ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ ΑΝΑΜΟΡΦΩΣΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ ΑΝΑΜΟΡΦΩΣΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ ΣΕ ΜΟΝΤΕΛΟ ΝΕΥΡΑΞΟΝΑ ΚΑΛΑΜΑΡΙΟΥ This program and the manual is a property of the Centre for Integrative Physiology of the University of Edinburgh. This program was presented to us by Professor Shipston. The interpretation in the Greek language was performed by Dr. Apostolia Hatziefthimiou Τα πνευματικά δικαιώματα του προγράμματος και του οδηγού λειτουργίας του ανήκουν στο «Centre for Integrative Physiology» του Πανεπιστημίου του Εδιμβούργου. Το πρόγραμμα παρουσιάστηκε σε μας από τον Καθηγητή Shipston. Η απόδοση στην ελληνική γλώσσα έγινε από την Δρ Αποστολία Χατζηευθυμίου. 1

ΔΥΝΑΜΙΚΑ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΝΕΥΡΩΝΑ ΚΑΛΑΜΑΡΙΟΥ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα πειράματα που ακολουθούν γίνονται με τη χρήση υπολογιστή και βασίζονται σε μοντέλο του γιγαντιαίου νευράξονα καλαμαριού. Οι αρχικές μελέτες που έγιναν στο παρασκεύασμα αυτό βοήθησαν στην κατανόηση του τρόπου δημιουργίας και αγωγής των δυναμικών ενεργείας στους νευρώνες. Οι γνώσεις μας σχετικά με τους μηχανισμούς δημιουργίας των δυναμικών ενεργείας βασίζονται στην ερευνητική δουλειά των Alan Hodgkin και Andrew Huxley που έγινε από το 1939 έως το 1955. Οι ερευνητές αυτοί έκαναν τις πρώτες ενδοκυττάριες καταγραφές δυναμικών ενεργείας και με πειράματα που σχεδίασαν και έκαναν, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο «καθήλωσης δυναμικού» ( voltage clamp technique), διερεύνησαν τον ρόλο τον ιόντων όπως και τις μεταβολές της μεμβράνης στην διαπερατότητα των ιόντων σε σχέση με το δυναμικό της. Οι μελέτες τους αυτές επιβραβεύτηκαν μετά από 20 χρόνια με το βραβείο Nobel. Οι τεχνικές που ανέπτυξαν είναι χρονοβόρες και δύσκολες στη χρήση τους. Η χρήση όμως του ηλεκτρονικού μοντέλου δεν απαιτεί την εκμάθηση και γνώση των τεχνικών αυτών ενώ αναπαριστά κάποια από τα κλασσικά πειράματα των Hodgkin & Huxley. Επίσης δίνει τη δυνατότητα στον φοιτητή να παρακολουθήσει τον συλλογισμό και τον σχεδιασμό των πειραμάτων από τους Hodgkin & Huxley αλλά επιπλέον ο φοιτητής μπορεί να προχωρήσει στο σχεδιασμό των δικών του πειραμάτων. Από την εργασία των Hodgkin & Huxley, αλλά και των άλλων ερευνητών που μελετούν τους βασικούς μηχανισμούς του κυττάρου, έχουν προκύψει δύο σημαντικές γνώσεις. Πρώτον, οι ομοιότητες μεταξύ κυττάρων που προέρχονται από διαφορετικά είδη, συνήθως υπερέχουν σε σπουδαιότητα των διαφορών ανάμεσα στα ζώα. Δεύτερον, για να καταλάβει κανείς γενικούς μηχανισμούς λειτουργίας του κυττάρου είναι προτιμότερο στις μελέτες του να χρησιμοποιεί παρασκευάσματα που είναι πιο προσιτά στην καλύτερη τεχνική που έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιήσει. Η μελέτη σε βάθος του μηχανισμού δημιουργίας δυναμικών ενεργείας στους νευρώνες επιτεύχθηκε με τη μελέτη των μηχανισμών αυτών στο νευράξονα του καλαμαριού καθώς η διάμετρος του είναι μεγάλη, περίπου 1 χιλιοστό (η διάμετρος των μεγαλύτερων νευαξόνων στον άνθρωπο ή τα άλλα θηλαστικά είναι περίπου 10 μm). Η μεγάλη διάμετρος του νευράξονα του καλαμαριού έκανε εφικτές τις ακριβείς 2

μετρήσεις, με τη βοήθεια ενδοκυττάριων καταγραφών, των δυναμικών ενεργείας και των ιοντικών ρευμάτων που τα προκαλούν. Μετά τις αρχικές μελέτες των Hodgkin & Huxley, έχει πλέον τεκμηριωθεί πως οι βασικοί κυτταρικοί μηχανισμοί δημιουργίας των δυναμικών ενεργείας είναι ίδιοι στο καλαμάρι και στον άνθρωπο. Το ίδιο ισχύει και για άλλες αρχές της κυτταρικής φυσιολογίας. Αξίζει επίσης να σημειωθεί πως τα θεωρητικά (μαθηματικά) μοντέλα των Hodgkin & Huxley που περιέγραφαν τους ιοντικούς μηχανισμούς που ήταν υπεύθυνοι για τη δημιουργία του δυναμικού ενεργείας προηγήθηκαν της γνώσης μας για τη δομή των ιοντικών διαύλων ως πρωτεΐνες που σχηματίζουν πόρους που είναι επιλεκτικοί στη διάβαση ιόντων. Αυτό απετέλεσε χειροπιαστή απόδειξη όχι μόνο της οξυδέρκειας και γνώσης των ερευνητών αυτών αλλά και της αξίας των μοντέλων στην βιολογία. Η γνώση των βασικών κυτταρικών μηχανισμών συχνά μας βοηθά να σχεδιάσουμε νέες θεραπείες: για παράδειγμα η ανάπτυξη ανταγωνιστών διαύλων νατρίου που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως τοπικά αναισθητικά ή ανταγωνιστών διαύλων καλίου που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε παθήσεις που χαρακτηρίζονται από μυϊκή αδυναμία όπως είναι το Μυασθενικό Σύνδρομο Lambert-Eaton. Οι θεραπείες που προαναφέρθηκαν βασίζονται στις γνώσεις μας για τη δημιουργία των δυναμικών ενεργείας που προέκυψαν από τις μελέτες στο νευράξονα του καλαμαριού. Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Windows XP Κάντε διπλό «Click» στο Squid axon programme Στο κύριο menu υπάρχουν δύο επιλογές A: Electrical Stimulation of the action potential. B: Voltage clamp experiments. Ολοκληρώστε πρώτα την ενότητα Α πριν προχωρήσετε στην ενότητα Β Μπορείτε κατά τη διάρκεια της άσκησης να πατήσετε την ένδειξη 'Help', όποτε θεωρείτε πως χρειάζεστε βοήθεια. 3

Α. ΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΔΙΕΓΕΡΣΗ ΚΑΙ ΔΥΝΑΜΙΚΟ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ (Electrical Stimulation and the Action Potential) ΠΕΙΡΑΜΑ 1: Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΝΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΕΡΕΘΙΣΜΑΤΟΣ Για να δημιουργήσετε δυναμικό ενεργείας χρειάζεται να εφαρμόσετε το κατάλληλο ερέθισμα. Πριν αρχίσετε βεβαιωθείτε πως όλες οι ενδείξεις είναι στις θέσεις που παρουσιάζονται στην παρακάτω εικόνα. Η ένταση του ερεθίσματος πρέπει να είναι 0.1 ma. Μπορείτε να μεταβάλλετε τις τιμές που παρουσιάζονται στον δείκτη της οθόνης είτε μετακινώντας το τετράγωνο πατώντας το συνεχώς με το ποντίκι και μετακινώντας το ή κάνοντας «Click» στα βέλη που βρίσκονται δεξιά και αριστερά του. Όταν καθορίσετε την ένταση του ερεθίσματος κάντε «Click» στην ένδειξη 'Draw' ώστε να καταγράψετε την απάντηση. Στην οθόνη εμφανίζονται 4 καταγραφές. Η πρώτη είναι το δυναμικό της μεμβράνης (Em) σε mv. Η δεύτερη (stim) δείχνει την ένταση του ερεθίσματος που εφαρμόζεται. Ο οριζόντιος άξονας των καταγραφών αντιπροσωπεύει τον χρόνο σε msec. Σημειώστε ότι με η εφαρμογή του ερεθίσματος προκαλεί απότομη μεταβολή του δυναμικού της μεμβράνης η οποία όμως εξασθενεί γρήγορα. Αυτό συμβαίνει 4

γιατί η ένταση του ερεθίσματος δεν είναι αρκετή να προκαλέσει δυναμικό ενεργείας, το ερέθισμα δηλαδή είναι υπο-βαλβιδικό (υπο-ουδικό). Για τον φοιτητή (στο τετράδιο εργασιών): Αυξήστε την ένταση του ερεθίσματος που εφαρμόζετε κάθε φορά, (π.χ διπλασιάζοντας το κάθε φορά, 0.20, 0.40, 0.80 ma) και περιγράψτε αυτό που συμβαίνει. Ποιο ερέθισμα μόλις υπερβαίνει τον ουδό και δημιουργεί δυναμικό ενεργείας; Η τρίτη καταγραφή δείχνει τις μεταβολές στην αγωγιμότητα του καλίου (G K )και η τέταρτη του νατρίου (G Na ). Σημειώστε πως και οι δύο αγωγιμότητες αυξάνουν, αλλά η G Na αυξάνεται γρήγορα κατά την εκπόλωση, ενώ G K η βραδύτερα. Και οι δύο αγωγιμότητες ελαττώνονται όταν η μεμβράνη επαναπολώνεται. 5

ΠΕΙΡΑΜΑ 2: Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΝΑΤΡΙΟΥ ΣΤΗ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ Σβήστε όλες τις καταγραφές που έχετε κάνει μέχρι τώρα κάνοντας «Click» στην ένδειξη 'Erase'. Ρυθμίστε την ένταση του ερεθίσματος σε μια υπερ-βαλβιδική τιμή, όπως έχετε βρει από το Πείραμα 1 και καταγράψτε ένα δυναμικό ενεργείας. Στη συνέχεια ελαττώστε την εξωκυττάρια συγκέντρωση του νατρίου και παρατηρήστε τι επίδραση θα έχουν οι μεταβολές αυτές στο δυναμικό ενεργείας. Μεταβάλλετε τις τιμές της [Να]ο σε 440, 220, 110 κλπ. Για τον φοιτητή (στο τετράδιο εργασιών): Καταγράψτε τις μετρήσεις σας Περιγράψτε τις μεταβολές στο ύψος και τη διάρκεια του δυναμικού ενεργείας σε κάθε συγκέντρωση νατρίου Η [Να]ο είναι υψηλή, αλλά θυμηθείτε πως οι μετρήσεις γίνονται σε νευράξονα καλαμαριού και το παρασκεύασμα διατηρείτε σε τεχνητό θαλασσινό νερό προκειμένου να λειτουργεί. Η συγκέντρωση του νατρίου στο θαλασσινό νερό είναι υψηλότερη από αυτή του πλάσματος. Η ενδοκυττάρια συγκέντρωση του νατρίου είναι περίπου 50mM. H εξίσωση του Nernst υπολογίζει το δυναμικό της μεμβράνης όταν αυτή είναι διαπερατή σε ένα μόνο ιόν. Η εξίσωση του Nernst: Ας υποθέσουμε πως κατά το μέγιστο ύψος του δυναμικού ενεργείας, η μεμβράνη είναι διαπερατή μόνο στο νάτριο. Μετρήστε το εύρος του δυναμικού ενεργείας σε κάθε συγκέντρωση [Να]ο. Στη συνέχεια συγκρίνετε τις τιμές που υπολογίσατε με βάση την εξίσωση του Nernst με τις μετρήσεις σας. Καταγράψτε τα αποτελέσματα σας στον παρακάτω πίνακα: 6

Για να μετρήσετε το εύρος του δυναμικού ενεργείας τοποθετείτε με το ποντίκι τον δείκτη στο σημείο που θέλετε και τότε στο κάτω αριστερά σημείο της οθόνης εμφανίζονται οι μετρήσεις. Οι μετρήσεις σας επαληθεύουν την αρχική σας υπόθεση (απόλυτα, μερικά ή καθόλου); Εξηγήστε την απάντηση σας. Επαναλάβετε τις μετρήσεις με λίγο μεγαλύτερη ένταση ερεθίσματος. Τι παρατηρείτε; 7

ΠΕΙΡΑΜΑ 3: Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΤΗΣ ΑΓΩΓΙΜΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΣΤΟ Na Ή K Τα τοπικά αναισθητικά όπως η λιδοκαϊνη παρεμποδίζουν την αύξηση της αγωγιμότητας του νατρίου (G Na ) κατά τη διάρκεια του δυναμικού ενεργείας. Δημιουργούν έτσι τοπική αναισθησία γιατί παρεμποδίζουν την αγωγή των δυναμικών ενεργείας. Η τεροδοτοξίνη (ΤΤΧ, δηλητήριο από το ψάρι puffer που βρίσκεται στις θάλασσες της Ιαπωνίας) έχει παρόμοια δράση και συχνά χρησιμοποιείται ερευνητικά ως ειδικός αναστολέας των διαύλων νατρίου. Η ΤΤΧ δεν χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη γιατί είναι εξαιρετικά τοξική και δεν μεταβολίζεται επαρκώς. Άλλες ουσιες όπως το τετραεθυλαμμώνιο (ΤΕΑ) ή η 4-αμινοπυριδίνη, επηρεάζουν τους διαύλους καλίου και παρεμποδίζουν τις μεταβολές στην αγωγιμότητα του καλίου (G K ). Μπορούμε να μελετήσουμε τις επιδράσεις των φαρμάκων βάζοντας στο μοντέλο μας τις τιμές των G Na ή G K στο μηδέν. Η επίδραση της λιδοκαϊνης Βάλτε τις ενδείξεις στις αρχικές τιμές (πχ φυσιολογική [Να]ο), σβήστε τις καταγραφές που έχετε κάνει και στη συνέχεια καταγράψτε ένα δυναμικό ενεργείας. Ελαττώστε την μέγιστη αγωγιμότητα του νατρίου (G Na ) όσο το δυνατόν πιο κοντά στο μηδέν και παρατηρήστε την επίδραση που έχει. Σχεδιάστε αυτό που βλέπετε και σημειώστε ποια απόκριση είναι φυσιολογική και ποια οφείλεται στον ανταγωνιστή των διαύλων Να. Η αύξηση στην αγωγιμότητα του νατρίου είναι φυσιολογικά υπεύθυνη για την γρήγορη εκπόλωση του κυττάρου, αλλά στο πείραμα η G Na παρεμποδίζεται. Η απάντηση που καταγράφεται όταν αναστέλλεται η G Na περιγράφεται ως ηλεκτροτονική εκπόλωση: το δυναμικό της μεμβράνης επιστρέφει στην αρχική κατάσταση ηρεμίας μετά την εφαρμογή του εκπολωτικού ερεθίσματος, χωρίς να 8

προκαλέσει δυναμικό ενεργείας με ρυθμό που εξαρτάται από τις παθητικές ηλεκτρικές ιδιότητες του νευρώνα (αγωγιμότητα της μεμβράνης σε κατάσταση ηρεμίας, χωρητικότητα της μεμβράνης και εσωτερική αντίσταση). Η ηλεκτροτονική αυτή εκπόλωση είναι παρόμοια με την επίδραση ενός υπο-βαλβιδικού ερθίσματος γιατί και σε αυτή την περίπτωση η G Na δεν μεταβάλλεται. Η επίδραση του ΤΕΑ Η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται είναι παρόμοια με αυτή που περιγράφεται στην επίδραση της λιδοκαϊνης. Βάλτε ξανά την τιμή της αγωγιμότητας του Να στο 60 (G Na max=60) και καταγράψτε ένα δυναμικό ενεργείας. Ελαττώστε τη μέγιστη τιμής της αγωγιμότητας του Κ (G K ) σχεδόν κοντά στο μηδέν και παρατηρήστε την επίδραση που έχει. Σχεδιάστε αυτό που βλέπετε και σημειώστε ποια απόκριση είναι φυσιολογική και ποια όταν η G K είναι περίπου κοντά στο μηδέν. Τι σας φανερώνει η παρατήρηση σας αυτή για τον φυσιολογικό ρόλο που παίζει η αύξηση της αγωγιμότητας Οι μεταβολές της αγωγιμότητας της μεμβράνης κατά το δυναμικό ενεργείας Συμπερασματικά, κατά την εκπόλωση αυξάνεται η G Na που προκαλεί ρεύμα ιόντων νατρίου προς τα έσω και οδηγεί σε περαιτέρω εκπόλωση του κυττάρου. Πρόκειται για μηχανισμό θετικής επανατροφοδότησης (positive feedback). Για τον λόγο αυτό συχνά περιγράφεται πως το δυναμικό ενεργείας υπακούει στο νόμο του όλο ή ουδέν. Με το χρόνο όμως η αγωγιμότητα του νατρίου ελαττώνεται. Η ελάττωση αυτή ονομάζεται απενεργοποίηση των διαύλων νατρίου. Η όψιμη αύξηση της G K προάγει την επαναπόλωση του κυττάρου αλλά οδηγεί επίσης σε ελάττωση της G K. Όταν το δυναμικό της μεμβράνης επιστρέφει στο δυναμικό ηρεμίας, η G K επιστρέφει στο αρχικό επίπεδο. Πρόκειται για ένα μηχανισμό αρνητικής επανατροφοδότησης (negative feedback). 9

ΠΕΙΡΑΜΑ 4: ΑΝΕΡΕΘΙΣΤΗ ΠΕΡΙΟΔΟΣ Για σύντομο χρονικό διάστημα μετά το δυναμικό ενεργείας, ο νευράξονας δεν ανταποκρίνεται σε δεύτερο ερέθισμα που δίνεται. Η περίοδος αυτή ονομάζεται ανερέθιστη. Μπορεί να διαιρεθεί σε δύο τμήματα: το πρώτο, που ονομάζεται απόλυτη ανερέθιστη περίοδος που ακολουθείται από τη σχετική ανερέθιστη περίοδο. Σημειώστε πως στο συγκεκριμένο πείραμα τα παραπάνω έχουν κάπως διαφορετική σημασία από αλλού. Απόλυτη ανερέθιστη περίοδος Βάλτε τις αγωγιμότητες στις αρχικές τιμές (G Na max=60, G K max=30). Δώστε το πρώτο ερέθισμα όπως και στα προηγούμενα πειράματα (ο χρόνος για το πρώτο ερέθισμα είναι προκαθορισμένος στα 0.5ms από την έναρξη και δεν μεταβάλλεται) Δώστε το δεύτερο ερέθισμα με μέγιστη τιμή έντασης (1.20mA) σε χρονική απόσταση 2 ms, 3 ms, 4 ms κλπ από την έναρξη. Μετρήστε τον χρόνο μεταξύ των δύο ερεθισμάτων, όταν το δεύτερο ερέθισμα προκαλεί δυναμικό ενεργείας (ακόμη και αν αυτό δεν έχει μέγιστο εύρος). Ο χρόνος αυτός είναι η απόλυτη ανερέθιστη περίοδος. Σημειώστε: Η απόλυτη ανερέθιστη περίοδος είναι από 0 ms έως ms. Σχετική ανερέθιστη περίοδος Σβήστε από την οθόνη όλες τις καταγραφές Δώστε το δεύτερο ερέθισμα με τη ίδια ένταση όπως και προηγουμένως αλλά σε χρόνους 2 ms, 4 ms, 6 ms κλπ από την έναρξη. Μετρήστε τον χρόνο μεταξύ των δύο ερεθισμάτων όταν η απάντηση στο δεύτερο ερέθισμα επιστρέφει στο φυσιολογικό. Η σχετική ανερέθιστη περίοδος εκτείνεται από το τέλος της απόλυτης ανερέθιστης περιόδου μέχρι το σημείο αυτό. Σημειώστε: Η σχετική ανερέθιστη περίοδος είναι από.. ms έως ms. Γιατί δεν δημιουργούνται δυναμικά ενεργείας κατά τη διάρκεια της απόλυτης ανερέθιστης περιόδου; Γιατί ένα υπερβαλβιδικό ερέθισμα δεν προκαλεί δυναμικό ενεργείας κατά την σχετική ανερέθιστη περίοδο; 10

Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΚΑΘΗΛΩΣΗΣ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ ΤΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (Voltage clamp experiments) Η τεχνική καθήλωσης του δυναμικού της μεμβράνης (Voltage clamp) χρησιμοποιείται από τους φυσιολόγους για να μετρήσουν κυρίως τα ρεύματα ιόντων που ρέουν δια μέσου της κυτταρικής μεμβράνης παρά τις μεταβολές του δυναμικού της. Υπάρχουν δύο τεχνικές: η καθήλωση του δυναμικού ολόκληρης της κυτταρικής μεμβράνης (whole-cell clamp), η οποία μας επιτρέπει να μετρήσουμε το συνολικό ιοντικό ρεύμα που ρέει δια μέσου της κυτταρικής μεμβράνης και η καθήλωση του δυναμικού μεμονωμένων ιοντικών διαύλων (single-channel patch clamp) με την οποία μετράμε το ιοντικό ρεύμα από μεμονωμένους διαύλους (από πρωτεΐνες) της κυτταρικής μεμβράνης. Οι περισσότεροι δίαυλοι επιτρέπουν την διέλευση ορισμένων μόνο ιόντων δια μέσου αυτών, γεγονός που εξηγεί την εκλεκτική διαπερατότητα των μεμβρανών. Τα πειράματα που θα κάνετε στην μεμβράνη του καλαμαριού γίνονται με την τεχνική καθήλωσης του δυναμικού ολόκληρης της κυτταρικής μεμβράνης (wholecell clamp). Η βασική αρχή της τεχνικής είναι η καθήλωση του δυναμικού της μεμβράνης σε μια τιμή που επιλέγεται από τον ερευνητή. Για τον λόγο αυτό διοχετεύεται ηλεκτρικό ρεύμα στο κύτταρο. Το ρεύμα που απαιτείται για να καθηλώσει το δυναμικό της μεμβράνης, κατά τη διάρκεια προκαθορισμένων κλιμακωτών μεταβολών του δυναμικού της ή κατά τη διάρκεια χορήγησης φαρμάκων, ισούται προς το ρεύμα που μεταφέρεται από ιόντα που ρέουν δια μέσου της μεμβράνης όταν το δυναμικό της έχει την προκαθορισμένη τιμή. Οι πληροφορίες που αποκτήθηκαν με πειράματα καθήλωσης δυναμικού (voltage-clamp) διαφώτισαν πολλές πτυχές της κυτταρικής λειτουργίας και βοήθησαν στον σχεδιασμό και ανάπτυξη νέων φαρμάκων. Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η καταγραφή του ιοντικού ρεύματος διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης (Ιm). Εναλλακτικά, μπορείτε να καταγράψετε την αγωγιμότητα του νατρίου (G Na ) ή καλίου (G K ). Στην περίπτωση αυτή χρειάζεται να κάνετε «click» στην ένδειξη «Mode». 11

12

ΠΕΙΡΑΜΑ 5: ΙΟΝΤΙΚΑ ΡΕΥΜΑΤΑ Επιλέξτε το Β (Voltage clamp experiments) από το κύριο menu. Προκαλέστε εκπόλωση του κυττάρου από το δυναμικό ηρεμίας -70 mv σε μία νέα τιμή δυναμικού 0 mv, για μία περίοδο 8 msec (μεταξύ 1 και 9 msec από την έναρξη) όπως φαίνεται στην εικόνα της οθόνης στην προηγούμενη σελίδα. Σημειώστε ότι: Το κύτταρο μένει αυτόματα σε -70 mv για 1 msec. Με τον επάνω αριστερά δείκτη (Τhen Εm:) μπορείτε να δημιουργήσετε κλιμακωτές μεταβολές του δυναμικού η διάρκεια των οποίων καθορίζεται από τον μεσαίο αριστερό δείκτη (Until X ms). Για τα επόμενα πειράματα ο κάτω αριστερά δείκτης πρέπει να είναι στην τιμή -70 mv. Χωρίς τις κλιμακωτές μεταβολές του δυναμικού, η παραπάνω εκπόλωση θα οδηγούσε στη δημιουργία δυναμικού ενεργείας. Με τη καθήλωση του δυναμικού της μεμβράνης αποφεύγουμε την δημιουργία δυναμικού ενεργείας. Τα ιοντικά ρεύματα που μετράτε φυσιολογικά είναι αυτά που παρατηρούνται κατά τη δημιουργία ενός δυναμικού ενεργείας. Το ρεύμα που ρέει διαμέσου της μεμβράνης (σημαίνεται ως Im) έχει 3 στοιχεία: Όταν το δυναμικό της μεμβράνης μεταβάλλεται σε μια νέα τιμή, καταγράφεται ένα σύντομης διάρκειας ρεύμα που οφείλεται στην φόρτιση της ηλεκτρικής χωρητικότητας της κυτταρικής μεμβράνης και δεν οφείλεται σε ροή ιόντων. Ακολουθεί ένα πρώιμο προς τα έσω ιοντικό ρεύμα (καταγράφεται ως αρνητική απόκλιση) Ακολουθεί όψιμο προς τα έξω ιοντικό ρεύμα (καταγράφεται ως θετική απόκλιση) Τα δύο τελευταία στοιχεία αποτελούν ξεχωριστά ιοντικά ρεύματα που οφείλονται στη ροή ιόντων νατρίου και καλίου αντίστοιχα. Μπορούμε να δείξουμε πως πρόκειται για δύο ξεχωριστά ιοντικά ρεύματα, αν μεταβάλλουμε τις εξωκυττάριες συγκεντρώσεις των ιόντων αυτών ή αν χρησιμοποιήσουμε φαρμακευτικές ουσίες που παρεμποδίζουν εκλεκτικά τους διαύλους νατρίου (τετροδοτοχίνη-ττχ) ή καλίου (τετραεθυλαμμώνιο- ΤΕΑ). 13

Η επίδραση της ΤΤΧ Βάλτε τη μέγιστη αγωγιμότητα του νατρίου (G Na max) περίπου στο μηδέν. Σχεδιάστε παρακάτω τα αποτελέσματα σας και σημειώστε την καμπύλη ελέγχου (control) και την καταγραφή που παίρνετε όταν G Na max=0 Το πρώιμο προς τα έσω ιοντικό ρεύμα που καταγράφεται αναστέλλεται από την ΤΤΧ. Παραμένει μόνο το όψιμο προς τα έξω ιοντικό ρεύμα που οφείλεται σε ιόντα καλίου. Το ρεύμα Κ συμβάλλει στην αποκατάσταση του δυναμικού της μεμβράνης μετά τη μέγιστη τιμή του δυναμικού ενεργείας. Η επίδραση τους ΤΕΑ Βάλτε τη G Na max=60. Βάλτε τη μέγιστη αγωγιμότητα του καλίου (G Κ max) περίπου στο μηδέν Σχεδιάστε παρακάτω τα αποτελέσματα σας και σημειώστε την καμπύλη ελέγχου (control) και την καταγραφή που παίρνετε όταν G Κ max=0 14

Στην περίπτωση αυτή αναστέλλεται από το ΤΕΑ το όψιμο προς τα έξω ιοντικό ρεύμα που καταγράφεται. Παραμένει μόνο το πρώιμο προς τα έσω ιοντικό ρεύμα που οφείλεται σε ιόντα νατρίου. Σημειώστε ότι αντίθετα προς το ρεύμα καλίου, το ρεύμα νατρίου αρχικά αυξάνεται αλλά στη συνέχεια ελαττώνεται γιατί η καθήλωση δυναμικού διατηρεί σταθερό το δυναμικό της μεμβράνης. Η ιδιότητα αυτή του ρεύματος νατρίου ονομάζεται απενεργοποίηση. Περιγράψτε εν συντομία πως τα παραπάνω μπορούν να ερμηνεύσουν την απόλυτη ανερέθιστη περίοδο μετά από ένα δυναμικό ενεργείας. 15

ΠΕΙΡΑΜΑ 6: ΓΡΑΦΙΚΗ ΠΑΡΑΣΤΑΣΗ ΡΕΥΜΑΤΟΣ-ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ (I-V PLOT) Η ακριβής σχέση μεταξύ δυναμικού και του μεγέθους των ρευμάτων νατρίου και καλίου διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης είναι πολύ σημαντική για την «υπόθεση του ρεύματος ιόντων νατρίου» στη δημιουργία του δυναμικού ενεργείας. Η σχέση αυτή μεταξύ ιοντικού ρεύματος και δυναμικού περιγράφεται αρκετά καθαρά με το διάγραμμα ρεύματος-δυναμικού ή όπως αλλιώς είναι γνωστό ως I-V plot. Βάλτε την G Κ max περίπου στο μηδέν Βάλτε την εξωκυττάρια συγκέντρωση νατρίου στην φυσιολογική τιμή (440 mm) Εφαρμόστε παλμούς καθήλωσης δυναμικού της μεμβράνης σε διάφορα επίπεδα χρησιμοποιώντας τον δείκτη που βρίσκεται επάνω και αριστερά. Δοκιμάστε τις εξής τιμές δυναμικού: -80, -60, -40, -20, 0, +20, +40, +60 mv. Παίρνεται μια σειρά καταγραφών ρευμάτων Νa που εξαρτώνται από το δυναμικό της μεμβράνης και τον χρόνο. Μετρήστε το εύρος των ιοντικών ρευμάτων στην κάθε περίπτωση χρησιμοποιώντας τον δρομέα (cursor) και τοποθετήστε τις τιμές στον παρακάτω πίνακα: Σχεδιάστε το διάγραμμα ρεύματος-δυναμικού (I-V plot) 16

Η περιοχή των δυναμικών της μεμβράνης όπου η κλίση της καμπύλης είναι αρνητική ονομάζεται περιοχή αγωγιμότητας με αρνητική κλίση. Είναι η περιοχή όπου η διαβατότητα της μεμβράνης είναι ασταθής κατά την εκπόλωση που συμβαίνει όταν δημιουργείται ένα δυναμικό ενεργείας. Κάθε μικρή εκπόλωση της μεμβράνης στην περιοχή αυτή προκαλεί αύξηση της αγωγιμότητας του νατρίου η οποία εκπολώνει περαιτέρω την κυτταρική μεμβράνη με μηχανισμό θετικής επανατροφοδότησης. Για τον λόγο αυτό η φάση εκπόλωσης του δυναμικού ενεργείας είναι επανατροφοδοτούμενη και υπακούει στο νόμο του όλο ή ουδέν. Όταν η καμπύλη ρεύματος-δυναμικού (I-V plot) τέμνει τον οριζόντιο άξονα, η πολικότητα του ιοντικού ρεύματος αντιστρέφεται από αρνητικό (προς τα έσω) σε θετικό (προς τα έξω). Η τιμή του δυναμικού στο σημείο αυτό αναφέρεται ως δυναμικό αναστροφής. 17

ΠΕΙΡΑΜΑ 7: Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΝΑΤΡΙΟΥ [Νa]o ΣΤΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗΣ Από τη γραφική παράσταση που σχεδιάσατε στο πείραμα 6 έχετε την τιμή του δυναμικού αναστροφής για το νάτριο όταν η [Νa]o=440mM. Ελαττώστε την εξωκυττάρια συγκέντρωση Νατρίου [Νa]o=220mM και επαναλάβετε το πείραμα 6 ώστε να υπολογίσετε το δυναμικό αναστροφής. Συγκρίνετε τις τιμές του δυναμικού αναστροφής που υπολογίσατε με αυτές που προκύπτουν από την εξίσωση του Nernst. Αν οι τιμές αυτές συμφωνούν τα πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση πως το προς τα έσω ιοντικό ρεύμα οφείλεται σε ιόντα νατρίου. Γιατί το νάτριο εξέρχεται από το κύτταρο όταν το δυναμικό υπερβεί το δυναμικό αναστροφής; Ερμηνεύστε την μορφολογία U που εμφανίζει η Νa I-V plot (λάβετε υπόψη την ηλεκροχημική κλίση και τον αριθμό των ιοντικών διαύλων που είναι ανοιχτοί σε κάθε φάση). Ποιο θα ήταν το δυναμικό αναστροφής αν η εξωκυττάρια συγκέντρωση νατρίου ήταν 110mM; Σε ποιο δυναμικό της μεμβράνης εμφανίζεται για πρώτη φορά προς τα έσω ρεύμα νατρίου; Τι καθορίζει τον ουδό δημιουργίας ενός δυναμικού ενεργείας; 18