ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΙΓΟΠΡΟΒΕΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΤΥΡΟΓΑΛΑΚΤΟΣ IN VITRO KAI ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ C2C12

Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΙΓΟΠΡΟΒΕΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΤΥΡΟΓΑΛΑΚΤΟΣ IN VITRO KAI ΣΤΗΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ C2C12 Ευθαλία Κερασιώτη, Αλέξανδρος Πρίφτης, Στέφανος Αϊβαζίδης, Δημήτριος Στάγκος, Δημήτριος Κουρέτας Αθήνα, Οκτώβριος 2013

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΛΕΥΘΕΡΗ ΡΙΖΑ: χημικό μόριο που έχει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια στην εξωτερική στοιβάδα σθένους. ΡΙΖΕΣ ΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΜΗ ΡΙΖΕΣ Ρίζα Υδροξυλίου ( OH ) Υπεροξείδιο Υδρογόνου (H 2 O 2 ) Ρίζα Υπεροξειδίου (RO 2 ) Υποχλωριώδες Οξύ (HOCl) Ρίζα Αλκοξειδίου (RO ) Υποβρωμιώδες Οξύ HOBr) Ρίζα Υδροϋπεροξειδίου( HO 2 ) Όζον (O 3 ) Μονήρες Οξυγόνο ( 1 O 2 )

ΠΗΓΕΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ Επίσης, η εξαντλητική άσκηση επάγει την παραγωγή ελευθέρων ριζών και μπορεί να οδηγήσει στην πρόκληση οξειδωτικού στρες (Nikolaidis et al., 2007; Veskoukis et al., 2008).

ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΑ: ενζυμικοί και μη ενζυμικοί μηχανισμοί που εξουδετερώνουν ή ελέγχουν τη δράση των ελευθέρων ριζών ΕΝΖΥΜΙΚΑ Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Καταλάση (CAT) Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPX) Αναγωγάση της γλουταθειόνης (GR) ΜΗ ΕΝΖΥΜΙΚΑ Φλαβονοειδή Πρωτεϊνες θερμικού σοκ (HSP) Μελατονίνη Στοιχεία μετάπτωσης Συνένζυμο Q10 (ουβικινόλη) Βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) Ουρικό οξύ Βιταμίνη Α Βιταμίνη Ε (α-τοκοφερόλη ή ΑΗ) Γλουταθειόνη (GSH)

ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ Η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των ελευθέρων ριζών και της αντιοξειδωτικής άμυνας υπέρ των πρώτων Σχετίζεται με πολλές παθολογικές καταστάσεις όπως: καρδιαγγειακές παθήσεις διαβήτης καρκίνος νευροεκφυλιστικές διαταραχές

ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΟΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ Έχει βρεθεί ότι η πρωτεΐνη ορού γάλακτος ενισχύει την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού (Kerasioti et al.,2012, Xu et al., 2011, Yang-Ming Tseng et al., 2006, Kent et al., 2003). Επίσης, ένας μεγάλος αριθμός κλινικών ερευνών έχει πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας την για τη θεραπεία ασθενειών όπως του καρκίνου, του HIV, της ηπατίτιδας, των καρδιαγγειακών ασθενειών, του διαβήτη τύπου ΙΙ (Hakkak et al., 2001; Micke et al., 2002; Sagara et al., 2004; Watanabe et al., 2000).

ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΟΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ Είναι το σύνολο των πρωτεϊνών που παραμένουν στην υγρή φάση κατά τη διάρκεια της παρασκευής του τυριού μετά την καθίζηση της καζεΐνης του γάλακτος. Αποτελούν πρωτεϊνικό συμπλήρωμα υψηλής βιολογικής αξίας ενώ ενισχύουν τη σωματική απόδοση και τον αντιοξειδωτικό μηχανισμό κατά τη διάρκεια της άσκησης. Έχουν υψηλή συγκέντρωση αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας, όπως λευκίνη, ισολευκίνη και βαλίνη, τα οποία αποτελούν σημαντικούς παράγοντες στην υπερτροφία των μυών, στην αύξηση της δύναμης, καθώς και στην ανάπτυξη και επιδιόρθωση των ιστών. Είναι πλούσιες σε κυστεΐνη και συμβάλλουν στην ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας μέσω μετατροπής της σε γλουταθειόνη.

ΣΚΟΠΟΣ A. Να προσδιοριστεί in vitro η αντιοξειδωτική δράση της αιγοπρόβειας πρωτεΐνης ορού γάλακτος και να συγκριθεί με πρωτεϊνικά σκευάσματα του εμπορίου (πρωτεΐνη βοδινού, πρωτεΐνη σόγιας, αγελαδινή πρωτεΐνη τυρογάλακτος). B. Να εξεταστεί η επίδραση της αιγοπρόβειας πρωτεΐνης τυρογάλακτος σε δείκτες οξειδωτικού στρες σε μυοβλάστες ποντικού

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Για τον προσδιορισμό της in vitro αντιοξειδωτικής δράσης των πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω μέθοδοι: 1. Μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας εξουδετέρωσης της ρίζας DPPH 2. Μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας εξουδετέρωσης της ρίζας ABTS + 3. Μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας εξουδετέρωσης της ρίζας OH 4. Μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας εξουδετέρωσης της ρίζας O 2-5. Μέθοδος προσδιορισμού της αναγωγικής δύναμης

Μέθοδος DPPH Η σταθερή ρίζα DPPH αλληλεπιδρά με τα αντιοξειδωτικά μόρια και αδρανοποιείται (ανάγεται). είτε μέσω προσθήκης ενός ηλεκτρονίου (single electron transfer, SET). είτε μέσω προσθήκης ενός ατόμου υδρογόνου (hydrogen atom transfer, HAT). Ακολουθεί μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 517 nm. DPPH (Μωβ) DPPH:Η (Κίτρινο) 1,1 διφαινυλ-2 πικρυλυδραζύλιο 1,1-διφαινυλ-2-πικρυλυδραζίνη 10

Μέθοδος ABTS [2,2 -Azino-bis-(3-ethyl-benzthiazoline-sulphonic acid)] Το ABTS παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) και µέσω της δράσης του ενζύμου περοξειδάση (HRP), οξειδώνεται και δημιουργείται η δραστική ρίζα ABTS + Με την προσθήκη του αντιοξειδωτικού η ρίζα ABTS +, που έχει κυανοπράσινο χρώμα, ανάγεται και αποχρωματίζεται (ABTS). 11

Μέθοδος OH Ο προσδιορισμός εξουδετέρωσης των ριζών υδροξυλίου βασίστηκε στην οξείδωση της 2- δεοξυριβόζης. Η 2-δεοξυριβόζη οξειδώνεται από τις ρίζες υδροξυλίου που δημιουργούνται κατά την αντίδραση Fenton. Η ικανότητα εξουδετέρωσης της ρίζας υδροξυλίου εκτιμάται ως ο ρυθμός αναστολής της οξείδωσης της 2-δεοξυριβόζης από τις ρίζες υδροξυλίου. Αντίδραση Fenton

Μέθοδος O 2 - Οι ανιονικές ρίζες σουπεροξειδίου προέρχονται από τα συστήματα phenazine methosulfate (PMS)-NADH μέσω οξείδωσης του NADH και αναλύονται μέσω της αναγωγής του nitroblue tetrazolium(nbt). Το O 2 - μειώνει το κίτρινο χρώμα που προέρχεται από το NBT2+ με αποτέλεσμα να εμφανίζεται ένα μπλε χρώμα το οποίο μετράται φασματοφωτομετρικά στα 560 nm.

Αναγωγική δύναμη Στη μέθοδο αυτή, ουσίες, που μπορεί να έχουν κάποια αναγωγική ικανότητα, αντιδρούν με τον Fe 3+ και τον ανάγουν σε Fe 2+, όπου όταν αντιδρά με τον χλωριούχο σίδηρο δίνει ένα σύμπλοκο το οποίο απορροφά στα 700 nm. Το κίτρινο χρώμα του εξεταζόμενου διαλύματος αλλάζει σε αποχρώσεις του πράσινου και του μπλε ανάλογα με την αναγωγική δύναμη της εξεταζόμενης ουσίας.

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ: Μυϊκά κύτταρα της σειράς C2C12 καλλιεργήθηκαν σε φλάσκες επιφάνειας 25 και 75cm 2 σε θρεπτικό υλικό DMEM που αποτελούνταν από : 10% FBS 1% L-γλουταμίνη 1% διάλυμα πενικιλίνης [(100 units/ml)/στρεπτομυκίνης (100μg/ml)] C2C12 κύτταρα σε οπτικό μικροσκόπιο ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ: Θερμοκρασία 37 o C Συγκέντρωση 5% CO 2

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ - πρωτεΐνη τυρογάλακτος(control) + πρωτεΐνη τυρογάλακτος( (0.78, 1.56, 3.12, 6.24 mg/ml) + tbhp (0.3 mm) Συλλογή κυττάρων DMEM 10% FBS DMEM 0% FBS 30 min επώαση με tbhp(0.3 mm) 24h επώαση με πρωτεΐνη τυρογάλακτος -24h 0 24h 24 1/2 h

ΜΕΘΟΔΟΙ Προσδιορισμός της κυτταροτοξικής δράσης της πρωτεΐνης ορού γάλακτος με τη μέθοδο XTT. Προσδιορισμός των επιπέδων της γλουταθειόνης και των ελευθέρων ριζών με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry). Προσδιορισμός του δείκτη λιπιδικής υπεροξείδωσης TBARS φασματοφωτομετρικά. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Για τα αποτελέσματα πραγματοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης ενός παράγοντα, 1-way ANOVA. Οι ζευγαρωτές συγκρίσεις έγιναν μέσω ανάλυσης του τεστ του Tukey. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο P < 0.05. Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SPSS, version 13.0 (SPSS Inc., Chicago, Ill.). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως mean ± SEM.

ΜΕΘΟΔΟΣ ΧΤΤ Αρχή μεθόδου Χρωματομετρική δοκιμή για την ποσοτικοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της βιωσιμότητας. Η μέθοδος βασίζεται στον μεταβολισμό του τετραμμωνιακού άλατος (XTT) από μιτοχονδριακές αφυδρογονάσες των κυττάρων στον μεταβολίτη φορμαζάνη. Η φορμαζάνη είναι υδατοδιαλυτή και έχει ένα πορτοκαλί χρώμα το οποίο απορροφά στα 450-500 nm και έτσι μπορεί να προσδιοριστεί με φασματοφωτόμετρο. Η αύξηση στον αριθμό των ζωντανών κυττάρων οδηγεί στον αυξημένο μεταβολισμό του τετραμμωνιακού άλατος και κατά συνέπεια σε αυξημένη απορρόφηση. Μέτρηση στα 490nm σε φασματοφωτόμετρο ELISA plate reader (Biotek) με την χρήση του λογισμικού Gen5 (Biotek).

ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Αρχή μεθόδου

Ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS) Αρχή μεθόδου Το οξειδωτικό στρες στο κυτταρικό περιβάλλον έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ασταθών υπεροξειδίων των λιπιδίων από τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Προϊόν της διάσπασης αυτών των ασταθών μορίων είναι η μηλονική διαλδεΰδη (MDA). Η μηλονική διαλδεΰδη μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της αντίδρασής της με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA). Έτσι, τα TBARS εκφράζονται σαν ισοδύναμα της μηλονικής διαλδεΰδης., η οποία σχηματίζει μία ένωση με το θειοβαρβιτουρικό οξύ με αναλογία 1/2 αντίστοιχα.

% DPPH radical scavenging activity % hydroxyl radical scavenging activity ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ % ABTS radical scavenging activity % Superoxide radical scavenging activity Ικανότητα εξουδετέρωσης ελευθέρων ριζών 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Concentration (mg/ml) Beef protein Soy protein Cow whey protein Sheep whey protein 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Concentration (mg/ml) Beef protein Soy protein Cow whey protein Sheep whey protein 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Concentration (mg/ml) Beef protein Soy protein Cow whey protein Sheep whey protein 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 Beef protein (mg/ml) Beef protein

Absorbance Αναγωγική δύναμη 2,5 2 1,5 Beef protein Soy protein Cow whey protein Sheep whey protein 1 0,5 0 0 2 4 6 8 Concentration (mg/ml)

Τιμές IC 50 (mg/ml) και RP 0.5AU (mg/ml) για την πρωτεΐνη βοδινού, πρωτεΐνη σόγιας, αιγοπρόβεια πρωτεΐνη τυρογάλακτος, αγελαδινή πρωτεΐνη τυρογάλακτος και την αναγωγική δύναμη αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως mean±sem. Πρωτεΐνες DPPH ABTS + OH O 2 - Αναγωγική δύναμη Πρωτεΐνη βοδινού 1.3±0.12 0.6±0.02 0.85±0.05 2.5±0.2 0.9±0.03 Πρωτεΐνη σόγιας 2.2±0.31 3.1±1.00 1.1±0.34-3.1±1.2 Αιγοπρόβεια 3.1±0.06 4.1±0.15 1.8±0.20-1.3±0.05 πρωτεϊνη ορού γάλακτος Αγελαδινή πρωτεΐνη 8.2±0.55 3.9±0.09 1.7±0.10-4.8±0.02 ορού γάλακτος

Cell Via bility (%) Αποτελέσματα μεθόδου XTT 100 80 60 40 Η πρωτεΐνη ορού γάλακτος δεν εμφάνισε τοξική δράση στα μυϊκά κύτταρα C2C12 20 0 0,78 mg/ml 1,56 mg/ml 3,12 mg/ml 6,24 mg/ml Sheep whey protein (mg/ml)

Αποτελέσματα κυτταρομετρίας ροής Γλουταθειόνη (GSH)

GSH levels 200 180 160 +112.9% * +118% * +138% * 140 120 100 80-31.5% # +25.7% 60 40 20 0 control tbhp 0,78 mg/ml +tbhp 1,56 mg/ml +tbhp 3,12 mg/ml +tbhp 6,24 mg/ml +tbhp * Στατιστικά σημαντικό σε σχέση με το tbhp (P<0.05) # Στατιστικά σημαντικό σε σχέση με το control (P<0.05)

Ελεύθερες ρίζες (ROS)

ROS levels 120 100-2,8% -12,8% * -16,4% * 80 60-41,3% * 40 20 0 control tbhp 0,78 mg/ml +tbhp 1,56 mg/ml+ tbhp 3,12 mg/ml + tbhp 6,24 mg/ml + tbhp * Στατιστικά σημαντικό σε σχέση με το tbhp (P<0.05)

Αποτελέσματα TBARS TBARS levels 140 120 100 +29% # -21,7% * -15% * -25,5% * -24% * 80 60 40 20 0 control tbhp 0,78 mg/ml +tbhp 1,56 mg/ml +tbhp 3,12 mg/ml +tbhp 6,24 mg/ml +tbhp * Στατιστικά σημαντικό σε σχέση με το tbhp (P<0.05) # Στατιστικά σημαντικό σε σχέση με το control (P<0.05)

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η αιγοπρόβεια πρωτεΐνη τυρογάλακτος εμφάνισε ικανότητα εξουδετέρωσης απέναντι στις ρίζες DPPH, ABTS + και OH με τιμές IC 50 να κυμαίνονται από 1.8-4.1 mg/ml. Η χορήγηση της πρωτεΐνης ορού γάλακτος (0.78, 1.56, 3.12 6.24 mg/ml) στην κυτταρική σειρά C2C12 αύξησε σημαντικά τα επίπεδα της GSH (έως και 138%) και μείωσε σημαντικά τα επίπεδα των ROS (έως και 41,3%) και των TBARS (έως και 25,5%). Η αντιοξειδωτική δράση της πρωτεΐνης ορού γάλακτος πιθανώς οφείλεται στην ενδοκυτταρική μετατροπή του αμινοξέος κυστεΐνη σε γλουταθειόνη. Έτσι, λοιπόν είναι ένα κατάλληλο αντιοξειδωτικό συμπλήρωμα διατροφής για την πρόληψη ή αντιμετώπιση διάφορων παθολογικών καταστάσεων. Απαιτούνται περαιτέρω έρευνες σχετικά με τον ακριβή μηχανισμό δράσης της πρωτεΐνης καθώς έχει δειχθεί ότι αυξάνει τη σύνθεση αντιοξειδωτικών ενζύμων (Sukkar & Bounous 2004).

H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου