Λέξεις κλειδιά Μαύρη πεύκη, ταυτοποίηση κλώνων, ισοένζυμα, τράπεζα γονιδίων

ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΛΩΝΩΝ ΜΑΥΡΗΣ ΠΕΥΚΗΣ (Pinus nigra ARN.) ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ Π. Τσολακίδης, Μ. Τσακτσίρα Εργαστήριο Δασικής Γενετικής και Βελτίωσης Δασοπονικών Ειδών, Σχολή Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, 54124, Θεσσαλονίκη Περίληψη Η μαύρη πεύκη (Pinus nigra) είναι ένα κωνοφόρο με πολύ ευρεία εξάπλωση, που εκτείνεται στη Β. Αφρική, Ν. Ευρώπη, Κύπρο, Μικρά Ασία και στην Κριμαία. Παράλληλα, η εμφάνισή της, ξεκινά από τα 250 μ., παρόλο που χαρακτηρίζεται ψυχρόβιο είδος, και φτάνει έως και τα 1800 μ. υψόμετρο, ενώ οι οικολογικές απαιτήσεις της είναι ελάχιστες. Τα στοιχεία αυτά, καθώς και το ότι θεωρείται λείψανο του Τριτογενούς, αφενός της προσδίδουν μεγάλη γενετική ποικιλότητα και αφετέρου, μεγάλη πλαστικότητα που σε περιβάλλον κλιματικής αλλαγής θα επιτρέψει την επιβίωση του είδους και θα προσδώσει δυναμικότητα στην προσαρμογή του. Παράλληλα με την επιτακτικότητα της προστασίας των γενετικών πόρων, επιβάλλεται η ταυτοποίηση του προστατευόμενου υλικού για τη σωστή διαχείριση και προώθησή του. Η παρούσα εργασία είχε σκοπό να διερευνήσει την αποτελεσματικότητα του ενζύμου της μηλικής αφυδρογονάσης στην ταυτοποίηση γενο-τύπων/κλώνων μαύρης πεύκης. Επιλέχθηκε η χρήση του ενζυμικού συστήματος της μηλικής αφυδρογονάσης (MDH) διότι είναι ένα σημαντικό ένζυμο για κάθε έμβιο οργανισμό, ενώ παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία στα κωνοφόρα και έχει χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση ειδών, ποικιλιών και προελεύσεων της μαύρης πεύκης. Μελετήθηκαν 34 άτομα, από την τράπεζα γονιδίων που βρίσκεται στο Δασαρχείο Πολυγύρου, τα οποία παρουσίασαν 4 γονιδιακές θέσεις εκ των οποίων οι 2 (MDH-A και MDH-D) ήταν μονομορφικές και οι υπόλοιπες MDH-B και MDH-C, παρουσίασαν 4 και 3 αλληλόμορφα αντίστοιχα, ενώ σχηματίστηκαν και ετεροδιμερή, που μας επέτρεψαν να υπολογίσουμε τους δυνητικά ταυτοποιούμενους γενοτύπους σε 60 (για το παρόν δείγμα). Η ερμηνεία της μηλικής αφυδρογονάσης (MDH) επιτεύχθηκε με τη χρήση 2 ηλεκτροφορητικών συστημάτων και με την ανάλυση χ 2 επιβεβαιώθηκε ότι το ένζυμο αυτό ακολουθεί μεντελική κληρονόμηση. Λέξεις κλειδιά Μαύρη πεύκη, ταυτοποίηση κλώνων, ισοένζυμα, τράπεζα γονιδίων Εισαγωγή Η μαύρη πεύκη εκτείνεται σε περισσότερα από 3,5 εκατομμύρια εκτάρια από τη Β. Αφρική, στη Ν. Ευρώπη έως τη Μ. Ασία, Κύπρο και στην Κριμαία. Ειδικότερα στην Ελλάδα, καταλαμβάνει μεγάλη έκταση (281.692 ha), ιδιαίτερα στην οροσειρά της Πίνδου από τα βόρεια σύνορα με την Αλβανία και το FYROM μέχρι τον Πάρνωνα και τον Ταΰγετο και στα νησιά Θάσο, Μυτιλήνη, Σάμο και Εύβοια. Στη Βόρεια Ελλάδα απαντάται στο συγκρότημα Ολύμπου, Πιερίων, Βερμίου και ασυνεχώς στα όρη Βόρας, στη Χαλκιδική, στην οροσειρά της Ροδόπης, στον Έβρο και στην Κομοτηνή (Αθανασιάδης, 1986). Η μαύρη πεύκη θεωρείται ψυχρόβιο κωνοφόρο αλλά σποραδικά φύεται και κοντά στη θάλασσα. Τα παραπάνω στοιχεία, καθώς και το ότι θεωρείται λείψανο του Τριτογενούς, αφενός της προσδίδουν μεγάλη γενετική ποικιλότητα και 393

αφετέρου, μεγάλη πλαστικότητα που σε περιβάλλον κλιματικής αλλαγής θα επιτρέψει την επιβίωση του είδους και θα προσδώσει δυναμικότητα στην προσαρμογή του. Η σπουδαιότητα των γενετικών πόρων είναι εμφανής, άλλοτε από οικονομική άποψη, άλλοτε οικολογική, κοινωνική αλλά και αισθητική. Η γενετική ποικιλότητα επιτρέπει στα δασικά είδη να προσαρμόζονται στις αλλαγές του περιβάλλοντος και επιτρέπει στα φυτά να ανταπεξέλθουν σε νέες συνθήκες, ώστε τελικά να επιτυγχάνεται η προσαρμογή και η αύξηση της παραγωγικότητας (Eriksson et al. 1993). Τέλος, θα πρέπει να τονισθεί και η αισθητική αξία των ειδών, που οφείλεται στη γενετική ποικιλότητα (μεταλλάξεις), καθώς και η μελλοντική χρήση ειδών, με χαρακτηριστικά τα οποία σήμερα μπορεί να μην έχουν αναγνωρισμένη αξία (White et al., 2007). Οι γενετικοί δείκτες χρησιμοποιούνται στους φυσικούς και στους καλλιεργούμενους πληθυσμούς για τη μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν τους πληθυσμούς αυτούς, όπως την περιγραφή του τρόπου διασταύρωσης, τη μοντελοποίηση της γεωγραφικής ποικιλότητας, τη μεταξύ των ειδών και ποικιλιών ταξινομική και φυλογενετική σχέση, τις επιπτώσεις της βελτίωσης και διαχείρισης στη γενετική σύσταση, την κατασκευή γενετικών χαρτών σύνδεσης, τη βελτίωση με βάση τους γενετικούς δείκτες και τέλος την ταυτοποίηση γενοτύπων και γενετικού υλικού στους βελτιωτικούς και πολλαπλασιαστικούς πληθυσμούς (White et al., 2007). Τα ισοένζυμα, που είναι είδος γενετικών δεικτών, παρουσιάζουν τα παρακάτω πλεονεκτήματα: α) Τα ισοένζυμα θεωρούνται άμεσα προϊόντα της έκφρασης των γονιδίων, ακολουθούν μενδελική κληρονόμηση και είναι συγκυρίαρχοι χαρακτήρες, β) ο φαινότυπός τους δεν επηρεάζεται από το περιβάλλον, γ) η ερμηνεία των ζυμογραμμάτων στις περισσότερες περιπτώσεις είναι εύκολη, δ) το κόστος της όλης διαδικασίας είναι μικρό, ε) μπορούν εύκολα να υπολογιστούν οι συχνότητες των αλληλομόρφων των γονιδίων στους πληθυσμούς και στ) η ποσότητα του δείγματος (ιστού) που είναι απαραίτητη για τις αναλύσεις είναι μικρή. Σε μία ηλεκτροφόρηση, μπορούν να αναλυθούν πολλά δείγματα και να εμφανιστούν αρκετά ένζυμα, ζ) η αξιοπιστία τους, όσον αφορά στην επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων, είναι πολύ υψηλή (Rothe 1990, Bergmann 1991, Glaubitz & Moran 2000). Τα ισοένζυμα στηρίζονται στην αρχή του αποκλεισμού για την ταυτοποίηση ατόμων (εν αντιθέσει με τις νέες μοριακές μεθόδους), όπου δύο άτομα θεωρούνται διαφορετικά αν τα ζυμογράμματά τους είναι διαφορετικά, αλλά δεν θεωρούνται ταυτόσημα όταν τα ζυμογράμματά τους είναι ίδια. Σύμφωνα με τους Cheliak και Pitel (1984), στην εύρεση ενός μοναδικού γενοτύπου τρεις παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο: α) ο αριθμός των γονιδιακών θέσεων που αναλύονται, β) ο αριθμός των αλληλομόρφων που παρατηρούνται στην κάθε γονιδιακή θέση και γ) η συχνότητα των αλληλομόρφων στον πληθυσμό που μελετάται. Οι πρωτοπόροι στη χρήση των ισοενζύμων ως μεθόδου ταυτοποίησης γενοτύπων υπήρξαν οι Conkle & Adams (1977), οι οποίοι μελέτησαν τη δυνατότητα αυτή σε κλώνους της πεύκης Pinus taeda. Ο Scaltsoyiannes (2004), ταυτοποίησε είδη του γένους Pinus με τη χρήση ισοενζυμικών δεικτών και ειδικότερα της μηλικής αφυδρογονάσης και της ρεδουκτάσης της μεναντιόνης. Σε κάθε υπογένος (Strobus-Haploxylon και Pinus-Diploxylon), τα είδη διαχωρίστηκαν μεταξύ τους είτε με την ύπαρξη μοναδικών αλληλομόρφων είτε με τις συχνότητες των αλληλομόρφων. Από τα ένζυμα που έχουν χρησιμοποιηθεί στη μαύρη πεύκη κατά το παρελθόν, η MDH έχει παρουσιάσει το μεγαλύτερο αριθμό γονιδιακών θέσεων. Η MDH είναι ένα ένζυμο του κύκλου του κιτρικού οξέος και καταλύει τη μετατροπή του μηλικού σε οξαλοξικό οξύ και αντίστροφα και εμπλέκεται στη γλυκονεογένεση (cmdh), δηλαδή στη διαδικασία της 394

σύνθεσης της γλυκόζης από μικρότερα μόρια. Η MDH είναι ένα μάλλον πανταχού παρόν ένζυμο, για το οποίο έχουν αναγνωριστεί πολλές ισομορφές. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ταυτοποίηση κλώνων μαύρης πεύκης από τράπεζα γονιδίων του είδους, με στόχο τόσο την ταυτοποίηση του εγκατεστημένου γενετικού υλικού όσο και την εύρεση του άγνωστου σχεδιασμού εγκατάστασής της. Παράλληλα, διερευνάται η αποτελεσματικότητα του ενζυμικού συστήματος της μηλικής αφυδρογονάσης (MDH) στην ταυτοποίηση γενοτύπων της μαύρης πεύκης. Υλικά και Μέθοδοι Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε προήλθε από την τράπεζα γονιδίων Μαύρης Πεύκης ο οποίος βρίσκεται στον Πολύγυρο Χαλκιδικής. Το γενετικό υλικό από όπου προήλθε η τράπεζα γονιδίων περιλαμβάνει άριστους φαινοτύπους της μαύρης πεύκης από διάφορες προελεύσεις της Βορείου Ελλάδας. Η ανάλυση των ενζύμων έγινε σε απλοειδή ενδοσπέρμια σπόρων με την τεχνική της οριζόντιας ηλεκτροφόρησης αμύλου με τη χρήση δύο ηλεκτροφορητικών συστημάτων. Το διάλυμα εκχύλισης των ενδοσπερμίων, τα διαλύματα των ηλεκτροφορητικών συστημάτων, η παρασκευή και οι χρώσεις των ενζύμων έγιναν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των Conkle et al. (1982) και Cheliak & Pitel (1985). Οι γονιδιακές θέσεις και τα αλληλόμορφα αριθμήθηκαν με αύξουσα σειρά από την άνοδο προς την κάθοδο. Για να είναι τα αποτελέσματα συγκρίσιμα, σε κάθε ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήσαμε ως μάρτυρες (controls) τα ζυμογράμματα γνωστών γενοτύπων από το ίδιο ή διαφορετικό είδος πεύκης. Αποτελέσματα και συζήτηση Κατά τις προκαταρκτικές μελέτες δοκιμάστηκαν τα ενζυμικά συστήματα: 6PGD, MDH, PGI, MR, ACP, ADH. Μεταξύ αυτών, επιλέχθηκε η MDH, η οποία αποτελεί ένα ένζυμο το οποίο χαρακτηρίζεται ως ένα πανταχού παρόν ένζυμο που δρα στα μιτοχόνδρια συμμετέχοντας στη διαδικασία παραγωγής ενέργειας σε όλους τους οργανισμούς, από τα φυτά έως και τον άνθρωπο (Minard & McAlister-Henn, 1991; Goward & Nicholls, 1994; Minarik et al., 2002), στον κύκλο του Krebs. Η συμμετοχή του ενζυμικού συστήματος της μηλικής αφυδρογονάσης παίζει μεγάλο ρόλο στη θεώρηση του είδους ως ένα εκ των πιο ποικιλόμορφων ευρωπαϊκών ειδών πεύκης (Τσακτσίρα & Σκαλτσογιάννης, 1998; Τσακτσίρα, 1998). Την τελευταία δεκαετία, η χρήση του ενζύμου απέκτησε νέα διάσταση για τους δασικούς πληθυσμούς των κωνοφόρων (Silin & Goncharenko, 1996; Kara et al., 1997; Σκαλτσογιάννης, 2001), καθώς φαίνεται πως η διακριτότητα του ενζυμικού συστήματος αποτελεί αντιπροσωπευτικό δείγμα για τη γενετική ποικιλότητα 10 Ευρωπαϊκών ειδών πεύκης (Σκαλτσογιάννης, 2001), αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί από μόνο του για την αναγνώριση κάθε ευρωπαϊκού είδους πεύκης και των υβριδίων τους (Σκαλτσογιάννης, 2001). Το ένζυμικό σύστημα MDH, παρουσιάζει μεγάλη ποικιλότητα, με 1 έως 5 γονιδιακές θέσεις (Aguinagalde et al., 1997; Scaltsoyiannes, 2004), έως 21 αλληλόμορφα και επιπρόσθετα το σχηματισμό ετεροδιμερών. Ο Scaltsoyiannes (2004) διαπίστωσε την ύπαρξη 5ης γονιδιακής θέσης, η οποία αποτέλεσε και διαγνωστικό χαρακτηριστικό για το υπογένος Strobus του γένους Pinus. Επίσης, ο ίδιος, έκανε διάκριση των ειδών με τη αποκλειστική χρήση της MDH (Scaltsoyiannes, 2004), ενώ η Τσακτσίρα (1998) πραγματοποίησε ταυτοποίηση προελεύσεων με τη χρήση της ποικιλότητας του ενζυμικού συστήματος της μηλικής αφυδρογονάσης. Το ενζυμικό σύστημα της MDH έδωσε την κωδικοποίηση 4 γονιδιακών θέσεων (MDH-A, MDH-B, MDH-C, MDH-D) και καταγράφηκαν συνολικά 15 αλληλόμορφα. Μεταξύ της δεύτερης (MDH-B) γονιδιακής θέσης και της τρίτης (MDH-C) υπήρχε η 395

παρουσία ετεροδιμερών. Τα δύο ηλεκτροφορητικά συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν, παρουσίασαν διαφορετικό φαινότυπο και η ανάγνωση των ζυμογραμμάτων εξαρτιόταν από τις συχνές αλληλοεπικαλύψεις των γονιδιακών θέσεων και έγινε σε συνδυασμό με τη θέση των ετεροδιμερών. Η χρήση δύο ηλεκτροφορητικών συστημάτων έχει αποδειχτεί ιδιαίτερα επιτυχής στην ερμηνεία των ζυμογραμμάτων της μηλικής αφυδρογονάσης (Τσακτσίρα, 1998; Σκαλτσογιάννης & Τσακτσίρα, 1998; Σκαλτσογιάννης, 2001; Scaltsoyiannes et al., 2009). Oι Sharma & von Wuehlisch (1998) εφήρμοσαν μία διαφορετική μέθοδο για την ερμηνεία του ενζυμικού συστήματος της MDH, κατά την οποία χρησιμοποίησαν δύο διαφορετικές νέες χρώσεις. Πίνακας 1: Συχνότητες εμφάνισης των αλληλομόρφων Γονιδιακή Θέση Αλληλόμορφα ανά γον. θέση Συχνότητα Άλληλομόρφων MDH-A MDH-A1 1,000 MDH-B MDH-B3 MDH-B4 MDH-B5 MDH-B6 0,295 0,030 0,602 0,073 MDH-C MDH-C3 MDH-C4 MDH-C5 0,368 0,015 0,617 MDH-D MDH-D1 1,000 Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται οι συχνότητες των αλληλομόρφων ανά γονιδιακή θέση. Οι γονιδιακές θέσεις MDH-Α και MDH-D ήταν μονομορφικές στο δείγμα μας. Τα αποτελέσματα ανάλυσης των γενοτύπων, διέκρινε δύο άτομα, που είχαν διαφορετικό γενότυπο από τα υπόλοιπα και ομαδοποίησε τα υπόλοιπα άτομα σε όμοιους γενοτύπους (8 άτομα δημιούργησαν ζεύγη και δημιουργήθηκαν 3 μεγάλες ομάδες ατόμων με όμοιους γενοτύπους, όπου η μία ομαδοποίηση αφορά 9 άτομα, η δεύτερη 8 άτομα, και η τρίτη αφορά 7 άτομα). Σύμφωνα με την παραπάνω ανάλυση, αποδείχτηκε ότι η διάταξη με την οποία φυτεύτηκαν οι κλώνοι στο πεδίο, δεν ήταν γραμμική, αλλά μάλλον τυχαιοποιημένη. Έγινε έλεγχος για την περίπτωση που είχε χρησιμοποιηθεί άλλου είδους διάταξη των κλώνων στη φυτεία. Δοκιμάστηκαν γειτονικά ζεύγη και ομάδες 3 και 4 ατόμων για να ελεγχθεί διαφορετική διάταξη των κλώνων στη φυτεία αλλά δεν επιβεβαιώθηκε κάποια άλλη υπόθεση αφού δεν υπήρξε οποιαδήποτε κανονικότητα. Πίνακας 2: Κριτήριο Χ 2 για τις πολυμορφικές γονιδιακές θέσεις Γενότυπος Παρατηρούμενες Αναμενόμενες Χ 2 Πιθανότητα Β3Β5 44:61 52.5:52.5 2.752 0.0971 Β5Β6 17:18 17.5:17.5 0.029 0.8658 C3C6 75:72 73.5:73.5 0.061 0.8046 Για τους 5 γενοτύπους που προέκυψαν στο δείγμα μας, οι δύο παρουσίασαν χαμηλή εμφάνιση και δεν εξετάστηκαν για το κριτήριο Χ 2. Οι υπόλοιποι 3 γενότυποι ακολούθησαν την αναμενόμενη συχνότητα (1:1) σύμφωνα με το μεντελικό διαχωρισμό. Στον Πίνακα 2 παρουσιάζεται η ανάλυση των θέσεων κατά το κριτήριο Χ 2. Τα αποτελέσματα που μας δίνει η ανάλυση κατά το κριτήριο Χ 2 των γονιδιακών θέσεων, μας επιτρέπει να επιβεβαιώσουμε την ύπαρξη μεντελικού διαχωρισμού και συνεπώς την 396

ύπαρξη μεντελικής κληρονόμησης. Σε πολλές μελέτες σε άλλους έμβιους οργανισμούς έχει βρεθεί ότι η MDH, παρόλο που δρα στα μιτοχόνδρια, ελέγχεται από γονίδιο του πυρήνα και συνεπώς ακολουθεί μεντελική κληρονόμηση, γεγονός που συμφωνεί με τα αποτελέσματά μας (Davidson & Cortner 1967, Longo & Scandalios 1969, Shows et al. 1970). Οι γονιδιακές θέσεις MDH-B και MDH-C παρουσίασαν 4 και 3 αλληλόμορφα αντίστοιχα και σύμφωνα με τον τύπο των Cheliak & Pitel (1984): L ni ( ni + 1) Ng = Π= ι 1 2 η MDH-B που εμφάνισε 4 αλληλόμορφα, μπορεί να δώσει 10 πιθανούς γενοτύπους, ενώ η MDH-C που εμφάνισε 3 αλληλόμορφα, μπορεί να δώσει 6 πιθανούς γενοτύπους. Ο συνδυασμός των δύο αυτών γονιδιακών θέσεων μπορεί να παρέχει μία διακριτότητα του γινομένου των δύο πιθανοτήτων, δηλαδή μπορούν δυνητικά να αποδώσουν διακριτότητα 60 διαφορετικών γενοτύπων. Συμπεράσματα Α) Η ερμηνεία της μηλικής αφυδρογονάσης επιτεύχθηκε με τη χρήση 2 ηλεκτροφορητικών συστημάτων. Β) Από τις 4 γονιδιακές θέσεις που αναλύθηκαν, οι 2 (MDH-B και MDH-C) παρουσίασαν ποικιλότητα, η οποία και ακολουθούσε μενδελική κληρονόμηση. Η μενδελική κληρονόμηση του ενζύμου επιβεβαίωσε τα ευρήματα από άλλους έμβιους οργανισμούς. Γ) Ο εντοπισμός 3 αλληλομόρφων στη μία γονιδιακή θέση και 4 αλληλομόρφων στην άλλη, μπορούν δυνητικά να αποδώσουν διακριτότητα έως και 60 γενοτύπων. Δ) Η ταυτοποίηση γειτονικών γενοτύπων μαύρης πεύκης της παρούσας φυτείας, απέδειξε ότι αυτή δε σχεδιάστηκε με γραμμική τοποθέτηση των μελών κάθε κλώνου και η τοποθέτηση των ταυτοποιημένων γενοτύπων στη φυτεία δεν παραπέμπει σε κάποια συγκεκριμένη διάταξη. Βιβλιογραφία Aguinagalde, I., Lorente, F. and Benito, C. 1997. Relationships among five populations of European black pine (Pinus nigra ARN.) using morphometric and isozyme markers. Silvae Genetica, 46, 1-5. Αθανασιάδης, Ν., 1986. Δασική Βοτανική ΙΙ. Δέντρα και θάμνοι των δασών της Ελλάδος. Εκδ. Γιαχούδη-Γιαπούλη, Θεσσαλονίκη, σελ. 309. Bergmann, F., 1991. Characterization of multiclonal aspen cultivars using isoenzyme electrophoresis. Forest Ecology and Management. 22:167-172. Cheliak, W.M. and Pitel, J.A. 1985. Techniques for starch gel electrophoresis of enzymes from forest tree species. Report PI-X-42. Petawawa National Forest Institute. Canadian Forest Service. Ontario, Canada. Cheliak, W.M. and Pitel, J.A., 1984. Electrophoretic identification of clones of trembling aspen. Can. J. For. Res., 14: 740-743. Conkle, M.T., Hodgskinss, P., Nunnally, L., and Hunter, S. 1982. Starch gel electrophoresis of conifer seeds: a laboratory manual. General Technical Report PSW-64. Berkeley, CA: Pacific Southwest Forest and Range Experiment Station, Forest Service, US Department of Agriculture. Washington, DC: US Forest Service. Conkle, M.T. and Adams, W.T., 1977. Use of isoenzyme techniques in forest genetics research. Proc. South. For. Trees Improv. Conf., pp. 219-226. Davidson, R.G. and J.A., Cortner, 1967. Mitochondrial malate dehydrogenase: a new genetic polymorphism in man. Science, 157: 1569-1571. Eriksson, G., Namkoong, G. and Roberds, J. H. 1993. Dynamic gene conservation for uncertain futures. Forest Ecology and Management, 62, 15-37. 397

Glaubitz, J.C. and Moran, G.F. 2000. Genetic tools: The use of biochemical and molecular markers. In: Forest Conservation Genetics: Principles and Practice. (eds) A. Young, D. Boshier and T. Boyle. CSIRO Publishing, Australia, pp. 39-59. Goward, C.R. and Nicholls, D.J., 1994. Malate dehydrogenase: A model for structure, evolution, and catalysis. Protein Science, 3(10), pp.1883 1888. Kara, N., Korol, L., Isik, K. and Schiller, G. 1997. Genetic diversity in Pinus brutia TEN.: Altitudinal variation. Silvae Genetica. Vol. 46. 2-3: 155-161. Longo, G.P. and J.G., Scandalios, 1969. Nuclear gene control of mitochondrial malic dehydrogenase in maize. Proc. Natl. Acad. Sci., 62: 104-111. Minard K.I. and McAlister-Henn L. 1991. Isolation, nucleotide sequence analysis, and disruption of the MDH2 gene from Saccharomyces cerevisiae: evidence for three isozymes of yeast malate dehydrogenase. Mol. Cell. Biol. 11, 370-380. Minarik, P., Tomaskova, N., Kollarova, M., and Antalik, M. 2002. Malate dehydrogenases - Structure and function. Gen.Physiol.and Biophys., 21(3), 257 265. Rothe, G. M. 1990. Forest genetic resources informations n18. Food and Agriculture Organisation of the United Nations. 1-15. Scaltsoyiannes, A., Tsaktsira, M., Pasagiannis, G., Tsoulpha, P., Zhelev, P., Iliev, I. and Rohr, R. 2009. Allozyme variation of European Black (Pinus nigra Arnold) and Scots pine (Pinus sylvestris L.) populations and implications on their evolution: A comparative study. Journal of Biological Research-Thessaloniki, 11, 95-106. Scaltsoyiannes, A. 2004. Identification by isozyme gene markers of European pine species used for ornamental purposes. Propag.of Ornam.Plants. Vol. 4. 1:42-46. Sharma, K. and Von Wuehlisch, G., 1998. Genetic interpretation of malate dehydrogenase (MDH) isozyme gene loci using a new staining approach and the genetic control of 10 other isozymes in Pinus roxburghii Sarg.Silv.Gen.47.321-332. Shows, T.B., Chapman, V.M. and F.H., Ruddle, 1970. Mitochondrial malate dehydrogenase and malic enzyme: Mendelian inherited electrophoretic variants in the mouse. Biochem. Genet., 4: 707-718. Silin, A.E. and Goncharenko, G.G. 1996. Allozyme variation in natural populations of eurasian pines:iv.population structure&genetic variation in geographically related & isolated populations of Pinus nigra Arn. the Crimean Peninsula. Silv.Gen.,45,67-75. Σκαλτσογιάννης, Α. 2001. Η συμβολή του ισοενζυμικού συστήματος της μηλικής σφυδρογονάσης (MDH) στη γενετική ανάλυση και ταυτοποίηση των ευρωπαϊκών ειδών πεύκης. Πρακτικά 8ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Ελληνικής Επιστημονικής Εταιρείας Γενετικής Βελτίωσης Φυτών. Άρτα. Τσακτσίρα, Μ. και Σκαλτσογιάννης, Α. 1998. Συμβολή των ισοενζυμικών δεικτών στην επίλυση του ταξινομικού προβλήματος της Ευρωπαϊκής μαύρης πεύκης. Πρακτικά 7ου Πανελλήνιου Συνεδρίου Ελληνικής Επιστημονικής Εταιρείας Γενετικής Βελτίωσης Φυτών. Σελ. 245-254. Ηράκλειο. Τσακτσίρα, Μ. 1998. Έρευνα ισοενζυμικής παραλλακτικότητας φυσικών πληθυσμών Μαύρης Πεύκης (Pinus nigra ARΝ.). Διδακτορική διατριβή. Τμήμα Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος. ΑΠΘ. Θεσσαλονίκη. White T.L., Adams W.T. and D.B. Neale, 2007. Δασική Γενετική. Μετάφραση: Α. Σκαλτσογιάννης και Δ. Ζαραγκότας, Εκδόσεις Έμβρυο (2009), σελ. 800. 398

BLACK PINE (Pinus nigra ARN.) CLONE IDENTIFICATION USING BIOCHEMICAL MARKERS P. Tsolakidis, M. Tsaktsira Black Pine (Pinus nigra) is a conifer with a very wide distribution, extending from N. Africa, S. Europe, Asia Minor, Cyprus and Crimea. Ιts altitudinal appearance, starts at 250m (sometimes near the sea) goes up to 1800m altitude and its ecological requirements are minimal. These data, while that is a relic of Tertiary, confer great genetic diversity and great plasticity to the species that in a climate change environment will allow its survival and the capacity to adapt. Alongside the imperative to protect genetic resources is the identification of the protected genetic material for proper management and promotion. This research paper attempted investigates the penetratability of the enzyme malate dehydrogenase in the identification of black pine genotypes/clones and in parallel, does this in the best way (fast, cheap, easy). The use of the enzymic system of malate dehydrogenase (MDH) was selected because of its importance in every living organism, its great diversity that demonstrates in conifers and because it has also been used to identify species, varieties and populations of black pine in the past. 34 individuals were studied, from the gene bank located in the Forest Service of Poligiros, that showed 4 locus of which 2 (MDH-A and MDH-D) were monomorphic and the remaining MDH-B and MDH-C showed 4 and 3 alleles, respectively, also forming heterodimer, which allows us to calculate the potential of identification for this sample to 60 genotypes. The interpretation of MDH was achieved using 2 electrophoretic systems and with the X 2 analysis it was reconfirmed that the identified polymorphic genotypes follow Mendelian inheritance. 399

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ 14o ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΑΠΑΝΤΑ ΣΤΙΣ ΠΡΟΚΛΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΣΗΜΕΡΑ: ΑΕΙΦΟΡΙΑ - ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΕΙΣ ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ Θεσσαλονίκη, 10-12 Οκτωβρίου 2012 I