεγάλου µοριακού βάρους αλυσίδες ινουλίνης µεταβολίζονται στο ακραίο του τµήµα (Tarrega et al., 2009). Προϊόντα του µεταβολισµού της ινουλίνης είναι µικρής αλυσίδας λιπαρά οξέα, οξικό οξύ και εντερικά αέρια. Αποτέλεσµα της παραγωγής των λιπαρών οξέων και του οξικού οξέος είναι η πτώση της τιµής του ph στο περιβάλλον των προβιοτικών βακτηρίων. Το χαµηλό ph έχει ανασταλτική δράση έναντι της ανάπτυξης παθογόνων βακτηρίων

25 και κλωστριδίων (Gibson & Roberfroid, 1994, Dahl et al., 2004). Εκτός από πρεβιοτικό, η ινουλίνη είναι και διαιτητική ίνα. Πέραν της δράσης της ως πρεβιοτικό, η ινουλίνη έχει σηµαντικές τεχνολογικές ιδιότητες και εφαρµογές κυρίως ως γλυκαντική ουσία χαµηλής θερµιδικής αξίας (1,5 Kcal/g) και ως µιµητικό λίπους (Villegas & costell, 2006). Οι ιδιότητες αυτές της ινουλίνης εξαρτώνται από το βαθµό πολυµερισµού των αλυσίδων της. Τα µόρια της ινουλίνης µε µέσο βαθµό πολυµερισµού < 10 είναι περισσότερο διαλυτά στο νερό και έχουν γλυκύτητα παρόµοια µε αυτήν της σακχαρόζης. Τα µόρια της ινουλίνης µε µέσο βαθµό πολυµερισµού µεταξύ 22 και 25 είναι σταθερά σε υψηλές θερµοκρασίες (µέχρι και 190 ο C), λιγότερο διαλυτά στο νερό και αυξάνουν το ιξώδες του διαλύµατος στο οποίο προστίθενται (Tarrega et al, 2009). Ως µιµητικό λίπους χρησιµοποιείται η ινουλίνη µε υψηλό βαθµό πολυµερισµού. Η ιδιότητά της αυτή βασίζεται στην ικανότητα σχηµατισµού κρυστάλλων που αλληλεπιδρούν και σχηµατίζουν µία δοµή που εγκλωβίζει τα µόρια του διαλύτη και δίνει την αίσθηση λίπους. Τα τρόφιµα στα οποία η ινουλίνη προστίθεται ως συστατικό για την ανάπτυξη δοµής αποµίµησης του λίπους δίνουν συνήθως µια πιο κρεµώδη υφή στο στόµα ενώ η δοµή και η γεύση τους παραµένει ανεπηρέαστη (Jardine, 2009). 1.6 Συµβιωτικές ενώσεις Ο όρος συµβιωτικά χρησιµοποιείται όταν ένα προϊόν περιέχει τόσο προβιοτικά όσο και πρεβιοτικά. Ο ορισµός που θα µπορούσε να δοθεί για τα συµβιωτικά είναι: «Συµβιωτικά είναι µίγµατα προβιοτικών και πρεβιοτικών τα οποία επηρεάζουν ευεργετικά τον ξενιστή βελτιώνοντας την επιβίωση και την εµφύτευση ζώντων µικροβιακών διαιτητικών προσθέτων στο γαστρεντερικό σωλήνα, ενεργοποιώντας το µεταβολισµό ενός περιορισµένου αριθµού βακτηρίων τα οποία προάγουν την υγεία διεγείροντας εκλεκτικά την ανάπτυξη τους και βελτιώνοντας την ευεξία του ξενιστή» (Gibson & Roberfroid, 1995). Επειδή η λέξη συµβιωτικό υπαινίσσεται τη λέξη συνεργισµός, ο όρος θα πρέπει να χρησιµοποιείται µε επιφύλαξη για προϊόντα στα οποία το πρεβιοτικό συστατικό ευνοεί εκλεκτικά το προβιοτικό συστατικό.

26 1.7 Γαλακτώµατα Ως γαλάκτωµα ορίζεται το κολλοειδές σύστηµα διασποράς δυο µη αναµίξιµων υγρών (συνήθως έλαιο και νερό). Το ένα υγρό απαντά µε τη µορφή αιωρούµενων σταγονιδίων (µεγέθους 0,1 έως 100 µm) στο δεύτερο υγρό, που αποτελεί και τη συνεχή φάση του γαλακτώµατος (McClements, 1998, Friberg et al, 2004). Τα γαλακτώµατα µπορούν να κατηγοριοποιηθούν σύµφωνα µε την κατανοµή των φάσεων του ελαίου και του νερού σε: α) γαλακτώµατα ελαίου σε νερό (o/w), στα οποία τα σταγονίδια του ελαίου διασπείρονται στη συνεχή φάση του νερού. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα εµβάµµατα σαλάτας (salad dressings), οι µαγιονέζες και οι κρέµες γάλακτος. β) γαλακτώµατα νερού σε έλαιο (w/o), στα οποία τα σταγονίδια του νερού διασπείρονται στη φάση του ελαίου. Στα γαλακτώµατα αυτά ανήκουν το βούτυρο και η µαργαρίνη. γ) Εκτός από τον σχηµατισµό των απλών γαλακτωµάτων, είναι δυνατός και ο σχηµατισµός γαλακτωµάτων πολλαπλής φάσης του είδους o/w/o ή w/o/w (Dickinson & McClements, 1995), όπου συνυπάρχουν και οι δύο κατηγορίες γαλακτώµατος ελαίου σε νερό (o/w) και νερού σε έλαιο (w/o). Τα γαλακτώµατα είναι ετερογενή, θερµοδυναµικώς ασταθή, φυσικοχηµικά συστήµατα, διότι ενεργειακά δεν ευνοείται η ανάµιξη του ελαίου µε το νερό. Τα γαλακτώµατα είναι ασταθή από θερµοδυναµική άποψη εξαιτίας της µεγάλης ποσότητας ελεύθερης ενέργειας στη διεπιφάνεια των δύο υγρών (Halling, 1981). Υπάρχουν τέσσερις µηχανισµοί αποσταθεροποίησης των γαλακτωµάτων, όπως φαίνεται στην Εικόνα 3. Οι µηχανισµοί αυτοί είναι η αποκορύφωση (creaming), η συσσωµάτωση (flocculation), η συγχώνευση (coalescence) και η ιζηµατoαπόθεση (sedimentation) (McClements, 1998). Αποκορύφωση είναι η ανοδική κίνηση των σταγονιδίων του ελαίου, λόγω της διαφοράς πυκνότητας µε την υδατική φάση, χωρίς παράλληλα να παρατηρείται κάποια µεταβολή στο µέγεθός τους (Melik & Fogler, 1988; Dukhin & Sjoblom, 1996). Η συσσωµάτωση είναι επίσης µία αντιστρεπτή διαδικασία κατά την οποία τα σταγονίδια πλησιάζουν και δηµιουργούν ένα τρισδιάστατο πλέγµα.

27 Η συγχώνευση, περιλαµβάνει τη διάρρηξη του διεπιφανειακού υµενίου και τη συνένωση στη συνέχεια δύο ή περισσοτέρων σταγονιδίων, προς σταγονίδια µεγαλύτερου µεγέθους (van den Tempel, 1957). Η ιζηµαταπόθεση, είναι η καθοδική κίνηση των σταγονιδίων της φάσης σε διασπορά, λόγω της µεγαλύτερης πυκνότητας σε σχέση µε την υδατική φάση, µε αποτέλεσµα την εµφάνιση ιζήµατος. Εικόνα 3. Μηχανισµοί αποσταθεροποίησης των γαλακτωµάτων 1.7.1 Γαλακτωµατοποιητές Προκειµένου να αυξηθεί η σταθερότητα των γαλακτωµάτων, για να επιµηκυνθεί το όριο ζωής των διάφορων προϊόντων κατά την αποθήκευση, προστίθενται γαλακτωµατοποιητές ή σταθεροποιητές. Στη βιοµηχανία τροφίµων ένα πλήθος συστατικών χρησιµοποιούνται ως γαλακτωµατοποιητές. Κυριότεροι από αυτούς είναι ο κρόκος αυγού, η πρωτεΐνη του ορού γάλακτος και το αραβικό κόµµι (Dickinson, 2008). Οι γαλακτωµατοποιητές φέρουν στο µόριο τους δύο περιοχές (πολική/µη πολική, υδρόφιλη/υδρόφοβη). Στα γαλακτώµατα ελαίου/νερού οι γαλακτωµατοποιητές προσροφούνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου και µειώνουν την τιµή της επιφανειακής τάσης µεταξύ των δύο φάσεων και σχηµατίζουν µία µεµβράνη που µειώνει την τάση των σταγονιδίων του ελαίου για συγχώνευση. Οι γαλακτωµατοποιητές κατηγοριοποιούνται µε βάση τον υδρόφιλο/υδρόφοβο χαρακτήρα τους (Angelo A.J., 1989).

28 1.7.2 Ο ρόλος του κρόκου αυγού στα γαλακτώµατα Ο κρόκος του αυγού αποτελεί το 27-33% του βάρους του αυγού. Η περιεκτικότητα του κρόκου σε στερεά συστατικά τα οποία είναι κυρίως λιπίδια και πρωτεΐνες, ανέρχεται σε 50%. Το ποσοστό αυτό εξαρτάται από τον χρόνο αποθήκευσης, επειδή το νερό τείνει να µεταναστεύει από το άσπρο στον κρόκο. Οι πρωτεΐνες, που αποτελούν περίπου το 16,6% της µάζας του κρόκου, απαντούν κυρίως µε τη µορφή λιποπρωτεϊνών. Τα λιπίδια αποτελούν περίπου 32,6% της µάζας του κρόκου. Αυτά είναι σε ποσοστό 65,5% τριγλυκερίδια, 28,3% φωσφολιπίδια και 5,2% χοληστερόλη (Kiosseoglou, 1989). Εκτός από τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια, ο κρόκος περιέχει περίπου1% υδατάνθρακες καθώς και διάφορα ανόργανα στοιχεία, όπως φωσφόρο, ασβέστιο και κάλιο (Powrie, 1973). Ο κρόκος του αυγού χρησιµοποιείται ως γαλακτωµατοποιητής σε µια πληθώρα εδώδιµων προϊόντων όπως η µαγιονέζα, τα εµβάµµατα σαλάτας, οι κρέµες, τα κέικ και άλλα (Kiosseoglou, 2003). H ικανότητα του κρόκου να συµβάλει στην ελάττωση της διεπιφανειακής τάσης σε διεπιφάνειες ελαίου/νερού αποδίδεται τόσο στην παρουσία των LDL όσο και ορισµένων άλλων συστατικών του κρόκου, όπως είναι τα φωσφολιπίδια, οι λιβετίνες και η χοληστερόλη. Οι χαµηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες προσρoφούνται πολύ γρήγορα την επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου κατά τη διάρκεια της γαλακτωµατοποίησης, µε αποτέλεσµα να προστατεύουν τα σταγονίδια από τη µεταξύ τους συγχώνευση. Οι γαλακτωµατοποιητικές ικανότητες του αυγού επηρεάζονται από την συγκέντρωση του κρόκου του αυγού, την παρουσία άλλων συστατικών του αυγού, την τιµή ph, την περιεκτικότητα του χλωριούχου νατρίου, τη θερµοκρασία, το είδος του ελαίου του γαλακτώµατος και την παρουσία οργανικών διαλυτών (π.χ. αιθανόλη). H επίδραση των παραγόντων αυτών συνδέεται κυρίως µε τη διάσπαση των σωµατιδίων του κρόκου κατά την προσρόφηση των συστατικών και την απελευθέρωση, στη συνέχεια, των συστατικών τους (λιποπρωτεΐνες, χοληστερόλη και φωσφολιπίδια) στη διεπιφάνεια. 1.7.3 Ο ρόλος των πολυσακχαριτών στα γαλακτώµατα Οι πολυσακχαρίτες συµβάλλουν στην ανάπτυξη τόσο της δοµής όσο και των µηχανικών, φυσικοχηµικών και οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τροφίµων. Όπως αναφέρθηκε, ορισµένοι από αυτούς έχουν την ικανότητα να δρουν ταυτόχρονα ως γαλακτωµατοποιητές αλλά και ως παχυρευστοποιητές, σταθεροποιητές και

29 πηκτωµατοποιητές. Οι ιδιότητές τους αυτές συνδέονται άµεσα µε την µοριακή τους δοµή. Στα περισσότερα γαλακτώµατα, συνήθως, συνυπάρχουν πρωτεΐνες µε πολυσακχαρίτες (Abu Ghoush et al, 2008). Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µορίων των δύο πολυµερών οδηγούν σε φαινόµενα συµβατότητας και σταθεροποίησης του συστήµατος ή φαινόµενα ασυµβατότητας και διαχωρισµού φάσεων (de Kruif et al, 2001, Dickinson, 2003). Οι πολυσακχαρίτες, επίσης, προστίθενται ως παχυρευστοποιητές, τροποποιώντας την ρεολογική συµπεριφορά της συνεχούς φάσης καθυστερώντας ή εµποδίζοντας την αποκορύφωση. Η προσθήκη, σε µικρές συγκεντρώσεις, πολυσακχαριτών που δεν φέρουν φορτίο, συνήθως επιταχύνει το φαινόµενο της αποκορύφωσης µέσω του µηχανισµού της πολυµερικής συσσωµάτωσης. Ωστόσο, η προσθήκη τους σε µεγαλύτερη συγκέντρωση έχει ως αποτέλεσµα την σταθεροποίηση του γαλακτώµατος λόγω της αύξησης του ιξώδους της συνεχούς φάσης ή της δηµιουργίας ενός σταθερού δικτύου. Αυτός ο µηχανισµός µελετήθηκε από τους Parker και συνεργάτες, (1995), σε εµβάµµατα σαλάτας µε διαφορετικές συγκεντρώσεις ελαίου και ξανθάνης. 1.7.4 Εµβάµµατα σαλάτας Τα εµβάµµατα σαλάτας είναι ρευστά ή ηµίρευστα προϊόντα που χρησιµοποιούνται για να εµπλουτίσουν την γεύση της σαλάτας, των σάντουιτς ή ως συστατικά σε συνταγές για κρύα ή ζεστά γεύµατα. Τα εµβάµµατα σαλάτας χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες µε βάση τη σύσταση και τη σταθερότητά τους (Yang & Lal, 2003): 1. Εµβάµµατα ελαίου και ξυδιού 2. Εµβάµµατα που είναι γαλακτώµατα 3. Cooked salad dressings (γαλακτώµατα που περιέχουν άµυλο ως παχυρευστοποιητή) 4. Εµβάµµατα µε χαµηλή περιεκτικότητα σε λίπος/ προϊόντα διαίτης Κάθε τύπος εµβάµµατος πρέπει να πληροί συγκεκριµένες προδιαγραφές (να περιέχει συγκεκριµένα συστατικά και σε συγκεκριµένες περιεκτικότητες) οι οποίες καθορίζονται από οργανισµούς (στην Αµερική καθορίζονται από τον Οργανισµό τροφίµων και φαρµάκων, FDA).

30 H πλειονότητα των εµβαµµάτων είναι γαλακτώµατα ελαίου σε νερό. Στα εµβάµµατα αυτά ανήκουν οι µαγιονέζες και τα ρευστά εµβάµµατα τα οποία θα πρέπει να περιέχουν έλαιο σε περιεκτικότητα 30-45 % w/w και 65-80 % στην περίπτωση της µαγιονέζας. Πέραν του ελαίου θα πρέπει να περιέχουν κιτρικό ή οξικό οξύ σε περιεκτικότητα τουλάχιστον 2,5%. Ο ρόλος του κιτρικού ή του οξικού οξέος στο Έµβαµµα είναι η αποτροπή της ανάπτυξης µικροβιακού φορτίου στο προϊόν διατηρώντας την τιµή του ph του σε χαµηλά επίπεδα (ph<4). Περιέχουν επίσης αυγό ή κρόκο αυγού (υγρός, κατεψυγµένος ή σε µορφή σκόνης) και χλωριούχο νάτριο. Εκτός αυτών των βασικών συστατικών τα εµβάµµατα αυτά µπορεί να περιέχουν γλυκαντικές ουσίες όπως σακχαρόζη και µια ποικιλία φυσικών συστατικών που ενισχύουν την γεύση τους (πιπέρι, µουστάρδα, αρωµατικά βότανα και άλλα) (Yang & Lal, 2003).

31 2. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία είχε ως στόχο την ανάπτυξη τεχνογνωσίας για την παραγωγή ενός προβιοτικού τροφίµου τύπου εµβάµµατος σαλάτας µε την ενσωµάτωση στο προϊόν ινουλίνης (µέσος βαθµός πολυµερισµού 22-26) και προβιοτικής καλλιέργειας Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DC 412. Το συγκεκριµένο στέλεχος επιλέχθηκε µε βάση αποτελέσµατα µελετών που αποδεικνύουν τις προβιοτικές του ιδιότητες τόσο µε in vitro όσο και µε in vivo µεθόδους (Κουρελής, 2010). Αρχικά, µελετήθηκε η βιωσιµότητα των κυττάρων του προβιοτικού µικροοργανισµού τόσο στη συνεχή φάση όσο και στα σταγονίδια του γαλακτώµατος αυτού του τύπου που παρασκευάστηκε µε τη βοήθεια διαφορετικών γαλακτωµατοποιητών (κρόκος αυγού, µίγµα αραβικού κόµµεος/ξανθάνης, πρωτεΐνη ορού γάλακτος), µε ή χωρίς την προσθήκη ινουλίνης και σακχαρόζης. Η εκτίµηση της βιωσιµότητας του προβιοτικού µικροοργανισµού στα παραπάνω συστήµατα έγινε τόσο στα νωπά γαλακτώµατα όσο και µετά την αποθήκευσή τους σε συνδυασµό µε έκθεσή τους σε παράγοντες ανάλογους µε αυτούς τους οποίους ενδέχεται να εκτεθεί κατά την πέψη στον ανθρώπινο οργανισµό. Οι πληροφορίες που συλλέχτηκαν από τις προκαταρκτικές πειραµατικές δοκιµές αξιοποιήθηκαν για την ανάπτυξη µαθηµατικών µοντέλων πρόβλεψης του χρόνου διατήρησης του δυνητικά προβιοτικού τροφίµου και των συγκεντρώσεων της ινουλίνης και του κρόκου αυγού ώστε να επιτευχθεί η παρασκευή ενός σταθερού από φυσικοχηµική άποψη προϊόντος µε ικανοποιητικό αριθµό ζώντων κυττάρων προβιοτικής καλλιέργειας µετά την αποθήκευσή του ή/και σε συνδυασµό µε την έκθεσή του σε εργαστηριακές συνθήκες ανάλογες µε αυτές της πέψης.

32 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1 Υλικά - Αντιδραστήρια Ο µικροοργανισµός που χρησιµοποιήθηκε στην εργασία ήταν ο Lactobacillus paracasei subsp. paracasei DC 412 ο οποίος ήταν ευγενική προσφορά του Καθηγητή κ. Νίκου Τζανετάκη. Το στέλεχος αυτό ανήκει στη συλλογή του εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίµων του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης και αποµονώθηκε από ανθρώπινο παχύ έντερο (Xanthopoulos et al., 1999). Χρησιµοποιήθηκαν για τις µικροβιολογικές αναλύσεις τα θρεπτικά υποστρώµατα Man Rogosa and Sharpe (MRS) Broth (Panreac, Barcelona, Spain), MRS agar (Panreac Barcelona, Spain), Plate Count Agar (PCA) (Applichem, Darmstadt Germany), Potato Dextrose agar (PDA) (Applichem, Darmstadt Germany) και Kristallviolett-Galle-Lactose-Agar (Violet-Red-Bile-Agar) (Applichem, Darmstadt Germany). Για την παρασκευή των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκαν αυγά από την τοπική αγορά, εξευγενισµένο αραβοσιτέλαιο εµπορικού τύπου (ΦΛΩΡΑ, ΕΛΑΙΣ), χλωριούχο νάτριο (Panreac Barcelona, Spain), οξικό οξύ (16Ν) (Sigma-Aldrich Corporation, Steinheim, Germany). Επίσης, χρησιµοποιήθηκαν ινουλίνη µε µέσο βαθµό πολυµερισµού 23 (ΜΒ 4200) (Alfa Aesar Gmbh & Co A18425, Karlsruhe, Germany), αραβικό κόµµι (Fluka, Switzerland), πρωτεΐνη ορού γάλακτος (WPI) (DAVISCO), ξανθάνη εµπορίου (1253-100G Batch#023K0185) (Sigma-Aldrich Corporation, Steinheim, Germany) και σακχαρόζη (Merck, Darmstadt Germany). Για την παρασκευή του τεχνητού γαστρικού υγρού χρησιµοποιήθηκε το ένζυµο πεψίνη (pepsin from porcine gastric mucosa) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany P7000-25G, 424 U/mg solid). Η ρύθµιση της οξύτητας του διαλύµατος πεψίνης έγινε µε τη χρήση πυκνού HCl (Riedel-de-Haen, Seelze Germany). Για την παρασκευή του διαλύµατος χολικών αλάτων και παγκρεατίνης χρησιµοποιήθηκαν παγκρεατίνη (pancreatin from porcine pancreas), (Sigma-Aldrich, Steinheim Germany, P7545-25G) και χολικά άλατα (Merck, Darmstadt Germany). Για την παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος χρησιµοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια NaH 2 PO 4 (Merck, Darmstadt Germany) και KH 2 PO 4 (Merck, Darmstadt Germany).

33 3.2 Συσκευές Για την παρασκευή των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκε µηχανικός αναδευτήρας µε προπέλα RW 14H (IKA Instruments, Germany) και οµογενοποιητής Ultra Turrax T25 (IKA Labortechnik, Germany) µε στέλεχος S25KG-25F. Για την παστερίωση των συνεχών φάσεων των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκε υδρόλουτρο, model WB 3015, (Bioline Scientific). Για την αποστείρωση της φάσης του ελαίου και των σκευών χρησιµοποιήθηκε αποστειρωτήρας (Tefal). Η ρύθµιση της οξύτητας των διαλυµάτων και των γαλακτωµάτων έγινε µε τη χρήση ψηφιακού πεχαµέτρου MP220 (Mettler Toledo, Germany). Οι ζυγίσεις έγιναν σε αναλυτικό ζυγό µε ακρίβεια ± 1mg EORV70 Explorer (Ohaus, Switzerland). Για την ήπια ανάδευση διαλυµάτων καθώς και την ανάδευση και θέρµανση των υποστρωµάτων χρησιµοποιήθηκε µαγνητικός αναδευτήρας τύπου SMT 150 της Bioline Scientific (Greece). Η µικροσκοπική παρατήρηση των γαλακτωµάτων έγινε µε τη βοήθεια µικροσκοπίου Axiolab A εφοδιασµένου µε φακούς Carl Zeiss, ενώ οι εικόνες αποτυπώθηκαν µε ψηφιακή φωτογραφική µηχανή Power Shot G2 (Canon). Για τη µέτρηση του µέσου µεγέθους των σταγονιδίων του γαλακτώµατος χρησιµοποιήθηκε αναλυτής µεγέθους σωµατιδίων Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, UK) και το ιξώδες των γαλακτωµάτων µετρήθηκε µε την βοήθεια ιξωδοµέτρου MODEL DVII Brookfield ( Engineering Laboratories Inc., U.S.A) H επώαση της καλλιέργειας στα τριβλία έγινε στον επωαστικό κλίβανο (MMM Medcenter-Incucell, England). Η επώαση και ανάδευση των δειγµάτων κατά την προσοµοίωση των συνθηκών του γαστρικού και εντερικού περιβάλλοντος έγινε µε τη βοήθεια παλινδροµητή ανακίνησης (Mk x Incubator Shaker, England). 3.3 Πειραµατική ιαδικασία 3.3.1 Παρασκευή µικροβιολογικών υποστρωµάτων Πεπτονούχος φυσιολογικός ορός: για την προετοιµασία του στελέχους καθώς και για τις δεκαδικές αραιώσεις των δειγµάτων του γαλακτώµατος κατά την καταµέτρηση των µικροοργανισµών, χρησιµοποιήθηκε πεπτονούχο υδατικό διάλυµα. Για την παρασκευή του διαλύµατος χρησιµοποιήθηκε: 0,1% w/v διαλύµατος πεπτόνης, 0,9% w/v διαλύµατος χλωριούχου νατρίου και απιονισµένο νερό. Η τιµή του ph

34 ρυθµίστηκε στο 7,0 ± 0,2. Ποσότητες των 9 ml κατανεµήθηκαν σε δοκιµαστικούς σωλήνες και στη συνέχεια αποστειρώθηκαν στους 121 ο C για 30 λεπτά. ΜRS Broth: σε 100 ml απιονισµένου νερού διαλύθηκαν 5,2 g υποστρώµατος MRS Broth. Η τιµή ph του διαλύµατος ρυθµίστηκε µε διάλυµα καυστικού νατρίου στο 6,5 ± 0,2. Το διάλυµα αποστειρώθηκε στους 121 ο C, για 30 λεπτά. MRS agar: σε 100 ml θερµού (~65 ο C) απιονισµένου νερού διαλύθηκαν µε την βοήθεια µαγνητικού αναδευτήρα 6,1 g υποστρώµατος MRS agar. Η τιµή του ph του διαλύµατος ρυθµίστηκε µε διάλυµα καυστικού νατρίου στο 6,5 ± 0,2. Το διάλυµα αποστειρώθηκε στους 121 ο C για 30 λεπτά. PCA: σε 100 ml θερµού (~65 ο C) απιονισµένου νερού διαλύθηκαν µε την βοήθεια µαγνητικού αναδευτήρα 2,35 g υποστρώµατος PCA. Η τιµή του ph ρυθµίστηκε µε διάλυµα καυστικού νατρίου στο 7,0 ± 0,2. Το διάλυµα αποστειρώθηκε στους 121 ο C για 30 λεπτά. PDA: σε 100 ml θερµού (~65 ο C) απιονισµένου νερού διαλύθηκαν µε την βοήθεια µαγνητικού αναδευτήρα 3,9 g υποστρώµατος PDA. Η τιµή του ph ρυθµίστηκε µε διάλυµα υδροχλωρικού οξέος στο 5,6 ± 0,2. Το διάλυµα αποστειρώθηκε στους 121 ο C για 30 λεπτά. VRBA: σε 100 ml θερµού (~65 ο C) απιονισµένου νερού διαλύθηκαν µε την βοήθεια µαγνητικού αναδευτήρα 4,15 g υποστρώµατος VRBA. Η τιµή του ph ρυθµίστηκε µε διάλυµα καυστικού νατρίου στο 7,4 ± 0,2. 3.3.2 Παρασκευή γαλακτωµάτων ελαίου σε νερό (o/w) Αρχικά αποστειρώθηκαν όλα τα υλικά (εκτός του αυγού) και τα σκεύη που χρησιµοποιήθηκαν για την παρασκευή των γαλακτωµάτων. Η αποστείρωση έγινε στους 121 0 C, για 30 λεπτά. Α. Γαλάκτωµα µε γαλακτωµατοποιητή κρόκο αυγού (γαλάκτωµα Ι): Σε πρώτο στάδιο παρασκευάστηκε η συνεχής φάση του γαλακτώµατος. Αρχικά παραλήφθηκε υγρός κρόκος από φρέσκα αυγά ως εξής: Μετά το σπάσιµο του κελύφους του αυγού διαχωρίστηκε ο κρόκος από το άσπρο µε το χέρι και µε τη βοήθεια απορροφητικού χαρτιού αποµακρύνθηκε η αλβουµίνη από τη βιτελινική µεµβράνη. Μετά από διάτρηση της µεµβράνης συλλέχτηκε ο υγρός κρόκος. Ποσότητα του υγρού κρόκου προστέθηκε σε απιονισµένο νερό και παρασκευάσθηκε αιώρηµα 4% (w/w) σε κρόκο. Εν συνεχεία προστέθηκε χλωριούχο νάτριο 1,5% (w/w) και τέλος ρυθµίστηκε η τιµή του ph της συνεχούς φάσης στο 3,7 µε την προσθήκη σταγόνων πυκνού οξικού

35 οξέος (16Ν). Το διάλυµα της συνεχούς φάσης παστεριώθηκε ώστε να αποφευχθεί οποιαδήποτε επιµόλυνση µπορούσε να προέλθει από τον κρόκο του αυγού. Η παστερίωση έγινε στους 64 ο C για 10 λεπτά (Snyder, 2009). Στη συνέχεια, προστέθηκε στάγδην και υπό συνεχή ανάδευση ποσότητα αποστειρωµένου αραβοσιτελαίου ώστε το γαλάκτωµα να έχει τελική περιεκτικότητα σε έλαιο 50% w/w. Το γαλάκτωµα οµογενοποιήθηκε για 2 λεπτά µε τη βοήθεια οµογενοποιητή. Β. Γαλάκτωµα µε γαλακτωµατοποιητή αραβικό κόµµι χωρίς/µε την προσθήκη σακχαρόζης (αντίστοιχα γαλάκτωµα ΙΙ και ΙΙΙ): Σε απιονισµένο νερό προστέθηκε χλωριούχο νάτριο 1,5% (w/w) και ρυθµίστηκε η τιµή του ph της συνεχούς φάσης στο 3,7 µε την προσθήκη σταγόνων πυκνού οξικού οξέος ( 16Μ ). Υπό συνεχή ανάδευση και σταδιακά προστέθηκε ποσότητα αραβικού κόµµεος σε τελική συγκέντρωση 2% w/w και ξανθάνη σε τελική συγκέντρωση 0,1 % w/w, χωρίς/µε την προσθήκη σακχαρόζης (2%, w/w). Η διαδικασία παρασκευής του γαλακτώµατος συνεχίστηκε όπως στην περίπτωση του γαλακτώµατος Ι. Γ. Γαλάκτωµα µε γαλακτωµατοποιητή πρωτεΐνη ορού γάλακτος (γαλάκτωµα ΙV): Σε απιονισµένο νερό προστέθηκε χλωριούχο νάτριο 1,5% w/w και ρυθµίστηκε η τιµή του ph της συνεχούς φάσης στο 3,7 µε την προσθήκη σταγόνων πυκνού οξικού οξέος (16Μ). Υπό συνεχή ανάδευση και σταδιακά προστέθηκε ποσότητα πρωτεΐνης ορού γάλακτος σε τελική συγκέντρωση 3,5% w/w. Η διαδικασία παρασκευής του γαλακτώµατος συνεχίστηκε όπως στην περίπτωση του γαλακτώµατος Ι.. Γαλάκτωµα µε γαλακτωµατοποιητή κρόκο αυγού που περιείχε ινουλίνη ή/και σακχαρόζη:. Ποσότητα του υγρού κρόκου προστέθηκε σε απιονισµένο νερό και παρασκευάσθηκε αιώρηµα 4% (w/w) σε κρόκο. Εν συνεχεία προστέθηκε χλωριούχο νάτριο 1,5% w/w, σακχαρόζη 2% w/w και τέλος ρυθµίστηκε η τιµή του ph της συνεχούς φάσης στο 3,7 µε την προσθήκη σταγόνων πυκνού οξικού οξέος (16Ν). Υπό συνεχή ανάδευση και σταδιακά προστέθηκε ποσότητα ινουλίνης 0,5-5%, (w/w). Η διαδικασία παρασκευής του γαλακτώµατος συνεχίστηκε όπως στην περίπτωση του γαλακτώµατος Ι. 3.3.3 Παρασκευή του διαλύµατος πεψίνης Το τεχνητό γαστρικό υγρό παρασκευάστηκε ως εξής: το ένζυµο πεψίνη διαλύθηκε σε αλατούχο διάλυµα (NaCl, 0,2% w/v) σε τελική συγκέντρωση 0,3 g/l. Η τιµή του ph ρυθµίστηκε στο 1,2 ή 2,5 µε την προσθήκη πυκνού HCl 37 % v/v. Έπειτα, το διάλυµα αποστειρώθηκε µε διήθηση µε τη χρήση µεµβράνης οξικής

36 κυτταρίνης πόρων 0,45µm (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) σε στείρες συνθήκες (κάτω από φλόγα). 3.3.4 Παρασκευή του διαλύµατος παγκρεατίνης και χολικών αλάτων Παρασκευάστηκε διάλυµα δισόξινου φωσφορικού καλίου 9,073 g/l και µονόξινου φωσφορικού νατρίου 11,87 g/l. Σε ογκοµετρική φιάλη των 100 ml µεταφέρθηκαν 19 ml του πρώτου διαλύµατος και 81 ml του δευτέρου. Η τιµή του ph του ρυθµιστικού διαλύµατος ήταν 7,4. Το διάλυµα αποστειρώθηκε στους 121 ο C για 30 λεπτά. Μετά την αποστείρωση και ψύξη του διαλύµατος προστέθηκε παγκρεατίνη σε τελική συγκέντρωση 0,1% w/v και χολικά άλατα σε τελική συγκέντρωση 0,45% w/v. Το διάλυµα ανακινήθηκε µέχρι διάλυσης των αλάτων. 3.3.5 ιατήρηση και aνακαλλιέργεια του µικροοργανισµού H διατήρηση του µικροοργανισµού Lactobacillus. paracasei subsp. paracasei DC412 έγινε σε υγρό υπόστρωµα MRS Broth που περιείχε 25 % (v/v) γλυκερόλη, στους -80 ο C. Πριν από κάθε πειραµατική χρήση, γινόταν τουλάχιστον τρεις διαδοχικές ανακαλλιέργειες του µικροοργανισµού. Ο µικροοργανισµός καλλιεργούνταν κάθε φορά σε υγρό υπόστρωµα MRS Broth χωρίς ανακίνηση, στους 37 o C για 18h. 3.3.6 Προετοιµασία του µικροοργανισµού για τον εµβολιασµό των γαλακτωµάτων Τα βακτηριακά κύτταρα της παραπάνω καλλιέργειας συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν (3500 g στους 4 ο C για 10 λεπτά). Στη συνέχεια τα κύτταρα ξεπλύθηκαν 2 φορές µε πεπτονούχο φυσιολογικό ορό. Μετά τις πλύσεις έγινε αραίωση των κυττάρων του µικροοργανισµού σε πεπτονούχο φυσιολογικό ορό ώστε ο τελικός πληθυσµός του µικροοργανισµού να είναι 1 ± 0,5 10 10 cfu/ml και το αιώρηµα των κυττάρων διατηρήθηκε στους 4 ο C µέχρι τη στιγµή της χρησιµοποίησής του. 3.3.7 Εµβολιασµός των γαλακτωµάτων µε ελεύθερα κύτταρα του µικροοργανισµού Ο εµβολιασµός των γαλακτωµάτων µε ελεύθερα κύτταρα του µικροοργανισµού έγινε µε προσθήκη 2,5% (w/w) του αιωρήµατος κυττάρων (παρ.

37 3.3.6) είτε α) στην παστεριωµένη συνεχή φάση µετά από ψύξη πριν την προσθήκη του ελαίου, ή β) στο γαλάκτωµα αµέσως µετά την οµογενοποίηση (παρ. 3.3.2). 3.3.8 Εγκλεισµός των κυττάρων στο εσωτερικό των σταγονιδίων του γαλακτώµατος Ο εγκλεισµός των κυττάρων στο εσωτερικό των σταγονιδίων του γαλακτώµατος έγινε µε προσθήκη 2,5% (w/w) του αιωρήµατος των κυττάρων (παρ. 3.3.6) στο έλαιο και ανάδευση για 40 λεπτά. Ακολούθησε προσθήκη του ελαίου στο αιώρηµα του κρόκου και οµογενοποίηση. Ο έλεγχος του εγκλεισµού έγινε µε µικροσκοπική παρατήρηση, ενώ το ποσοστό των εγκλεισµένων κυττάρων υπολογίστηκε έµµεσα από τη διαφορά του αριθµού των ζώντων κυττάρων που προστέθηκαν στη φάση του ελαίου µείον τον αριθµό των ελεύθερων ζώντων κυττάρων που καταµετρήθηκαν στο γαλάκτωµα. 3.4 Πειραµατικός σχεδιασµός Η παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκε σε τέσσερις φάσεις όπως περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: Φάση 1: Στη φάση αυτή έγιναν δοκιµές για την εξακρίβωση της επίδρασης της οµογενοποίησης που εφαρµόζεται κατά τη διαδικασία της παρασκευής του γαλακτώµατος στη βιωσιµότητα των κυττάρων του Lactobacillus. paracasei subsp. paracasei DC412. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν δύο σειρές δειγµάτων του γαλακτώµατος Ι, µε την διαφορά ότι η πρώτη σειρά περιελάµβανε γαλακτώµατα που είχαν εµβολιαστεί µε αιώρηµα κυττάρων του µικροοργανισµού στην παστεριωµένη συνεχή φάση πριν την προσθήκη του ελαίου, ενώ στη δεύτερη σειρά ο εµβολιασµός πραγµατοποιήθηκε µετά την προσθήκη του ελαίου και την οµογενοποίηση που ακολούθησε (παρ. 3.3.2Α). Στα δείγµατα αυτά έγινε µικροσκοπική παρατήρηση και καταµέτρηση του αριθµού των ελεύθερων ζώντων κυττάρων σε χρόνο µηδέν από τη στιγµή της παρασκευής τους. Οι µετρήσεις αποτελούν το µέσο όρο 6 επαναλήψεων. Φάση 2: Στη δεύτερη φάση εξετάστηκε η επίδραση της αποθήκευσης στους 4 ο C για 12 εβδοµάδες στη βιωσιµότητα των ελεύθερων κυττάρων του Lactobacillus. paracasei subsp. paracasei DC412 στο γαλάκτωµα Ι στο οποίο ο εµβολιασµός των κυττάρων πραγµατοποιήθηκε πριν την προσθήκη του ελαίου (παρ. 3.3.2Α). Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν 9 δείγµατα εµβολιασµένου µε κύτταρα γαλακτώµατος Ι (50 g ανά δείγµα) τα οποία τοποθετήθηκαν σε αποστειρωµένους γυάλινους

38 περιέκτες χωρητικότητας 100 ml (χρόνος µηδέν). Στα δείγµατα αυτά έγινε κινητική µελέτη της βιωσιµότητας του µικροοργανισµού µε καταµέτρηση του αριθµού των ζώντων κυττάρων του µικροοργανισµού µετά από αποθήκευση για 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12 εβδοµάδες. Η καταµέτρηση του αριθµού των ζώντων κυττάρων έγινε και σε 9 δείγµατα MRS broth για τις ίδιες χρονικές στιγµές αποθήκευσης για συγκριτικούς λόγους (control samples). Φάση 3: Στη φάση αυτή έγινε αρχικά µία προσπάθεια να µελετηθεί η επίδραση διαφορετικών συστηµάτων εγκλεισµού των κυττάρων του Lactobacillus. paracasei subsp. paracasei DC412 στη βιωσιµότητα τους κατά την αποθήκευση στους 4 o C. Επειδή δεν στάθηκε δυνατή η πλήρης απελευθέρωση, προκειµένου να καταµετρηθούν, των εγκλεισµένων στο εσωτερικό των σταγονιδίων του ελαίου κυττάρων όταν δεν είχε προηγηθεί κατεργασία µε τεχνητό γαστρικό διάλυµα σε συνδυασµό µε διάλυµα παγκρεατίνης-χολικών αλάτων, τα αποτελέσµατα των καταµετρήσεων δεν θεωρήθηκαν αξιόπιστα και δεν παρουσιάζονται. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν τέσσερεις σειρές δειγµάτων που περιελάµβαναν αντίστοιχα τα γαλακτώµατα Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και IV, και στα οποία ο εγκλεισµός των κυττάρων του µικροοργανισµού στο εσωτερικό των σταγονιδίων έγινε όπως περιγράφεται στην παρ. 3.3.8. Όλα τα δείγµατα τοποθετήθηκαν σε αποστειρωµένους γυάλινους περιέκτες χωρητικότητας 100 ml (χρόνος µηδέν). Στα δείγµατα αυτά έγινε κινητική µελέτη της βιωσιµότητας του µικροοργανισµού µε καταµέτρηση του αριθµού των ζώντων κυττάρων του µικροοργανισµού σε χρόνο µηδέν και στις εξής χρονικές στιγµές αποθήκευσης: 0, 1, 2, 4, και 6 εβδοµάδες, σε συνδυασµό κάθε φορά µε κατεργασία σε τεχνητό γαστρικό υγρό και διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων. Η πειραµατική διαδικασία, προκειµένου να γίνουν οι δοκιµές έκθεσης των δειγµάτων σε τεχνητό γαστρικό υγρό και διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων, ήταν η εξής: Σε 45 ml διαλύµατος του ενζύµου πεψίνη προστέθηκαν 5 g δείγµατος. Το διάλυµα επωάστηκε στους 37 ο C για 2 ώρες και µε συνεχή ανακίνηση στις 100 rpm. Μετά από τις δύο ώρες στο δείγµα προστέθηκαν 50 ml του διαλύµατος παγκρεατίνης-χολικών αλάτων. Το δείγµα επωάστηκε στους 37 ο C για άλλες 4 ώρες και µε συνεχή ανακίνηση στις 100 rpm. Μετά το πέρας των 4 ωρών έγινε φυγοκέντρηση των δειγµάτων σε 15000xg για 30 min, στους 4 o C, ώστε να εξασφαλιστεί η πλήρης απελευθέρωση των εγκλεισµένων κυττάρων και η καταµέτρηση όλων των ζώντων κυττάρων. Στη συνέχεια τα κύτταρα ξεπλύθηκαν 2

39 φορές µε πεπτονούχο φυσιολογικό ορό και έγινε η καταµέτρηση των ζώντων κυττάρων. Οι µετρήσεις που δίνονται παρακάτω αποτελούν το µέσο όρο 6 επαναλήψεων. Φάση 4: Στην φάση 4 σχεδιάστηκε µια σειρά προκαταρκτικών πειραµάτων για να εξεταστεί η δράση της προσθήκης ινουλίνης ή/και της σακχαρόζης στη βιωσιµότητα α) των ελεύθερων κυττάρων του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 κατά την αποθήκευση των γαλακτωµάτων στους 4 o C µε ή χωρίς κατεργασία µε τεχνητό γαστρικό υγρό και διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων, και β) των εγκλεισµένων κυττάρων του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 κατά την αποθήκευση των γαλακτωµάτων στους 4 o C µετά από κατεργασία µε τεχνητό γαστρικό υγρό και διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν γαλακτώµατα µε/ή χωρίς την προσθήκη ινουλίνης και σακχαρόζης όπως περιγράφεται στην παρ. 3.3.2.Ε. Η ακριβής σύσταση των δειγµάτων που µελετήθηκαν εµφανίζεται στον Πίνακα 3 (το δείγµα µε περιεκτικότητα σακχαρόζης 2% w/w, απουσία ινουλίνης, χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας). Ο εµβολιασµός των γαλακτωµάτων µε ελεύθερα κύτταρα έγινε όπως περιγράφεται στη Φάση 2 του πειραµατικού σχεδιασµού και ο εγκλεισµός των κυττάρων του µικροοργανισµού στα σταγονίδια του γαλακτώµατος έγινε όπως περιγράφεται στη Φάση 3 του πειραµατικού σχεδιασµού. Όλα τα δείγµατα τοποθετήθηκαν σε αποστειρωµένους γυάλινους περιέκτες χωρητικότητας 100 ml (χρόνος µηδέν). Στα δείγµατα αυτά έγινε κινητική µελέτη της βιωσιµότητας του µικροοργανισµού µε καταµέτρηση του αριθµού των ζώντων κυττάρων του µικροοργανισµού σε χρόνο µηδέν και µετά από αποθήκευση για 1, 2, 4, και 6 εβδοµάδες, αφού προηγήθηκε κατεργασία σε τεχνητό γαστρικό υγρό και διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων όπως περιγράφεται στην Φάση 3 του πειραµατικού σχεδιασµού.

40 Πίνακας 3: Συγκέντρωση ινουλίνης και σακχαρόζης των γαλακτωµάτων που χρησιµοποιήθηκαν για τη µελέτη της επίδρασης της προσθήκης ινουλίνης, απουσία/παρουσία σακχαρόζης, στη βιωσιµότητα της προβιοτικής καλλιέργειας του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412. Γαλάκτωµα Συγκέντρωση ινουλίνης και σακχαρόζης στο γαλάκτωµα (% w/w) Ινουλίνη Σακχαρόζη 1-2,0 2 2,0-3 0,5 2,0 4 2,0 2,0 5 5,0 2,0 3.5. Μελέτη, µε τη βοήθεια πολυωνιµικού µοντέλου µε τη Μεθοδολογία της Επιφανειακής Απόκρισης, της επίδρασης του χρόνου αποθήκευσης και της σύστασης στη βιωσιµότητα του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 και τα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά του γαλακτώµατος Προκειµένου να επιτευχθεί η παρασκευή ενός γαλακτώµατος που θα συνδυάζει τόσο ικανοποιητική φυσικοχηµική σταθερότητα όσο και βιωσιµότητα του πληθυσµού της προβιοτικής καλλιέργειας ακολούθησε η βελτιστοποίηση της σύστασης µε τη χρήση στατιστικών µεθόδων. Συγκεκριµένα, τα δεδοµένα σειράς πειραµάτων για την επίδραση του χρόνου αποθήκευσης του γαλακτώµατος, και των συγκεντρώσεων της ινουλίνης και κρόκου αυγού, µέσω του σύνθετου κεντρικού σχεδιασµού (Central Composite Response Surface Design) αναλύθηκαν µε την τεχνική της ανάλυσης πολλαπλής παλινδρόµησης. Η τρισδιάστατη απεικόνιση της πολλαπλής παλινδρόµησης έγινε µε τη µεθοδολογία επιφανειακής απόκρισης (Response Surface Methodology) (Box et al., 1978, Neter et al., 1996). Ως ανεξάρτητες (independent) µεταβλητές ορίστηκαν ο χρόνος αποθήκευσης του γαλακτώµατος (X1), η συγκέντρωση της ινουλίνης (Χ2) και η συγκέντρωση του

41 κρόκου του αυγού (X3). Για κάθε µεταβλητή χρησιµοποιήθηκαν πέντε πειραµατικά επίπεδα µε τις κωδικοποιηµένες τιµές: -a, -1, 0, +1, +a, όπου a=2n/4, n=αριθµός των µεταβλητών, το 0 αντιστοιχεί στο κεντρικό σηµείο (center point) και τα 1, +1 αντιστοιχούν στην κατώτερη και ανώτερη τιµή κάθε παράγοντα, αντίστοιχα, που ορίστηκαν µε βάση τα παραπάνω προκαταρκτικά πειράµατα της παραγράφου της φάσης 4. Οι πραγµατικές τιµές των µεταβλητών υπολογίστηκαν µε τη χρήση της παρακάτω εξίσωσης: Ο σύνθετος κεντρικός σχεδιασµός περιελάµβανε 20 πειραµατικές δοκιµές: 8 πειράµατα σε ακραίες τιµές των παραγόντων (Χ1, Χ2, Χ3) = (±1, ±1, ±1) (corner point), 6 πειράµατα σε τιµές όλων των παραγόντων εκτός ενός να αντιστοιχούν στο κεντρικό επίπεδο (Χ1, Χ2, Χ3) = (±a, 0, 0), (0, ±a, 0) ή (0, 0, ±a) (star or axial point) και 6 επαναλήψεις σε τιµές των παραγόντων να αντιστοιχούν στο κεντρικό επίπεδο (Χ1, Χ2, Χ3) = (0, 0, 0). Οι εξαρτηµένες (dependent) µεταβλητές ή αποκρίσεις (responses) (Y i ) που επιλέχθηκαν για να µελετηθεί η µεταβλητότητά τους σε σχέση µε τις µεταβολές των ανεξάρτητων µεταβλητών Χ1, Χ2 και Χ3 ήταν οι εξής: ο πληθυσµός της προβιοτικής καλλιέργειας (cfu/g γαλακτώµατος) κατά την αποθήκευσή του τροφίµου χωρίς (Υ1) ή µετά από κατεργασία σε τεχνητό γαστρικό υγρό και επακόλουθη κατεργασία µε χολικά άλατα και παγκρεατίνη (βλέπε Φάση 3 πειραµατικού σχεδιασµού) (Υ2), η τιµή ph του γαλακτώµατος (Υ3), ο συντελεστής συνεκτικότητας, Κ, του γαλακτώµατος (Υ4), και το µέγεθος των σταγονιδίων του γαλακτώµατος (Υ5). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν µε τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου Minitab Statistical Software, version 13.1 (Minitab Inc. 2000). Βάσει του προγράµµατος αυτού εκτιµήθηκαν οι άγνωστες παράµετροι βο, β1, β2, β3, β11, β22, β33, β12, β13, β23, του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης µε γενικό τύπο: Υ=βο+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β13X1X3+β23X2 +X3 [2]

42 ώστε να εξασφαλιστεί η εισαγωγή στην εξίσωση [2] των στατιστικά σηµαντικών µεταβλητών. Ως επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας ορίστηκε το 5% (p<0,05). Τα βασικά κριτήρια που ελήφθησαν υπόψη για την αξιολόγηση του µοντέλου είναι: α) η ακρίβεια της προσαρµογής του µοντέλου στα δεδοµένα µας (goodness of fit), β) η τιµή του σφάλµατος προσαρµογής (lack of fit) που οφείλεται είτε σε παράλειψη µεταβλητών είτε σε χρήση µεταβλητών που δεν σχετίζονται µε τον µέγιστο πληθυσµό της προβιοτικής καλλιέργειας, και γ) οι παράµετροι να έχουν βιολογικό νόηµα και ρεαλιστικές τιµές. 3.6 Μικροβιολογικές αναλύσεις 3.6.1 ειγµατοληψία Ποσότητα δείγµατος (1g) συλλέχθηκε αµέσως µετά την παρασκευή των γαλακτωµάτων µε ελεύθερα ή εγκλεισµένα κύτταρα του µικροοργανισµού καθώς επίσης και στο τέλος των διαφόρων χρονικών περιόδων αποθήκευσης χωρίς ή µετά από κατεργασία µε διάλυµα πεψίνης και διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων (βλέπε φάση 3 πειραµατικού σχεδιασµού). Η δειγµατοληψία έγινε υπό ασηπτικές συνθήκες και το δείγµα τοποθετήθηκε σε δοκιµαστικό σωλήνα που περιείχε 9 ml αποστειρωµένου πεπτονούχου φυσιολογικού ορού και διατηρήθηκε στους 4 ο C µέχρι τη στιγµή της καταµέτρησης του αριθµού των ζώντων κυττάρων. 3.6.2 Καταµέτρηση του µικροοργανισµού Η καταµέτρηση πραγµατοποιήθηκε µε την τεχνική έγχυσης σε τρυβλίο. Για την καταµέτρηση του µικροοργανισµού χρησιµοποιήθηκε το υπόστρωµα MRS agar. Μετά από διαδοχικές αραιώσεις του δείγµατος συλλέχθηκε 1 ml από τους δοκιµαστικούς σωλήνες µε δεκαδική αραίωση 0 η, 1 η, 3 η, 5 η, και 7 η για κάθε χρονική στιγµή της δειγµατοληψίας, και τοποθετήθηκε σε τρυβλία petri, όπου προστέθηκε υπόστρωµα µε θερµοκρασία ~40 ο C και στη συνέχεια αναµίχθηκε προσεκτικά. Προκειµένου να δηµιουργηθεί αναερόβιο περιβάλλον για τον µικροοργανισµό, αµέσως µετά την στερεοποίηση του υποστρώµατος, ακολούθησε δεύτερη έγχυση µε δεύτερο στρώµα υποστρώµατος (~5 ml) και το τρυβλίο αφέθηκε σε ηρεµία έως ότου στερεοποιηθεί. Η επώαση πραγµατοποιήθηκε στους 37 ο C για 48 ώρες. Τα τρυβλία που περιείχαν από 30 έως 300 αποικίες καταµετρήθηκαν και καταγράφηκαν ως colony forming units ανά g (cfu/g).

43 3.6.3 Έλεγχος επιµολύνσεων Για την καταµέτρηση της ολικής µεσόφιλης χλωρίδας χρησιµοποιήθηκε το υπόστρωµα PCA. Μετά από διαδοχικές αραιώσεις του δείγµατος συλλέχθηκε 1 ml από το αρχικό δοκιµαστικό σωλήνα (χωρίς αραίωση) για κάθε χρονική στιγµή δειγµατοληψίας και τοποθετήθηκαν σε τρυβλία Petri, όπου προστέθηκε υπόστρωµα µε θερµοκρασία ~40 ο C και στη συνέχεια αναµίχθηκε προσεκτικά και αφέθηκε σε ηρεµία έως ότου στερεοποιηθεί. Η επώαση πραγµατοποιήθηκε στους 30 ο C για 48 ώρες. Τα τρυβλία που περιείχαν από 30 έως 300 αποικίες καταµετρήθηκαν και καταγράφηκαν ως colony forming units ανά g (cfu/g). Η ίδια πειραµατική διαδικασία ακολουθήθηκε και για την καταµέτρηση των εντεροβακτηρίων σε υπόστρωµα VRBA µετά από επώαση στους 35 ο C για 48 ώρες, και των ζυµών και των µυκήτων σε υπόστρωµα PDA µετά από επώαση στους 25 ο C για 72 ώρες. Στην τελευταία περίπτωση, τα τρυβλία φυλάχθηκαν για 5 εβδοµάδες και ελεγχόταν ανά µία εβδοµάδα για την εµφάνιση αποικιών. Τα τρυβλία που περιείχαν από 30 έως 300 αποικίες καταµετρήθηκαν και καταγράφηκαν ως colony forming units ανά g (cfu/g). 3.6.4 Μελέτη της υδροφοβικότητας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού Η πειραµατική διαδικασία για τη µελέτη της υδροφοβικότητας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού έγινε όπως αναφέρεται από τους Huong Ly και συνεργάτες, (2006). Συγκεκριµένα, τα βακτηριακά κύτταρα φρέσκιας καλλιέργειας του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 συλλέχθηκαν µε φυγοκέντρηση (3500 g στους 4 ο C για 10 λεπτά). Στη συνέχεια τα κύτταρα αραιώθηκαν σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικού καλίου (0,01 M) και µετρήθηκε η απορρόφησή τους στα 600 nm (A 0 ). Σε 2,4 ml αυτού του αιωρήµατος προστέθηκαν 0,4 ml δεκαεξανίου. Το αιώρηµα αναµίχθηκε µε vortex για 30 δευτερόλεπτα και αφέθηκε σε ηρεµία για 20 λεπτά ώστε να διαχωριστούν οι δύο φάσεις. Μετά από αποµάκρυνση της υδατικής φάσης µε πιπέτα παστέρ επαναµετρήθηκε η απορρόφησή του αιωρήµατος στα 600 nm (A 1 ). Το ποσοστό της προσκόλλησης των µικροβίων στο δεκαεξάνιο υπολογίστηκε από την σχέση: (1-Α 1 /Α 0 ) x 100.

44 3.5. Φυσικοχηµικές µετρήσεις στα διαλύµατα ινουλίνης και στα γαλακτώµατα 3.5.1 Μέτρηση του µεγέθους των σωµατιδίων του διαλύµατος της ινουλίνης και του γαλακτώµατος. Η κατανοµή του µεγέθους και η µέση διάµετρος των σωµατιδίων του γαλακτώµατος και των διαλυµάτων ινουλίνης µετρήθηκαν µε τη βοήθεια του αναλυτή κατανοµής µεγέθους σταγονιδίων Mastersizer 2000. Οι µετρήσεις έγιναν σε θερµοκρασία δωµατίου. Μικρή ποσότητα (1-2 ml) κάθε δείγµατος αραιώθηκε αρχικά µε ποσότητα απιονισµένου νερού και στη συνέχεια αναµίχθηκε µε περίπου 700 ml απιονισµένου νερού στο δοχείο της συσκευής µέτρησης σταγονιδίων. Η τιµή του δείκτη διάθλασης που χρησιµοποιήθηκε για τον υπολογισµό του µεγέθους σταγονιδίων του ελαίου ήταν 1,47, ο δείκτης διάθλασης του νερού ήταν 1,33 και ο δείκτης διάθλασης της ινουλίνης κοντά στο 1,6. Μετρήθηκε η µέση διάµετρος των σταγονιδίων, d 4,3 κάτω από συνθήκες έντονης ανάδευσης. 3.5.2 Πειράµατα αποκορύφωσης Η σταθερότητα των γαλακτωµάτων ως προς την αποκορύφωση, αξιολογήθηκε µε παρατήρηση της µεταβολής του ύψους της διεπιφάνειας ανάµεσα στην υδατική στιβάδα και την κρέµα, µε τον χρόνο αποθήκευσης. Συγκεκριµένα, µεταφέρθηκαν 10 ml του γαλακτώµατος σε ειδικά κυλινδρικά δοχεία µε πώµα, διαστάσεων 1cm (διάµετρος) x 6cm (ύψος) και έγινε καταγραφή του αρχικού ύψους Η 0. Αρχικά το γαλάκτωµα ήταν οµοιογενές (t = 0). Σηµειώθηκε ο χρόνος εµφάνισης ορού στον πυθµένα του δοχείου και µετρήθηκε κατά διαστήµατα το ύψος του ορού που διαχωρίστηκε. Η σταθερότητα του γαλακτώµατος ως προς την αποκορύφωση υπολογίσθηκε από τη σχέση: H t H % = 100 H o H o = το αρχικό ύψος του γαλακτώµατος για t = 0 (45 mm) και H t = το ύψος του ορού που διαχωρίστηκε τη χρονική στιγµή t.

45 3.5.3 Παρατήρηση των γαλακτωµάτων στο µικροσκόπιο Τα γαλακτώµατα αραιώθηκαν µε απιονισµένο νερό και ποσότητα δείγµατος τοποθετήθηκε σε αντικειµενοφόρο πλάκα. Ακολούθησε παρατήρηση µε τη βοήθεια µικροσκοπίου που έφερε φακό Carl Zeiss (10/0,22). Οι εικόνες στο µικροσκόπιο αποτυπώθηκαν µε τη βοήθεια ψηφιακής φωτογραφικής µηχανής. Τα γαλακτώµατα παρατηρήθηκαν πριν και µετά τη κατεργασία τους µε ένζυµα καθώς και σε ενδιάµεσα διαστήµατα ώστε να διαπιστωθεί αν τα κύτταρα του µικροοργανισµού παρέµεναν ζωντανά καθώς επίσης και για να εκτιµηθεί και ο βαθµός αποσταθεροποίησης του γαλακτώµατος. 3.5.4 Μέτρηση του ιξώδους των διαλυµάτων ινουλίνης και των γαλακτωµάτων Οι µετρήσεις του ιξώδους έγιναν µε τη βοήθεια του ιξωδοµέτρου τύπου DVII της Broοkfield µετά από θερµοστάτηση στους 25 0 C για 15 λεπτά. Τα συστήµατα των οµόκεντρων κυλίνδρων που χρησιµοποιήθηκαν διέφεραν ανάλογα µε την περίπτωση του εκάστοτε διαλύµατος ή γαλακτώµατος. Η µετατροπή των ταχυτήτων περιστροφής του εσωτερικού κυλίνδρου σε τιµές ρυθµού διάτµησης για κάθε σύστηµα οµόκεντρων κυλίνδρων υπολογίστηκε µε πολλαπλασιασµό µε συντελεστή που δίνεται από τον κατασκευαστή.

46 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Επίδραση της οµογενοποίησης και του χρόνου αποθήκευσης του γαλακτώµατος στη βιωσιµότητα των κυττάρων. Τα προβιοτικά βακτήρια που χρησιµοποιούνται για την παρασκευή προβιοτικών τροφίµων πρέπει να διατηρούν τις προβιοτικές τους ιδιότητες και τη ζωτικότητά τους σε υψηλά επίπεδα, τόσο κατά τα διάφορα στάδια της επεξεργασίας του τροφίµου, όσο και κατά την αποθήκευσή του, αλλά και κατά την κατανάλωση και τη διέλευσή του, στη συνέχεια, µέσα από το ανθρώπινο γαστρεντερικό σύστηµα. Μια σηµαντική διεργασία που εφαρµόζεται κατά την παρασκευή των γαλακτωµάτων είναι η οµογενοποίηση του αρχικού µίγµατος ελαίου/νερού που προκύπτει κατά την προσθήκη του ελαίου και το οποίο είναι στην ουσία ένα γαλάκτωµα µε µεγάλο µέγεθος σταγονιδίων. Η οµογενοποίηση επιτρέπει τη διάσπαση των σταγονιδίων σε σταγονίδια µικρότερου µεγέθους µε αποτέλεσµα τη βελτίωση της φυσικοχηµικής σταθερότητας και των ρεολογικών χαρακτηριστικών του τελικού προϊόντος. Η οµογενοποίηση, όµως, µπορεί να προκαλέσει λύση των βακτηριακών κυττάρων λόγω µηχανικής καταπόνησης (Donsi et al., 2009). Καθώς, δεν υπήρχαν βιβλιογραφικά δεδοµένα για την επίδραση της οµογενοποίησης στη ζωτικότητά του Lact. paracasei subsp. paracasei DC 412, στην πρώτη φάση του πειράµατος εκτιµήθηκε η επίδρασή της στη βιωσιµότητα των κυττάρων µε προσδιορισµό του πληθυσµού των βακτηριακών κυττάρων στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος µετά την οµογενοποίηση. Ο εµβολιασµός των γαλακτωµάτων µε ελεύθερα κύτταρα έγινε µε προσθήκη 2,5% (w/w) του αιωρήµατος των κυττάρων (παρ. 3.3.4) είτε α) στην παστεριωµένη συνεχή φάση µετά την ψύξη και πριν την προσθήκη του ελαίου ή β) στο τελικό οµογενοποιηµένο γαλάκτωµα (βλ. παρ. 3.3.2). Από τις τιµές του Πίνακα 4 φαίνεται ότι η οµογενοποίηση δεν επηρέασε σε σηµαντικό βαθµό τον πληθυσµό του βακτηρίου. Συγκεκριµένα, το µικροβιακό φορτίο που καταµετρήθηκε στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος, αµέσως µετά την οµογενοποίηση ήταν 2,7x10 8 έναντι 3,0x10 8 cfu/g πριν την οµογενοποίηση. Ο µικρότερος πληθυσµός των κυττάρων του βακτηρίου που καταµετρήθηκαν στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος µετά την οµογενοποίηση, σε σχέση µε τον αρχικό αριθµό των ζώντων κυττάρων, µπορεί να αποδοθεί είτε στη θανάτωση ενός µέρους των κυττάρων του εµβολίου ή/και στον εγκλεισµό ενός κλάσµατος των κυττάρων στο εσωτερικό των σταγονιδίων του ελαίου κατά την οµογενοποίηση (Καρουσιώτη,

47 2009). Πάντως, η επιβεβαίωση της δεύτερης υπόθεσης, δηλαδή, του πιθανού εγκλεισµού των κυττάρων στο εσωτερικό των σταγονιδίων του ελαίου δεν κατέστη δυνατή µε απλή παρατήρηση στο µικροσκόπιο. Συµπερασµατικά, ο πληθυσµός του βακτηρίου που επιβιώνουν µετά την οµογενοποίηση του αρχικού γαλακτώµατος ήταν σηµαντικά υψηλότερος του αντίστοιχου πληθυσµού που απαιτείται προκειµένου να χαρακτηριστεί το τρόφιµο προβιοτικό (>10 6 cfu/g τροφίµου) (Xin et al., 2009, Akin et al., 2007, Corcoran et al., 2007). Στην περίπτωση που ο εµβολιασµός του γαλακτώµατος µε τα προβιοτικά κύτταρα έγινε µετά την οµογενοποίηση, η καταµέτρηση του πληθυσµού των ζώντων κυττάρων δεν ήταν επαναλήψιµη, κάτι που αποδόθηκε στη µη αποτελεσµατική διασπορά των κυττάρων στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος. Πίνακας 4. Επίδραση της οµογενοποίησης του γαλακτώµατος στον πληθυσµό των ζώντων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας. Αρχικός πληθυσµός ζώντων κυττάρων στο εµβόλιο ( cfu x10 10 /g MRS Broth) Πληθυσµός ζώντων κυττάρων πριν την οµογενοποίηση ( cfu/g x 10 8 γαλακτώµατος Ι) Πληθυσµός ζώντων κυττάρων µετά την οµογενοποίηση ( cfu/g x 10 8 γαλακτώµατος Ι) 1,2 ± 0,05 3,0 ± 0,12 2,7 ± 0,03 Ο υψηλός πληθυσµός των κυττάρων της καλλιέργειας που µετρήθηκε στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος υποδηλώνει την τάση των κυττάρων του βακτηρίου να προτιµούν την υδατική φάση παρά τη φάση του ελαίου. Προκειµένου να εξηγηθεί η τάση αυτή, έγινε προσδιορισµός του βαθµού υδροφοβικότητας της κυτταρικής µεµβράνης του βακτηρίου. Με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία, η υδροφοβικότητα της κυτταρικής µεµβράνης διαφοροποιείται σηµαντικά µεταξύ διαφορετικών στελεχών του Lact. paracasei subssp. paracasei (Kotzamanidis et al., 2010). Παρόλο, που στη βιβλιογραφία υπήρχαν διαθέσιµες πληροφορίες για την υδροφοβικότητα στελεχών του Lact. paracasei subssp. paracasei δεν υπήρχαν πληροφορίες για το συγκεκριµένο στέλεχος που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Οπότε, έγινε προσδιορισµός του ποσοστού της προσκόλλησης των κυττάρων Lact. paracasei subssp. paracasei DC412 στον λιπόφιλο διαλύτη (δεκαεξάνιο) (παρ. 3.6.4) και η τιµή της

48 υδροφοβικότητας που προσδιορίστηκε ήταν 1 ± 0,2. Η χαµηλή αυτή τιµή της υδροφοβικότητας της κυτταρικής µεµβράνης του Lact. paracasei subssp. paracasei DC412 µπορεί να εξηγήσει και τον µη εγκλεισµό των κυττάρων στη φάση του ελαίου του γαλακτώµατος. Στη επόµενη φάση της µελέτης εξετάστηκε η βιωσιµότητα των κυττάρων του Lact. paracasei subsp. paracasei DC412 της συνεχούς φάσης του γαλακτώµατος τύπου εµβάµµατος σαλάτας που παρασκευάστηκε µε κρόκο αυγού (γαλάκτωµα Ι) κατά τη διάρκεια της αποθήκευσής του στους 4 ο C για 12 εβδοµάδες. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν 9 δείγµατα του γαλακτώµατος Ι (παρ. 3.3.2A) (50 g ανά δείγµα), τα οποία περιείχαν 2,1 x 10 8 ελεύθερα κύτταρα του µικροοργανισµού, και τοποθετήθηκαν σε αποστειρωµένους γυάλινους περιέκτες χωρητικότητας 100 ml. Ακολούθησε κινητική µελέτη της βιωσιµότητας του µικροοργανισµού µε καταµέτρηση του µικροβιακού φορτίου σε χρόνο µηδέν και µετά από αποθήκευση των γαλακτωµάτων για 1, 2, 3, 4, 8 και 12 εβδοµάδες. Τα αποτελέσµατα των παραπάνω πειραµατικών δοκιµών παρουσιάζονται στον Πίνακα 5 και σχολιάζονται σε σχέση µε τη βιωσιµότητα των κυττάρων σε MRS Broth. Σε όλα τα δείγµατα έγινε έλεγχος της µικροβιακής σταθερότητας µε καταµέτρηση της ολικής µεσόφιλης χλωρίδας, των εντεροβακτηριδίων, και των ζυµών και µυκήτων για τις χρονικές στιγµές που αναφέρονται παραπάνω (παρ. 3.6.3). Από την παρατήρηση των αποτελεσµάτων του Πίνακα 5 για τον αριθµό ζώντων κυττάρων στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος Ι και στο MRS Broth συµπεραίνονται τα εξής: 1 η -3 η εβδοµάδα: Σε αυτό το διάστηµα ο πληθυσµός των κυττάρων της καλλιέργειας παρέµεινε περίπου σταθερός (~2,7x10 8 cfu/g). Αυτό υποδηλώνει ότι ο αριθµός των νέων κυττάρων που σχηµατίζονται ισούται µε τον πληθυσµό των κυττάρων που θανατώνονται, κάτι που µπορεί να αποδοθεί, εν µέρει, στη φάση προσαρµογής του µικροοργανισµού στο νέο περιβάλλον. Αν και στη φάση αυτή δεν υπάρχει καθαρή αύξηση του πληθυσµού του µικροοργανισµού, τα κύτταρα συνθέτουν νέα συστατικά (π.χ. ένζυµα). Το στάδιο αυτό πριν την έναρξη της διαδικασίας διαίρεσης των κυττάρων είναι απαραίτητο. Η διάρκεια της φάσης προσαρµογής εξαρτάται από τη σύσταση του θρεπτικού µέσου ανάπτυξης και τις φυσικοχηµικές παραµέτρους του περιβάλλοντος όπως την τιµή ph του θρεπτικού µέσου, το διαθέσιµο οξυγόνο και τη θερµοκρασία. Στη συγκεκριµένη µελέτη, η χαµηλή τιµή του ph και η διαθεσιµότητα

49 των θρεπτικών συστατικών του γαλακτώµατος Ι, καθώς και η θερµοκρασία (4 o C) του περιβάλλοντος διατήρησης του γαλακτώµατος Ι, ήταν περιοριστικοί παράγοντες για την αύξηση, µε αποτέλεσµα ο ρυθµός της µικροβιακής αύξησης να αποκλίνει του µέγιστου ρυθµού ανάπτυξης σε ιδανικές συνθήκες. Αντίθετα, στην περίπτωση της διατήρησης των κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας στο υπόστρωµα MRS Broth, στο τέλος της 3 ης εβδοµάδας παρατηρήθηκε αύξηση κατά 1 λογάριθµο του αριθµού των ζώντων κυττάρων (1,2x10 9 ), λόγω ευνοϊκότερων συνθηκών αύξησης. 4 η -12 η εβδοµάδα: Σε αυτό το διάστηµα ο πληθυσµός του µικροοργανισµού µειώθηκε κατά 1 λογάριθµο τόσο στο γαλάκτωµα Ι όσο και στο MRS Broth (1,2x10 7 και 1,6x10 8, αντίστοιχα). Είναι ευνόητο ότι ένα περιβάλλον, στο οποίο δεν υπάρχει εξωτερική προσθήκη θρεπτικών συστατικών, σύντοµα καθίσταται περιοριστικό για την αύξηση, δηλ. τα θρεπτικά συστατικά του µειώνονται σε συγκεντρώσεις κατώτερες των ορίων διατήρησης του µέγιστου ρυθµού αύξησης, ο δε µικροοργανισµός παύει να βρίσκεται σε κατάσταση κορεσµού. Έτσι, όσο τα θρεπτικά συστατικά των παραπάνω υποστρωµάτων περιορίζονται, τόσο ο ρυθµός αύξησης αποκλίνει του µεγίστου. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι η διαθεσιµότητα ενός ή περισσοτέρων για την αύξηση παραγόντων (limiting growth factor), καθορίζει την κινητική της αύξησης ή της µείωσης του µικροβιακού πληθυσµού. Επιπλέον, η ανασταλτική επίδραση των προϊόντων µεταβολισµού στην αύξηση των µικροβιακών κυττάρων θα πρέπει να ληφθεί σοβαρά υπόψη. Στα δείγµατα, τέλος, δεν ανιχνεύθηκε (cfu/g<1) η παρουσία ολικής µεσόφιλης µικροχλωρίδας, εντεροβακτηρίων, ζυµών, µυκήτων στο χρονικό διάστηµα των 12 εβδοµάδων.

50 Πίνακας 5. Επίδραση του χρόνου αποθήκευσης στη βιωσιµότητα του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 σε MRS Broth και στο γαλάκτωµα Ι. Χρόνος Αποθήκευσης (εβδοµάδες) Πληθυσµός ζώντων κυττάρων του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 στο MRS BROTH (cfu x 10 8 /g) Πληθυσµός ζώντων κυττάρων του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 στο ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ Ι (cfu x 10 8 /g) 0 3,2 x ± 0, 05A,c 2,7 x ± 0,03 B,d,e 1 3,2 x ± 0,04 C,b,c 2,4 x ± 0,03 C,e 2 8,7 x ± 0,12 D,d 2,0 x ± 0,1 E,d 3 12 x ± 0,13 F,e 2,0 x ± 0,08 G,d,e 4 2,3 x ± 0,13 H,a,b 1,2 x ± 0,05 H,c 8 2,2 x 1 ± 0,07 I,a,b 0,6 x ± 0,012 I,b 12 1,6 x ± 0,04 J,a 0,12 x ± 0,06 J,a 95%. ιαφορετικά γράµµατα στους εκθέτες υποδηλώνουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές για διάστηµα εµπιστοσύνης Σύµφωνα µε τη διεθνή βιβλιογραφία, το ελάχιστο όριο του πληθυσµού των ζώντων βακτηριακών κυττάρων σε ένα προβιοτικό τρόφιµο πρέπει να είναι µεταξύ 10 6-10 8 cfu/g, ανάλογα µε το στέλεχος και το τρόφιµο (Coeuret et al., 2004, Akin et al., 2006, Corcoran et al., 2007, Xin et al., 2008). Στη Γαλλία και στην Ισπανία απαιτείται ο πληθυσµός της προβιοτικής καλλιέργειας στο γιαούρτι µετά από αποθήκευση να µην µειώνεται κάτω από 5x10 8 cfu/ml (Xin et al., 2008). Για χαµηλότερο προβιοτικό µικροβιακό φορτίο, είναι απαραίτητη η καθηµερινή κατανάλωση του προβιοτικού γιαουρτιού ώστε να εξασφαλιστούν τα ευεργετικά οφέλη στους καταναλωτές (Shah, 2000). Ο Coeuret και συνεργάτες (2004), αναφέρουν ότι τα τρόφιµα µε τους υψηλότερους πληθυσµούς προβιοτικών είναι κυρίως τα ζυµούµενα προϊόντα γάλακτος ή άλλα προϊόντα γάλακτος όπως τα παγωτά µε µικροβιακό φορτίο προβιοτικών που φτάνει έως και 10 10 cfu/g. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη διατήρηση των προβιοτικών στελεχών κατά την αποθήκευση είναι η παρουσία στο τρόφιµο θρεπτικών συστατικών που µπορούν να αφοµοιωθούν από το µικροοργανισµό. Στην παρούσα µελέτη, ο πληθυσµός των προβιοτικών κυττάρων (1,2x10 7 cfu/g) που µετρήθηκε στο γαλάκτωµα Ι µετά από 12 εβδοµάδες

51 αποθήκευσης στους 4 ο C µπορεί να θεωρηθεί ικανοποιητικός σε σχέση τον αντίστοιχο πληθυσµό που προσδιορίστηκε στο MRS broth (1,6x10 8 cfu/g)και µε βάση τη διεθνή βιβλιογραφία για άλλα τρόφιµα-φορείς προβιοτικών µικροοργανισµών. Ο Micalen και συνεργάτες (1997) µελέτησαν τους πληθυσµούς του Lact. acidophilus σε δείγµατα γιαουρτιού µε πλήρη και χαµηλά λιπαρά για 6 εβδοµάδες. Ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων που καταµετρήθηκε ήταν 7,4x10 6 cfu/g. Σε δείγµατα παγωτού, οι πληθυσµοί των Lactobacillus rhamnosus και Lactobacillus acidophilus που καταµετρήθηκαν ανέρχονταν, αντίστοιχα, σε ~10 8 cfu/g µετά από 54 εβδοµάδες αποθήκευσης και 1x10 7 cfu/g µετά από 17 εβδοµάδες αποθήκευσης (Cruz et al., 2009). Επίσης, η βιωσιµότητα στελεχών Lactobacillus και Bifidobacterium µελετήθηκε και σε χυµούς φρούτων (Sheehan et al., 2007). Μετά από 12 εβδοµάδες, οι πληθυσµοί των προβιοτικών στελεχών ανέρχονταν σε ~10 7 cfu/ml για τον χυµό πορτοκαλιού, ~10 6 cfu/ml για τον χυµό ανανά και ~10 6 cfu/ml για τον χυµό µύρτιλων. Η ικανοποιητική διατήρηση της βιωσιµότητας των κυττάρων στο γαλάκτωµα Ι µπορεί να αποδοθεί στη σύστασή του. Τα κύρια συστατικά του γαλακτώµατος Ι είναι ο κρόκος του αβγού και το αραβοσιτέλαιο (παρ. 3.3.2A). Ο κρόκος του αυγού αποτελεί σηµαντική πηγή πρωτεϊνών, βιταµινών και ιχνοστοιχείων τόσο για τον άνθρωπο όσο και για τους µικροοργανισµούς. Ο κρόκος είναι ένα γαλάκτωµα ελαίου σε νερό µε περιεκτικότητα 50% σε ξηρή ύλη, και αποτελείται από πρωτεΐνες (32%), λιπίδια (63%), ανόργανα στοιχεία (2,1%) και υδατάνθρακες (0,9%) (Belitz et al., 2006). Με σκοπό την περαιτέρω ενίσχυση της βιωσιµότητας του προβιοτικού µικροοργανισµού τόσο κατά την αποθήκευση του προϊόντος όσο και κατά την διέλευσή του από τον γαστρεντερικό σωλήνα, στις επόµενες φάσεις της µελέτης εξετάστηκε η επίδραση της αποθήκευσης των δειγµάτων και της κατεργασίας σε συνθήκες πέψης στον πληθυσµό των κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας, α) µετά από εγκλεισµό των κυττάρων στα σταγονίδια του ελαίου γαλακτώµατος τύπου εµβάµµατος σαλάτας που παρασκευάστηκε µε διαφορετικούς γαλακτωµατοποιητές και β) µετά από προσθήκη παραγόντων ανάπτυξης (σακχαρόζη) και πρεβιοτικών (ινουλίνη).

52 4.2 Εγκλεισµός των κυττάρων στη φάση του ελαίου του γαλακτώµατος και µελέτη της βιωσιµότητάς τους κατά την αποθήκευση σε συνάρτηση µε τη φύση του γαλακτωµατοποιητή. Προκειµένου να ενισχυθεί η βιωσιµότητα των προβιοτικών µικροοργανισµών σε ένα προϊόν κατά την αποθήκευση και, στη συνέχεια, την κατανάλωσή του (στάδιο κατά το οποίο εκτίθεται στις δυσµενείς συνθήκες του στοµάχου και του εντέρου), έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές οι κυριότερες από τις οποίες είναι: α) η ζύµωση δύο σταδίων, β) η µέθοδος του stress adaption, γ) η προσθήκη ασκορβικού οξέος, δ) η µικροενθυλάκωση και ε) ο εγκλεισµός (Picot and Lacroix, 2004). Ο εγκλεισµός είναι µια µέθοδος που χρησιµοποιείται πλέον ευρύτατα στην βιοµηχανία τροφίµων για την προστασία των προβιοτικών κυττάρων και εφαρµόζεται σε µία µεγάλη ποικιλία τροφίµων. Ορίζεται ως η τεχνική της ενσωµάτωσης στερεών, υγρών ή αέριων υλικών σε µικρο-κάψουλες οι οποίες επιτρέπουν την απελευθέρωση του περιεχοµένου τους µε ελεγχόµενο ρυθµό κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες (Kumar Anal & Harjinder, 2007). Ο εγκλεισµός παρέχει προστασία στην προβιοτική καλλιέργεια τόσο από αλληλεπιδράσεις µε άλλα συστατικά του τροφίµου όσο και από το γαστρικό υγρό και τα χολικά άλατα στο γαστρεντερικό σωλήνα. Στην βιβλιογραφία αναφέρεται ένας µεγάλος αριθµός τρόπων και υλικών εγκλεισµού (Vidhyalakshmi et al., 2009, Kumar Anal and Harjinder, 2007, Rodríduez-Huezo et al., 2004) που είναι: Ο εγκλεισµός µικροοργανισµών σε σφαιρίδια πηκτής αλγινικών αλάτων-ασβεστίου. Ο εγκλεισµός µε την µέθοδο του Spray-Drying. Ο εγκλεισµός σε µικρό-κάψουλες πρωτεϊνών του γάλακτος µε την χρήση του ενζύµου ρενίνης. Ο εγκλεισµός σε σφαιρίδια πηκτής κ-καραγεννάνης. Ο εγκλεισµός σε σφαιρίδια χιτοζάνης µε αλγινικά άλατα. Ο εγκλεισµός σε κόκκους άµυλου ή σε σφαιρίδια άµυλου µε αλγινικά άλατα. Ο εγκλεισµός σε σταγονίδια γαλακτώµατος. Στην τρίτη φάση της µελέτης εξετάστηκε η επίδραση του εγκλεισµού των κυττάρων του Lact. paracasei subsp. paracasei DC412 στο εσωτερικό των σταγονιδίων του ελαίου του γαλακτώµατος, στον πληθυσµό των κύτταρων της προβιοτικής καλλιέργειας τόσο µετά από αποθήκευση των δειγµάτων όσο και µετά την κατεργασία σε συνθήκες πέψης. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα των µετρήσεων

53 της υδροφοβικότητας της κυτταρικής µεµβράνης του µικροοργανισµού (παρ.3.6.4), τα κύτταρα του µικροοργανισµού αναµένεται να κινηθούν προς την υδατική φάση του γαλακτώµατος. Προκειµένου, εποµένως, να επιτευχθεί ο εγκλεισµός του µεγαλύτερου ποσοστού των κυττάρων του εµβολίου στα σταγονίδια του ελαίου απαιτείται αρχικά καλή ανάµιξη για χρονικό διάστηµα 40 λεπτών του αιωρήµατος κυττάρων µε το έλαιο και στη συνέχεια προσθήκη του µίγµατος στην υδατική φάση για την παρασκευή του γαλακτώµατος (Hou et al.. 2003). Το ποσοστό του εγκλεισµού των κυττάρων του µικροοργανισµού προσδιορίστηκε µε έµµεσο τρόπο από τη διαφορά του πληθυσµού ζώντων κυττάρων στο αρχικό εµβόλιο και του πληθυσµού των ζώντων κυττάρων στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος µετά την παρασκευή του. Από την διαφορά των δύο τιµών εκτιµήθηκε ότι τα εγκλεισµένα κύτταρα της προβιοτικής καλλιέργειας ανέρχονταν σε ποσοστό 90% των κυττάρων του αρχικού εµβολίου. Ο εγκλεισµός επιβεβαιώθηκε και µε µικροσκοπική ανάλυση (Εικόνα 4). Εικόνα 4: Εγκλεισµένα κύτταρα του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 σε σταγονίδια ελαίου του γαλακτώµατος εµβάµµατος σαλάτας µε κρόκο του αυγού. Προκειµένου να αξιολογηθεί η σηµασία του είδους του γαλακτωµατοποιητή στη βιωσιµότητα των εγκλεισµένων κυττάρων παρασκευάστηκαν τέσσερις σειρές δειγµάτων που περιελάµβαναν αντίστοιχα τα γαλακτώµατα τύπου εµβάµµατος σαλάτας Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και IV, και στα οποία ο εγκλεισµός των κυττάρων του µικροοργανισµού έγινε όπως περιγράφεται παραπάνω και στην παρ.3.3.8 του Πειραµατικού Μέρους. Τα παραπάνω γαλακτώµατα διαφοροποιούνταν σε σχέση µε το είδος του γαλακτωµατοποιητή που χρησιµοποιήθηκε. Ο κρόκος αυγού που περιέχονταν στο γαλάκτωµα Ι αντικαταστάθηκε από α) αραβικό κόµµι (γαλάκτωµα

54 ΙΙ) ή β) πρωτεΐνη του ορού γάλακτος (γαλάκτωµα ΙV). Το αραβικό κόµµι χρησιµοποιείται ευρύτατα ως γαλακτωµατοποιητής στην τεχνολογία τροφίµων και παράλληλα εµφανίζει πρεβιοτικές ιδιότητες (Phillips & Phillips, 2010). Η πρωτεΐνη του ορού γάλακτος είναι ένας ευρέως χρησιµοποιούµενος γαλακτωµατοποιητής. Τέλος, θεωρήθηκε αναγκαίο να µελετηθεί η τυχόν συνεργιστική δράση του αραβικού κόµεος µε κάποιο σάκχαρο, και συγκεκριµένα τη σακχαρόζη, η οποία συµπεριλαµβάνεται στα σάκχαρα που πρωταρχικά µεταβολίζει ο συγκεκριµένος µικροοργανισµός (Hammond, 1966). Επιπλέον, η σακχαρόζη αποτελεί συχνά συστατικό γαλακτωµάτων τύπου εµβάµµατος σαλάτας (Woodroof and Tressler, 1976). Για τους παραπάνω λόγους, παρασκευάστηκε και ένα δείγµα (γαλάκτωµα ΙΙΙ) στο οποίο γαλακτωµατοποιητής ήταν το αραβικό κόµµι και περιείχε σακχαρόζη (2%, w/w). Ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας καταµετρήθηκε τόσο κατά την διάρκεια της αποθήκευσης των γαλακτωµάτων στους 4 ο C όσο και µετά από κατεργασία σε τεχνητό γαστρικό διάλυµα για 2h (παρουσία πεψίνης 0,3 g/l και πυκνού HCL σε τιµή ph 2,5) και επακόλουθη κατεργασία σε διάλυµα χολικών αλάτων 0,45 % w/v και παγκρεατίνης 0,1 % w/v για 4h. Σε αυτό το σηµείο είναι σηµαντικό να αναφερθούν ορισµένα προβλήµατα που εµφανίστηκαν κατά την πειραµατική διαδικασία. Οι δοκιµές της έκθεσης του Lact. paracasei subsp. paracasei DC412 σε διαλύµατα πεψίνης µε τιµή ph 1,2 (ελάχιστη τιµή) έδειξαν ότι ο συγκεκριµένος µικροοργανισµός δεν αντέχει στο ισχυρά όξινο περιβάλλον. Μετά από βιβλιογραφική ανασκόπηση, βρέθηκε ότι κατά την πέψη ενός γαλακτώµατος τύπου εµβάµµατος σαλάτας, το ph του στοµάχου µετά από µισή ώρα σταθεροποιείται κατά την διάρκεια της πέψης σε τιµή ~2,5 (Armand et al., 1996, Armand et al., 1999). Λαµβάνοντας υπόψη τα παραπάνω επιλέχθηκε να ρυθµιστεί το ph του διαλύµατος πεψίνης στην τιµή αυτή, στην οποία ο µικροοργανισµός εµφανίζει υψηλή αντοχή. Επίσης, ένα άλλο πρόβληµα ήταν η δυσκολία της πλήρους διάσπασης των σταγονιδίων στα γαλακτώµατα και η απελευθέρωση των εγκλεισµένων κυττάρων που θα επέτρεπε στα κύτταρα να δηµιουργήσουν αποικίες και να καταµετρηθούν. Πιο συγκεκριµένα, παρόλο που επιχειρήθηκε η εφαρµογή ορισµένων γνωστών µεθόδων ώστε να επιτευχθεί η διάσπαση των σταγονιδίων, όπως η αραίωση των γαλακτωµάτων µε αραιωτικό διάλυµα ακολουθούµενη από φυγοκέντρηση ή η διαδοχική κατάψυξη-απόψυξη των γαλακτωµάτων ακολουθούµενη από φυγοκέντρηση, καµία από αυτές τις µεθόδους δεν ήταν αποτελεσµατική.

55 Προκειµένου να ξεπεραστεί το πρόβληµα θεωρήθηκε ότι αφού το σηµαντικότερο κριτήριο για την ανάπτυξη ενός νέου προβιοτικού τροφίµου είναι η αξιολόγηση της βιωσιµότητας της προβιοτικής καλλιέργειας µέσα στον εντερικό σωλήνα, θα ήταν πιο σηµαντικό να γίνει η καταµέτρηση των ζώντων κυττάρων µετά από την επεξεργασία σε συνθήκες που επικρατούν στον εντερικό σωλήνα. Ο ποσοτικός προσδιορισµός των ζώντων κυττάρων µετά από την κατεργασία σε συνθήκες πέψης ήταν εφικτός καθώς παρατηρήθηκε µερική ή ολική αποσταθεροποίηση των γαλακτωµάτων και διαχωρισµός της υδατικής από την λιπαρή φάση που οδήγησε στην απελευθέρωση των εγκλεισµένων κυττάρων στην υδατική φάση. Πιο συγκεκριµένα, µετά την κατεργασία του γαλακτώµατος που παρασκευάστηκε µε κρόκο αυγού µε διάλυµα πεψίνης σε ph 2,5 για δύο ώρες παρατηρήθηκε συσσωµάτωση των σταγονιδίων και µερική συγχώνευση (Εικόνα 5β). Οι µεταβολές αυτές αποδίδονται στο ισχυρά όξινο περιβάλλον που έχει ως αποτέλεσµα την µεταβολή των φορτίων των πρωτεϊνών που βρίσκονται προσροφηµένες στην επιφάνεια των σταγονιδίων αλλά και στην πρωτεολυτική δράση της πεψίνης. Η πρωτεόλυση των πρωτεϊνών που είναι προσροφηµένες στην επιφάνεια των σταγονιδίων οδηγεί σε µείωση των απωστικών δυνάµεων µεταξύ των σταγονιδίων µε αποτέλεσµα την συσσωµάτωση τους (Singh et al., 2009). Παρόλα αυτά δεν παρατηρείται σηµαντική µεταβολή στο µέγεθος των σταγονιδίων. Στην επακόλουθη κατεργασία µε διάλυµα παγκρεατίνης και χολικών αλάτων παρατηρήθηκε αύξηση του µεγέθους των σταγονιδίων λόγω της συγχώνευσης τους. Το µέγεθος των σταγονιδίων κυµαίνεται στα 100 µm σε σχέση µε το αρχικό τους µέγεθος που ήταν ~6 µm. Οι αλλαγές αυτές επιβεβαιώθηκαν και µε µικροσκοπική ανάλυση (Εικόνα 5γ). Η απότοµη αύξηση της τιµής του ph (από 2,5 σε 7,4) έχει ως αποτέλεσµα την αλλαγή του φορτίου των πρωτεϊνών στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Επιπλέον, τα χολικά άλατα αντικαθιστούν τα προσροφηµένα µόρια στην επιφάνεια των σταγονιδίων και προάγουν την δράση των ενζύµων της παγκρεατίνης (αµυλάσες, λιπάσες και πρωτεάσες). Πρωτεΐνες µε ισχυρότερη γαλακτωµατοποιητική δράση, όπως οι λιποπρωτεΐνες του κρόκου, εκτοπίζονται δυσκολότερα από τα χολικά άλατα σε σχέση µε πρωτεΐνες µε ασθενέστερη δράση (πρωτεΐνη όρου γάλακτος). Συγκρίνοντας, µακροσκοπικά την επίδραση του διαλύµατος χολικών αλάτων και παγκρεατίνης σε γαλάκτωµα µε κρόκο αυγού και γαλάκτωµα µε πρωτεΐνη ορού γάλακτος διαπιστώθηκε ότι στο γαλάκτωµα µε πρωτεΐνη ορού γάλακτος υπήρξε πλήρης διάσπαση (όλη η ποσότητα του ελαίου

56 ελευθερώθηκε στην επιφάνεια του διαλύµατος) ενώ στο γαλάκτωµα µε κρόκο αυγού δεν παρατηρήθηκε διαχωρισµός φάσεων σε µεγάλο ποσοστό. Παράλληλα, η δράση των χολικών αλάτων παρεµποδίζεται από την ύπαρξη επιπλέον συστατικών στην διεπιφάνεια των σταγονιδίων (φωσφολιπιδίων, τριακυλογλυκερολών και άλλα). Αντίστοιχες είναι οι παρατηρήσεις του Μun και συνεργάτες, (2007) οι οποίοι διαπίστωσαν ότι η πρωτεΐνη του ορού γάλακτος εκτοπίζεται από τα χολικά άλατα, από την επιφάνεια των σταγονιδίων, πιο εύκολα σε σχέση µε την καζεΐνη. Αποτέλεσµα της δράσης των χολικών αλάτων και των ενζύµων είναι η συγχώνευση των σταγονιδίων σε µεγάλο βαθµό και η µερική διάσπαση του γαλακτώµατος. Για την εξασφάλιση της πλήρους απελευθέρωσης των εγκλεισµένων κυττάρων στην υδατική φάση και την καταµέτρηση όλων των ζώντων κυττάρων µετά την κατεργασία έγινε έντονη φυγοκέντρηση των δειγµάτων σε 15000xg για 30 min, στους 4 o C (παρ.3.4 Φάση ΙΙΙ). Η διάσπαση των σταγονιδίων των γαλακτωµάτων και η πλήρης απελευθέρωση των κυττάρων επιβεβαιώθηκε µε παρατήρηση στο µικροσκόπιο. Οι πληθυσµοί των ζώντων κυττάρων που καταµετρήθηκαν στα γαλακτώµατα µετά από κατεργασία παρουσιάζονται στο Σχήµα 1. Σχήµα 1. Επίδραση του χρόνου αποθήκευσης και του είδους του γαλακτωµατοποιητή στον πληθυσµό των εγκλεισµένων κυττάρων στα σταγονίδια του ελαίου του γαλακτώµατος µετά από κατεργασία σε τεχνητό γαστρικό υγρό και επακόλουθη κατεργασία σε διάλυµα χολικών αλάτων και παγκρεατίνης. Από Σχήµα 1 φαίνεται ότι ο µικροοργανισµός εµφανίζει αντοχή µετά από κατεργασία σε συνθήκες πέψης µόνο στα νωπά γαλακτώµατα. Συγκεκριµένα, στο

57 γαλάκτωµα Ι ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων που καταµετρήθηκε σε χρόνο µηδέν από τη στιγµή της παρασκευής του ήταν 8,0 x 10 7 cfu/g, ενώ για τα γαλακτώµατα ΙΙ, ΙΙΙ και ΙV ήταν ~1 x 10 8 cfu/g. Το ποσοστό των κυττάρων που επιβίωσε ανέρχονταν στο 41,6% του αρχικού πληθυσµού (2,4 x 10 8 cfu/g). Ο χαµηλότερος πληθυσµός ζώντων κυττάρων που καταµετρήθηκε στο γαλάκτωµα Ι σε σχέση µε τα γαλακτώµατα ΙΙ, ΙΙΙ και ΙV µπορεί να αποδοθεί στη µη πλήρη απελευθέρωση των κυττάρων από τα σταγονίδια του ελαίου. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το γαλάκτωµα Ι εµφάνιζε µεγαλύτερη σταθερότητα τόσο κατά την κατεργασία του σε διάλυµα πεψίνης και διάλυµα παγκρεατίνης-χολικών αλάτων όσο και µετά την έντονη φυγοκέντρηση, λόγω προφανώς της ισχυρότερης γαλακτωµατοποιητικής δράσης του κρόκου αυγού σε σχέση µε τους άλλους γαλακτωµατοποιητές. Γενικά, το ποσοστό των κυττάρων που επιβίωσε σε όλα τα δείγµατα κρίνεται ικανοποιητικό µε βάση τη διεθνή βιβλιογραφία. Συγκεκριµένα, οι Picot & Lacroix (2003), οι οποίοι µελέτησαν την επίδραση του εγκλεισµού στην αντοχή δυο διαφορετικών στελεχών του γένους Bifidobacterium (µε υλικό εγκλεισµού την πρωτεΐνη του ορού γάλακτος) σε συνθήκες πέψης, βρήκαν ότι το ποσοστό των κυττάρων που επιβίωσε µετά την έκθεση των εγκλεισµένων κυττάρων κυµαινόταν µεταξύ 0,71%-22,4% του αρχικού πληθυσµού ανάλογα µε το σύστηµα εγκλεισµού. Αντίστοιχα, οι Ding & Shah (2009) µελετώντας την επίδραση του σε αλγινικά άλατα, ξανθάνη, κόµµι γκουάρ, κ-καραγεννάνη και κόµµι χαρουπιού ως συστήµατα εγκλεισµού στην αντοχή 10 διαφορετικών προβιοτικών στελεχών σε συνθήκες πέψης αναφέρουν ότι οι αρχικοί πληθυσµοί των στελεχών µειώθηκαν µέχρι και 4 λογαρίθµους, όταν οι αντίστοιχοι αριθµοί των ελεύθερων κυττάρων µειώθηκαν κατά 7 λογαρίθµους. Όπως προκύπτει από την παρατήρηση του Σχήµατος 1, µετά την πρώτη εβδοµάδα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων Ι, ΙΙ και ΙV ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας µειώνεται σηµαντικά. Μόνο στην περίπτωση του γαλακτώµατος ΙΙΙ δεν παρατηρήθηκε σηµαντική πτώση του πληθυσµού των ζώντων κυττάρων. Η αρχική µας υπόθεση ήταν ότι τα παραπάνω συστήµατα εγκλεισµού οδήγησαν σε υψηλή θνησιµότητα των κυττάρων. Η υπόθεσή µας αυτή δεν επιβεβαιώθηκε όταν δείγµατα των κατεργασµένων γαλακτωµάτων εµβολιάστηκαν σε υγρό υπόστρωµα MRS Broth. Ειδικότερα, αυτό που παρατηρήθηκε ήταν ότι µετά από ένα ασυνήθιστα µεγάλο διάστηµα φάσης προσαρµογής (72h επώαση στους 37 ο C έναντι 18h στους 37 ο C που είναι ο φυσιολογικός χρόνος επώασης για την ανάπτυξη

58 του µικροοργανισµού) ο µικροοργανισµός αναπτύχθηκε. Το υγρό υπόστρωµα ευνοεί σε µεγαλύτερο βαθµό την ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων σε σχέση µε το αντίστοιχο στερεό υπόστρωµα, λόγω των φαινοµένων διάχυσης που διευκολύνουν τη λήψη των θρεπτικών ουσιών από το κύτταρο. Η ανάπτυξη των κυττάρων στο υγρό υπόστρωµα σηµαίνει ότι τα εγκλεισµένα κύτταρα κατά την αποθήκευση δεν θανατώνονται, αλλά οδηγούνται σε λανθάνουσα κατάσταση (lethal condition), η οποία σίγουρα δεν είναι επιθυµητή γιατί αναµένεται να επηρεάσει αρνητικά την ικανότητα της προβιοτικής καλλιέργειας να προσκολληθεί και να αποικίσει στον εντερικό σωλήνα του ξενιστή. Με βάση προηγούµενες µελέτες, υπάρχει έντονη συσχέτιση της περατότητας του υλικού εγκλεισµού από τα θρεπτικά στοιχειά και της διατήρησης της ζωτικότητας των κυττάρων κατά την διάρκεια του εγκλεισµού. Τα σφαιρίδια χιτοζάνης µε αλγινικά άλατα αποτελούν το πιο κοινό υλικό εγκλεισµού προβιοτικών (Picot & Lacroix, 2003, Khalil & Mansour, 2006). Τα πλεονεκτήµατα τους ως υλικά εγκλεισµού είναι η επιλεκτική περατότητα της µεµβράνης που δηµιουργείται και επιτρέπει την διέλευση θρεπτικών συστατικών από το περιβάλλον στο εσωτερικό, η βιοσυµβατότητα και η βιοαποικοδόµηση τους (Jen et al., 1996, Forster et al., 2010). Oι Ding & Shah (2009) αναφέρουν ότι η κ-καρραγενάνη παρουσιάζει κοινά χαρακτηριστικά και παρόµοιο βαθµό προστασίας στα εγκλεισµένα κύτταρα ως υλικό εγκλεισµού καθώς έχει κοινή προέλευση µε τα αλγινικά άλατα (φύκη). Οι ίδιοι ερευνητές αναφέρουν ότι οι κάψουλες εγκλεισµού µε υλικό το αραβικό κόµµι ή την ξανθάνη εµφανίζουν περατότητα σε µόρια µικρού µεγέθους µε µοριακό βάρος έως 376, όπως είναι οι δισακχαρίτες. Από όλα τα παραπάνω φαίνεται ότι στην παρούσα εργασία η προσδοκώµενη θετική επίδραση του εγκλεισµού στη διατήρηση της ζωτικότητας των προβιοτικών κυττάρων του Lact. paracasei subsp. paracasei DC412 δεν επιτεύχθηκε. Αυτό µπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι εγκλεισµός των κυττάρων στα σταγονίδια του ελαίου δυσχεραίνει την πρόσληψη των υδατοδιαλυτών συστατικών της συνεχούς φάσης από τα εγκλεισµένα κύτταρα. Η ευεργετική δράση της σακχαρόζης στο γαλάκτωµα ΙΙΙ µπορεί να αποδοθεί στη διατήρηση των ελεύθερων κυττάρων σε δραστική µορφή και την αύξηση τους κατά την αποθήκευση. Την υπόθεση αυτή ενισχύουν οι τιµές των πληθυσµών των ζώντων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας στη συνεχή φάση των γαλακτωµάτων µετά από αποθήκευση για χρονικό διάστηµα 1 εβδοµάδας (Σχήµα 2). Για τα γαλακτώµατα Ι, ΙΙ και IV ο πληθυσµός ελεύθερων ζώντων κυττάρων ήταν σταθερός για την 1 η εβδοµάδα (~10 7 cfu/g). Μετά την 1 η εβδοµάδα δεν υπήρξε σηµαντική αύξηση.

59 Αντίθετα, στο γαλάκτωµα ΙΙΙ παρατηρήθηκε σηµαντική αύξηση του µικροβιακού φορτίου της προβιοτικής καλλιέργειας στη συνεχή φάση µετά από αποθήκευση για 1 εβδοµάδα, ο οποίος ανέρχονταν σε 2 x 10 8 cfu/g, έναντι του αριθµού ζώντων κυττάρων σε χρόνο µηδέν µετά την παρασκευή του γαλακτώµατος (2 x 10 6 cfu/g). Στην τελευταία περίπτωση, στο τέλος της 2 ης εβδοµάδας παρατηρήθηκε µείωση του πληθυσµού των ελεύθερων ζώντων κυττάρων (8 x 10 7 cfu/g) πιθανόν λόγω εξάντλησης της σακχαρόζης. Η αποθήκευση των γαλακτωµάτων για χρονικό διάστηµα µεγαλύτερο των 4 εβδοµάδων οδήγησε σε θανάτωση των ελεύθερων κυττάρων, όπως, φαίνεται στο Σχήµα 2. Πληθυσµός ζώντων κυττάρων cfu/g 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 Χρόνος µηδέν 1η Εβδοµάδα 2η Εβδοµάδα 4η Εβδοµάδα 6η εβδοµάδα ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ Ι ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ ΙΙ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ ΙΙΙ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ ΙV Σχήµα 2. Επίδραση του χρόνου αποθήκευσης και του είδους του γαλακτωµατοποιητή στον πληθυσµό των ελεύθερων κυττάρων της προβιοτική καλλιέργειας στα γαλακτώµατα.

60 α) β) γ)

61 Εικόνα 5: Φωτογραφία γαλακτώµατος Ι από µικροσκόπιο πριν (α) και µετά την κατεργασία µε πεψίνη (β) ή µε πεψίνη και παγκρεατίνη (γ) 4.3 Επίδραση της προσθήκης σακχαρόζης και ινουλίνης στη βιωσιµότητα των κυττάρων στα γαλακτώµατα. Προκειµένου να ενισχυθεί µε θρεπτικά συστατικά ένα τρόφιµο-φορέας προβιοτικών µικροοργανισµών, χρησιµοποιούνται κατά κανόνα ορισµένοι παράγοντες ανάπτυξης (growth factors), οι οποίοι διεγείρουν την ανάπτυξη και τον µεταβολισµό των κυττάρων. Ως παράγοντες ανάπτυξης µπορούν να χρησιµοποιηθούν υδατάνθρακες (π.χ. µονοσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες, πολυσακχαρίτες, άµυλο), αµινοξέα, πηκτίνες, πεπτόνες κ.α. (Gibson & Roberfroid, 1995). Από τους παραπάνω παράγοντες, αυτοί που έχουν µελετηθεί περισσότερο είναι οι υδατάνθρακες, και κυρίως οι µονοσακχαρίτες, καθώς επίσης και ορισµένοι ολιγοσακχαρίτες και πολυσακχαρίτες που εµφανίζουν πρεβιοτική δράση. Ο Elli και συνεργάτες (1999) πρότειναν την προσθήκη παραγόντων ανάπτυξης (εκχύλισµα ζύµης, αµινοξέων, πεπτονών) σε προϊόντα µε βάση το άπαχο γάλα (φτωχό υπόστρωµα), προκειµένου ο πληθυσµός του προβιοτικού να διατηρηθεί σε 10 6 cfu/ml. Επίσης, οι Ramchandran & Shah (2009) διατήρησαν τις προβιοτικές ιδιότητες του γιαουρτιού µε χαµηλά λιπαρά µε την προσθήκη πολυσακχαριτών µικροβιακής προέλευσης. Με τον τρόπο αυτό διατηρήθηκε ο ελάχιστος απαιτούµενος πληθυσµός της προβιοτικής καλλιέργειας (10 6 cfu/ml) µετά από αποθήκευση του προϊόντος για χρονικό διάστηµα 21 ηµερών σε συνθήκες ψύξης. Στην παρούσα µελέτη έγιναν δοκιµές µε σκοπό τον εµπλουτισµό της συνεχούς φάσης του γαλακτώµατος τύπου εµβάµµατος σαλάτας, που παρασκευάστηκε µε κρόκο αυγού, µε ινουλίνη ή/και σακχαρόζη. Η επιλογή της ινουλίνης έγινε µε βάση τις πρεβιοτικές της ιδιότητες (παρ. 1.5.1) καθώς, επίσης, και την ευεργετική της δράση ως διαιτητική ίνα και την χαµηλή θερµιδική της αξία (Jardin, 2009). Οι ιδιότητες αυτές είναι άκρως επιθυµητές για την παρασκευή ενός νέου λειτουργικού τροφίµου. Η µελέτη της βιωσιµότητας των κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας που βρίσκονταν ελεύθερα στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος έγινε παράλληλα µε τη µελέτη της βιωσιµότητάς τους µετά από εγκλεισµό τους στα σταγονίδια του γαλακτώµατος.

62 Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν 10 διαφορετικά γαλακτώµατα, η ακριβής σύσταση των οποίων παρουσιάζεται στον Πίνακα 3 (σελ. 39). Τα γαλακτώµατα µε τα ελευθέρα κύτταρα εµβολιάστηκαν όπως αναφέρεται στην παρ. 3.3.7, ενώ τα γαλακτώµατα µε εγκλεισµένα κύτταρα όπως αναφέρεται στην παρ. 3.3.8. Τα δείγµατα αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C και καταµετρήθηκε ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων µετά από αποθήκευση για 0, 2 και 4 εβδοµάδες, πριν ή µετά από κατεργασία σε συνθήκες πέψης (παρ. 3.4 Φάση ΙΙΙ). Τα αποτελέσµατα των παραπάνω πειραµατικών δοκιµών παρουσιάζονται στα Σχήµατα 3, 4 και στον Πίνακα 6. Πληθυσµός ζώντων κυττάρων cfu/g 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ Ι 1 2 3 4 5 0 2η Εβδοµάδα 4η Εβδοµάδα Σχήµα 3. Επίδραση της προσθήκης ινουλίνης και σακχαρόζης στην επιβίωση των ελεύθερων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας κατά την αποθήκευση του γαλακτώµατος. (Το γαλάκτωµα Ι παρασκευάστηκε µε κρόκο αυγού χωρίς ινουλίνη και σακχαρόζη).

63 Πληθυσµός ζώντων κυττάρων cfu/g 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 ΓΑΛΑΚΤΩΜΑ Ι 1 2 3 4 5 2η Εβδοµάδα 4η Εβδοµάδα Σχήµα 4. Επίδραση της προσθήκης ινουλίνης και σακχαρόζης στην επιβίωση των ελεύθερων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας κατά την αποθήκευση του γαλακτώµατος και µετά από κατεργασία µε τεχνητό γαστρικό υγρό και επακόλουθη κατεργασία µε διάλυµα χολικών αλάτων και παγκρεατίνης. Πίνακας 6. Επίδραση της προσθήκης ινουλίνης απουσία και παρουσία 2 % w/w σακχαρόζης στην επιβίωση των εγκλεισµένων στα σταγονίδια κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας µετά από αποθήκευση και κατεργασία του γαλακτώµατος. Πληθυσµός των ζώντων κυττάρων του Lactobacillus paracasei Χρόνος αποθήκευσης (εβδοµάδες) subssp. paracasei DC412 στα γαλακτώµατα (cfu/g) 1 2 3 4 5 2 η Εβδοµάδα <10 3 <10 3 <10 3 <10 3 <10 3 4 η Εβδοµάδα <10 2 <10 2 <10 2 <10 2 <10 2 Ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων στη συνεχή φάση όλων των γαλακτωµάτων που εξετάστηκαν αυξήθηκε σηµαντικά µετά από 2 εβδοµάδες αποθήκευσης (από 0,9 x 10 9 cfu/g έως 1,2 x 10 9 cfu/g, όταν ο αρχικός πληθυσµός ήταν 1,8 x10 8 cfu/g), σε σχέση µε τον αντίστοιχο πληθυσµό στο γαλάκτωµα που δεν περιείχε ινουλίνη και σακχαρόζη (γαλάκτωµα Ι) για το ίδιο χρονικό διάστηµα (2x10 8 cfu/g). Η µεγαλύτερη

64 αύξηση παρατηρήθηκε στο γαλάκτωµα µε 2% (w/w) ινουλίνη απουσία σακχαρόζης (πληθυσµός ζώντων κυττάρων 1,6 x 10 9 cfu/g έναντι του αρχικού 1,8 x 10 8 cfu/g). Το αποτέλεσµα αυτό είναι ενθαρρυντικό λαµβάνοντας υπόψη ότι η ινουλίνη µπορεί να αντικαταστήσει αποτελεσµατικά τη σακχαρόζη ως παράγοντας ανάπτυξης της προβιοτικής καλλιέργειας. Τα αποτελέσµατα αυτά συµβαδίζουν µε τα αποτελέσµατα από in vivo µελέτες που έγιναν σε εθελοντές όπου µετά 15 µέρες λήψης µέσω της τροφής 15g σακχαρόζης ή 15g ινουλίνης καταµετρήθηκαν πληθυσµοί στελεχών Lact. από τον εντερικό τους σωλήνα. Οι πληθυσµοί αυτοί στα άτοµα που κατανάλωσαν σακχαρόζη και στα άτοµα που κατανάλωσαν ινουλίνη ήταν περίπου ίδιοι (6,6 log 10 /g και 6,1 log 10 /g αντίστοιχα) (Gibson, 1999, Gibson et al., 2004). Περαιτέρω αποθήκευση όλων των γαλακτωµάτων για 4 εβδοµάδες, είχε ως αποτέλεσµα τη µείωση του πληθυσµού των ζώντων κυττάρων κατά 2 λογάριθµους (1-1,5 x10 7 cfu/g). Οι πληθυσµοί αυτοί βρέθηκαν να είναι ισοδύναµοι µε τον αντίστοιχο πληθυσµό στο γαλάκτωµα Ι (1,2x10 7 cfu/g) για το ίδιο χρονικό διάστηµα αποθήκευσης. Η θανάτωση των κυττάρων θα πρέπει να αποδοθεί στην εξάντληση των θρεπτικών συστατικών στο υπόστρωµα, κυρίως της ινουλίνης και της σακχαρόζης (Σχήµατα 3 και 4). Ένα ενδιαφέρον στοιχείο που προέκυψε από τη µελέτη ήταν ότι ο πληθυσµός των ζώντων κυττάρων όλων των εµπλουτισµένων µε ινουλίνη (παρουσία ή απουσία σακχαρόζης) γαλακτωµάτων µετά από κατεργασία σε διάλυµα πεψίνης και διάλυµα παγκρεατίνης-χολικών αλάτων (Σχήµα 4) ήταν σηµαντικά αυξηµένος σε σχέση µε το γαλάκτωµα Ι. Όµοια µε τα προηγούµενα αποτελέσµατα, µετά το τέλος της 2 ης εβδοµάδας αποθήκευσης, ο µεγαλύτερος αριθµός των κυττάρων που επιβίωσαν µετά την κατεργασία παρατηρήθηκε στο γαλάκτωµα µε 2% (w/w) ινουλίνη (1,6x10 7 cfu/g). Μελέτες in vivo αποδεικνύουν ότι η προσθήκη ινουλίνης στην τροφή διεγείρει την ανάπτυξη στελεχών του γένους Lactobacillus. Φαίνεται ότι η ινουλίνη έχει µία αξιόλογη προστατευτική δράση στα κύτταρα που εκτίθενται σε συνθήκες πέψης. Μελέτες αναφέρουν ότι δρα δραστηριοποιώντας τα κύτταρα έναντι της τοξικής δράσης των χολικών αλάτων (Perrin et al., 2000). Σε όλα τα γαλάκτωµα ο πληθυσµός των κυττάρων που επιβίωσαν ήταν υψηλός ώστε το τρόφιµο να αποδίδει τα ευεργετικά οφέλη των προβιοτικών µικροοργανισµών. Στην τέταρτη εβδοµάδα ο πληθυσµός ζώντων κυττάρων όλων των γαλακτωµάτων µετά από κατεργασία µειώθηκε κατά 1 λογάριθµο. Το αποτέλεσµα αυτό ήταν αναµενόµενο λόγω της µείωσης του µικροβιακού φορτίου κατά την αποθήκευση πριν την κατεργασία.

65 Σε αντίθεση µε τα κύτταρα στη συνεχή φάση του γαλακτώµατος, τα εγκλεισµένα στο εσωτερικό των σταγονιδίων κύτταρα δεν επιβίωσαν µετά από 2 εβδοµάδες αποθήκευσης και κατεργασίας (Πίνακας 6). Όµοια µε τα προηγούµενα αποτελέσµατα (Σχήµα 1), φαίνεται ότι ο εγκλεισµός των κυττάρων στο εσωτερικό των σταγονιδίων του ελαίου δεν επιτρέπει στα κύτταρα να προσλάβουν τα θρεπτικά συστατικά που βρίσκονται στην υδατική φάση του γαλακτώµατος. Αποτέλεσµα αυτού είναι τα κύτταρα να βρεθούν σε µία λανθάνουσα φάση όπου δύσκολα αναπτύσσονται µετά από έκθεση στις στρεσογόνες συνθήκες πέψης. Ενώ κάποιες έρευνες, υποστηρίζουν ότι ο εγκλεισµός βακτηρίων του γένους Lact. σε σταγονίδια ελαίου γαλακτώµατος οδηγεί σε αυξηµένο βαθµό επιβίωσης, µετά από 16 ηµέρες αποθήκευσης ή µετά από κατεργασία µε ένζυµα (χωρίς όµως να έχει προηγηθεί αποθήκευση), σε σχέση µε το βαθµό επιβίωσης των ελευθέρων κυτάρων (Hou et al., 2003), η παρούσα µελέτη δεν έδειξε κάτι ανάλογο. Για το λόγο αυτό εγκαταλείφθηκε η ιδέα του εµπλουτισµού του γαλακτώµατος µε εγκλεισµό του προβιοτικού στη φάση του ελαίου και η µελέτη συνεχίστηκε µε την απόπειρα της ενίσχυσης της βιωσιµότητας των κυττάρων που απαντούν ελεύθερα στην υδατική φάση του συστήµατος µε την προσθήκη αυξητικών παραγόντων.

66 4.4 Μελέτη της επίδρασης του χρόνου αποθήκευσης του γαλακτώµατος σε συνδυασµό µε την συγκέντρωση του κρόκου αυγού και της ινουλίνης στη βιωσιµότητα της προβιοτικής καλλιέργειας. Με βάση τα αποτελέσµατα της µελέτης που προηγήθηκε, κρίθηκε απαραίτητη η βελτιστοποίηση των συγκεντρώσεων του κρόκου αυγού και της ινουλίνης του γαλακτώµατος επειδή οι παράµετροι αυτοί είχαν τη µεγαλύτερη επίδραση στη βιωσιµότητα του προβιοτικού αλλά και στη σταθερότητα του γαλακτώµατος. Στόχος ήταν η εύρεση των βέλτιστων συγκεντρώσεων για την παρασκευή ενός φυσικοχηµικά σταθερού εµβάµµατος σαλάτας που θα εµφανίζει έναν ικανοποιητικό πληθυσµό ζώντων κυττάρων προβιοτικής καλλιέργειας µετά την αποθήκευσή του ή/και την έκθεσή του σε εργαστηριακές συνθήκες ανάλογες µε αυτές της πέψης. Για τη βελτιστοποίηση, ορίστηκε το κατώτερο (-1) και το ανώτερο (+1) επίπεδο τιµών των ανεξάρτητων µεταβλητών, δηλαδή του χρόνου αποθήκευσης του γαλακτώµατος (X1), και των συγκεντρώσεων της ινουλίνης (Χ2) και του κρόκου αυγού (Χ3). Στη συνέχεια, οι τιµές αυτές χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό των πέντε πειραµατικών επιπέδων των παραπάνω µεταβλητών (Πίνακας 7) και τον πειραµατικό σχεδιασµό (Πίνακας 8) µε τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου Minitab Statistical Software, version 13.1 (Minitab Inc. 2000). Πίνακας 7. Επίπεδα τιµών των ανεξάρτητων µεταβλητών που χρησιµοποιήθηκαν στο πειραµατικό σχεδιασµό του µοντέλου πρόβλεψης. Μεταβλητή Παράγοντας Κωδικοποιηµένη τιµή -a -1 0 +1 +a Πραγµατική τιµή Χ1 Χρόνος αποθήκευσης 0,3 2 4,5 7 8,7 του γαλακτώµατος (εβδοµάδες) Χ2 Συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) 0,9 2 3,5 5 6 X3 Συγκέντρωση του κρόκου (% w/w) 0,9 2 3,5 5 6 Πίνακας 8. Πειραµατικός σχεδιασµός και τιµές των εξαρτηµένων µεταβλητών που

67 µετρήθηκαν στις διαφορετικές δοκιµές του πειραµατικού σχεδιασµού Χρόνος οκ αποθήκευσης Συγκέντρ Α) Αριθµός (Β) Αριθµός ζωντανών ιµ του Συγκέντρω ωση ζωντανών κυττάρων µετά την (Γ) Τιµή Βαθµός ή γαλακτώµατο ση κρόκου κυττάρων µετά αποθήκευση και ph του Συντελεστής Αποκορύ ς Ινουλίνης αυγού την αποθήκευση κατεργασία γαλακτώµ Συνεκτικότητ φωσης (εβδοµάδες) (% w/w) (% w/w) (cfu/g) (cfu/g) ατος ας Κ (Pa x s n ) Η% 1 4,5 3,5 3,5 1000000000 12000000 3,8 9,97 4,9 2 2 5 5 50000000 2000000 3,7 29,09 0,2 3 4,5 3,5 3,5 800000000 9000000 3,75 10,19 4,2 4 7 5 5 23000000 9000000 3,71 24,92 0 5 4,5 3,5 1,0 100000000 80000000 3,44 1,16 8 6 2 2 5 35000000 680000 3,74 7,44 3,9 7 4,5 6,0 3,5 10000000 360000 3,76 62,1 0 8 2 5 2 80000000 36000 3,62 27,93 0 9 4,5 3,5 3,5 800000000 10000000 3,78 11 3,9 10 7 5 2 40000000 520000 3,59 35,72 0,1 11 2 2 2 50000000 80000 3,59 1,16 12 12 4,5 3,5 3,5 1000000000 11000000 3,79 10,14 4,7 13 4,5 3,5 6,0 1200000 180000 3,73 22,14 0,2 14 7 2 5 20000000 6000000 3,73 5,919 9 15 0,3 3,5 3,5 1000000000 800000 3,75 5,06 0 16 4,5 1,0 3,5 1000000 40000 3,72 2,68 14,2 17 7 2 2 25000000 1000000 3,58 1,83 14 18 8,7 3,5 3,5 3000000 60000 3,81 9,64 4,7 19 4,5 3,5 3,5 1200000000 10000000 3,82 10,38 4,6 20 4,5 3,5 3,5 1000000000 10500000 3,79 9,7 3,7 Τα αποτελέσµατα των πειραµατικών δοκιµών που περιγράφονται στον Πίνακα 8 χρησιµοποιήθηκαν για την εκτίµηση του πληθυσµού των ζώντων κύτταρων του Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412 στο τέλος των διαφόρων χρονικών διαστηµάτων αποθήκευσης του γαλακτώµατος, χωρίς (Y1) ή µετά από κατεργασία (Y2) (παρ 3.4 Φάση ΙΙΙ). Για την εκτίµηση της φυσικοχηµικής σταθερότητας των διαφορετικών γαλακτωµάτων µετρήθηκαν, επίσης, η τιµή του ph του γαλακτώµατος (Y3), το ιξώδες όπως αυτό εκφράζεται από το συντελεστή συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) (Y4) και ο βαθµός αποκορύφωσης του γαλακτώµατος (Y5) για διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης. Η ανάλυση διακύµανσης (ANOVA) που έγινε για κάθε ένα µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης ξεχωριστά (Πίνακας 9), παρέχει πληροφορίες για την επάρκεια του µοντέλου. Πιο συγκεκριµένα, α) αν η τιµή του λόγου F για το µοντέλο είναι στατιστικώς σηµαντική σε επίπεδο 5% και η τιµή της πιθανότητας (p-value) του ελέγχου ολικής σηµαντικότητας του µοντέλου είναι χαµηλή (p<0,05), τότε το µοντέλο θεωρείται έγκυρο και ικανό να ερµηνεύσει την παραλλακτικότητα της

68 απόκρισης, β) αν η τιµή του λόγου F για το σφάλµα προσαρµογής, το οποίο οφείλεται είτε σε παράλειψη µεταβλητών είτε σε χρήση µεταβλητών που δεν σχετίζονται µε την υπό εξέταση µεταβλητή, είναι στατιστικώς σηµαντική, τότε θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί ένα πολυπλοκότερο µοντέλο, στο οποίο θα περιλαµβάνονται υψηλότερου βαθµού παραγοντικές επιδράσεις (Box et al., 1978, Neter et al., 1996). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα του πίνακα 10, η τιµή του συντελεστή προσδιορισµού R 2 για όλα τα µοντέλα είναι πολύ κοντά στη µονάδα (0,936-0,989). Αυτό δείχνει ότι η µεταβλητότητα των Υ1, Y2, Y3, Y4 και Y5 οφείλεται σχεδόν εξ ολοκλήρου στις σχέσεις που υπάρχουν µεταξύ των παραπάνω µεταβλητών και των ανεξάρτητων µεταβλητών Χ1, Χ2 και Χ3. Επιπλέον η τιµή του λόγου F για κάθε παλινδρόµηση είναι στατιστικώς σηµαντική σε επίπεδο 5% (p<0,05), ενώ η αντίστοιχη τιµή του F για το σφάλµα προσαρµογής δεν είναι στατιστικώς σηµαντική στο ίδιο επίπεδο (p>0,05). Κρίνεται, εποµένως, ότι τα µοντέλα µπορούν να ερµηνεύσουν ικανοποιητικά την επίδραση του χρόνου αποθήκευσης και των συγκεντρώσεων της ινουλίνης και του κρόκου στον πληθυσµό των ζώντων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας Lactobacillus paracasei subssp. paracasei DC412. Πίνακας 9. Ανάλυση διακύµανσης για το µοντέλο πολλαπλής παλινδρόµησης του αριθµού των ζώντων κυττάρων µετά την αποθήκευση (A), του αριθµού των ζώντων κυττάρων µετά από κατεργασία (B) και της τιµής ph του γαλακτώµατος(γ). Πηγή µεταβλητότητας Άθροισµα Μέσο F b P β.ε. a τετραγώνων τετράγωνο (Α) Αριθµός ζωντανών κυττάρων για διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης (Υ1) R 2 = 0,980 Παλινδρόµηση 9 3,39216E+18 3,76907E+17 53,61 0,000 Γραµµική 3 1,34488E+18 4,48294E+17 63,76 0,000 Τετραγωνική 3 3,38579E+18 1,12860E+18 160,51 0,000 Αλληλεπίδραση 3 2,48375E+14 8,27917E+13 0,01 0,998 Υπόλλειµα 10 7,03110E+16 7,03110E+15 Έλλειψη προσαρµογής 5 1,69777E+16 3,39554E+15 0,32 0,883 Πειραµατικό σφάλµα 5 5,33333E+16 1,06667E+16 Σύνολο 19

69 (Β) Αριθµός ζωντανών κυττάρων µετά από κατεργασία για διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης (Υ2) R 2 = 0,936 Παλινδρόµηση 9 3,59689E+14 3,99655E+13 16,23 0,000 Γραµµική 3 1,02685E+14 3,42284E+13 13,90 0,001 Τετραγωνική 3 3,08638E+14 1,02879E+14 41,78 0,000 Αλληλεπίδραση 3 1,10194E+13 3,67312E+12 1,49 0,276 Υπόλλειµα 10 2,46222E+13 2,46222E+12 Έλλειψη προσαρµογής 5 1,77472E+13 3,54944E+12 2,58 0,161 Πειραµατικό σφάλµα 5 6,87500E+12 1,37500E+12 Σύνολο 19 (Γ)Τιµή του ph του γαλακτώµατος (Υ3) R 2 = 0,968 Παλινδρόµηση 9 0,167744 0,018638 33,55 0,000 Γραµµική 3 0,087092 0,029031 52,25 0,000 Τετραγωνική 3 0,103977 0,034659 62,39 0,000 Αλληλεπίδραση 3 0,001450 0,000483 0,87 0,488 Υπόλλειµα 10 0,005556 0,000556 Έλλειψη προσαρµογής 5 0,002872 0,000574 1,07 0,471 Πειραµατικό σφάλµα 5 0,002683 0,000537 Σύνολο 19 ( ) Συντελεστής συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) (Υ4) R 2 = 0,947 Παλινδρόµηση 9 4049,191 449,910 19,87 0,000 Γραµµική 3 231,933 77,311 3,41 0,061 Τετραγωνική 3 903,165 301,055 13,30 0,001 Αλληλεπίδραση 3 77,575 25,858 1,14 0,379 Υπόλλειµα 10 226,434 22,643 Έλλειψη προσαρµογής 5 225,460 45,092 231,57 0,000 Πειραµατικό σφάλµα 5 0,974 0,195 Σύνολο 19

70 (Ε) Βαθµός αποκορύφωσης Η% (Υ5) R 2 = 0,947 Παλινδρόµηση 9 405,139 45,0154 66,92 0,000 Γραµµική 3 84,633 28,2111 41,94 0,000 Τετραγωνική 3 23,825 7,9416 11,81 0,001 Αλληλεπίδραση 3 29,240 9,7467 14,49 0,001 Υπόλλειµα 10 6,727 0,6727 Έλλειψη προσαρµογής 5 5,593 1,1187 4,94 0,052 Πειραµατικό σφάλµα 5 1,133 0,2267 Σύνολο 19 a Βαθµοί ελευθερίας b Οι τιµές του F είναι στατιστικώς σηµαντικές σε επίπεδο 5% Πίνακας 10. Εκτίµηση των συντελεστών παλινδρόµησης του µοντέλου πολλαπλής παλινδρόµησης δευτέρου βαθµού για τον αριθµό των ζώντων κυττάρων µετά την αποθήκευση (A), τον αριθµό ζώντων κυττάρων µετά από κατεργασία (B) και την τιµή ph του γαλακτώµατος(γ) Όρος Συντελεστής Τ P (Α) Αριθµός ζωντανών κυττάρων σε διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης (Υ1) Σταθερά -3403659353-11,069 0,000 Χρόνος ( εβδοµάδες) 420095404 8,199 0,000 Ινουλίνη 987410884 10,810 0,000 Κρόκος Αυγού 959076687 10,500 0,000 Χρόνος Χ Χρόνος -47504531-13,442 0,000 Ινουλίνη Χ ινουλίνη -139185232-14,178 0,000 Κρόκος αυγού Χ Κρόκος -137221047-13,978 0,000 Χρόνος Χ ινουλίνη -900000-0,114 0,912 Χρόνος Χ Κρόκος Αυγού 766667 0,097 0,925 Ινουλίνη Χ Κρόκος Αυγού -1500000-0,114 0,912 (Β) Αριθµός ζωντανών κυττάρων µετά από κατεργασία σε διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης (Υ2) Σταθερά -28976774-5,036 0,001 Χρόνος ( εβδοµάδες) 3897781 4,065 0,002

71 Ινουλίνη 9742118 5,699 0,000 Κρόκος Αυγού 6111487 3,575 0,005 Χρόνος Χ Χρόνος -504760-7,632 0,000 Ινουλίνη Χ ινουλίνη -1438253-7,829 0,000 Κρόκος αυγού Χ Κρόκος -998276-5,434 0,000 Χρόνος Χ ινουλίνη -25200-0,170 0,868 Χρόνος Χ Κρόκος Αυγού 297200 2,009 0,072 Ινουλίνη Χ Κρόκος 158000 0,641 0,536 (Γ)Τιµή του ph του γαλακτώµατος (Υ3) Σταθερά 2,95175 34,149 0,000 Χρόνος ( εβδοµάδες) 0,02013 1,398 0,192 Ινουλίνη 0,08886 3,461 0,006 Κρόκος Αυγού 0,31797 12,384 0,000 Χρόνος Χ Χρόνος -0,00289-2,904 0,016 Ινουλίνη Χ ινουλίνη -0,00959-3,474 0,006 Κρόκος αυγού Χ Κρόκος -0,03708-13,439 0,000 Χρόνος Χ ινουλίνη -0,00000-0,000 1,000 Χρόνος Χ Κρόκος Αυγού 0,00133 0,600 0,562 Ινουλίνη Χ Κρόκος Αυγού -0,00556-1,500 0,165 ( ) Συντελεστής συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) (Υ4) Σταθερά -10,65-0,610 0,555 Χρόνος ( εβδοµάδες) 3,14 1,081 0,305 Ινουλίνη -10,81-2,085 0,064 Κρόκος Αυγού 6,73 1,299 0,223 Χρόνος Χ Χρόνος -0,19-0,947 0,366 Ινουλίνη Χ ινουλίνη 3,41 6,116 0,000 Κρόκος αυγού Χ Κρόκος 0,15 0,266 0,795 Χρόνος Χ ινουλίνη 0,15 0,332 0,747 Χρόνος Χ Κρόκος Αυγού -0,47-1,051 0,318 Ινουλίνη Χ Κρόκος Αυγού -1,11-1,487 0,168 (Ε) Βαθµός αποκορύφωσης Η% (Υ5) Σταθερά 27,882 9,270 0,000 Χρόνος ( εβδοµάδες) 1,847 3,684 0,004 Ινουλίνη -7,824-8,758 0,000 Κρόκος Αυγού -4,249-4,756 0,001 Χρόνος Χ Χρόνος -0,100-2,882 0,016 Ινουλίνη Χ ινουλίνη 0,470 4,891 0,001 Κρόκος αυγού Χ Κρόκος -0,002-0,018 0,986 Χρόνος Χ ινουλίνη -0,240-3,104 0,011 Χρόνος Χ Κρόκος Αυγού 0,093 1,207 0,255 Ινουλίνη Χ Κρόκος Αυγού 0,733 5,690 0,000

72 a Οι τιµές του Τ είναι στατιστικώς σηµαντικές σε επίπεδο 5% Από τα στοιχεία που παρουσιάζονται στους παραπάνω πίνακες συνάγονται τα εξής: Α) Υπάρχει µία ισχυρή θετική γραµµική συσχέτιση ανάµεσα στον χρόνο αποθήκευσης, και στις συγκεντρώσεις της ινουλίνης και του κρόκου, και στον πληθυσµό των ζώντων κυττάρων του γαλακτώµατος. Με βάση τους συντελεστές παλινδρόµησης των ανεξάρτητων µεταβλητών, η επίδραση της ινουλίνης και του κρόκου έχουν την ίδια ισχύ. Αντίθετα, βρέθηκε ότι όλες οι ανεξάρτητες µεταβλητές είχαν σηµαντική τετραγωνική επίδραση στον πληθυσµό των ζώντων κυττάρων που καταµετρήθηκαν τις διάφορες χρονικές στιγµές αποθήκευσης. Αυτό υποδηλώνει ότι η αύξηση των τιµών Χ1, Χ2 και Χ3 πέρα από το µεσαίο επίπεδο οδηγεί σε δραστική µείωση της τιµής της παραπάνω εξαρτηµένης µεταβλητής. Σηµαντικό είναι, επίσης, το γεγονός ότι δεν βρέθηκαν σηµαντικές αλληλεπιδράσεις όλων των ανεξάρτητων µεταβλητών στον πληθυσµό των ζώντων κυττάρων κατά την αποθήκευση (Y1). Β) Γενικά, ανάλογες παρατηρήσεις µπορούν να γίνουν για την εκτίµηση της µεταβολής του πληθυσµού των ζώντων κυττάρων στις διάφορες χρονικές στιγµές της αποθήκευσης σε συνδυασµό µε την ενζυµική κατεργασία (Y2). Όµως, για την εξαρτηµένη µεταβλητή Y2, η θετική γραµµική και η αρνητική τετραγωνική επίδραση της συγκέντρωσης της ινουλίνης είναι ισχυρότερη σε σχέση µε την αντίστοιχη επίδραση της συγκέντρωσης του κρόκου αυγού. Γ) Υπάρχει θετική γραµµική συσχέτιση ανάµεσα στη συγκέντρωση του κρόκου και την τιµή του ph (Υ3). Η αρνητική τετραγωνική επίδραση της συγκέντρωσης του κρόκου (Χ3) που παρατηρήθηκε µπορεί να αποδοθεί στη διακύµανση των αρχικών τιµών του ph των γαλακτωµάτων (3,75-3,7). Επίσης, σε υψηλές συγκεντρώσεις κρόκου δεν παρατηρείται πτώση στην τιµή του ph, οπότε και η αρνητική επίδραση που παρατηρείται θεωρείται αµελητέα. Τέλος, βρέθηκε ότι τόσο ο χρόνος αποθήκευσης όσο και η συγκέντρωση της ινουλίνης δεν είχαν κάποια σηµαντική γραµµική και τετραγωνική επίδραση στην τιµή ph των γαλακτωµάτων. ) Όσον αφορά τον συντελεστή συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) (Υ4) των γαλακτωµάτων, παρατηρήθηκε µία σηµαντική τετραγωνική επίδραση της συγκέντρωσης της ινουλίνης. Αυξηµένη συγκέντρωση ινουλίνης φαίνεται να οδηγεί σε σηµαντική αύξηση του ιξώδους των γαλακτωµάτων.

73 Ε) Όσον αναφορά την σταθερότητα του γαλακτώµατος ως προς την αποκορύφωση, αναµενόµενη ήταν η θετική γραµµική επίδραση του χρόνου αποθήκευσης στην εξαρτηµένη µεταβλητή Υ5. Αντίθετα, ισχυρή αρνητική συσχέτιση παρατηρείται ανάµεσα στις συγκεντρώσεις της ινουλίνης (Χ2) και του κρόκου αυγού (Χ3) και στον βαθµό αποκορύφωσης Η%. Τέλος, µε βάση τους συντελεστές παλινδρόµησης, η τετραγωνική επίδραση των συγκεντρώσεων της ινουλίνης και του κρόκου αυγού στην εξαρτηµένη µεταβλητή Y5 δεν φαίνεται να είναι σηµαντική. Αυτό είναι πιθανό να υποδηλώνει ότι η περαιτέρω αύξηση των επιπέδων τιµών των Χ2 και Χ3 δεν ενισχύει την σταθερότητα του γαλακτώµατος ως προς την αποκορύφωση. Τα παραπάνω απεικονίζονται στα αντίστοιχα τρισδιάστατα σχήµατα της επιφάνειας απόκρισης του χρόνου αποθήκευσης, της συγκέντρωσης της ινουλίνης και του κρόκου αυγού του γαλακτώµατος σε σχέση µε τον πληθυσµό των ζώντων κυττάρων της προβιοτικής καλλιέργειας κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα της αποθήκευσης των γαλακτωµάτων πριν (α, β, γ) και µετά (δ, ε, στ) την κατεργασία του και σε σχέση µε την τιµή του ph των γαλακτωµάτων (ζ, η, θ) τον συντελεστή συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) (ι, κ, λ,) και τον βαθµό αποκορύφωσης Η% (µ, ν, ξ). α) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του πληθυσµού ζώντων κυττάρων κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και του κρόκου αυγού (% w/w)

74 β) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του πληθυσµού ζώντων κυττάρων κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης. γ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του πληθυσµού ζώντων κυττάρων κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων σε σχέση µε την συγκέντρωση κρόκου αυγού (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης.

75 δ)τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του πληθυσµού ζώντων κυττάρων κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων σε συνδυασµό µε κατεργασία σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και του κρόκου αυγού (% w/w) ε) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του πληθυσµού ζώντων κυττάρων κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων σε συνδυασµό µε κατεργασία σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης.

76 στ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του πληθυσµού ζώντων κυττάρων κατά τα διάφορα χρονικά διαστήµατα αποθήκευσης των γαλακτωµάτων σε συνδυασµό µε κατεργασία σε σχέση µε την συγκέντρωση κρόκου αυγού (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης. ζ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της τιµής του ph των γαλακτωµάτων σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και του κρόκου αυγού (% w/w)

77 η) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της τιµής του ph των γαλακτωµάτων σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης του κρόκου αυγού (% w/w) θ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης της τιµής του ph των γαλακτωµάτων σε σχέση µε την συγκέντρωση του κρόκου αυγού (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης

78 ι) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του συντελεστή συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και του κρόκου αυγού (% w/w) κ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του συντελεστή συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης

79 λ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του συντελεστή συνεκτικότητας Κ (Pa x s n ) σε σχέση µε την συγκέντρωση κρόκου αυγού (% w/w) και το χρόνο αποθήκευσης µ) Τρισδιάστατη απεικόνιση της επιφάνειας απόκρισης του βαθµού αποκορύφωσης Η% σε σχέση µε την συγκέντρωση ινουλίνης (% w/w) και του κρόκου αυγού (% w/w)