ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΔΙΣΟΥΛΦΙΔΙΚΟΥ ΔΕΣΜΟΥ ΠΟΥ ΑΝΑΠΤΥΣΣΕΤΑΙ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΚΥΣΤΕΙΝΩΝ 356 ΚΑΙ 455 ΣΤΗ ΔΟΜΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΙΝΙΚΗΣ ΚΙΝΑΣΗΣ SRPK1 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΚΟΥΤΡΟΥΜΑΝΗ ΜΑΡΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 5 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 Α.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs) 7 Α.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs κινασών - χαρακτηριστικά της δομής τους 7 Α.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης 14 Α.1.3. Εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς 15 Α.1.4. Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης 16 Α.1.5. Υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης 21 Α.1.6. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης 26 Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 28 B.1. Υλικά 28 Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια 28 Β.1.2 Υλικά χρωματογραφίας 28 Β.1.3. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας 28 B.2. Μέθοδοι 29 Β.2.1. Ιστοκαλλιέργειες 29 Β.2.2. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου 30 B.2.3. Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με τη χρήση του kit X-tremeGENE Q2 Reagent της εταιρείας Roche 32 ~ 2 ~

Β.2.4. Παρασκευή εκχυλισμάτων από 293T και HeLa κύτταρα 33 Β.2.5. Έμμεσος ανοσοφθορισμός 33 Β.2.6. Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων 34 Β.2.7. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων ώστε να γίνουν επιδεκτικά για μετασχηματισμό (Competent Cells) 35 Β.2.8. Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (Transformation) 36 Β.2.9. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση 36 Β.2.10. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 37 Β.2.11. Παρασκευή του μεταλλάγματος της SRPK1 από το οποίο λείπει η συνδετική περιοχή (SRPK1 Δspacer) 39 Β.2.12. Σημειακές μεταλλάξεις των κυστεϊνών 356 και 455 της SRPK1 σε γλυκίνη 40 Β.2.13. Δημιουργία διπλής μετάλλαξης των κυστεϊνών 356 και 455 της SRPK1 σε γλυκίνη 42 Β.2.14. Παρασκευή του αμινοτελικού τμήματος του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) που περιέχεται ανάμεσα στα αμινοξέα 62-92 43 Β.2.15. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 43 Β.2.16. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE) 45 Β.2.17. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE) 46 Β.2.18. Βαφή με Coomasie Brilliant Blue R-250 48 Β.2.19. Αυτοραδιογραφία 48 Β.2.20. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western blot) 49 Β.2.21. Ανοσοανίχνευση 49 Β.2.22. Ανοσοκατακρήμνιση 50 Β.2.23. Ανίχνευση δράσης SRPK1 με in vitro φωσφορυλίωση 52 ~ 3 ~

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ 53 Γ.1. Έλεγχος κινητικότητας της SRPK1 μετά από SDS-ηλεκτοφόρηση σε εκχυλίσματα από διάφορες κυτταρικές σειρές 53 Γ.2. Πιθανή δομή του μορίου της SRPK1 54 Γ.3. Έλεγχος κινητικότητας της πρωτεΐνης SRPK1 Δspacer σε SDS ηλεκτροφόρηση απουσία και παρουσία DTT 55 Γ.4. Έκφραση των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G σε βακτηριακά κύτταρα E. coli και σε HeLα κύτταρα 56 Γ.5. Έλεγχος κινητικότητας των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G σε SDS ηλεκτροφόρηση απουσία και παρουσία DTT 57 Γ.6. Ανίχνευση δραστικότητας των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G με in vitro φωσφορυλίωση 58 Γ.7. Υποκυτταρική εντόπιση των SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G, και SRPK1 356/455G σε HeLa κύτταρα με δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού 60 Γ.8. Έλεγχος της ικανότητας πρόσδεσης ουβικιτίνης από την SRPK1 και την SRPK1 356/455G σε 293Τ κύτταρα 62 Δ. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 64 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 65 ~ 4 ~

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η πρωτεϊνική κινάση SRPK1, το πιο μελετημένο μέλος της οικογένειας των SR πρωτεϊνικών κινασών, παίζει καθοριστικό ρόλο σε μια σειρά από κυτταρικές λειτουργίες όπως το μάτισμα των mrna, η πρόσδεση της ετεροχρωματίνης στον πυρηνικό φάκελο και η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταμίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης. Αν και φέρει δύο σήματα πυρηνικής εντόπισης, η SRPK1 κατανέμεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Σύμφωνα με το ισχύον μοντέλο η SRPK1, μέσω της ενδιάμεσης συνδετικής της αλληλουχίας που λειτουργεί ως «κυτταροπλασματική άγκυρα», συνδέεται στο σύμπλοκο Hsp70/Hsp90 το οποίο αφ ενός βοηθάει να πάρει την ενεργή της διαμόρφωση αλλά ταυτόχρονα την καθηλώνει στην περιοχή του κυτταροπλάσματος. Υπό συνθήκες στρες η κινάση απελευθερώνεται από το σύμπλοκο των σαπερονινών -με άγνωστο έως τώρα μηχανισμό- και μεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου. Στην παρούσα εργασία προτείνουμε ότι η ανάπτυξη ενός δισουλφιδικού δεσμού μεταξύ των κυστεϊνών 356 και 455 στη συνδετική περιοχή της κινάσης είναι υπεύθυνη για την είσοδό της στον πυρήνα. Ο δισουλφιδικός αυτός δεσμός συμβάλλει ακόμα στην σταθεροποίηση και αύξηση της δραστικότητας της κινάσης. Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κάτω από την άμεση καθοδήγηση του αναπληρωτή καθηγητή κ. Θωμά Γιαννακούρου, τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την υπόδειξη του θέματος και για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εργασίας. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω την καθηγήτρια κ Θ. Χολή- Παπαδοπούλου και την επίκουρο καθηγήτρια κ Αναστασία Πανταζάκη, μέλη της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής, για τις υποδείξεις και την εποικοδομητική κριτική της εργασίας. Ευχαριστώ θερμά τον Δρ. Γιώργο Παπαδόπουλο για τις μελέτες μοριακής δυναμικής που έκανε στο μόριο της SRPK1 καθώς και τους υπευθύνους του Εργαστηρίου Ιστολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής του ~ 5 ~

Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης για την παραχώρηση του συνεστιακού μικροσκοπίου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την επίκουρο καθηγήτρια κ Ελένη Νικολακάκη για την στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συμπαράσταση, καθώς και για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθεια που μου προσέφερε κατά την πειραματική διαδικασία. Τέλος, ευχαριστίες οφείλω και σε όλο το προσωπικό και τους συναδέλφους του εργαστηρίου Βιοχημείας για τη συνεργασία τους και τη δημιουργία του ευχάριστου συναδελφικού κλίματος μέσα στο εργαστήριο. ~ 6 ~

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. Κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης (Serine/Arginine Protein Kinases, SRPKs). Α.1.1. Μέλη της οικογένειας των SRPKs - χαρακτηριστικά της δομής τους. Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν μια σχετικά νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώματα τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες που αποτελούν μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Οι κινάσες αυτές έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθμιση του ματίσματος του mrna, η πρόσδεση της ετεροχρωματίνης στον πυρηνικό φάκελλο, η μεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταμίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης, η μεταφορά πολυαμινών μέσα στα κύτταρα και η ομοιόσταση ιόντων (Nikolakaki et al., 2001). Το πρώτο μέλος της οικογένειας το οποίο κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε ήταν η ανθρώπινη μορφή της SRPK1, με βάση την ικανότητα της να φωσφορυλιώνει τους παράγοντες ματίσματος που περιέχουν στο μόριο τους ακολουθίες διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης. Η φωσφορυλίωση των συγκεκριμένων ακολουθιών παίζει καθοριστικό ρόλο στη συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος του RNA (Gui et al.,1994a; Gui et al.,1994b). Μέχρι σήμερα τουλάχιστον δέκα διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αγρινίνης έχουν αναγνωριστεί σε διάφορους οργανισμούς. Στα θηλαστικά, οι ανθρώπινες μορφές των SRPK1 (accession No: U09564), SRPK1a (accession No: AJ318054) και SRPK2 (accession No: U88666A) και στο ποντίκι οι μορφές των SRPK1 (accession No: AJ224115), SRPK2 (accession No: AB006036) και SRPK3 (accession No: ΝΜ_019684). Στη ζύμη οι Sky1 (accession No: S55098) (S. cerevisiae) και Dsk1 (accession No: D13447) (S. pompe), στη Drosophila το ομόλογο της SRPK1 (accession No: AF01149), στο νηματοειδές C. elegans η SPK-1 (accession No: AF241656) ~ 7 ~

και στα φυτά το αντίστοιχο ομόλογο της SRPK1 (accession No: AJ292978) (Arabidopsis thaliana) (NCBI, Entrez Nucleotide). Σχήμα Α.1. Σχηματική αναπαράσταση των SRPKs ποντικού. Τα τρία μέλη της οικογένειας εμφανίζουν μεγάλη ομολογία στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), αλλά διαφέρουν στο Ν-τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή (hinge region). Το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες. Τα ποσοστά δηλώνουν την ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία, ενώ δίνονται και οι αριθμοί των αμινοξέων (Nakagawa et al., 2005). Οι SRPKs των θηλαστικών έχουν το χαρακτηριστικό ότι παρουσιάζουν πολύ μεγάλη ομολογία στην πρωτοταγή τους δομή, στις περιοχές με δράση κινάσης (kinase domain), καθώς επίσης και στην εξειδίκευση τους ως προς τα διάφορα υποστρώματα. Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των κινασών αυτών αποτελεί το γεγονός ότι οι περιοχές του μορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης (kinase domains) διαχωρίζονται από μία ασυνήθιστα μεγάλη αλληλουχία αμινοξέων (σχήμα Α.1), γεγονός πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισμένο σε κινάσες τυροσίνης (Wang et al., 1998). Η μεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αμινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, όσο και στην υποκυτταρική τους κατανομή (Ding et al., 2006). Ακόμη ένα κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι περιέχουν στο μόριο τους δύο πιθανά σήματα για την εντόπιση στον πυρήνα (NLS nuclear localization signal), ένα στην αμινοτελική περιοχή ( 11 R-K-K-R-T-K-A-K-K-D-K 21 ) και ένα στο κέντρο του μορίου ( 267 Κ-Κ-Κ-Κ-L-K-K-K-Q-K-R 277 ) (Gui et al., 1994a). ~ 8 ~

Σχήμα Α.2. Σχηματική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος της SRPK1a. (Α) Αναπαράσταση της δομής του γονιδίου των SRPK1/1a. Το εξόνιο 1 της SRPK1a αποτελείται από τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1 καθώς και από το τμήμα των 513 bp το οποίο δεν περιλαμβάνεται στην SRPK1. (Β) Σύγκριση της αμινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1a με την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (C) Η νουκλεοτιδική ακολουθία που περιβάλει το τμήμα των 513 bp. (D) Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος που βρίσκονται στα όρια μεταξύ των εξονίων 1a και 1b και του τμήματος των 513 bp (Nikolakaki et al., 2001). ~ 9 ~

Οι διαφορές ανάμεσα στα μέλη της οικογένειας που απαντώνται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισμένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε μορίου στην πρωτοταγή του δομή. Στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού ματίσματος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η μόνη διαφορά έγκειται στην ύπαρξη μιας εμβόλιμης ακολουθίας από 171 αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο του μορίου αμέσως μετά τα τέσσερα πρώτα αμινοξέα, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.2 (Nikolakaki et al., 2001). Η εμβόλιμη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σημαντικό αριθμό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες με το μοτίβο L-X-X-L-L ( 148 L-A-P-L-L 152 και 158 L-G-R-L-L 162 ), το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση διαφόρων πρωτεϊνών με πυρηνικούς υποδοχείς. Η πρόσθετη αυτή αλληλουχία φαίνεται να δίνει στην SRPK1a τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης με διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1, όπως στην περίπτωση της δέσμευσης της με την πρωτεΐνη του πυρηνικού πλέγματος SAFB1 (Scaffold Attachment Factor B1) (Nikolakaki et al., 2001). Στην περίπτωση του μορίου της SRPK2, η οποία αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε μικρές αλλαγές στην αμινοξική ακολουθία στη κεντρική και καρβοξυτελική τους περιοχή. Οι διαφορές αυτές δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα και την εξειδίκευση των δύο ενζύμων (πάνω από 90% ομολογία στις περιοχές κινάσης). Επιπλέον, το αμινοτελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες και περιέχει την αμινοξική αλληλουχία P-P-L-P, η οποία αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με SH 3 - και WW-περιοχές άλλων πρωτεϊνών (Wang et al., 1998). Κατ αναλογία με την πρόσθετη αλληλουχία της SRPK1a, η διαφορετική αυτή περιοχή της SRPK2 μπορεί να παίζει το ρόλο ενός σήματος για την αλληλεπίδραση της με διαφορετικά υποστρώματα ή άλλα ρυθμιστικά μόρια, σε σύγκριση με την SRPK1. Πρόσφατες κρυσταλλογραφικές μελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Sky1p της ζύμης S.cerevisiae υπέδειξαν τρία δομικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητα που παρουσιάζουν τα μέλη της οικογένειας των SRPKs. Για λόγους που ευνοούσαν την κρυστάλλωση του μορίου της Sky1p, δημιουργήθηκε μια μεταλλαγμένη της μορφή από την οποία είχαν αφαιρεθεί μία μη διατηρημένη αλληλουχία 137 αμινοξέων στο ~ 10 ~

αμινοτελικό της άκρο, καθώς και η περιοχή που παρεμβάλλεται μεταξύ των δραστικών περιοχών της κινάσης. Η μεταλλαγμένη αυτή μορφή παραμένει ενεργή, παρουσιάζοντας παρόμοια δραστικότητα με τη φυσιολογική μορφή της κινάσης (Nolen et al., 2001). Η συνολική δομή του μορίου της Sky1p, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.3, είναι παρόμοια με αυτή που παρουσιάζουν και άλλες κινάσες πρωτεϊνών, έχοντας έναν μικρό λοβό ο οποίος αποτελείται κυρίως από β-ελάσματα και έναν μεγάλο λοβό αποτελούμενο κυρίως από α-έλικες. Στη φυσιολογική της μορφή η αλληλουχία που παρεμβάλλεται μεταξύ των περιοχών της κινάσης τοποθετείται μεταξύ των ελασμάτων β7 και β8. Τα χαρακτηριστικά που διαφοροποιούν την Sky1p και γενικά όλες τις κινάσες της οικογένειας των SRPK από άλλες κινάσες πρωτεϊνών και είναι πιθανά υπεύθυνα για τη συνεχή δραστικότητά που εμφανίζουν είναι τα εξής: i. Η έλικα αc, η οποία σε ορισμένες κινάσες πρωτεϊνών είναι υπεύθυνη για τον έλεγχο της δράσης τους, στην περίπτωση της Sky1p περιλαμβάνει μία επιπλέον αλληλουχία αμινοξέων (αc ) η οποία επεκτείνει τη δομή της αc κατά μία περιστροφή. Η επιπλέον αυτή περιοχή σταθεροποιεί την αc, φέρνοντας την σε επαφή με την έλικα αε του μεγάλου λοβού. Η Tyr283 της αε έλικας παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομής αλληλεπιδρώντας μέσω δεσμών υδρογόνου με τα αμινοξέα Asn210 και Asp213 της έλικας αc. ii. Οι SRPKs δεν απαιτούν τη φωσφορυλίωση του βρόχου ενεργοποίησης προκειμένου να καταστούν δραστικές. Στη θέση ενός χαρακτηριστικού αμινοξέος Arg που προηγείται του καταλυτικού Asp διαθέτουν μία Thr. Προκειμένου τα μόρια των SRPKs να καταστούν ενεργά, αντί της φωσφορυλίωσης του βρόχου ενεργοποίησης, ευνοείται η αλληλεπίδρασή του με περιοχές του μορίου εκτός της δραστικής περιοχής, οι οποίες σταθεροποιούν το βρόχο σε μία κατάσταση συνεχούς ενεργότητας. iii. Οι SRPKs διαθέτουν μία δομή στην περιοχή δέσμευσης του υποστρώματος, η οποία αναγνωρίζει φωσφοσερίνες που βρίσκονται σε P- 2 θέση από τη σερίνη που πρόκειται να φωσφορυλιωθεί. Έτσι η μετατόπιση της φωσφορυλιωμένης σερίνης στην περιοχή αυτή και δέσμευση της γειτονικής σερίνης στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου, ~ 11 ~

προκαλεί τη διαδοχική φωσφορυλίωση των σερινών του υποστρώματος (Nolen et al., 2001). Σχήμα Α.3. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της Sky1p. Παρουσιάζεται επίσης η δομική αναπαράσταση του μορίου της Sky1p ανεστραμμένη κατά 40 μοίρες όπου φαίνονται οι μη καταλυτικές περιοχές της κινάσης (Nolen et al., 2001). Σχήμα Α.4. Κρυσταλλική δομή τύπου κορδέλας του μορίου της SRPK1ΔNS1 (Ngo et al., 2005). ~ 12 ~

Τα παραπάνω δομικά στοιχεία επιβεβαιώθηκαν μετά από την κρυσταλλογραφική μελέτη και της SRPK1, όπως φαίνεται στο σχήμα Α.4. Για την καλύτερη κρυστάλλωση του μορίου της SRPK1, αφαιρέθηκαν από το μόριό της μία περιοχή 40 αμινοξέων από το Ν-τελικό άκρο και 217 αμινοξέα από τη συνδετική αλληλουχία (aa 256 473). Το μόριο που δημιουργήθηκε αναφέρεται ως SRPK1ΔNS1 (Ngo et al., 2005). Η SRPK1 παρουσιάζει υψηλή δομική ομολογία με την Sky1p. Παρόλα αυτά διαθέτει και δύο αξιοσημείωτες διαφορές. Το C-τελικό άκρο της Sky1p περιλαμβάνει μία αλληλουχία 40 αμινοξέων που περιελίσσεται γύρω από την καταλυτική περιοχή (kinase domain) του καρβοξυ-τελικού άκρου του μορίου, κάτι που δεν υπάρχει στην SRPK1ΔNS1. Επιπλέον, η συνδετική περιοχή της SRPK1ΔNS1 δημιουργεί δύο δομές α-έλικας, που συμβάλλουν (σχηματίζουν ένα ασυνεχές τοίχος πλευρικά του ενζύμου, στο οποίο οφείλεται) στη συνεχή ενεργή διαμόρφωση της κινάσης (Ngo et al., 2005). Το μοντέλο ότι οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωμάτων τους, δεν εξηγεί τη φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώματος. Είναι πιθανό in vivo το υπόστρωμα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από μία άλλη κινάση πρωτεϊνών και ακολούθως οι SRPKs να το αναγνωρίζουν και να φωσφορυλιώνουν τις υπόλοιπες σερίνες, ακολουθώντας μία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPKs, αλλά με πολύ μικρότερη αποτελεσματικότητα. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η SRPK1 συνδέεται αρχικά με τα υποστρώματά της μέσω μίας αύλακας του μορίου της (docking groove), η οποία αναγνωρίζει το μοτίβο R-X-R/K-X-X-X-R (Ngo et al., 2005). Όταν η αρχική φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιτευχθεί, η SRPK συνεχίζει τη φωσφορυλίωση του υποστρώματος επιδεικνύοντας υψηλότερη δραστικότητα (Nolen et al., 2001). Σε πειράματα φωσφορυλίωσης του παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 από την SRPK1 βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση των σερινών της RS ακολουθίας γίνεται διαδοχικά. Όσο διαρκεί η διαδικασία αυτή, το υπόστρωμα παραμένει δεσμευμένο πάνω στο μόριο της κινάσης. Αποδείχτηκε ακόμη ότι από τις 20 σερίνες της RS ακολουθίας, μόνο οι μισές φωσφορυλιώνονται in ~ 13 ~

vitro. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης μάλιστα είναι ανεξάρτητες της ποσότητας του ATP ή της ποσότητας της κινάσης (Aubol et al., 2003). Α.1.2. Εξειδίκευση των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης. Η εξειδίκευση των SRPKs εντοπίζεται στην ύπαρξη μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα μόρια των υποστρωμάτων τους. Η μεταφορά της γ-φωσφορικής ομάδας του ΑΤΡ γίνεται στις σερίνες των ακολουθιών αυτών. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι SRPKs είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων (-R-S-R-S-R-S-). Σε πειράματα in vitro φωσφορυλίωσης χρησιμοποιώντας ως κινάση την πρωτεΐνη σύντηξης GST-SRPK1 και υποστρώματα που περιείχαν μόνο δύο επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης, δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ακόμη έχει δειχτεί ότι η αντικατάσταση της σερίνης από θρεονίνη ή της αργινίνης από λυσίνη στις RS ακολουθίες, έχει ως αποτέλεσμα τη μη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων από την SRPK1 (Wang et al., 1998). Το Ν-τελικό άκρο του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR Lamin B Receptor) περιέχει κατάλληλη περιοχή διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από την SRPK1. Μεταλλάγματα της περιοχής αυτής, στα οποία είχαν εισαχθεί με σημειακές μεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών, έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν την δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίμηση από την πλευρά της κινάσης (Nikolakaki et al., 1996; Papoutsopoulou et al., 1999b). Ακόμη σε in vitro πειράματα που έγιναν χρησιμοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 με διάφορους παράγοντες ματίσματος του mrna που προέρχονται από διαφορετικούς οργανισμούς, έδειξαν ότι οι κινάσες αυτές προτιμούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης που είναι τοποθετημένες ανάμεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αμινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al., 1998). Όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των SRPKs, οι μελέτες που έγιναν χρησιμοποιώντας ως πηγή δράσης την SRPK1 και ως υπόστρωμα τον παράγοντα ματίσματος ASF/SF2 έδωσαν μια τιμή Κm 10 μμ για το ΑΤΡ, και ~ 14 ~

μία πολύ μικρή τιμή Κm 0,07 μμ για το υπόστρωμα. Το γεγονός αυτό δείχνει την πολύ μεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώματά τους (Gui et al., 1994b). Α.1.3. Εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/ αργινίνης και έκφραση στους διάφορους ιστούς. Φθορισμομετρικός in situ υβριδισμός (FISH) σε ανθρώπινα σωματικά κύτταρα έδειξε ότι το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται τοποθετημένο στο χρωμόσωμα 6 (θέση 6p21.2-p21.3), ενώ αντίστοιχα το γονίδιο της SRPK2 στο χρωμόσωμα 7 (θέση 7q22-q31.1). Στο ποντίκι, η χαρτογράφηση των χρωμοσωμάτων έδειξε ότι τα γονίδια των SRPK1 και SRPK2 βρίσκονται στα χρωμοσώματα 17 (θέση 17 A3.3) και 5 (θέση 5 9.0 cm) αντίστοιχα (NCBI, Entrez Gene; Wang et al., 1999). Στο ποντίκι ακόμη, όπου δεν εκφράζεται η ανθρώπινη ισομορφή SRPK1a, εκφράζεται η Stk23/SRPK3 (Nakagawa et al., 2005), το γονίδιο της οποίας βρίσκεται στο χρωμόσωμα Χ (θέση X A7.3). Ομόλογη της συγκεκριμένης χρωμοσωμικής περιοχής έχει βρεθεί και στον άνθρωπο, στο χρωμόσωμα Χ (θέση Xq28) (NCBI, Entrez Gene), δεν έχει όμως βρεθεί ακόμη η αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η κατανομή των μελών της οικογένειας των SRPKs πρωτεϊνικών κινασών στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σημαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασης τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των SRPKs, χρησιμοποιώντας υβριδισμό κατά Northern με ιχνηλάτες ραδιενεργά επισημασμένα τμήματα των γονιδίων τους, έδειξε ότι η SRPK1 εκφράζεται σε μεγαλύτερο βαθμό στους όρχεις, έχοντας μικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύμος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός μυς (Papoutsopoulou et al., 1999a). Παρόμοια εικόνα έδειξε και η μελέτη των επιπέδων έκφρασης της SRPK1a, όμως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασής της στους διάφορους ιστούς ήταν σημαντικά μικρότερα (Nikolakaki et al., 2001). Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα, αφού εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, μέτρια στην καρδιά και το σκελετικό μυ, ενώ παρουσιάζει χαμηλά ~ 15 ~

επίπεδα έκφρασης στον πνεύμονα, το ήπαρ και το νεφρό (Wang et al., 1998). Τέλος, η SRPK3 έχει βρεθεί ότι εκφράζεται κυρίως στην καρδιά και το σκελετικό μυ του ποντικού (Nakagawa et al., 2005). Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των κινασών αυτών στους ιστούς των οργανισμών, συμβάλουν στη ρύθμιση των λειτουργιών τους κατά ένα εξειδικευμένο τρόπο στο επίπεδο του κάθε ιστού ξεχωριστά (tissue specific regulation). Α.1.4. Υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/ αργινίνης. Η υποκυτταρική κατανομή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης παρουσιάζει μια αινιγματική συμπεριφορά. Αν και όλα τα, μέχρι τώρα, γνωστά υποστρώματα τους είναι πυρηνικές πρωτεΐνες, πειράματα ανοσοφθορισμού σε καθηλωμένα κύτταρα έδειξαν ότι οι SRPKs κατανέμονται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα, χωρίς να είναι απόλυτα διευκρινισμένοι οι μοριακοί μηχανισμοί εκείνοι που οδηγούν σε κυτταροπλασματική ή αντίστοιχα πυρηνική εντόπιση των ενζύμων (Wang et al., 1998, βλ. και Σχήμα Α.5.). Σχήμα Α.5. Υποκυτταρική εντόπιση των FLAG-SRPK1 (a,b) και FLAG-SRPK2 (d,e) σε HeLa κύτταρα, Ο ανοσοφθορισμός έγινε με τη χρήση του anti- ~ 16 ~

FLAG μονοκλωνικού αντισώματος. Στα κύτταρα παρατηρήθηκε τόσο κυτταροπλασματική (a,d) όσο και πυρηνική εντόπιση (b,e) των κινασών. Στην περίπτωση επιμόλυνσης των κυττάρων με GFP-SRPK1 και GFP- SRPK2 παρατηρήθηκε κυρίαρχη κυτταροπλασματική εντόπιση (c και f αντίστοιχα). Μελέτες της κινάσης πρωτεϊνών Dsk1 της ζύμης S. pompe αποκάλυψαν ότι σε κύτταρα συγχρονισμένα στη μεσόφαση η κυτταροπλασματική εντόπιση της κινάσης είναι κυρίαρχη. Αντίθετα σε κύτταρα λίγο πριν την είσοδο τους στη μίτωση, το σήμα ανοσοφθορισμού της κινάσης εμφανίζεται έντονα στον πυρήνα, υπονοώντας ότι η διαφορετική κυτταρική εντόπιση των κινασών αυτών κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων του κυτταρικού κύκλου είναι σημαντική για τις λειτουργίες του κυττάρου (Takeuchi and Yanagida, 1993). Στην περίπτωση της κινάσης πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης Sky1p της ζύμης S. cerevisiae, βρέθηκε ότι η μεγάλη ενδιάμεση ακολουθία που χωρίζει τις δραστικές περιοχές της κινάσης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της υποκυτταρικής της εντόπισης. Χρησιμοποιώντας τόσο τη φυσιολογική, όσο και τη μορφή της κινάσης από την οποία είχε αφαιρεθεί η εν λόγω ακολουθία, βρέθηκε ότι στα κύτταρα που έφεραν τη φυσιολογική μορφή, το κυτταροπλασματικό σήμα είναι έντονο, σε αντίθεση με τη μεταλλαγμένη της μορφή η οποία εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρήνα. Μία αρχική υπόθεση για το ρόλο αυτού του εμβόλιμου τμήματος ήταν ότι περιέχει κάποιο σήμα εξόδου από τον πυρήνα (NES-Nuclear Export Signal) (Siebel et al., 1999). Άλλωστε η αντίστοιχη ενδιάμεση ακολουθία της Dsk1 περιέχει ένα αντίστοιχο σήμα που μπορεί να δράσει ως NES και το οποίο εξαρτάται από τον αναστολέα της εξόδου από τον πυρήνα, λεπτομυκίνη Β (Fukuda et al., 1997). Ανάλογες μελέτες από την ερευνητική ομάδα του Dr. Fu X.D. έδειξαν αντίστοιχη συμπεριφορά για τις πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/αργινίνης των θηλαστικών. Ακόμη δείχτηκε ότι η SRPK1, σε κύτταρα HeLa, αποκρινόμενη σε άγνωστα έως τώρα μονοπάτια μεταφοράς σήματος που λειτουργούν κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, εισέρχεται στον πυρήνα, λίγο πριν αυτά εισέλθουν στη φάση Μ (Ding et al., 2006). ~ 17 ~

Σχήμα Α.6. Ο ρόλος της συνδετικής αλληλουχίας και της ενεργής διαμόρφωσης στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1. (Α) SRPK1, (D) ανενεργή SRPK1(K109M), (G) SRPK1-ΔS, που δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία, (J) SRPK1-ΔS(K109M), που είναι και ανενεργή και δεν περιέχει τη συνδετική αλληλουχία (Β, E, H, K) παράγοντας ματίσματος SC35 και (C, F, I, L) μίξη των αντίστοιχων εικόνων (merge) (Ding et al., 2006). Η αφαίρεση της συνδετικής αλληλουχίας έχει ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό της SRPK1 εξ ολοκλήρου στον πυρήνα. Ακριβώς το ίδιο αποτέλεσμα έχουμε και στην περίπτωση της SRPK2. Σε αντίθεση με την υπόθεση ότι η περιοχή αυτή περιέχει κάποιο σήμα εξόδου από τον πυρήνα, μελέτες από την ίδια ερευνητική ομάδα έδειξαν ότι η υποκυτταρική εντόπιση εξαρτάται από τη δραστικότητα της κινάσης. Ανενεργή SRPK1, που φέρει τη σημειακή μετάλλαξη Κ109Μ στην περιοχή δέσμευσης του ΑΤΡ, διατηρεί την κυτταροπλασματική της εντόπιση, ενώ η ίδια μετάλλαξη, σε SRPK1 που της έχει αφαιρεθεί η συνδετική αλληλουχία, επηρεάζει την κατανομή και οδηγεί την ~ 18 ~

κινάση τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα (σχήμα Α.6). Επιπλέον αποδείχτηκε ότι η υποκυτταρική κατανομή της SRPK1 είναι ανεξάρτητη της δράσης της λεπτομυκίνης Β (Ding et al., 2006). Τα παραπάνω δεδομένα ενισχύουν την άποψη ότι στις SRPKs η συνδετική αλληλουχία λειτουργεί περισσότερο ως «κυτταροπλασματική άγκυρα» και η έκθεσή της ανάλογα με τη διαμόρφωση (ενεργή ή ανενεργή) του ενζύμου, είναι αυτή που επηρεάζει την είσοδο στον πυρήνα. Η διαφορετική συμπεριφορά της Dsk1, όπου φαίνεται ότι η αντίστοιχη συνδετική αλληλουχία περιέχει σήμα εξόδου από τον πυρήνα, ίσως οφείλεται στο γεγονός ότι η συγκεκριμένη περιοχή των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης δεν είναι αρκετά συντηρημένη κατά την εξέλιξη (Ding et al., 2006). Η ερευνητική ομάδα του Dr Fu με πρόσφατα πειράματα έδειξαν ότι υπεύθυνες για τη σωστή διαμόρφωση της SRPK1 είναι το σύμπλοκο των σαπερονινών Hsp70/Hsp90 και ότι εκτός από την συνδετική αλληλουχία ενεργό ρόλο παίζει και η καταλυτική περιοχή (Zhong et al., 2009). Στο σχήμα Α.7 παρουσιάζεται ένα μοντέλο του τρόπου που λειτουργούν οι σαπερονίνες στην υποκυτταρική εντόπιση της SRPK1. Σχήμα Α.7. Σχηματική αναπαράσταση του ρόλου των σαπερονινών στην μεταφορά της SRPK1 στον πυρήνα, στη φωσφορυλίωση των SR πρωτεϊνών και στο μάτισμα του pre-mrna. ~ 19 ~

Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό η SRPK1 συνδέεται στο σύμπλοκο Hsp70/Hsp90 το οποίο αφ ενός βοηθάει να πάρει την ενεργή της διαμόρφωση αλλά ταυτόχρονα την καθηλώνει στην περιοχή του κυτταροπλάσματος. Υπό συνθήκες στρες η κινάση απελευθερώνεται από το σύμπλοκο των σαπερονινών -με άγνωστο έως τώρα μηχανισμό- και μεταφέρεται στον πυρήνα του κυττάρου. Η ελεγχόμενη μεταφορά της κινάσης στον πυρήνα ενεργοποιεί το μάτισμα ενώ κάτω από συνθήκες στρες, η υπερβολική συσσώρευση στον πυρήνα, έχει ως αποτέλεσμα την υπερφωσφορυλίωση των SR πρωτεϊνών και την αναστολή του ματίσματος του RNA. Οι SRPKs διαθέτουν μια περιοχή ομόλογη της MAPK, όπου δεσμεύονται ορισμένα από τα υποστρώματά τους, όπως ο ASF/SF2 παράγοντας ματίσματος (Ngo et al., 2005). Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αλληλεπίδραση των φωσφορυλιωμένων παραγόντων ματίσματος με υποδοχείς εισόδου στον πυρήνα, όπως οι TRN-SR1 και 2 (transportin-sr1 και 2) (Lai et al., 2000; Yun et al., 2003), οδήγησε στην υπόθεση ότι η είσοδος των SRPKs στον πυρήνα γίνεται μέσω ενός τριαδικού συμπλόκου, που περιλαμβάνει την κινάση, τους παράγοντες ματίσματος και τους πυρηνικούς υποδοχείς. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι η υπερέκφραση του ASF/SF2 αυξάνει την πυρηνική εντόπιση της SRPK1 (Ngo et al., 2005). Αντίστοιχα η έξοδος των SRPKs από τον πυρήνα θεωρείται πως γίνεται μέσω των υπο-φωσφορυλιωμένων παραγόντων ματίσματος, οι οποίοι συνδέονται με το mrna (Huang et al., 2004). Η δραστικότητα των SRPKs είναι απαραίτητη κατά την είσοδό τους στον πυρήνα, αλλά όχι και κατά την έξοδο, όπου ίσως αποτελούν συστατικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων, τα οποία εξάγονται στο κυτταρόπλασμα (Ding et al., 2006). ~ 20 ~

Α.1.5. Υποστρώματα των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης Πιθανός ρόλος της φωσφορυλίωσης. Παράγοντες ματίσματος του RNA (SR splicing factors) Τα πιο καλά μελετημένα υποστρώματα της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης αποτελούν οι παράγοντες ματίσματος, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (SR splicing factors), με πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα τον ASF/SF2. Άλλα μέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ο SC35, ο 9G8 και πέντε ακόμα πολυπεπτίδια με μοριακές μάζες 20, 35, 40, 55 και 75 kda, όπως φαίνονται στο σχήμα Α.7. Άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη διαδικασία ματίσματος του RNA και περιέχουν το χαρακτηριστικό μοτίβο των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιμοποιείται για τις έξι προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται με τις μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεϊνες (snrnps small nuclear RiboNucleoProteins) όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο αμινοτελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης και δέσμευσης του RNA, RBDs (RNA Binding Domains), ενώ το καρβοξυτελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (Manley and Tacke, 1996). Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με άλλους παράγοντες ματίσματος και εκτός από την συγκρότηση του σωματιδίου ματίσματος, θεωρούνται σημαντικές και στην περίπτωση του εναλλακτικού τρόπου ματίσματος των mrnas ρυθμίζοντας την επιλογή της θέσης όπου θα γίνει το μάτισμα (Manley and Tacke, 1996; Valcarcel and Green, 1996). ~ 21 ~

Σχήμα Α.7. Σχηματική αναπαράσταση των δομικών περιοχών των SR παραγόντων ματίσματος. Διακρίνονται στο αμινοτελικό άκρο τους μία ή δύο περιοχές δέσμευσης με το RNA (RBD - κόκκινο ή μπλε) και στο καρβοξυτελικό τους άκρο οι περιοχές των επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS - πράσινο). Μία συνδετική αλληλουχία πλούσια σε γλυκίνη και σε ορισμένους παράγοντες εκτός της γλυκίνης πλούσια και σε προλίνη ή αργινίνη, φαίνεται με πορτοκαλί. Ακόμη ο παράγοντας 9G8 με μοριακή μάζα 35 kda περιέχει μία θέση δέσμευσης ψευδαργύρου (γκρι) (Manley and Tacke, 1996). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης των παραγόντων ματίσματος είναι η αποσύνδεσή τους από τις θέσεις αποθήκευσης στον πυρήνα (IGCs - Interchromatin Granule Clusters), όπου βρίσκονται συγκεντρωμένοι σε μεγάλα ανενεργά σύμπλοκα. Έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική μορφή τους, είναι δυνατή η μεταφορά τους σε ενεργές περιοχές μεταγραφής στο νουκλεόπλασμα (PFs - Perichromatin Fibrils), όπου και συμμετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριμου mrna (Gui et al., 1994a; Kuroyanagi et al., 1998; Yeakley et al., 1999). Επίσης, η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από την οικογένεια των SR πρωτεϊνικών κινασών, επάγει τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να ~ 22 ~

συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύμπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας ματίσματος του mrna (Gui et al., 1994a; Yue et al., 2000). Στην ικανότητα των SR πρωτεϊνικών κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συμπλόκου, συνηγορούν και δεδομένα τα οποία δείχνουν ότι με μη φωσφορυλιωμένους παράγοντες ματίσματος ή με την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύμπλοκο δεν συγκροτείται και το μάτισμα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (Cao et al., 1997). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιμη με προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων ματίσματος. Αφού όμως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συμπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος ώστε το σωματίδιο ματίσματος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία. Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι η παρουσία μεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, μετά την συγκρότηση του συμπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του ματίσματος του mrna (Cao et al., 1997). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει την λειτουργικότητα του συμπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Το γεγονός αυτό είναι ένα ακόμη σημείο που καταδεικνύει την σημασία της ρυθμιζόμενης δραστικότητας των SR πρωτεϊνικών κινασών. Η δράση τους είναι απαραίτητη μόνο κατά τα αρχικά της στάδια του ματίσματος, αφού παρατεταμένη φωσφορυλίωση οδηγεί σε αναστολή της καταλυτικής διαδικασίας (Cao et al., 1997; Valcarcel et al., 1996; Wang et al., 1998; Xiao and Manley, 1997). Άλλο ένα αποτέλεσμα που συνηγορεί την παραπάνω θεώρηση, είναι η ανώμαλη φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος και η ανικανότητα δημιουργίας λειτουργικού συμπλόκου ματίσματος κατά την αλληλεπίδραση της SRPK1 με την πρωτεΐνη ICP27 του HSV-1 (Herpes Simplex Virus) (Sciabica et al., 2003). Τέλος, η φωσφορυλίωση των παραγόντων ματίσματος από το κυτταροπλασματικό κλάσμα των SR πρωτεϊνικών κινασών επάγει τη μεταφορά τους από το κυτταρόπλασμα, όπου συντίθενται, στον πυρήνα. Ταυτόχρονα ρυθμίζεται και η ενδοπυρηνική τους εντόπιση στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές του πυρήνα (Yeakley et al., 1999). Στο σημείο αυτό πρέπει να σημειωθεί ότι στη ζύμη S. cerevisiae, η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εμπλέκεται στη δέσμευση και ~ 23 ~

μεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθμίζεται η είσοδος της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p με τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (Gilbert et al., 2001). Υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR - Lamin B Receptor) Ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR, p58), είναι μία πρωτεΐνη της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης του πυρηνικού φακέλου. Ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του έδειξε ότι αποτελείται από 8 υδρόφοβες διαμεμβρανικές περιοχές που διαπερνούν την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη, καθώς και δύο υδρόφιλες περιοχές στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό του άκρο αντίστοιχα, τα οποία εκτείνονται προς το πυρηνόπλασμα (Worman et al., 1990; Ye and Worman, 1994). Αν και δεν έχει γίνει συστηματική μελέτη των διαμεμβρανικών τμημάτων της πρωτεΐνης και του καρβοξυτελικού της άκρου, οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά του αμινοτελικού της άκρου έχουν μελετηθεί διεξοδικά. Το αμινοτελικό του υποδοχέα της λαμίνης Β αποτελείται από μία ακολουθία 208 αμινοξέων και έχει σφαιρικό (globular) σχήμα. Στο τμήμα αυτό περιέχονται το σήμα πυρηνικού εντοπισμού της πρωτεΐνης (NLS), ακολουθίες αμινοξέων οι οποίες είναι ικανές να φωσφορυλιωθούν από την πρωτεϊνική κινάση Α και την κινάση πρωτεϊνών p34/cdc2, μία περιοχή επαναλαμβανόμενων διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS domain), καθώς και πιθανές περιοχές δέσμευσης του DNA (Appelbaum et al., 1990; Nikolakaki et al., 1997; Nikolakaki et al., 1996; Simos and Georgatos, 1992; Soullam and Worman, 1993). Ακόμη το αμινοτελικό άκρο του LBR είναι ικανό να δεσμεύσει την λαμίνη τύπου Β, γεγονός που εξηγεί και την ονομασία της πρωτεΐνης (Simos and Georgatos, 1992; Worman et al., 1988; Ye and Worman, 1994). Η RS ακολουθία του αμινοτελικού άκρου του LBR περιλαμβάνει πέντε επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης ( 75 RSRSRSRSRS 84 ) και όλες οι σερίνες της φωσφορυλιώνονται από την SRPK1 (Mylonis et al., 2004; Nikolakaki et al., 1996). Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση του LBR με άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα όπως η πρωτεΐνη p32/p34, οι ιστόνες Η3 και Η4 (Polioudaki et al., 2001) και η πρωταμίνη 1 (Mylonis et al., 2004). Ακόμη έχει διατυπωθεί η άποψη ότι η φωσφορυλίωση ~ 24 ~

της RS ακολουθίας του LBR από την SRPK1 επάγει τη δέσμευση χρωματίνης στον LBR (Takano et al., 2004). Πρωταμίνη P1 Ένα άλλο υπόστρωμα των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελεί η πρωταμίνη P1. Οι πρωταμίνες Ρ1 είναι πολύ βασικά, χαμηλού μοριακού βάρους πολυπεπτίδια με ισοηλεκτρικό σημείο μεγαλύτερο του 11 (τα μισά τους αμινοξέα αποτελούνται από αργινίνες). Είναι πρωτεΐνες πολύ συντηρημένες κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και διαιρούνται σε δύο κατηγορίες αυτές που δεν περιέχουν κυστεΐνες και συναντώνται στα πτηνά, στα ερπετά και τα μαρσιποφόρα, και αυτές των θηλαστικών με πλακούντα που περιέχουν 6-9 κυστεΐνες, οι οποίες σχηματίζουν ενδομοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς που σταθεροποιούν τη δομή τους (Oliva and Dixon, 1991; Retief et al., 1993). Και οι δύο κατηγορίες των Ρ1 πρωταμινών περιλαμβάνουν στο μόριο τους επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης από τις SRPKs (Papoutsopoulou et al., 1999a). Ο ρόλος των πρωταμινών είναι η αντικατάσταση των ιστονών κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης με αποτέλεσμα να προκύπτει χρωματίνη με πολύ υψηλό βαθμό συμπύκνωσης (Oliva and Dixon, 1991). Κατά τα αρχικά στάδια της σπερματογένεσης οι πρωταμίνες φωσφορυλιώνονται στοιχειομετρικά, ενώ αργότερα στα ώριμα σπερματοζωάρια αποφωσφορυλιώνονται στο μεγαλύτερο μέρος τους (Chirat et al., 1993; Oliva and Dixon, 1991). Παλιότερα είχε προταθεί ότι ο ρόλος της φωσφορυλίωσης διευκολύνει τη σωστή σύνδεση των πρωταμινών με το DNA, ενώ η αποφωσφορυλίωση τους κατά τα τελικά στάδια της σπερματογένεσης οδηγεί πιθανότατα σε μία περαιτέρω συμπύκνωση της χρωματίνης (Chirat et al., 1993). Στη συνέχεια διατυπώθηκε η άποψη ότι επειδή υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση πρωταμινών και άλλων βασικών πρωτεϊνών γύρω από το DNA, η φωσφορυλίωση σε συγκεκριμένες θέσεις στο μόριο των P1 πρωταμινών μειώνει τις δυνάμεις απώθησης μεταξύ γειτονικών θετικών φορτίων (Papoutsopoulou et al., 1999a). Πρόσφατα όμως αποτελέσματα μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της με τον πυρηνικό φάκελο (Mylonis et al., 2004). Δεδομένου δε ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταμίνες γίνεται ~ 25 ~

στην πυρηνική περιφέρεια, η φωσφορυλίωση της P1 πρωταμίνης και η συνεπακόλουθη εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, μάλλον συνεισφέρει στη διαδικασία αντικατάστασης. Α.1.6. Άλλες λειτουργίες της οικογένειας των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/αργινίνης. Η ομόλογη της SRPK1 στη ζύμη S. cerevisiae, η Sky1p, εμπλέκεται στη ρύθμιση της μεταφοράς πολυαμινών στο κύτταρο καθώς και στην ομοιόσταση ιόντων (Erez and Kahana, 2001). Μεταλλαγμένα κύτταρα ζύμης, όπου έγινε ανενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν μεγάλη ανθεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερμίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με το γονίδιο που κωδικοποιεί την Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο με επιμόλυνσή τους με ένα μεταλλαγμένο γονίδιο που εκφράζει μια μη λειτουργική μορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξημένη ευαισθησία στην σπερμίνη. Η ανενεργοποίηση του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύμης προκάλεσε ακόμη μειωμένη πρόσληψη σπερμιδίνης και πουτρεσκίνης. Η ίδια μεταλλαγμένη μορφή των κυττάρων έδειξε και μία μεγάλη ανεκτικότητα στα ιόντα λιθίου και νατρίου (Erez and Kahana, 2001). Ένα άλλο μέλος της οικογένειας αυτής των κινασών, η SPK-1 στο νηματοειδές C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων. Η SPK-1 δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη CeSF2 in vitro. Η κινάση αυτή και το υπόστρωμα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηματοειδούς και παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την διάρκεια του εμβρυϊκού σταδίου του C. elegans (Kuroyanagi et al., 2000). Τέλος, η SRPK1 έχει απομονωθεί ως σύμπλοκο με την τοποϊσομεράση ΙΙa, δύο ATPάσες/ελικάσες (RNA helicase A και RHII/Gu), δύο παράγοντες ματίσματος του RNA (PRP8 και hnrnp C) και μια HMG πρωτεΐνη (SSRP1) (Lee et al., 2004). Το σύμπλοκο αυτό, το οποίο ονομάστηκε τοποσωμάτιο (toposome), φαίνεται να συγκροτείται κυρίως κατά τη G2/M φάση ενώ κατά τη G1/S φάση, οι συστατικές του πρωτεΐνες εμφανίζουν πολύ χαμηλή αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Το τοποσωμάτιο θεωρείται μερικώς υπεύθυνο ~ 26 ~

για το διαχωρισμό των αδελφών χρωματίδων. Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι το συγκεκριμένο σύμπλοκο είναι δυναμικό και ότι ο σχηματισμός ή/και η ενεργοποίησή του εξαρτώνται άμεσα από τον κυτταρικό κύκλο (Lee et al., 2004). ~ 27 ~

Β. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Υλικά Β.1.1. Χημικά αντιδραστήρια. Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προμηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, MI, USA), Serva (Heidelberg, Germany) και Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany). Τo ισότοπo γ- 32 Ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol ήταν της εταιρείας Izotóp Intézet Kft. Τα ακτινογραφικά φιλμ που χρησιμοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες ήταν του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εμφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλμ ήταν αντίστοιχα τα X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρίας. Β.1.2. Υλικά χρωματογραφίας. Για τον καθαρισμό των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε στήλη αγχιστείας γλουταθειόνη-σεφαρόζη της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd (Buckinghamshire, UK) και για τις ανοσοκατακρημνίσεις χρησιμοποιήθηκε protein A-σεφαρόζη της ίδιας εταιρίας. Β.1.3. Ένζυμα και υλικά μοριακής βιολογίας. Tα ένζυμα μοριακής βιολογίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν των εταιριών New England BioLabs Inc. (Beverly, MA, USA) και Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan). Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Το θρεπτικό υγρό DMEM (Dulbecco s ~ 28 ~

Modified Eagle s Medium), ο ορός εμβρύου μοσχαριού (fetal calf serum, FCS) και το μίγμα αντιβιοτικών που χρησιμοποιήθηκαν στις ιστοκαλλιέργειες ήταν προϊόντα της GIBCO, Life Technologies Inc. (Scotland). Η έκφραση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα έγινε με τη χρησιμοποίηση των φορέων κλωνοποίησης pflag-cmv-2 (Eastman Kodak Company) και pcdna3/ha-ub που μας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Γ. Μόσιαλο (Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ.) Τα μονοκλωνικά αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το anti- SRPK1 της εταιρείας BD Biosciences, το anti-flag M5 της εταιρείας Sigma- Aldrich και το anti-ha-1 της εταιρείας Santa Cruz Biochemicals. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για Western blot ανάλυση ήταν rabbit anti-mouse της εταιρείας Chemicon International Inc. (Temecula, CA USA). Το αντίσωμα αυτό ήταν συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση, ώστε να δίνει τη χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση. Για δοκιμές ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκε ως δεύτερο αντίσωμα το goat anti-mouse IgG 568 με απορρόφηση (Abs) στα 578 nm και εκπομπή (Em) στα 603 nm, της εταιρείας Molecular Probes, Invitrogen. B.2. Μέθοδοι Β.2.1. Ιστοκαλλιέργειες. Οι κυτταρικές σειρές 293Τ και HeLa διατηρήθηκαν στην αναπτυξιακή τους φάση σε θρεπτικό υγρό DMEM, που περιέχει 10% ορό εμβρύου μοσχαριού (FΒS) και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Έτσι αναπτύχθηκαν σε τριβλία πολυστυρενίου ως μονοστιβάδα (monolayer cultures), σε επωαστήρα στους 37 ο C, με ατμόσφαιρα 5% CO 2 και κορεσμένη σε υγρασία (95%). Οι κυτταροκαλλιέργειες αραιώνονταν σε τακτά χρονικά διαστήματα 3-4 ημερών, υπό ασηπτικές συνθήκες, έτσι ώστε να διατηρούνται οι πληθυσμοί σε εκθετική φάση ανάπτυξης. Πριν από τη διαδικασία της αραίωσης των κυττάρων, οι καλλιέργειες επωάζονται για 15 λεπτά με 0,5% τρυψίνη και 0,02% (τετρανατριούχο) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) για την αποκόλλησή τους. Στη συνέχεια αραιώνονται έτσι ώστε η συγκέντρωσή τους να διατηρείται ~ 29 ~

μεταξύ 5x10 4-8x10 5 κύτταρα/ml θρεπτικού υγρού. Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη μέθοδο του αιματοκυτταρόμετρου (Neübauer) κάτω από μικροσκόπιο (100x) (American Optical Corp., USA) και έτσι προσδιορίζεται η συγκέντρωση της καλλιέργειας σε κύτταρα/ml. Β.2.2. Παροδική επιμόλυνση κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για την εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιημένων γονιδίων ως πρωτεϊνών σύντηξης με χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιμες. Η παροδική επιμόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή μίξη του πλασμιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυμα CaCl 2 με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσμα της ανάμιξης είναι η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Τα ιζήματα αυτά DNA/φωσφορικού ασβεστίου διαπερνούν την κυτταροπλασματική μεμβράνη πιθανώς με ενδοκύττωση. Η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις μεταβολές του ph (βέλτιστο ph 6.9-7.2) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εμπορικά kit καθαρισμού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρμογή της μεθόδου). Ο κλωνοποιημένος πλασμιδιακός φορέας εντοπίζεται εκτός του γενώματος των κυττάρων, ενώ η ανίχνευση της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το κλωνοποιημένο γονίδιο είναι δυνατή για χρονικό διάστημα 1-4 ημερών. Επίσης σε κάθε κυτταρική διαίρεση μόνο τα μισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασμιδιακού DNA που εισήχθη με την επιμόλυνση των κυττάρων (Chen and Okayama, 1987). Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα 293Τ κύτταρα, τα οποία επιμολύνθηκαν παροδικά με το γονίδιο της SRPK1 κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pflag-cmv-2 και το γονίδιο της ουβικιτίνης κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα pcdna3/ha-ub. ~ 30 ~

Σχήμα Β.1. Σχηματική αναπαράσταση της παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων με τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιμόλυνση πρέπει να καταλαμβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλίου. Το διάλυμα του DNA με το CaCl 2 (250 mm CaCl 2, 20 μg/ml πλασμιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 μg/ml περιλαμβάνουν το κλάσμα του DNA που φέρει το κλωνοποιημένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος HEPESφωσφορικών (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na 2 HPO 4 ph 7.1). Το μίγμα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για 20-30 λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήμνιση του DNA με το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως απομακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1 ml του αιωρήματος DNA-φωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τριβλίο της καλλιέργειας. Τα τριβλία αφήνονται στον επωαστήρα για 20 λεπτά με παροδική ανακίνηση. Στη συνέχεια σε κάθε τριβλίο προστίθενται 4 ml DMEM /10% v/v FBS, 5 μl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυμα που διασπούν το DNA, καθώς και μίγμα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη μυκήτων και μικροβίων. Τα τριβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία CO 2. Μετά από τέσσερις ώρες αφαιρούνται τα 5 ml του υγρού που έγινε η επιμόλυνση και προστίθενται εκ νέου 10 ml θρεπτικού μέσου. Η καλλιέργεια αφήνεται στον επωαστήρα στους 37 C σε ατμόσφαιρα ~ 31 ~

CO 2 για 24 ώρες και ακολουθεί αλλαγή του θρεπτικού μέσου και επώαση για άλλες 24 ώρες. Με την συμπλήρωση συνολικά 48 ωρών από την στιγμή της επιμόλυνσης τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό μέσο ανάπτυξης και ακολουθεί η λύση τους. Β.2.3. Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με τη χρήση του kit X- tremegene Q2 Reagent της εταιρείας Roche. Για την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa χρησιμοποιήθηκε το kit X-tremeGENE Q2 Reagent της εταιρείας Roche (Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, N.J. USA). Το kit αυτό είναι λιπιδιακής φύσεως και επάγει υψηλά επίπεδα επιμόλυνσης στο συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο. Μια ημέρα πριν την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων, αυτά τοθετήθηκαν σε συγκέντρωση 7x10 4 κύτταρα/ml θρεπτικού υγρού DMEM με 10% FBS, έτσι ώστε την ημέρα της επιμόλυνσης να καταλαμβάνουν το 50-60% της επιφάνειας της οπής, σε τριβλίο 24 οπών. Την ημέρα της επιμόλυνσης τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με διάλυμα PBS και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 0.5 ml θρεπτικού υγρού OPTIMEM απουσία FBS. Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 C με 5% CO 2, όσο προετοιμάζεται το σύμπλοκο επιμόλυνσης (transfection complex). Αρχικά, φτιάχνεται το αντιδραστήριο επιμόλυνσης (transfection reagent), με την ανάμιξη του λιπιδίου με θρεπτικό υγρό απουσία ορού, σε αναλογία όγκου 1/12.5. Στη συνέχεια, αραιώνεται το DNA με το ειδικό διάλυμα της Roche (DNA dilution buffer) σε αναλογία 0.4 μg DNA/15 μl buffer και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 min. Ακολουθεί ήπια ανάδευση ίσου όγκου αντιδραστηρίου επιμόλυνσης και αραιωμένου DNA και επώαση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου προς σχηματισμό του συμπλόκου επιμόλυνσης. Με το πέρας των 5 min προστίθεται σε κάθε οπή 30 μl συμπλόκου. Ύστερα από 4 ώρες προστίθεται 0.5 ml θρεπτικού υγρού DMEM που περιέχει 20% FBS. Τα κύτταρα επωάζονται για 48 ώρες και έπειτα συλλέγονται. ~ 32 ~

Β.2.4. Παρασκευή εκχυλισμάτων από 293Τ και HeLa κύτταρα. Tα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αφαίρεση του θρεπτικού υγρού από τα τριβλία και αιώρηση των κυττάρων σε 1 ml διαλύματος PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, σε ddh 2 O), με τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter). Στο ίζημα των κυττάρων που λήφθηκε μετά από φυγοκέντρηση, προστέθηκε μία ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (1% Triton X-100, 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 150 mm NaCl και 1 mm PMSF). Συγκεκριμένα, για τη διατήρηση της αναλογίας του αριθμού των κυττάρων σε κάθε εκχύλισμα χρησιμοποιήθηκαν 200 μl διαλύματος λύσης για 10 7 κύτταρα. Τα αιωρημένα κύτταρα παρέμειναν για 10 λεπτά στον πάγο, στο διάλυμα λύσης και κατόπιν διαβιβάστηκαν μέσα από σύριγγα ινσουλίνης (1 ml), ώστε να σπάσει κατά το δυνατόν το μακρομοριακό DNA. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 12000 x g, για 15 λεπτά στους 4 C και συλλογή του υπερκείμενου. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυλάσσεται στους -70 C. Β.2.5. Έμμεσος ανοσοφθορισμός. Ο έμμεσος ανοσοφθορισμός έγινε σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα (Maison et al., 1993; Meier and Georgatos, 1994). Τα συγκεκριμένα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Ανατομίας και Ιστολογίας, της Κτηνιατρικής Σχολής, του Α.Π.Θ. Η πειραματική διαδικασία έχει ως εξής: HeLa κύτταρα τοποθετηθήκαν σε καλυπτρίδες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους. Ακολούθησαν δύο πλύσεις με PBS και μονιμοποίηση των κυττάρων με 1% φορμαλδεΰδη σε PBS, για 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η εξουδετέρωση των καταλοίπων της φορμαλδεΰδης έγινε με 100 mm Tris-HCl ph 7.5 σε PBS. Η διαπερατότητα των κυττάρων επιτεύχθηκε με επώαση με permeabilization buffer (150 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 2 mm MgCl 2, 0.2% Triton X- 100, 0.5% FSG και 0.5 mm PMSF), για 20 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η FSG (fish skin gelatin) χρησιμοποιήθηκε για να αποτραπεί η μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων. Ακολούθησε επώαση με το πρώτο αντίσωμα για 1 h σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, 3 διαδοχικές πλύσεις με blocking buffer (150 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 2 mm MgCl 2, 0.5% ~ 33 ~

FSG και 0.5 mm PMSF) και επώαση με το δεύτερο αντίσωμα για 45 min, επίσης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στην συνέχεια, τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη, για 10 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Χρώση του DNA έγινε με 1 mg/ml ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodide), αφού είχε προηγηθεί επώαση με 0.2 u/μl RNase. Οι καλυπτρίδες τελικά πλύθηκαν 3 φορές με PBS και τοποθετήθηκαν πάνω σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Για να προστατευθεί ο φθορισμός χρησιμοποιήθηκε ο παράγοντας Vectashield. Τέλος, η μελέτη των δειγμάτων, καθώς και η λήψη φωτογραφιών, έγινε σε συνεστιακό μικροσκόπιο Nikon. Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν αραιωμένα σε blocking buffer. Χρησιμοποιήθηκε ως πρώτο αντίσωμα anti-flag σε αραίωση 1:1500 ενώ ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε FITC-conjugated goat anti-mouse, σε αραίωση 1:400 (πράσινο χρώμα). Β.2.6. Καλλιέργειες βακτηριακών κυττάρων. Τα στελέχη E. Coli JM109, αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό SOC του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: Εκχύλισμα ζύμης Τρυπτόνη NaCl KCl Γλυκόζη MgSO4 0.5 % w/v 2.0 % w/v 0.01 M 2.5 mm 0.02 Μ 2 M Η ρύθμιση της οξύτητας γίνεται με τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση 1 atm, για 45 min. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, με έντονη ανάδευση, χρησιμοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. ~ 34 ~

Β.2.7. Κατεργασία βακτηριακών κυττάρων ώστε να γίνουν επιδεκτικά για μετασχηματισμό (Competent Cells). Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων ώστε να προσλάβουν τον πλασμιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιημένο το ξένο τμήμα DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασμένα με διαλύματα CaCl2 στους 4 οc και με ακόλουθη θέρμανση λίγων λεπτών μπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές (Sambrook et al., 1989). Πολλές παραλλαγές της βασικής τεχνικής έχουν περιγραφεί και μία από αυτές χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Σύμφωνα με αυτή, 2 ml θρεπτικού υλικού εμβολιάζονται με βακτηριακά κύτταρα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται για 12-16 ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση και στη συνέχεια 100 μl της καλλιέργειας μεταφέρονται σε 3 ml θρεπτικού μέσου, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται για 2-3 ώρες στους 37 C. Ένα ml από την νέα αυτή καλλιέργεια μεταφέρεται σε 50 ml θρεπτικού υλικού και ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, έως ότου η οπτική απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει την τιμή 0.35-0.4. Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 10 λεπτά στους 4 C και στη συνέχεια αιωρούνται σε 25 ml (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας) ρυθμιστικού διαλύματος, που αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaCl2, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικό κάλιο ph 7.5. Τα κύτταρα παραμένουν στον πάγο για 10 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 3000 x g. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 2 ml διαλύματος που αποτελείται από 10 mm MOPS, 75 mm CaCl2, 10 mm KCl και 20% γλυκερόλη (1/25 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρημα που προκύπτει μοιράζεται σε κλάσματα των 200 μl και εμβαπτίζεται σε λουτρό που αποτελείται από ξηρό πάγο/αιθανόλη για μικρό χρονικό διάστημα. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα. ~ 35 ~

Β.2.8. Μετασχηματισμός κυττάρων E. coli (Transformation). Ο μετασχηματισμός επιτυγχάνεται με την προσθήκη στο αιώρημα των επιδεκτικών βακτηρίων (200 μl) λίγων μl από το πλασμιδιακό DNA που θέλουμε να εισάγουμε και παραμονή των κυττάρων στον πάγο για 30 min. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υπόκεινται σε θερμικό σοκ για 2 min στους 42 C. Ακολουθεί η προσθήκη 500 μl υγρού θρεπτικού υλικού και επώαση στους 37 C για 20 min. Μετά από φυγοκέντρηση για 1 min στα 5000 x g, αφαιρείται το μεγαλύτερο μέρος του υπερκειμένου και γίνεται αιώρηση του ιζήματος των κυττάρων με το υπερκείμενο που εναπομένει. Τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με θρεπτικό υλικό LB-άγαρ, το οποίο περιέχει και το αντίστοιχο αντιβιοτικό (αυτό στο οποίο προσδίδει αντίσταση το πλασμιδιακό DNA που έχουμε εισαγάγει). Με τον τρόπο αυτό γίνεται η επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων έναντι των βακτηρίων που δεν έχουν προσλάβει το πλασμίδιο (Sambrook et al., 1989). Τα τριβλία επωάζονται στους 37 C για 12-16 ώρες, έτσι ώστε να πολλαπλασιαστούν τα μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τρυβλίων συλλέγονται η καθεμία χωριστά και αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό μέσο LB/αντιβιοτικού, ώστε είτε να απομονωθεί το πλασμιδιακό DNA είτε να γίνει έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Β.2.9. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA με αλκαλική λύση. Μία αποικία των μετασχηματισμένων βακτηρίων χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό 3 ml θρεπτικού υλικού παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού και αναπτύσσεται για περίπου 12 ώρες στους 37 ο C. Στη συνέχεια, 1.5 ml της καλλιέργειας μεταφέρεται σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου και φυγοκεντρείται για 1 λεπτό. Στο ίζημα αρχικά προστίθενται 50 μl διαλύματος GTE (50 mm Tris-ΗCl ph 8.0, 10 mm EDTA, 20% γλυκόζη) και τα κύτταρα αναδεύονται έντονα ώστε να αιωρηθεί πλήρως το ίζημα. Στην συνέχεια, προστίθεται διπλάσιος όγκος διαλύματος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το μίγμα ομογενοποιείται με απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 80 μl ψυχρού διαλύματος 3 Μ οξικού ~ 36 ~

καλίου και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά σε 12000 x g. Στο υπερκείμενο που παραλαμβάνεται γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 0.7 όγκου ισοπροπανόλης και παραμονή στους -20 C για 30 λεπτά. Το ίζημα που προκύπτει μετά από φυγοκέντρηση σε 12000 x g για 5 λεπτά, αιωρείται σε 100 μl διαλύματος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) παρουσία RNase A (20 μg/ml) και το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 20 λεπτά. Το DNA εκχυλίζεται με την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορμίου. Στην υδατική στοιβάδα που απομονώνεται μετά από φυγοκέντρηση 5 λεπτών σε 12000 x g, γίνεται κατακρήμνιση του DNA με την προσθήκη 2.5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αμμωνίου. Το DNA διαλύεται τελικά σε 20 μl αποστειρωμένου ddh 2 O και φυλάσσεται στους -20 C μέχρι τη χρησιμοποίηση του. Β.2.10. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη με ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκειμένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς. Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στη χρήση μιας θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης, η οποία χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως εκμαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου. Προκειμένου να δράσει η πολυμεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία και καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας που επιθυμούμε να πολλαπλασιάσουμε. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο μόριο του DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση σε 90 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δημιουργούνται δυο μονόκλωνες αλυσίδες και το τμήμα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, μπορεί πλέον να χρησιμοποιηθεί για τα επόμενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταματούν όλες οι ~ 37 ~

ενζυμικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγμα, η επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας. Στάδιο 2 ο : Υβριδισμός Η θερμοκρασία στο στάδιο αυτό μειώνεται στους 50-75 ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται με το εκμαγείο συμπληρωματικά, με δεσμούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερμοκρασίας υβριδισμού είναι πολύ σημαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το μήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγμένη θερμοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να μην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 ο : Πολυμερισμός Στο στάδιο αυτό η DNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την μονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ ομάδα, συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέμενες αλυσίδες επιμηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυμητό τμήμα του DNA. Η διάρκεια του πολυμερισμού εξαρτάται από το μήκος της πολλαπλασιαζόμενης ακολουθίας. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται είναι θερμοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερμοκρασίες των προηγούμενων σταδίων. Ο κύκλος αυτός επαναλαμβάνεται 20-30 φορές και παράγονται 2n μόρια DNA, όπου n είναι ο αριθμός των διεξαγόμενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το μίγμα της αντίδρασης παραμένει στους 72 C για 5 min, ώστε να συνεχιστεί ο πολυμερισμός (Innis et al., 1990). Το τέλος της αντίδρασης πραγματοποιείται με την παραμονή του μίγματος της PCR στους 4 C. Τα συστατικά του μίγματος συνολικού όγκου 50 μl της αντίδρασης PCR φαίνονται στον πίνακα B1. Το 10x ρυθμιστικό διάλυμα της Taq DNA πολυμεράσης αποτελείται από 20 mm Tris-Cl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 2 mm MgSO 4 και 0.1% Triton-X-100. ~ 38 ~

DNA εκμαγείο 0.1 μg Εκκινητής νοηματικός (sense) (0,13 μg/ μl) 3 μl Εκκινητής αντινοηματικός (antisense) (0,13 μg/ μl) 3 μl Μίγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 1.25 mm 8 μl Ρυθμιστικό διάλυμα Taq πολυμεράσης 10 x 5 μl Taq DNA Πολυμεράση (5 U/μl) 1 μl ddh 2 0 Έως 50 Πίνακας Β1. Συστατικά του μίγματος αντίδρασης PCR, συνολικού όγκου 50 μl. B.2.11. Παρασκευή του μεταλλάγματος της SRPK1 από το οποίο λείπει η συνδετική περιοχή (SRPK1 Δspacer). Για να παρασκευασθεί η SRPK1 Δspacer ενώθηκαν τα cdna που κωδικοποιούν το N- και το C-τελικό άκρο της SRPK1. Για την ενίσχυση του N- τελικού άκρου χρησιμοποιήθηκε ως νοηματικός εκκινητής το ολιγονουκλεοτίδιο 5 -GCGTGGATCCATGGAGCGAAAGTGCTTGCG-3 (υπογραμμισμένη είναι η αλληλουχία την οποία αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση περιορισμού BamHI), και ως αντινοηματικός εκκινητής το ολιγονουκλεοτίδιο 5 -TCCCCCGGGAGCAGTACTGACTGCAGATCC-3 (υπογραμμισμένη η θέση κοπής από την ενδονουκλεάση περιορισμού SmaI). Για την ενίσχυση του C-τελικού άκρου χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές: νοηματικός: 5 - TCCCCCGGGAATTTTCTTGTTATTCCCCTTGAG-3, αντινοηματικός: 5 - CCGAGGAATTCGGAGTTAAGCCAAGGGTGCCG-3. Οι υπογραμμισμένες αλληλουχίες δηλώνουν τις θέσεις κοπής από το ένζυμο SmaI στην περίπτωση του νοηματικού κλώνου και από το ένζυμο EcoRI στην περίπτωση του αντινοηματικού. Ακολούθησε πέψη των προϊόντων της κάθε αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) με τα ένζυμα BamHI/ SmaI και SmaI/ EcoRI αντίστοιχα και καθαρισμός τους. Τέλος, τα δύο αυτά τμήματα της SRPK1 κλωνοποιήθηκαν σε θέσεις BamHI και EcoRI στον πλασμιδιακό φορέα pcmv- 2-FLAG. ~ 39 ~

Β.2.12. Σημειακές μεταλλάξεις των κυστεϊνών 356 και 455 της SRPK1 σε γλυκίνη. H μέθοδος που ακολουθήθηκε αποτελεί ένα συνδυασμό των in vitro mutagenesis kit QuickChange Lightning της εταιρείας Stratagene και Altered Sites II της εταιρείας Promega. Αρχικά έγινε κλωνοποίηση του τμήματος του γονιδίου της SRPK1 (954 bp) που περιέχεται ανάμεσα στα νουκλεοτίδια 832 ως 1786 - και το οποίο περιέχει και τις κυστεΐνες που πρόκειται να μεταλλαχθούν - στον πλασμιδιακό φορέα pbluescript SK +. Το τμήμα αυτό απομονώθηκε από το γονίδιο της SRPK1 μετά από κοπή με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού SacI και XhoI. Η εισαγωγή του στον pbluescript SK + πραγματοποιήθηκε μετά από αντίστοιχη κοπή του πλασμιδιακού φορέα με τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισμού. Το ανασυνδυασμένο αυτό πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την εισαγωγή των μεταλλάξεων των κυστεϊνών 356 και 455 σε γλυκίνη. Συγκεκριμένα σχεδιάστηκαν δύο διαφορετικά σετ εκκινητών (ένας νοηματικός και ένας αντινοηματικός) για κάθε μετάλλαξη: Cys 356 Gly νοηματικός: 5 -GGTGCAGCAGAAATTAATGGCAATGGAGTGATTGAAG-3 αντινοηματικός: 5 -CTTCAATCACTCCATTGCCATTAATTTCTGCTGCACC-3 Cys 455 Gly νοηματικός: 5 -ATTCGGGCAGAGATACCCGGTGAAGATGAACAAGAGC-3 αντινοηματικός: 5 -GCTCTTGTTCATCTTCACCGGGTATCTCTGCCCGAAT-3 Ακολούθησε PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του mutagenesis kit της εταιρείας Stratagene. Πραγματοποιήθηκαν συνολικά 20 κύκλοι για κάθε μετάλλαξη. Οι δέκα πρώτοι έγιναν στους 61 ο C (θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών) ενώ οι υπόλοιποι δέκα στους 63 ο C. ~ 40 ~

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε πέψη των προϊόντων της PCR με 2 μl DpnI, σύμφωνα με τις οδηγίες του kit της Stratagene για 1 h στους 37 ο C. Κατά τη διάρκεια της πέψης αυτής η ενδονουκλεάση DpnI διασπά όλα τα μεθυλιωμένα και ημιμεθυλιωμένα παράγωγα του αρχικού DNA και αφήνει μόνο τα νέα μεταλλαγμένα προϊόντα της PCR (τα οποία δεν φέρουν μεθυλιώσεις). Ακολούθησε κατακρήμνιση και επαναδιαλυτοποίηση των προϊόντων της PCR σε 20 μl Η 2 Ο. Το DNA αυτό χρησιμοποιήθηκε για μετασχηματισμό των ES 1301 mut S βακτηριακών κυττάρων της εταιρείας Promega από τα οποία λείπουν τα γονιδιακά εκείνα στοιχεία που προκαλούν την in vivo επιδιόρθωση των μεταλλάξεων. Από τις αποικίες των βακτηριακών κυττάρων που εμφανίστηκαν στο στάδιο αυτό, απομονώθηκε DNA για κάθε ένα μετάλλαγμα και ακολούθησε και πάλι μετασχηματισμός των JM 109 βακτηριακών κυττάρων της εταιρείας Promega. Από το τελικό DNA που απομονώθηκε από τα JM 109 κύτταρα έγινε επιβεβαίωση της εισαγωγής των μεταλλάξων μετά από αλληλουχιση των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων στο Εργαστήριο Μικροχημείας του Ιδρύματος Τεχνολογίας και Έρευνας του Ηρακλείου. Σχήμα Β.2. Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων PCMV-FLAG-SRPK1 που φέρουν τις μεταλλάξεις Cys 356 Gly, Cys 455 Gly και Cys 356/455 Gly. Το τμήμα του γονιδίου της SRPK1 των 954 bp με ~ 41 ~

προεξέχοντα άκρα SacI και XhoI είναι αυτό περιείχε κάθε φορά την αντίστοιχη μετάλλαξη της κυστεΐνης σε γλυκίνη. Στη συνέχεια ακολούθησε αντικατάσταση του μη μεταλλαγμένου τμήματος των 954 bp της SRPK1 με τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα τμήματα DNA ακολουθώντας περιληπτικά την παρακάτω πορεία: Αρχικά έγινε πέψη του απομονωμένου συνολικού cdna της SRPK1 (1966 bp, κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα palter σε θέσεις EcoRI και BamHI) με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού SacI και XhoI και απομονώθηκαν τα τμήματα EcoRI - SacI μεγέθους 726 bp και XhoI - BamHI μεγέθους 286 bp. Το τελικό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο για κάθε μετάλλαξη δημιουργήθηκε μετά από τετραπλή αντίδραση λιγάσης που περιλάμβανε τον πλασμιδιακό φορέα pcmv-flag που έφερε ειδικά προεξέχοντα άκρα που προέκυψαν μετά από κοπή με τις ενδονουκλεάσες περιορισμού EcoRI στο 5 άκρο και BamHI στο 3 άκρο και τα τρία τμήματα του γονιδίου της SRPK1 σύμφωνα με το σχήμα Β.2. Τα cdna που κωδικοποιούν τα μεταλλάγματα της SRPK1, SRPK1356G και SRPK1455G κόπηκαν στη συνέχεια από τον πλασμιδικό φορέα pcmv-flag και κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pgex-3x, προκειμένου να εκφραστούν οι αντίστοιχες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σε E. coli. Β.2.13. Δημιουργία διπλής μετάλλαξης των κυστεϊνών 356 και 455 της SRPK1 σε γλυκίνη. Για τη δημιουργία του διπλού μεταλλάγματος 356/455 χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο το τμήμα του γονιδίου της SRPK1 (954 bp) που περιέχεται ανάμεσα στα νουκλεοτίδια 832 ως 1786 και στο οποίο έχει ήδη γίνει σημειακή μετάλλαξη της κυστεΐνης στη θέση 356 σε γλυκίνη. Ως εκκινητές χρησιμοποιήθηκε το σετ που σχεδιάστηκε για σημειακή μετάλλαξη στη θέση 455. Η συνέχεια της διαδικασίας είναι η όμοια με αυτή που περιγράφηκε στην προηγούμενη παράγραφο. ~ 42 ~

B.2.14. Παρασκευή του αμινοτελικού τμήματος του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) που περιέχεται ανάμεσα στα αμινοξέα 62-92. Το cdna που αντιστοιχεί στο τμήμα του LBR που περιέχεται ανάμεσα στα αμινοξέα 62-92 ενισχύθηκε με PCR από το πλασμίδιο pgex-2t-lbrnt (που κωδικοποιεί ολόκληρη την αμινοτελική περιοχή του LBR αα 1-205) με τη χρήση των κατάλληλων εκκινητών. Ως νοηματικός εκκινητής χρησιμοποιήθηκε το ολιγονουκλεοτίδιο 5 -CGCGGATCCCAGAGGAAAAGCCAGTCT-3 (υπογραμμισμένη είναι η αλληλουχία την οποία αναγνωρίζει η ενδονουκλεάση περιορισμού BamHI) και ως αντινοηματικός το ολιγονουκλεοτίδιο 5 - GCGGAATTCTCTGCCTTTTGCTGGCCGACC-3 (υπογραμμισμένη η θέση αναγνώρισης της ενδονουκλεάσης περιορισμού EcoRI). Ακολούθησε πέψη του προϊόντος της PCR με τα ένζυμα BamHI και EcoRI, καθαρισμός και κλωνοποίηση στις αντίστοιχες θέσεις του βακτηριακού φορέα έκφρασης pgex-2t. Β.2.15. Έκφραση και καθαρισμός πρωτεϊνών σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST). Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα με υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισμό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασμιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο μόριο τους κατάλληλους προαγωγούς που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης μ αυτήν. Ο καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται με στήλη αγχιστείας που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωμένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισμός της πρωτεΐνης από το εκχύλισμα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST με τη γλουταθειόνη, με αποτέλεσμα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται με την προσθήκη διαλύματος γλουταθειόνης σε περίσσεια. Η διαδικασία αυτή έκλουσης εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτημα να γίνεται σε πολύ ήπιες ~ 43 ~

συνθήκες χωρίς να υπάρχει κίνδυνος αλλαγών στη δομή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης. Τα βακτηριακά κύτταρα (XL1/B- BL21(DE3)-TOP-10F) που έχουν μεταμορφωθεί με τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα απλώνονται σε τριβλία με θρεπτικό υλικό L.B./άγαρ που περιέχει 100 μg/ml αμπικιλλίνη και επωάζονται για 16 h στους 37 C. Με επιλογή μιας αποικίας από το τριβλίο, εμβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού L.B. (100 μg/ml αμπικιλλίνη) και το αιώρημα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 h στους 37 C. Από την καλλιέργεια που προκύπτει αφαιρούνται 10 ml με τα οποία εμβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού L.B. που περιέχουν 100 μg/ml αμπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C μέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήματος των κυττάρων γίνει ίση με Α 590 = 0.6-0.7. Τη δεδομένη χρονική στιγμή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG που ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση με τις άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες, καθώς και ελάττωση της θερμοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις πρωτεολυτικών ενζύμων. Η επώαση συνεχίζεται 3 h και τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στις 4000 στροφές για 15 min. Μετά την απόχυση του υπερκειμένου το ίζημα των κυττάρων αιωρείται σε 8 ml διαλύματος PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na2HPO4, 0.2 gr/l KH2PO4, 1% Triton X-100, 0.1% β-μερκαπτοαιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρημα σε υπέρηχους (UP5OH sonicator) για 5 χρονικά διαστήματα των 20 δευτερολέπτων, μεσολαβώντας κάθε φορά, μία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρμανση. Το αιώρημα φυγοκεντρείται για 20 min στα 8500 x g και λαμβάνεται το υπερκείμενο πρωτεϊνικό εκχύλισμα. Το εκχύλισμα αυτό αναμιγνύεται με το αιώρημα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 min σε θερμοκρασία 4 C, ώστε να δεσμευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 min στα 3000 x g και αφού απομακρυνθεί το υπερκείμενο, η στήλη πλένεται 3 φορές με διάλυμα PBST για 10 min στους 4 C υπό ανάδευση. Στους κόκκους της στήλης που λαμβάνονται μετά από φυγοκέντρηση στα 3000 g για 2 min, γίνονται 2 συνεχόμενες εκλούσεις των 5 min η κάθε μία με διάλυμα που περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris- Cl ph 8.0. Τα εκλούσματα που περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης ~ 44 ~

λαμβάνονται με φυγοκέντρηση στα 3000 g για 2 min και στη συνέχεια φυλάσσονται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης - σεφαρόζης μετά από κάθε χρήση αναγεννάται με τρείς διαδοχικές πλύσεις (30 min η κάθε πλύση) σε όξινο (0.1 M CH3COONa, 0.5 M NaCl, ph 4.5) και βασικό (0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-Cl, ph 8.5) διάλυμα, στους 4 C. Στη συνέχεια η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυμα PBST. Β.2.16. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου (PAGE). Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ενός δείγματος πραγματοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισμένα μόρια, κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πηκτώματος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα εξαρτάται από την διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύμφωνα με την εξίσωση: v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από την μάζα και το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηματισμός των πηκτών πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στον πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του Ν,Ν μεθυλενοδισακρυλαμιδίου ή bis-ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO- CH-CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα που διαθέτει πόρους που το μέγεθος τους εξαρτάται από το βαθμό πολυμερισμού ανάλογα και με την συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη του υπερθειϊκού αμμωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8 για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για την διάδοση του. Το σχήμα των πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα με τη συσκευή στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στην συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ~ 45 ~

ασυνεχή χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώματα, το πήκτωμα επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για την συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωμα διαχωρισμού που είναι υπεύθυνο για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώματα είναι διαφορετικά ως προς το ph και την σύσταση τους. Επίσης το ρυθμιστικό διάλυμα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούμενα (Andrews, 1981). Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου μπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS. Απουσία τέτοιων παραγόντων (μη μετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαμορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαμβάνουν τυχαία διαμόρφωση. Β.2.17. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες (SDS-PAGE). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιμοποιείται ως αποδιατακτικό μέσο το μετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσει τις πρωτεΐνες δεσμεύεται πάνω σ αυτές μέσω υδρόφοβων δεσμών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισμένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναμικές ιδιότητες είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι μοναδική συνάρτηση του μοριακού βάρους (Laemmli, 1970). Το σύστημα που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων κατά την διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωμα διαχωρισμού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωμα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν ~ 46 ~

εισχωρήσουν στο πήκτωμα διαχωρισμού και οι θέσεις εισαγωγής του δείγματος δημιουργούνται με την βοήθεια πλαστικής οδοντωτής μήτρας η οποία αφαιρείται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιμέρους στοιχείων του συστήματος είναι οι εξής: Διάλυμα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris ph 8.9 0.19 M γλυκίνη 0.1% SDS Πήκτωμα επιστοίβαξης: για τον πολυμερισμό 5% ακρυλαμίδιο 0.25% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS 0.125 Μ Tris-Cl ph 6.8 0.08% APS 0.04% TEMED Πήκτωμα διαχωρισμού: για τον πολυμερισμό 12% ακρυλαμίδιο 0.62% bis-ακρυλαμίδιο 0.5% SDS 0.375 Μ Tris-Cl ph 8.9 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγματα πριν εισαχθούν στο πήκτωμα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων το οποίο αποτελείται από: 0.0625 Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανού της βρωμοφαινόλης Το παραπάνω διάλυμα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 μl του διαλύματος αυτού σε 25 μl του μίγματος επώασης. Τα δείγματα θερμαίνονται για 3 λεπτά στους 100 C, ώστε ~ 47 ~

οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δημιουργία συμπλόκων SDS-πρωτεΐνης. Η β-μερκαπτοαιθανόλη που χρησιμοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσμούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υπομονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος 25 ma έως τη στιγμή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. Β.2.18. Βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250. Για να βαφούν οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα που περιέχει 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% μεθανόλη, όπου και ανακινείται για διάστημα 1 ώρας. Στο διάλυμα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωματισμός της πηκτής γίνεται με ανακίνηση σε διάλυμα 10% οξικό οξύ, 10% μεθανόλη. Β.2.19. Αυτοραδιογραφία. Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεμπόμενη ακτινοβολία του ισοτόπου που χρησιμοποιείται για την επισήμανση των διάφορων μορίων. Στην περίπτωση των πηκτωμάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωμα ανακινείται για 30 min σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3MM (Whatman International Ltd. Kent, England) υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάμους. Μία πρώτη εκτίμηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται μας δίνει η μέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger series 900 (Mini Instruments, Essex, UK). Η εμφάνιση και στερέωση του film γίνεται με εμβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα. ~ 48 ~

Β.2.20. Ηλεκτρομεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή σε μεμβράνη (Western blot). Η ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη μορφή συμπλόκου με το SDS και είναι αρνητικά φορτισμένες, από την πηκτή προς την μεμβράνη λόγω της εφαρμογής διαφοράς δυναμικού και στην καθήλωσή τους στο πλέγμα της μεμβράνης (Gershoni and Palade, 1983). Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η μεμβράνη και η πηκτή μεταφέρονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (Transfer Buffer) του οποίου η σύνθεση εξαρτάται από τη συσκευή και τις συνθήκες της ηλεκτρομεταφοράς. Η τοποθέτηση τους στην συσκευή ηλεκτρομεταφοράς γίνεται ανάμεσα σε έξι χαρτιά Whatman 3MM με την μεμβράνη προσανατολισμένη στον θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή μεταξύ της πηκτής και της μεμβράνης πρέπει να είναι άμεση και χωρίς την παρεμβολή φυσαλίδων που παρεμποδίζουν την διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος. Η συσκευή που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Semi-Dry Blotter της εταιρίας Scie-Plas. Το Transfer Buffer αποτελείται από 12.5 mm Tris-Βορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT. Η μεταφορά γίνεται για 1 ώρα κάτω από σταθερή ένταση ρεύματος (55-70 ma, ανάλογα με το μέγεθος της πηκτής). Β.2.21. Ανοσοανίχνευση. Η ανοσοανίχνευση είναι μια τεχνική που επιτρέπει τον εντοπισμό μιας καθηλωμένης σε μεμβράνη πρωτεΐνης με την βοήθεια αντισώματος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωμένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει με το αντίσωμα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται με τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώματος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσμευθεί με τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο μόριο του συζευγμένο κάποιο ένζυμο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας με εξωγενώς προστιθέμενο υπόστρωμα δίνει χαρακτηριστική χρωμοαντίδραση, καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου (Harlow and Lane, 1988). ~ 49 ~

Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρμόσθηκε για την εντόπιση της υπερεκφρασμένης FLAG-SRPK1 σε εκχυλίσματα HeLa κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με pflag-cmv-2-srpk1, καθώς και της υπερεκφρασμένης ΗΑ-Ub που προσδένεται στην SRPK1 ή τα μεταλλάγματά της. Η ανίχνευση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της στα διάφορα εκχυλίσματα έγινε με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο επίτοπο FLAG, ενώ η ανίχνευση της Ub έγινε με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στην ΗΑ (αιμαγλουτινίνη). Η διαδικασία που εφαρμόζεται έχει ως εξής: Αρχικά η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά το τέλος της ηλεκτρομεταφοράς εμβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 ώρα σε διάλυμα κορεσμού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), ώστε να κορεστεί από την ζελατίνη και να αποφύγουμε τις μη εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις της μεμβράνης με το αντίσωμα. Κατόπιν η μεμβράνη επωάζεται με το αντίστοιχο αντίσωμα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύματος κορεσμού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C. Η αραίωση στην οποία χρησιμοποιείται το μονοκλωνικό anti-flag (M5) είναι 1:15000. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 λεπτών στη μεμβράνη με διάλυμα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της μεμβράνης για 1 ώρα, υπό ανάδευση, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με το δεύτερο αντίσωμα (αραίωση 1:2000) σε διάλυμα κορεσμού. Αφού γίνουν δύο πλύσεις της μεμβράνης των 10 λεπτών με PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωμοαντίδραση με την αλκαλική φωσφατάση, έως ότου εμφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωμοαντίδραση επιτυγχάνεται με την προσθήκη 30 μl BCIP (Bromo-chloroindolyl phosphate) και 30 μl NBT (Nitro blue tetrazolium) σε 10 ml διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-HCl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η μεμβράνη αφού πλυθεί 2 φορές με ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο μέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3. Β.2.22. Ανοσοκατακρήμνιση. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης Α (Protein A) του μικροοργανισμού staphylococcus aureus να δεσμεύεται στις ~ 50 ~

ανοσοσφαιρίνες. Χρησιμοποιώντας την ιδιότητα αυτή, τα αντισώματα που έχουν δεσμεύσει το αντιγόνο τους από ένα πρωτεϊνικό εκχύλισμα δεσμεύονται στη συνέχεια στην πρωτεΐνη Α η οποία είναι καθηλωμένη σε ένα αδρανές υλικό. Σύμφωνα με την τεχνική, η επώαση πρωτεϊνικού εκχυλίσματος με συγκεκριμένο αντίσωμα σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει σαν αποτέλεσμα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωμα και την συμπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του παραπάνω μίγματος σε στήλη σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, εξισορροπημένης στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, θα έχει σαν αποτέλεσμα την δέσμευση του συμπλόκου αντισώματος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α και την παραλαβή του από το εκχύλισμα. Έτσι με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνουμε τον εξειδικευμένο διαχωρισμό/καθαρισμό της φυσιολογικής μορφής μιας πρωτεΐνης μέσα από ένα μίγμα πρωτεϊνών. Κατά την διάρκεια της εργασίας χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-flag (M5) για την ανοσοκατακρήμνιση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της. Τα σφαιρίδια (25 μl) εξισορροπούνται με 3 πλύσεις των 10 λεπτών η καθεμία, σε ρυθμιστικό διάλυμα lysis buffer (50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 1% Triton X-100, 0.1 M NaCl) και παραλαμβάνονται μετά από σύντομη φυγοκέντρηση, με απομάκρυνση του ρυθμιστικού διαλύματος. Στη συνέχεια επωάζονται με 1 μg anti-flag, παρουσία 750 μl lysis buffer, υπό ανακίνηση για χρονικό διάστημα 3 ωρών στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν το αντίσωμα και η πρωτεΐνη Α. Μετά το πέρας της διαδικασίας, 10 μl από τα κυτταρικά εκχυλίσματα, παρουσία 750 μl lysis buffer, προστίθεται στους σωλήνες με την καθηλωμένη στα σφαιρίδια πρωτείνη-α και τα αντίστοιχα αντισώματα. Η επώαση αυτή διαρκεί 12-16 ώρες και ακολουθούν 3 πλύσεις των 10 λεπτών με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα, ώστε να αποφευχθούν οι τυχόν ασθενείς αλληλεπιδράσεις με πρωτείνες των εκχυλισμάτων. Στα σφαιρίδια με τις ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες γίνονται πειράματα ελέγχου της δραστικότητας της κινάσης με την προσθήκη του υποστρώματος της και ραδιενεργού [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Πριν τα δείγματα αναλυθούν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου προστίθεται διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και ακολούθως θερμαίνονται στους 100 C για 3 λεπτά ώστε να διασπαστούν τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος. ~ 51 ~

Β.2.23. Ανίχνευση δράσης SRPK1 με in vitro φωσφορυλίωση. Η ανίχνευση δραστικότητας SRPK1 στηρίζεται στην επώαση ανοσοκατακρημνισμένης SRPK1, καθώς και των μεταλλαγμάτων της, με ένα κατάλληλο υπόστρωμα. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα το τμήμα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) που περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 62 και 92, εκφρασμένο, ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST, στα Ε. coli (GST-LBRRS). Το τμήμα αυτό περιέχει στο μόριο του έξι επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια, οι σερίνες των οποίων φωσφορυλιώνονται από τις SRPK1. Ως δότης φωσφορικών χρησιμοποιήθηκε το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Το μίγμα επώασης επίσης περιλαμβάνει 12.5 mm Hepes ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 0.6 μci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ και 25 μμ ψυχρό ΑΤΡ. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 μl και ρυθμίζεται με την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη 2 Ο. Τα δείγματα επωάζονται για 30 min σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 50 mm DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων που χρησιμοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορούνται. Ακολουθεί βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R- 250 και αποχρωματισμός της. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής, αυτοραδιογραφία και κοπή των ζωνών της πηκτής που αντιστοιχούν στο μοριακό βάρος του υποστρώματος σε συμφωνία και με τις ζώνες που εμφανίζονται στο film της αυτοραδιογραφίας. Ακολουθεί η μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή 1500 TR (Packard) κατά Cherenkov. Κατ αυτό τον τρόπο ανιχνεύεται η επιθυμητή δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών καθώς και η έκταση της ενσωμάτωσης της ραδιενέργειας από το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ στα αντίστοιχα υποστρώματα. ~ 52 ~

Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Γ.1. Έλεγχος κινητικότητας της SRPK1 μετά από SDS-ηλεκτροφόρηση σε εκχυλίσματα από διάφορες κυτταρικές σειρές. Από παλιότερα αποτελέσματα της προπτυχιακής διπλωματικής μου εργασίας προέκυψαν ενδείξεις για την ύπαρξη δισουλφιδικών δεσμών στο μόριο της SRPK1, η αναγωγή των οποίων προκαλούσε αλλαγή της κινητικότητας της κινάσης σε SDS-PAGE. Για να επαληθεύσουμε αυτά τα αποτελέσματα και να διαπιστωθεί αν αναπτύσσεται δισουλφιδικός δεσμός στο μόριο της SRPK1 σε διάφορους τύπους κυττάρων, έγινε έλεγχος της κινητικότητας της κατά την ηλεκτροφόρηση εκχυλισμάτων από διάφορες κυτταρικές σειρές απουσία και παρουσία 140 mm DTT, το οποίο όπως είναι γνωστό ανάγει τους δισουλφιδικούς δεσμούς. Παρασκευάστηκαν εκχυλίσματα από διάφορες κυτταρικές σειρές, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.4. Σε κάθε περίπτωση ηλεκτροφορήθηκαν δείγματα που περιείχαν 100 μg πρωτεϊνικού εκχυλίσματος (25 μl), 6 μl loading buffer και 5 μl DTT (όπου απαιτείται) σε τελικό όγκο δείγματος 36 μl. Μετά την ηλεκτροφόρηση ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και Western-Blot. Η ανίχνευση της SRPK1 έγινε με κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα. Σχήμα Γ.1. Ανοσοανίχευση της SRPK1 από εκχυλίσματα διαφόρων ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών. Η ηλεκτροφόρηση των εκχυλισμάτων έγινε είτε απουσία, είτε παρουσία 140 mm DTT. Η ανίχνευση της SRPK1 έγινε με κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.1. υπάρχει μια εμφανής αλλαγή στην κινητικότητα της SRPK1 παρουσία και απουσία DTT, σε όλους τους ~ 53 ~

κυτταρικούς τύπους που ελέγχθηκαν. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει την ύπαρξη δισουλφιδικού δεσμού, ο οποίος με την επίδραση του DTT ανάγεται και έτσι «ανοίγει» η δομή της πρωτεΐνης και μετακινείται πιο αργά κατά την ηλεκτροφόρηση. Γ.2. Πιθανή δομή του μορίου της SRPK1. Μελέτες μοριακής δυναμικής στο μόριο της SRPK1, που έγιναν από το Δρ. Γιώργο Παπαδόπουλο έδειξαν ότι υπάρχει η πιθανότητα δημιουργίας δισουλφιδικού δεσμού στην ενδιάμεση συνδετική αλληλουχία (spacer domain) της κινάσης, με πιθανότερες να εμπλέκονται σε δισουλφιδικό δεσμό τις κυστεΐνες 356 και 455, όπως φαίνεται και στο σχήμα Γ.2. Σχήμα Γ.2. Πιθανή δομή του μορίου της SRPK1 που προκύπτει από μελέτες μοριακής δυναμικής. Στο σχήμα φαίνεται ο πιθανός δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ των Cys356 και Cys455, καθώς και οι υπόλοιπες κυστεΐνες της ενδιάμεσης συνδετικής αλληλουχίας της κινάσης. ~ 54 ~

Γ.3. Έλεγχος κινητικότητας της πρωτεΐνης SRPK1 Δspacer σε SDS ηλεκτροφόρηση απουσία και παρουσία DTT. Θέλοντας να επιβεβαιώσουμε τις μελέτες μοριακής δυναμικής αρχικά κατασκευαάσαμε ένα μετάλλαγμα της SRPK1 από το οποίο είχε αφαιρεθεί η ενδιάμεση συνδετική αλληλουχία (SRPK1 Δspacer, βλ. παράγραφο Β.2.11.) και έγινε έλεγχος της κινητικότητας του μετά από ηλεκτροφόρηση εκχυλισμάτων από HeLa κύτταρα απουσία και παρουσία 140 mm DTT. Για το σκοπό αυτό HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον αντίστοιχο πλασμιδιακό φορέα και παρασκευάσθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.4. Σχήμα Γ.3. Ανοσοανίχευση της SRPK1 Δspacer από εκχύλισματα HeLa κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με τον αντίστοιχο πλασμιδιακό φορέα. Η ηλεκτροφόρηση των εκχυλισμάτων έγινε είτε απουσία, είτε παρουσία 140 mm DTT. Η ανίχνευση της SRPK1 Δspacer έγινε με ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο FLAG. Όπως παρατηρείται στο σχήμα Γ.3. δεν υπάρχει αλλαγή στην κινητικότητα του μεταλλάγματος SRPK1 Δspacer απουσία και παρουσία DTT. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι πράγματι ο δισουλφιδικός δεσμός σχηματίζεται ανάμεσα σε κυστεΐνες που βρίσκονται στη συνδετική περιοχή της SRPK1 καθώς όταν αυτή αφαιρεθεί, η προσθήκη αναγωγικού δεν έχει κάποια επίδραση στην κινητικότητα της πρωτεΐνης. ~ 55 ~

Γ.4. Έκφραση των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G σε βακτηριακά κύτταρα E. coli και σε HeLα κύτταρα. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια επιβεβαίωσης της ύπαρξης δισουλφιδικού δεσμού ανάμεσα στις κυστεΐνες 356 και 455 της ενδιάμεσης συνδετικής αλληλουχίας της SRPK1, όπως προέβλεψαν οι μελέτες μοριακής δυναμικής. Για το σκοπό αυτό έγιναν σημειακές μεταλλάξεις των κυστεϊνών 356 και 455 της SRPK1 προς γλυκίνες (είτε ξεχωριστά είτε και οι δύο μαζί) όπως περιγράφεται στις παραγράφους Β.2.12. και Β.2.13. Για την έκφραση των τριών μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε βακτηριακά κύτταρα, ως πρωτεΐνες σύντηξης με την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pgex-3x (παράγραφος Β.2.12.) και o καθαρισμός των τριών ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών έγινε σύμφωνα με όσα αναφέρθηκαν στην παράγραφο Β.2.15. Για την έκφραση των τριών μεταλλαγμάτων της SRPK1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας έκφρασης pflag-cmv-2. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια εισάγονται σε HeLa κύτταρα με παροδική επιμόλυνση με τη χρήση του kit X-tremeGENE Q2 Reagen (όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.3) και στη συνέχεια παρασκευάστηκαν τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.4. Οι καθαρές GST-πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία DTT και ακολούθησε βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250, αποχρωματισμός της και ξήρανση υπό κενό. Τα εκχυλίσματα από τα ευκαρυωτικά κύτταρα (100 μg πρωτεΐνης) ηλεκτροφορήθηκαν παρουσία DTT σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και Western- Blot. Η ανίχνευση της SRPK1 έγινε με κατάλληλο μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο FLAG. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.4. και τα τρία μεταλλάγματα της SRPK1 εκφράζονται, όπως και η φυσιολογική κινάση, τόσο σε HeLa κύτταρα όσο και σε βακτηριακά κύτταρα. ~ 56 ~

Σχήμα Γ.4. Έκφραση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της σε προκαρυωτικά E. coli και ευκαρυωτικά HeLa κύτταρα. Αριστερά: Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G ως πρωτεΐνες σύντηξης με GST. Η βαφή των πρωτεϊνών έγινε με Coomassie Brilliant Blue R-250. Δεξιά: Ανοσοανίχνευση των SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G από εκχυλίσματα HeLa κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με τους αντίστοιχους πλασμιδιακούς φορείς. Η ανίχνευση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της έγινε με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο FLAG. Γ.5. Έλεγχος κινητικότητας των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G σε SDS ηλεκτροφόρηση απουσία και παρουσία DTT. Για να δούμε αν η μετάλλαξη των κυστεϊνών 356 και 455 σε γλυκίνη είχε ως αποτέλεσμα την καταστροφή του δισουλφιδικού δεσμού, με αποτέλεσμα να μην έχουμε πλέον μεταβολή στην κινητικότητα της αντίστοιχης πρωτεΐνης, έγινε έλεγχος της κινητικότητας των τριών μεταλλαγμάτων της SRPK1 μετά από ηλεκτροφόρηση εκχυλισμάτων από HeLa κύτταρα απουσία και παρουσία 140 mm DTT. Τα εκχυλίσματα (100 μg πρωτεΐνης), από HeLa κύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με τους αντίστοιχους πλασμιδιακούς φορείς, ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυκαμιδίου και ακολούθησε ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και Western-Blot. Η ανίχνευση των SRPK1 έγινε με μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο FLAG. ~ 57 ~

Σχήμα Γ.5. Ανοσοανίχευση των SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G από εκχυλίσματα HeLa κυττάρων που είχαν επιμολυνθεί με τους αντίστοιχους πλασμιδιακούς φορεις. Η ηλεκτροφόρηση των εκχυλισμάτων έγινε είτε απουσία, είτε παρουσία 140 mm DTT. Η ανίχνευση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της έγινε με το μονοκλωνικό αντίσωμα απέναντι στο πεπτίδιο FLAG. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.5. υπάρχει μια πολύ μικρή μεταβολή στην κινητικότητα, απουσία και παρουσία DTT, στα μονά μεταλλάγματα σε σχέση με την control SRPK1, η οποία όμως εξαφανίζεται τελείως στο διπλό μετάλλαγμα. Η πολύ μικρή μεταβολή της κινητικότητας που παρατηρείται στα μονά μεταλλάγματα πιθανόν να οφείλεται στο γεγονός ότι οι κυστεΐνες 356 και 455 μπορουν σε μικρή έκταση να σχηματίσουν δισουλφιδικούς δεσμούς και με άλλες κυστεΐνες της ενδιάμεσης συνδετικής αλληλουχίας της SRPK1. Γ.6. Ανίχνευση δραστικότητας των πρωτεϊνών SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G με in vitro φωσφορυλίωση. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της δραστικότητας της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της μετά από έκφρασή τους τόσο σε προκαρυωτικά όσο και σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Η ανοσοκατακρήμνιση της SRPK1 και των μεταλλαγμάτων της έγινε από εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.22. Οι καθαρές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες από E.coli και οι ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες από 293Τ κύτταρα ελέγθηκαν για τη δραστικότητά τους με την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος και ραδιενεργού [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα το ~ 58 ~

τμήμα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαμίνης Β (LBR) που περιέχεται μεταξύ των αμινοξέων 62 και 92, εκφρασμένο, ως πρωτεΐνη σύντηξης με GST, στα Ε. coli (GST-LBRRS, βλέπε παράγραφο Β.2.14.). Τα δείγματα επωάστηκαν για 30 min σε θερμοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστέθηκε DTT και διάλυμα διαλυτοποίησης των δειγμάτων και στη συνέχεια τα δείγματα ηλεκτροφορήθηκαν. Ακολούθησε βαφή της πηκτής με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, αποχρωματισμός της και ξήρανση υπό κενό. Σε φωτοπολλαπλασιαστικό θάλαμο τοποθετήθηκε πάνω στο ξηρό gel ακτινογραφικό film ευαίσθητο στην ακτινοβολία που εκπέμπει ο 32 P και ακολούθησε έκθεση για 24 h. Σχήμα Γ.6. Η μετάλλαξη των κυστεϊνών 356 και 455 σε γλυκίνη δεν επηρεάζει τη δραστικότητα των αντίστοιχων μεταλλαγμένων μορφών της SRPK1 στα E. coli ενώ υπάρχει σημαντική μείωση της δραστικότητάς τους σε ευκαρυωτικά 293T κύτταρα. (Α) Αυτοραδιογραφία στην οποία αποτυπώνεται η φωσφορυλίωση του ~ 59 ~

GST-LBRRS από τις καθαρές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες GST- SRPK1, GST-SRPK1 356G, GST-SRPK1 455G και GST-SRPK1 356/455 (Β) 293T κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcmv-2-flag-srpk1, pcmv-2-flag-srpk1 356G, pcmv-2-flag-srpk1 455G και pcmv- 2-FLAG-SRPK1 356/455G. Παρασκευάστηκαν εκχυλίσματα 48 h μετά την επιμόλυνση και ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση των SRPK1 με το M5 anti-flag μονοκλωνικό αντίσωμα. Αριστερά στην εικόνα και στο πάνω μέρος φαίνονται οι ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες μετά από SDS-ηλεκτροφόρηση και βαφή με Coomassie Brilliant Blue R-250. Στο κάτω μέρος δείχνεται η αυτοραδιογραφία στην οποία αποτυπώνεται η φωσφορυλίωση του GST-LBRRS από τις ανοσοκατακρημνισμένες πρωτεΐνες. Οι ραδιενεργές ζώνες της πηκτής πολυακρυλαμιδίου που αντιστοιχούν στο GST-LBRRS κόπηκαν και μετρήθηκαν σε υγρό σπινθηριστή. Δεξιά στην εικόνα το ιστόγραμμα απεικονίζει τα αποτελέσματα της μέτρησης στον υγρό σπινθηριστή. Όπως φαίνεται στο σχήμα Γ.6.A. δεν παρατηρείται στα E. coli καμία μεταβολή στη δραστικότητα των μεταλλαγμάτων σε σχέση με την SRPK1. Αυτό είναι αναμενόμενο γιατί στα βακτήρια δεν παρατηρείται ανάπτυξη δισουλφιδικών δεσμών (Ostermeier et al, 1996). Στην περίπτωση όμως των ευκαρυωτικών 293T κυττάρων, παρατηρείται σημαντική μείωση της δραστικότητας των μεταλλαγμένων μορφών της SRPK1. Μέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή (σχήμα Γ.6.Β., δεξιά) έδειξε μείωση της δραστικότητας κατά 49, 47 και 67% των SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G αντίστοιχα σε σχέση με την control SRPK1. Γ.7. Υποκυτταρική εντόπιση των SRPK1, SRPK1 356G, SRPK1 455G και SRPK1 356/455G σε HeLa κύτταρα με δοκιμή έμμεσου ανοσοφθορισμού. Σε ένα επόμενο βήμα θελήσαμε να διαπιστώσουμε, με δοκιμασίες έμμεσου ανοσοφθορισμού, αν η μετάλλαξη κάποιας από τις κυστεΐνες 356 και 455 σε γλυκίνη ή ο συνδυασμός τους οδηγούσε στην μεταβολή της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1. Για το σκοπό αυτό, HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με τη χρήση του kit X-tremeGENE Q2 Reagen (όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.3.) με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που κωδικοποιούν τόσο την control SRPK1 όσο και τα μεταλλάγματά της. Ακολούθησε δοκιμασία ~ 60 ~

έμμεσου ανοσοφθορισμού και ανίχνευση των SRPK1 με τη χρήση κατάλληλου μονοκλωνικού αντισώματος απέναντι στο πεπτίδιο FLAG. Η χρώση του DNA έγινε με 1 mg/ml ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodide), αφού είχε προηγηθεί επώαση με 0.2 u/μl RNase. Το αnti-flag χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1500 ενώ ως δεύτερο αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε FITCconjugated goat anti-mouse, σε αραίωση 1:400 (πράσινο χρώμα). Σχήμα Γ.7. Έμμεσος ανοσοφθορισμός των υπερεκφρασμένων FLAG-SRPK1, FLAG-SRPK1 356G, FLAG-SRPK1 455G και FLAG-SRPK1 356/455G σε HeLa κύτταρα. Ο εντοπισμός της SRPK1 έγινε με τη χρήση ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος απέναντι στο πεπτίδιο FLAG, ενώ οι πυρήνες βάφτηκαν με PI. ~ 61 ~